DD268975A1 - METHOD FOR PRODUCING ENZYME TRAEGER COMPLEXES - Google Patents
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Abstract
Es wird ein Verfahren zur Herstellung von Enzym-Traeger-Komplexen beschrieben, mit dessen Hilfe es moeglich ist, in ein im wesentlichen aus vinylaromatischen Monomeren hergestelltes Polymer gleichzeitig Aminomethyl- und Aldehydgruppen einzufuehren und an dasselbe Enzyme oder Proteine kovalent zu binden. Das Verfahren besteht darin, dass in das Polymere durch aufeinanderfolgende polymeranaloge Reaktionen zunaechst Chlormethyl- und dann Hexamethylentetraaminomethyl-Gruppen eingefuehrt werden und diese dann durch Einwirkung einer nicht zu ihrer vollstaendigen Umsetzung zu Aminomethylgruppen ausreichenden Menge Saeure simultan zum Teil zu Aldehyd- und zum Teil zu Aminomethyl-Gruppen umgesetzt werden. Derart gemischt funktionalisierte Polymere koennen direkt mit Enzymen oder anderen Biokatalysatoren zur Reaktion gebracht werden, wodurch letztere kovalent an das Polymere gebunden werden. Mit Hilfe der immobilisierten Enzyme koennen chemische Umsetzungen, die fuer die Lebensmittel- und Pharmaindustrie Bedeutung haben, speziell der enzymatische Abbau vorhydrolysierter Staerke zu Glucose, die Invertierung von Saccharose und die Gewinnung verschiedener L-Aminosaeuren aus ihren synthetisch hergestellten D,L-Formen, besonders vorteilhaft durchgefuehrt werden.The invention relates to a process for the preparation of enzyme-carrier complexes, with the aid of which it is possible to simultaneously introduce aminomethyl and aldehyde groups into a polymer prepared essentially from vinylaromatic monomers and to covalently bond to the same enzymes or proteins. The method consists in introducing into the polymer by successive polymer-analogous reactions first chloromethyl and then hexamethylenetetraaminomethyl groups and then simultaneously by the action of an amount of acid not sufficient for their complete conversion to aminomethyl groups, partly to aldehyde and partly to aminomethyl Groups are implemented. Such mixed-functionalized polymers can be reacted directly with enzymes or other biocatalysts, thereby covalently bonding the latter to the polymer. With the help of immobilized enzymes, chemical reactions important to the food and pharmaceutical industries, especially the enzymatic degradation of prehydrolyzed starch to glucose, the inversion of sucrose, and the recovery of various L-amino acids from their synthetically produced D, L forms, can be particularly be carried out advantageous.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung funktionalisierter Polymerer auf Styrenbasis, an die Enzyme oder andere Biokatalysatoren ohne weitere Vorbehandlung kovalent gebunden werden können. Die so herstellbaren Enzym-Träger-Komplexe können in der Lebensmittelindustrie sowie in der chemischen und pharmazeutischen Industrie angewendet werden. Solche Anwendungsfälle sind beispielsweise die enzymatische Spaltung vorhydrolysierter Stärke zu hochwertiger Glucose, die Invertierung von Saccharose und die Herstellung verschiedener L-Aminosäuren aus ihren D, L-Formen.The invention relates to a process for the preparation of functionalized polymers based on styrene, to which enzymes or other biocatalysts can be covalently bound without further pretreatment. The so produced enzyme-carrier complexes can be used in the food industry as well as in the chemical and pharmaceutical industries. Such applications are, for example, the enzymatic cleavage of prehydrolyzed starch to high-grade glucose, the inversion of sucrose, and the production of various L-amino acids from their D, L forms.
In den DD-PS 141977,142131 und 149679 sind Verfahren zur Herstellung von Trägern auf Styrenbasis und zur Bindung von Enzymen an dieselben beschrieben. Ferner wird an dieser Stelle dargestellt, daß die Anwendung von Enzymen in immobilisierter Form besondere technische und ökonomische Vorteile bedingt, die sich vor allem in einer wesentlichen Enzymersparnis, einer Stabilisierung der Enzyme, einer erhöhten Endprodukt-Reinheit, erheblich kürzeren Reaktions- und Verweilzeiten sowie in der Möglichkeit einer kontinuierlichen Prozeßführung mit den damit verbundenen Vorteilen äußern.DD-PS 141977, 142131 and 149679 disclose methods of making styrenic supports and binding enzymes thereto. Furthermore, it is shown at this point that the use of enzymes in immobilized form requires special technical and economic advantages, especially in a significant Enzymerssparnis, a stabilization of the enzymes, increased final product purity, significantly shorter reaction and residence times and in express the possibility of continuous litigation with the associated benefits.
Bei der Immobilisierung von Enzymen muß nun aber auf jeden Fall solchen Verfahren der Vorzug gegeben werden, bei denen das Enzym durch Hauptvalenzverbindungen an den Träger gebunden ist, weil erfahrungsgemäß nur so eine Inaktivierung des Enzym-Träger-Komplexes durch allmähliches Auswaschen des Enzyms verhindert werden kann.In the immobilization of enzymes but now in any case, preference must be given to those methods in which the enzyme is bound by Hauptvalenzverbindungen to the carrier, because experience has shown that only inactivation of the enzyme-carrier complex can be prevented by gradual washing out of the enzyme ,
Derartige Verfahren sind in der Literatur vielfach beschrieben (G.BAUM, Biotechnol. Bioeng. 17, [1975], 253-270; G. MANECKE, W. BEIER, Angew. Makromol. Chem. 97, (1981), 23-33; G.P.ROYER, Reviews in Catal. Rev.-Sci. Eng. 22, [1980], 29-73; G. MANECKE, H. G. VOGT, Biochemie 62, [1980], 603-613; R.GOLDMAN, L.GOLDSTEIN, E.KATCHALSKI in .Biochemical Aspects of Reactions un Solid Supports [Stark, G. A. Ed.], Acad. Press, New York [1971 ]), wobei speziell die Bindung des Enzyms über am Träger fixierte Aldehydgruppen, die durch Umsetzung eines Aminogruppen enthaltenden Polymeren mit Gutaraldehyd eingeführt werden, zu günstigen Trägern führt (vgl. o.g. Veröffentlichung von BAUM und DD-PS 149679). Bei der Herstellung solcher Trägermaterialien existiert aber der Nachteil, daß die beispielsweise als Zwischenprodukt bei der in DD-PS 79152 beschriebene Synthese relativ leicht zugänglichen Polymeren mit Aminomethylgruppen noch einem zusätzlichen Syntheseschritt, nämlich der Behandlung mit Glutaraldehyd unterworfen werden müssen. Andere Verfahren zur Aktivierung von Trägern zwecks kovalenter Bindung von Enzymen sind z. B. von GOLDMAN et al. .Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports" (G.A.StarkEd.), Acad. Press, New York(1971);WELBOECKundJAWOREK(Chmia29I1975],109);MANECKE(Chimia 28 [1974], 467) und LYNN (»Immobilized Ezymes, Antigenes, Antibodies and Peptides", (H.H.Weetall Ed.), Marcel Dekker Inc., New York [1975], 1,1) angegeben. Sie alle bestehen darin, daß der bereits funktionalisierte Träger mit einem Agens behandelt wird, das mit ihm hauptvalenzmäßig reagiert und zusätzlich eine reaktive chemische Gruppierung enthält, die das später zugegebene Enzym kovalent bindet.Such methods are widely described in the literature (G.BAUM, Biotechnol., Bioeng 17, [1975], 253-270; G. MANECKE, W. BEIER, Angew. Makromol. Chem. 97, (1981), 23-33 GPROYER, Reviews in Catal., Rev. Sci., Eng 22, [1980], 29-73, G. MANECKE, HG VOGT, Biochemistry 62, [1980], 603-613, R.GOLDMAN, L.GOLDSTEIN , E.KATCHALSKI in "Biochemical Aspects of Reactions and Solid Supports" [Stark, GA Ed.], Acad. Press, New York [1971]), in which specifically the binding of the enzyme via supported aldehyde groups obtained by reacting an amino group-containing Polymers are introduced with Gutaraldehyd leads to favorable carriers (cf the publication of BAUM and DD-PS 149679). In the preparation of such support materials, however, there is the disadvantage that the described, for example, as an intermediate in the synthesis described in DD-PS 79152 relatively easily accessible polymers with aminomethyl groups still need to be subjected to an additional synthesis step, namely the treatment with glutaraldehyde. Other methods of activating carriers for covalent binding of enzymes are e.g. By GOLDMAN et al. Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports "(GAStarkEd.), Acad. Press, New York (1971); WELBOECK and JAWOREK (Chmia 29I1975], 109); MANECKE (Chimia 28 [1974], 467) and LYNN (" Immobilized Ezymes, Antigens, Antibodies and Peptides ", (HHWeetall Ed.), Marcel Dekker Inc., New York [1975], 1,1). They all consist of treating the already functionalized carrier with an agent that is most valence-responsive with it and additionally contains a reactive chemical moiety which covalently binds the enzyme added later.
Die bekannten Verfahren zur effektiven Bindung des Enzyms an den Träger erfordern also grundsätzlich die Anwendung eines Hifisstoffes wie Glutaraldehyd usw. und eines zusätzlichen Arbeitsganges. Dabei muß eventuell mit toxikologisch bedenklichen Substanzen wie Chinonen oder Triazinderivaten gearbeitet werden, so daß der Einsatz des gebildeten Enzym-Träger-Komplexes nicht zur Herstellung oder Behandlung von Lebensmitteln oder Pharmazeutika geeignet (st oder nur nach aufwendigen Reinigungsoperationen möglich wird.The known methods for effective binding of the enzyme to the carrier thus basically require the use of a hifisubstance such as glutaraldehyde, etc., and an additional operation. It may be necessary to work with toxicologically questionable substances such as quinones or triazine derivatives, so that the use of the enzyme-carrier complex formed is not suitable for the production or treatment of foods or pharmaceuticals (st or only after extensive cleaning operations is possible.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers für immobilisierte Enzyme, das ökonomisch günstig und ohne zusätzliche Aktivierung des Trägers Enzyme stabil und in aktiver Form zu binden vermag.The aim of the invention is a process for the preparation of a support for immobilized enzymes, which is able to bind enzymes economically and in active form without additional activation of the carrier.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben genannten Nachteile der bisher bekannten technischen Problemlösungen dadurch zu vermeiden, daß ein Träger verwendet wird, der von vornherein direkt an das Polymergei üst gebundene Aldehydgruppen enthält, mit denen funktioneile Gruppen des zu bindenden Enzyms unter Ausbildung von Hauptvalenzbindungen reagieren können, und cVß ein den oben angegebenen Zwecken entsprechendos Trägerpolymerisat neben den Aldehydgruppen noch primäre oder sekundäre Aminogruppen enthält.The invention has for its object to avoid the above-mentioned disadvantages of the previously known technical problem solutions in that a carrier is used which contains from the outset directly to the Polymergei üst bound aldehyde groups with which functional groups of the enzyme to be bound to form Hauptvalenzbindungen and, according to the above-stated purposes, the carrier polymer further contains primary or secondary amino groups in addition to the aldehyde groups.
Sei dem Versuch, Trägerpolymere auf Styren-Basis vim Zv, eck der Immobilisierung von Enzymen an denselben herzustellen, die am Polymergerüst nebeneinander AldehydoMppen z<" Kovalenten Bindung dieser Enzyme und (vorzüglich primär Aminogruppen enthalten sollten, ergab sich überraschenderweise, daß es genügt, bei dem in DD-PS 1Λ9679 genannten und an sich bekannten (DD-PS 79152) Verfahren der Zersetzung eines Reaktionsproduktes aus mit Divinylbenzen vernetztem Poly(chlormethylstyren) mit Hexamethylentetramin (Urotropin) mittels Säure die angewandte Säuremenge gezielt herabzusetzen, um in einem Reaktionsschritt das in erwünschter Weise gemischt funktionalisierte Trägermaterial zu erhalten. Während man mit dem Ziel, ein nur Aminomethylgruppen enthaltendes Polymeres (d. h. vernetztes Polyfaminorr ethylstyren!), zu erhalten, eine Menge an Umsetzungsprodukt aus vernetztem Poly(chlormethylstyren) mit Urotropin, die einer molaren Monge der Monomereinheit entspricht, mit mindestens 500ml konzentrierter Salzsäure in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. Methanol) durch Kochen am Rückfluß umsetzt, bewirkt eine Senkung der Salzsäuremenge auf weniger als 50% der ungegebenen Menge eine nachweisbare Bildung von Aldehydgruppen; bei einer Senkung auf weniger als 25% der oben angegebenen Menge treten Aldehyd- und Aminomethylgruppen in vergleichbaren Mengen auf.The attempt to prepare carrier polymers based on styrene on the basis of the immobilization of enzymes on the polymer backbone next to each other for the purpose of containing aldehydes and covalent bonds of these enzymes and (preferably primary amino groups surprisingly revealed that it suffices the mentioned in DD-PS 1Λ9679 and known per se (DD-PS 79152) method of decomposition of a reaction product of crosslinked with divinylbenzene poly (chloromethylstyrene) with hexamethylenetetramine (urotropin) by acid to reduce the amount of acid used in a reaction step in the desired Whereas, with the aim of obtaining a polymer containing only aminomethyl groups (ie, crosslinked polyfatty acid methyl styrene), an amount of crosslinked poly (chloromethylstyrene) reaction product with urotropin corresponding to a molar ratio of the monomer unit is obtained. with at least 500ml concentrated hydrochloric acid in a suitable solvent (e.g. Methanol) by refluxing, a reduction in the amount of hydrochloric acid to less than 50% of the unreacted amount causes detectable formation of aldehyde groups; when reduced to less than 25% of the amount indicated above, aldehyde and aminomethyl groups occur in comparable amounts.
Es konnte festgestellt werden, daß die so gewonnenen gemischt funktionalisierten Trägerpolymeren in der gleichen Weise zur Bildung eines Enzym-Träger-Komplexes mit technisch ausnutzbarer Aktivität befähigt sind, wie die nach uinem herkömmlichen Verfahren hergestellten und ausschließlich Aminomethylgruppen enthaltenden Polymeren nach einer Aktivierung mit Glutaraldehyd, Benzochinon oder anderen Mitteln. Dabei wurde eine ähnliche Abhängigkeit der Aktivität des Enzym-Träger-Komplexes von der physikalischen Struktur des Trägerpolymeren beobachtet, wie sie in DD-PS 149679 beschrieben ist, d.h. es ergab sich, daß nur poröse Trägerpolymere eine technisch ausnutzbare Aktivität vermitteln, und unter ihnen solche, deren Po.-enstruktur durch Verwendung von 0,75 bis 0,90Gew.-Teilen eines porenbildenden Hilfsstoffes pro Gew.-Teil Monomere, die sich wiederum aus vinylaromatischen Stoffen mit einer Vinylgruppe und vernetzenden Monomeren mit mindestens zwei nicht konjugierten Vinylgruppen im Massenverhältnis 8:2 bis 9,5:0,5 zusammensetzten, determiniert wird, die besten Ergebnisse zeigen.It has been found that the mixed functionalized carrier polymers thus obtained are capable of forming an enzyme-carrier complex having technically useful activity in the same manner as those prepared by conventional methods and containing only aminomethyl groups after activation with glutaraldehyde, benzoquinone or other means. A similar dependence of the activity of the enzyme-carrier complex on the physical structure of the carrier polymer was observed, as described in DD-PS 149679, i. it has been found that only porous carrier polymers mediate technically exploitable activity, and among them those whose polymer structure by use of 0.75 to 0.90 parts by weight of a pore-forming auxiliary per part by weight of monomers, which in turn from vinyl aromatic substances having a vinyl group and crosslinking monomers with at least two non-conjugated vinyl groups in a mass ratio of 8: 2 to 9.5: 0.5 put together, is determined to show the best results.
fie Herstellung der erfindungsgemäßen Trägerpolymere für immobilisierte Enzyme geht dementsprechend folgendermaßen vorsieh:Accordingly, the preparation of the carrier polymers according to the invention for immobilized enzymes is as follows:
Es wird ein Gemisch aus monovinylaromatischen Verbindungen und vernetzenden Monomeren, dem vorzugsweise ein porenbildender Hilfsstoff zugesetzt wird, wobei für diese drei Komponenten vorteilhaft die oben angegebenen gegenseitigen Verhältnisse eingehalten werden, hergestellt. Als monovinylaromatlsche Komponenten kommen vorzüglich Styron oder ein Alkylderivat desselben in Frage, als Vernetzer vorzüglich Divinylbenzen oder eine andere Verbindung mit zwei oder mehr nicht konjugierten Doppelbindungen. Als porenbildender Hilfsstoff kommt jeder Stoff in frage, der mit den Monomeren mischbar ist, aber das entstehende Polymere nicht löst und so wenig quillt, daß bei der Polymerisation eine Phasentrennung eintreten muß. Es werden vorzüglich paraffinische Kohlenwasserstoffe im Siedebereich von 336 bis 523K (auch als Gemische) verwendet. Die Polymerisationsreaktion wird radikalisch initiiert, indem das beschriebene Gemisch in Gegenwart eines in der Wärme in Radikale zerfallenden Stoffes v/ie Dibenzoylperoxid oder Azo-bis(isobuttersäurenitril) auf Temperaturen zwischen 323und423K erwärmt wird. Diese Polymerisation wird vorzugsweise nach der bekannten Technologie der Suspensions-(Perl-)polymerisation durchgeführt. In das entstandene vernetzte Polymere werden nach bekannten Methoden an den aromatischen Kern gebundene Chlormethylgruppen eingeführt, wobei vorzugsweise die in GB-PS 654706,700470,649851 und 679852 beschrieben« Reaktion mit Monochlordimethylether in Gegenwart von Friedel-Crafts-Katalysatoren benutzt wird. Das so erhaltene chlormethylierte Polymere wird dann in einem organischen Lösungsmittel bei 303 bis 373K mit Hexamethylentetramin umgesetzt. Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise niedere Alkohole und Halogenkohlenwasserstoffe in Frage, die bei einer Reaktionstemperatur sieden, so daß die Umsetzung unter Rückfluß vor sich geht. Anschließend wird das so umgesetzte Produkt mit einem organischen Lösungsmittel (vorzüglich Methanol) oder mit Wasser gewaschen und dnnn auf die erfindungsgemäße Weise zersetzt; der ZeiSetzung kann eine Nacharninierung mit Ammoniak zur Überführung der bei der Reaktion mit Hexamethylentetramin nicht umgesetzten Chlormethylgruppen zu Aminomethylgruppen vorangehtn: Eine Menge des feuchten Harzes, die 100g Trockensubstanz enthält, wird mit weniger als 120 (vorzugsweise 30 bis 70) ml konzentrieiter Salzsäure in etwa 500ml Methanol mindestens 2 (vorzugsweise 4 bis 8) Stunden unter Erwärmen bis zum Rückfluß gerührt. Dann wird es von der Flüssigkeit getrennt und mit Wasser säurefrei gewaschen. Das so hergestellte Trägerpolym are, das in Form wasserfeuchter opaker Kugelchen (vorzugsweise im Korngrößenbereich von 0,2 bis 0,8 mm) vorliegt und in dom IR-spektroskopisch oder nach anderen Methoden der organischen Analyse Aldehydgruppen und Aminomethylgruppen nebeneinander nachgewiesen werden können, wird folgendermaßen mit dem zu immobilisierenden Enzym beladen: Eine gegebene Menge des feuchten Trägermaterials wird in einer dem jeweiligen Enzym angepaßten Pufferlösung mit einer entsprechenden Enzymmonge mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach vier- bis fünfmaligem Waschen mit einem Puffersystem (vorzugsweise Natriumacetatpuffer pH 5,0/1 M NaCI) wird die Probe unter Wasser bei 277 K aufbewahrt. Die Prüfung der Aktivität des Enzym-Träger-Komplexes erfolgt nach einer für den jeweiligen Fall spezifischen Methode; bei immobilisierter Glucoamylase wird beispielsweise folgende Arbeitsweise angewendet:A mixture of monovinylaromatic compounds and crosslinking monomers, to which preferably a pore-forming auxiliary is added, wherein the above-mentioned mutual ratios are advantageously maintained for these three components, is prepared. Preferred monovinylaromatic components are Styron or an alkyl derivative thereof, as crosslinkers, preferably divinylbenzene or another compound having two or more non-conjugated double bonds. As a pore-forming excipient is any substance in question, which is miscible with the monomers, but does not dissolve the resulting polymer and so little swells that during the polymerization phase separation must occur. It is best used paraffinic hydrocarbons in the boiling range of 336 to 523K (also as mixtures). The polymerization reaction is initiated by free-radicalization by heating the described mixture in the presence of a heat-decomposing substance, ie dibenzoyl peroxide or azo-bis (isobutyric acid nitrile), to temperatures between 323 and 423K. This polymerization is preferably carried out according to the known technology of suspension (bead) polymerization. In the resulting crosslinked polymers chloromethyl groups bound to the aromatic nucleus are introduced by known methods, wherein preferably the reaction described in GB-PS 654706,700470,649851 and 679852 with monochlorodimethyl ether in the presence of Friedel-Crafts catalysts is used. The chloromethylated polymer thus obtained is then reacted with hexamethylenetetramine in an organic solvent at 303 to 373K. Suitable solvents are preferably lower alcohols and halogenated hydrocarbons, which boil at a reaction temperature, so that the reaction proceeds under reflux. Subsequently, the product thus reacted is washed with an organic solvent (preferably methanol) or with water and dnnn decomposed in the manner according to the invention; the post-treatment may be preceded by ammonia post-amination to convert the chloromethyl groups unreacted in the reaction with hexamethylenetetramine to aminomethyl groups. An amount of the wet resin containing 100g of dry matter is reduced to about 500mL with less than 120 (preferably 30 to 70) ml of concentrated hydrochloric acid Methanol stirred for at least 2 (preferably 4 to 8) hours while heating to reflux. Then it is separated from the liquid and washed acid-free with water. The Trägerpolym prepared so, which is in the form of water-moist opaque spheres (preferably in the particle size range of 0.2 to 0.8 mm) and in dom-spectroscopy or other methods of organic analysis aldehyde groups and aminomethyl groups can be detected side by side, is as follows loaded with the enzyme to be immobilized: A given amount of the wet carrier material is stirred for at least four hours at room temperature in a buffer solution adapted to the respective enzyme with a corresponding enzyme. After washing four to five times with a buffer system (preferably sodium acetate buffer pH 5.0 / 1M NaCl), the sample is stored under water at 277K. The examination of the activity of the enzyme-carrier complex is carried out according to a specific method for each case; For immobilized glucoamylase, for example, the following procedure is used:
Der feuchte Enzym-Träger-Komplex wird in einer temperierbaren Fritte mit 1%iger Stärkelösung gerührt, und die entstandene Glucose durch Umsetzung mit 3,5-Dinitrosalicylsäure besti. imt.The moist enzyme-carrier complex is stirred in a temperature-controlled frit with 1% strength starch solution, and the resulting glucose by reaction with 3,5-dinitrosalicylic besti. IMT.
Es ist bemerkenswert, daß schon sehr geringe relativo Mengen an Aldehydgruppen, wie sie bei Anwendung von Salzsäuremengen, die an der oberen Grenze des angegebenen Bereiches liegen, erhalten werden, für eine kovalente Bindung befriedigender Enzymaktivitäten ausreichen. Ferner ist es interessant, c'aß bei den erfindungsgemäßen Trägerpolymeren die bisher übliche Umsetzung mit einem die Bindung des Enzyms vermittelnden Agens nicht nur unnötig, sondern sogar in bezug auf die Aktivität des Enzym-Ttäger-Komplexes schädlich ist.It is noteworthy that even very small relative amounts of aldehyde groups, such as are obtained when using quantities of hydrochloric acid which are at the upper limit of the stated range, suffice for a covalent bond of satisfactory enzyme activities. It is also interesting that in the case of the carrier polymers according to the invention the hitherto customary reaction with an agent which mediates the binding of the enzyme is not only unnecessary, but is even detrimental with respect to the activity of the enzyme-carrier complex.
der Erfindung boschreiben zu wollen:to write the invention bosch:
sowie 5g MgSO4 · 7H2O aufgelöst. Dann wird durch Zugabe von 1,75g NaOH eine Mg(OH)2-Suspension hergestellt, au der bei338K ein Gemisch aus 114,0g Styren; 25,3g eines technischen Divinylbenzens, das 54,2 Gew.-% Divinylbenzen und 38,5Gew.-%and 5 g MgSO 4 .7H 2 O dissolved. Then, by adding 1.75 g of NaOH, a Mg (OH) 2 suspension is prepared, except that at 238K, a mixture of 114.0 g of styrene; 25.3 g of a technical divinylbenzene containing 54.2% by weight of divinylbenzene and 38.5% by weight
und 0,75g Azo- bis (isobuttersäurenitril) gegeben wird. Dieses Gemisch wird durch Rühren zu Tröpfchen von etwa 0,35mmmittlerem Durchmesser verteilt. Unter fortgesetztem Rühren wird 4 Stunden bei 343K und 4 Stunden bei 373K polymerisiert.and 0.75 g of azo-bis (isobutyronitrile) is added. This mixture is distributed by stirring to droplets of about 0.35 mm median diameter. With continued stirring, polymerization is carried out at 343K for 4 hours and at 373K for 4 hours.
gebracht. Sowohl durch den Mantel, wie auch durch das Polymerisat werden Wasserdampf von etwa 0,12 MPa Druck geleitet, bisdas Kondensat des Dampfes, der das Polymerisat durchströmt hatte, keine organischen Bestandteile mehr enthält. Da» nunkreidig weiß aussehende Polymerisat wird bei 363K getrocknet und die Kornfraktion von 0,2 bis 0,5mm zur weiterenbrought. Both through the shell, as well as through the polymer water vapor of about 0.12 MPa pressure are passed until the condensate of the vapor, which had flowed through the polymer, contains no organic constituents. The white-looking polymer is dried at 363K and the grain fraction from 0.2 to 0.5 mm
50g dieses Polymerisates werden mit 250ml Monochlordimethylether und 10g Zinntetrachlorid β Stunden unter50g of this polymer are with 250ml Monochlordimethylether and 10g tin tetrachloride for under
säurefrei ist. Das lufttrockene Material wird dann in ein Gemisch von 360ml Methanol und 60g Hexamethylentetramin gegebenund 8 Stunden bei 303K gerührt. Dann wird es wieder abgetrennt, mit Methanol gewaschen und mit 400ml 25%igeris acid-free. The air-dry material is then added to a mixture of 360 ml of methanol and 60 g of hexamethylenetetramine and stirred for 8 hours at 303K. Then it is separated again, washed with methanol and with 400ml 25%
schließlich mit einem Gemisch aus 3GOmI Methanol und 40ml konzentrierter Salzsäure (etwa 30%ig) 6 Stunden unter Rühren amfinally with a mixture of 3GOmI methanol and 40ml of concentrated hydrochloric acid (about 30%) for 6 hours with stirring on
mit dem an Aminomethylgruppen vergleichbar ist. Der Gehalt en ersteren wurde nach R. ULBRICH, A. SCHELLENBERGER, Z.with which is comparable to aminomethyl groups. The content of the former was determined by R. ULBRICH, A. SCHELLENBERGER, Z.
zu einem Wert von 2,79 mol pro g Trockensubstanz führte und damit auswies, daß nur etwa Va der nach dem elementaranalytischgemessenen Umsetzungsgrad bei der Chlormethylierung bei vollständiger Zersetzung zu erwartenden Aminomethylgruppenentstanden waren, hervor.to a value of 2.79 mol per g of dry matter and thus showed that only about Va of the elementaranalytically measured degree of conversion in the chloromethylation with complete decomposition expected aminomethyl groups were, it emerged.
400mg des feuchten Trägermaterials wurden in 3ml Phosphatpuffer nach SÖRENSEN pH 7,0 gegeben. Nach Hinzufügen von50μΙ Glucoamylase (Firma NOVO Industries) (EC 3.2.1.3.)—was einem Aktivitätsangebot von etwa 1500U/g entsprach—wurdedie Probe 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde über eine Fritte kurz abgesaugt und fünfmal mit 25mM400 mg of the moist carrier material were added to 3 ml of phosphate buffer according to SORENSEN pH 7.0. After addition of 50μl glucoamylase (NOVO Industries) (EC 3.2.1.3.) - which corresponded to an activity of about 1500U / g - the sample was stirred for 4 hours at room temperature. It was then sucked off briefly via a frit and five times with 25mM
bei 277 K aufbewahrt.stored at 277K.
a) Aktivitätstesta) activity test
30 mg des mit Enzym beladenen feuchten Trägermaterials wurden in eine temperierbare, mit einem Glasrührer versehene Fritte gegeben. Nach Zugabe von 20 ml 1 %iger Zulkowsky-Stärkelösung in 25 mM Natriumacetatpufftsr pH 4,5 wurde bei 310 K1 ε min schnell gerührt und dann abgesaugt. Von der Probe wurden 2ml abgenommen und die Anzahl der reduzierenden Gruppen mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (P. BERNFELD, Methods Enzymol. 1 (1955], 145) bestimmt. Die Aktivität des Glucoamylase-Polystyron-Komplexes beträgt 210U/g.30 mg of the enzyme-loaded wet carrier material were placed in a temperature-controlled frit provided with a glass stirrer. After addition of 20 ml of 1% strength Zulkowsky starch solution in 25 mM Natriumacetatpufftsr pH 4.5 was stirred rapidly at 310 K1 ε min and then filtered with suction. 2 ml of the sample was taken and the number of reducing groups was determined with 3,5-dinitrosalicylic acid (P. BERNFELD, Methods Enzymol., 1 (1955), 145. The activity of the glucoamylase-polystyron complex is 210 U / g.
b) Stabilitätstestb) stability test
bei erhöhten Temperaturen (315-370K) inkubiert und deren Aktivität gemessen. Außerdem erfolgte im batch-Versuch dieincubated at elevated temperatures (315-370K) and measured their activity. In addition, the
wurde die Aktivität der Probe nach der oben beschriebenen Verfahrensweise bestimmt.the activity of the sample was determined according to the procedure described above.
500g des feuchten Trägermaterials wurden in einer Lösung von 30 mg Invertase (EC 3.2.1.26) aus Saccharomyces cerevisiae (Fa.500 g of the moist support material were dissolved in a solution of 30 mg invertase (EC 3.2.1.26) from Saccharomyces cerevisiae (Fa.
gerührt. Nach Absaugen der Enzymlösung über eine Fritte wurde der Enzym-Träger-Komplex fünfmal mit 1M NaCI/0,025Mtouched. After aspirating the enzyme solution through a frit, the enzyme-carrier complex was washed five times with 1M NaCl / 0.025M
entspricht. j equivalent. j
0,025M Natriumacotatpuffer pH 4,5 bei 297K durch enzymatische Bestimmung der freigesetzten Glucosemenge mit Hufe der0.025M sodium acotate buffer pH 4.5 at 297K by enzymatic determination of the amount of glucose released with hooves
angegebenen Bedingungen katalysiert.catalysed conditions.
500g feuchtes Trägermaterial wurden in einer Lösung von 50mg Aminoacylase (EC 3.4.1.14) aus Schweinenieren (Fa. Serva,500 g of moist carrier material were dissolved in a solution of 50 mg of aminoacylase (EC 3.4.1.14) from porcine kidneys (from Serva,
vom Trägermaterial mit Hilfe einer Fritto wurde dor Enzym-Träger-Komplex fünfmal mit 1M NaCI/0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0und dreimal mit 0,"! M Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen und anschließend bei 277 K unter Wasser aufbewahrt.from the carrier material by means of a Fritto dor enzyme-support complex is five times, "! M phosphate buffer pH 7.0 0 washed three times with 1M NaCl / 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 and then stored at 277 K under water.
(S. MOORE, W. Η.STEIN [1954], J. Biol. Chem. 211,907), wobei 1U die Freisetzung von 1 μΜοΙ L-Alanin unter den obenangegebenen Bedingungen katalysiert.(S. MOORE, W. Η.STEIN [1954], J. Biol. Chem. 211,907), wherein 1U catalyzes the release of 1 μΜοΙ L-alanine under the conditions indicated above.
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DD24733983A DD268975A1 (en) | 1983-01-19 | 1983-01-19 | METHOD FOR PRODUCING ENZYME TRAEGER COMPLEXES |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DD268975A1 true DD268975A1 (en) | 1989-06-14 |
Family
ID=5544478
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DD24733983A DD268975A1 (en) | 1983-01-19 | 1983-01-19 | METHOD FOR PRODUCING ENZYME TRAEGER COMPLEXES |
Country Status (1)
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DD (1) | DD268975A1 (en) |
-
1983
- 1983-01-19 DD DD24733983A patent/DD268975A1/en not_active IP Right Cessation
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