DD265164A1

DD265164A1 - PROCESS FOR PREPARING PROTEINOGENIC ACTIVE SUBSTANCES

Info

Publication number: DD265164A1
Application number: DD30678487A
Authority: DD
Inventors: Andreas Mueller; Juergen Hofemeister
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-09-09
Filing date: 1987-09-09
Publication date: 1989-02-22

Abstract

Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Herstellung proteinogener Wirkstoffe. Die Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem vor allem Enzyme in grossem Umfang und ohne grossen Aufwand hergestellt werden koennen. Anstelle von Mikroorganismen werden dabei als gentechnisch manipulierte Organismen einfach hoehere Pflanzen verwendet, die im Feldbau vermehrbar sind. Dazu wird eine fuer das entsprechende Enzym kodierende DNS-Sequenz mit entsprechenden Promotoren gekoppelt und das so gebildete Gen in das Erbgut der Pflanzen integriert. Aus den regenerierten, vermehrten, angebauten und geernteten Pflanzen wird das Enzym gewonnen, wobei alle die Proteine, die die Anwendung des Enzyms nicht stoeren, nicht entfernt werden muessen. Die Erfindung ist vor allem zur Herstellung von Chymosin geeignet.The invention includes a method for producing proteinogenic drugs. The invention relates to a method with which, above all, enzymes can be produced on a large scale and without much effort. Instead of microorganisms are used as genetically engineered organisms simply higher plants that are reproducible in field crops. For this purpose, a DNA sequence coding for the corresponding enzyme is coupled with appropriate promoters and the gene thus formed is integrated into the genome of the plants. From the regenerated, propagated, grown and harvested plants, the enzyme is obtained, whereby all the proteins that do not interfere with the application of the enzyme, must not be removed. The invention is particularly suitable for the production of chymosin.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung proteinogener Wirkstoffe unter Verwendung gentechnisch manipulierter Organismen.The invention relates to a method for producing proteinogenic active substances using genetically engineered organisms.

Characteristic of the known state of the art

Zur Produktion von industriell oder medizinisch nutzbaren Enzymen und anderen proteinogenen Wirkstoffen (z. B. Hormonen) werden in zunehmendem Maße gentechnisch manipulierte Mikroorganismen eingesetzt. Solche biotechnologischen Produktionsverfahren sind insbesondere dann von großer wirtschaftlicher Bedeutung, wenn die Organismen, in denen der betreffende Wirkstoff natürlicherweise vorkommt, nur in begrenzen! Umfang verfügbar oder für die Gewinnung des Wirkstoffes wenig geeignet sind. Beispielsweise wird das als Milchgerinnungsenzym für die Käseindustrie unentbehrliche Chymosin traditionell aus dem Labmagen geschlachteter Kälber isoliert und steht daher nur in begrenzter Menge zur Verfügung. Durch die Übertragung einer für Chymosin (bzw. Prochymosin) kodierenden DNS-Sequenz in geeignete Mikroorganismen (Bakterien, Hefe, Pilze) ist es nunmehr möglich geworden, Chymosin auch biotechnologisch zu erzeugen, wie das unter anderem in der PCT-Patentanmeldung 8500382 beziehungsweise in den EP-Patentanmeldungen 133756 und 154351 vorgeschlagen worden ist. Die gentechnisch manipulierten Mikroorganismen werden in Fermentoren kultiviert und seht id in das Prochymosin in die Kulturflüssigkeit aus, die danach zum Fertigprodukt des Enzympräparates aufgearbeitet wird. Die Fermentortechnik ist aber relativ teuer; hinzu kommt außerdem, daß die zur Fermentation benötigten Nährmedien in der Regel nicht mit billigen Abfallprodukten (z. B. Melasse) bereitet werden können, sondern Kohlenhydrat- und Proteinquellen nutzen, die auch für die menschliche Ernährung geeignet sind und dieser damit verlorengehen.For the production of industrially or medically usable enzymes and other proteinogenic active substances (eg hormones), genetically manipulated microorganisms are increasingly being used. Such biotechnological production processes are of great economic importance, in particular, if the organisms in which the active substance in question naturally occurs are limited in size! Scope available or are not suitable for the recovery of the active ingredient. For example, chymosin, which is indispensable as a milk clotting enzyme for the cheese industry, is traditionally isolated from the abomasum of slaughtered calves and is therefore available only in limited quantities. By transferring a coding for chymosin (or prochymosin) DNA sequence into suitable microorganisms (bacteria, yeast, fungi), it has now become possible to produce chymosin also biotechnologically, as described, inter alia, in PCT patent application 8500382 or in the EP patent applications 133756 and 154351 has been proposed. The genetically engineered microorganisms are cultured in fermentors and look id in the prochymosin in the culture liquid, which is then worked up to the finished product of the enzyme preparation. The fermentor technology is relatively expensive; In addition, the nutrient media required for fermentation can generally not be prepared with cheap waste products (eg molasses), but use carbohydrate and protein sources which are also suitable for human consumption and are therefore lost.

Prinzipiell die gleichen Charakteristika weisen auch die zur gentechnisch manipulierten Biosynthese anderer proteinogener Wirkstoffe vorgeschlagenen Verfahren auf. Alle bisher bekannten derartigen Verfahren nutzen Mikroorganismen und erfordern dementsprechend relativ teure Fermentoren und Nährmedien.In principle, the same characteristics are proposed for the genetically engineered biosynthesis of other proteinogenic drugs proposed methods. All previously known such methods use microorganisms and accordingly require relatively expensive fermentors and nutrient media.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, über den Spezialfall des Chymosins hinaus Enzyme oder andere proteinogene Wirkstoffe, vor allem solche, die in großen Mengen benötigt werden, in einem einfach zu handhabonden und wirtschaftlich günstigen Verfahren bereitzustellen, wobei im allgemeinen an deren Reinheit nur Anforderungen gestellt werden, wie sie für ihre großtechnische Verwendung unabdingbar sind.The object of the invention is, in addition to the special case of chymosin, to provide enzymes or other proteinogenic active substances, especially those which are required in large quantities, in an easy-to-handle and economically favorable process, with only requirements being generally imposed on their purity as they are indispensable for their industrial use.

Explanation of the essence of the invention

Demzufolge hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, proteinogene Wirkstoffe mit Hilfe gentechnischer veränderter Organismen zu gewinnen, ohne daß Fermentoren und teure Nährmedien eingesetzt werden müßten. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß eine klonierte DNS-Sequenz, die für einen proteinogenen Wirkstoff kodiert, mit solchen Kontroll-Sequenzen gekoppelt wird, die ihre Expression in höheren Pflanzen gewährleisten, daß das so gebildete chimäre Gen in das Erbgut von Pflanzenzellen integriert wird, daß aus den transformierten Pflanzenzellen ganze Pflanzen regeneriert und diese vermehrt werden und daß die Wirkstoff-Präparate aus den geernteten Pflanzen gewonnen werden. Es ist vorteilhaft, wenn die DNS-Sequenz für ein industriell oder pharmazeutisch genutztes Enzym kodiert, beispielsweise eine Protease. Besonders angepaßt ist die Erfindung an die Fälle, bei denen die DNS-Sequenz für kälberspezifisches Prä-Prochymosin oder Prochymosin kodiert. Es ist aber auch möglich; daß die DNS-Sequenz für einen nichtenzymatischen Wirkstoff kodiert.Accordingly, the object of the invention has been to obtain proteinogenic agents by means of genetically engineered organisms without fermenters and expensive nutrient media would have to be used. According to the invention the object is achieved in that a cloned DNA sequence encoding a proteinogenic agent is coupled with such control sequences that ensure their expression in higher plants that the chimeric gene thus formed is integrated into the genome of plant cells in that whole plants are regenerated from the transformed plant cells and these are propagated and that the active ingredient preparations are obtained from the harvested plants. It is advantageous if the DNA sequence encodes an industrially or pharmaceutically used enzyme, for example a protease. The invention is particularly adapted to the cases in which the DNA sequence codes for calf-specific pre-prochymosin or prochymosin. It is also possible; that the DNA sequence encodes a non-enzymatic drug.

Durch die Erfindung werden die Nachteile der bisher bekannten und verwendeten Herstellungsverfahren weitgehend vermieden. Der Anbau gentechnisch manipulierter Pflanzen wie beispielsweise von Tabak kann mit konventionellen landwirtschaftlichen Techniken erfolgen und erfordert keine teuren Nährmedien. Als Energiequelle für die biologische Synthese wird direkt das Sonnenlicht genutzt.By the invention, the disadvantages of the previously known and used manufacturing processes are largely avoided. The cultivation of genetically manipulated plants such as tobacco can be done with conventional agricultural techniques and does not require expensive nutrient media. As an energy source for biological synthesis, the sunlight is used directly.

Die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte können naturgemäß in vielfältiger Weise variiert werden, ohne daß der Bereich der Erfindung verlassen werden müßte, wie nachfolgend ausführlich beschrieben wird.The process steps according to the invention can of course be varied in many ways without departing from the scope of the invention, as will be described in detail below.

Es ist es für die Erfindung gleichgültig, auf welchem Wege die für den gewünschten Wirkstoff kodierende DNS-Sequenz isoliert und identifiziert wird. Es können sowohl natürliche DNS-Sequenzen aus anderen Organismen als auch gentechnisch veränderte oder synthetische DNS-Sequenzen benutzt werden. Es ist auch nicht ausgeschlossen, daß es sich um eine pflanzliche DNS-Soquenz handelt, von der zur Erhöhung der Produktausbeute zusätzliche Kopien in das Genom der Pflanze integriert werden. Im speziellen Fall wird mit einem für Prochymosin kodierenden cDNS-Klon gearbeitet, der aus der RNS des Kälberrnagsr.s gewonnen wurde.It is immaterial to the invention how the DNA sequence encoding the desired drug is isolated and identified. Both natural DNA sequences from other organisms as well as genetically modified or synthetic DNA sequences can be used. It is also not excluded that it is a plant DNA sequence from which additional copies are integrated into the genome of the plant to increase the product yield. In the special case, a clone coding for prochymosin cDNA clone, which was obtained from the RNA of Kälberrnagsr.s worked.

Um die kodierende DNS-Sequenz in Pflanzenzellen exprimierbar zu machen, wird sie mit einem pflanzlichen Promotor, einer pflanzlichen Polyadenylierungssequenz und gegebenenfalls zusätzlichen, die Expression steigernden Kontrollsequenzen gekoppelt. Der Promotor kann dabei konstitutiv oder regulierbar sein. Gut geeignet ist beispielsweise der Promotor des TR 2'-Gens aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. Dieser Promotor, der ein hohes konstitutivesTo make the coding DNA sequence expressable in plant cells, it is coupled with a plant promoter, a plant polyadenylation sequence and optionally additional expression enhancing control sequences. The promoter can be constitutive or regulatable. For example, the promoter of the TR 2 'gene from the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens is well suited. This promoter, which is a high constitutive

Expressionsniveau in Tabak und anderen höheren Pflanzen bedingt, liegt in E. coli-Plasmiden Moniert vor und Ist bereits'dazu benutzt worden, bakterielle Gene in höheren Pflanzen zu exprimieren/1, II. Level of expression in tobacco and other higher plants, is present in E. coli plasmids and has already been used to express bacterial genes in higher plants / 1, II.

Bisher sind jedoch weder mit dem Promotor des TR 2'-Gens noch mit anderen pflanzenspezifischen Promotoren solche Chimäre Gene konstruiert worden, die für Prochymosin oder einen anderen industriell nutzbaren Wirkstoff kodieren.So far, however, such chimeric genes have not been constructed with the promoter of the TR 2 'gene or with other plant-specific promoters, which code for prochymosin or another industrially usable drug.

Wesentlich an der Erfindung ist, daß die Biosynthese des gewünschten Wirkstoffes in einer zum Feldanbau geeigneten höheren Pflanze erfolgt, sio ist also nicht auf den besonders günstigen Tabak—Nicotiana tabacum — beschränkt.It is essential to the invention that the biosynthesis of the desired active ingredient takes place in a suitable for field cultivation higher plant, sio is therefore not on the particularly favorable tobacco Nicotiana tabacum - limited.

Auch die Methoden zum Transfer des Gens, zur Regeneration ganzer Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen und zur Vermehrung der regenierten Pflanzen sind beliebig. Nach dem gegenwärtigen Kenntnisstand läßt sich das gewünschte Ergebnis bei vielen dikotylen Pflanzen oesonders günstig durch agrobakterienvermittelten Gentransfer erreichen/2,3,4/. Dabei ist bedeutsam, daß zur (Erhöhung der Produktausbeute auch mehrere Kopien des Chimären Gens in das Genom integriert werden können und daß ein erblich stabiler transgenischer Pflanzenstamm entsteht, der beliebig vermehrt werden kann. Im speziellen Fall wird so verfahren, daß bei einer größeren Anzahl transgenischer Tabakpflanzen immunologisch und/oder onzymologisch der Gehalt an Prochymosin bestimmt wird. Von den Pflanzen mit dem höchsten Prochymosingehalt werden dann durch Selbstbefruchtung Nachkommen gewonnen, die einer erneuten Selektion auf hohe Prcchymosinproduktion unterworfen werden. Zusätzlich besteht die Möglichkeit, die Kopienzahl durch Kreuzung zwischen unabhängigen Transformanten oder durch erneuten Gentransfer noch weiter zu erhöhen.The methods for the transfer of the gene, for the regeneration of whole plants from the transformed plant cells and for the propagation of the regenerated plants are arbitrary. According to the current state of knowledge, the desired result in many dicotyledonous plants can be achieved particularly advantageously by agrobacterium-mediated gene transfer / 2,3,4 /. It is important that (to increase the product yield also several copies of the chimeric gene can be integrated into the genome and that a hereditary stable transgenic plant stem is produced, which can be arbitrarily propagated.The procedure is such that in a larger number of transgenic Of the plants with the highest prochymosin content, progeny are then obtained by self-pollination, which are subjected to a renewed selection for high procchymosin production to increase through new gene transfer even further.

Das Wirkstoffpräparat wird zweckmäßig durch Extraktion—etwa der Tabakblätter—gewonnen. Methoden zur großtechnischen Extraktgewinnung aus vegetativem Pflanzenmaterial sind grundsätzlich bekannt. Es ist aber nicht auszuschließen, daß gelegentlich auf die Extraktion verzichtet und das getrocknete und zerkleinerte Pflanzenmaterial bereits als Enzympräparat genutzt werden kann.The active substance preparation is expediently obtained by extraction-for example of the tobacco leaves. Methods for large-scale extract extraction from vegetative plant material are known in principle. However, it can not be ruled out that occasionally dispenses with the extraction and the dried and crushed plant material can already be used as an enzyme preparation.

Angesichts der Tatsache, daß sich die Erfindung wesentlich auf eine Verknüpfung von an sich bekannten und in anderem Zusammenhang bereits verwendeten Verfahrensschritten bezieht, deren fachgemäße Ausführung im einzelnen keiner weiteren Erläuterung bedarf, kann auf die Darlegung eines Ausführungsbeispieles verzichtet werden.In view of the fact that the invention relates essentially to a combination of known per se and in other context already used process steps, the professional execution of which requires no further explanation in detail, can be dispensed with the disclosure of an embodiment.

Literaturliterature

IM Veiten, J., Volten, L., Hain, R., Schell, J., EMBO J. 3(1£84) S.2723ff. IM Veiten, J., Volten, L., Hain, R., Schell, J., EMBO J. 3 (1 £ 84) p.2723ff.

121 Vaeck, M., Reynaerts, A., Hoofte, H., Jansens, S., Oe Beuckeleer, M., Dean, C, Zabeau, M., Van Montagu, M., Leemans, J., Nature 328 (1987), 121 Vaeck, M., Reynaerts, A., Hoofte, H. Jansen, S., Oe Beuckeleer, M. Dean, C., Zabeau, M., Van Montagu, M., Leemans, J., Nature 328 ( 1987)

l'il Gheysen, G., Dhaese, P., Van Montagu, M., Schell, J., in „Genetic Flux In Plants" (ede. Hohn, R., Dennis, E.S.), S. 11-17, New York 1985 IA/ Müller, A. J., Mandel, R. R., Schiemann, J., Simoens, C. Inze, D., Mol. Gen. Genet. 207 (1987), S. 171 ff. l'il Gheysen, G., Dhaese, P., Van Montagu, M., Schell, J., in "Genetic Flux In Plants" (ede. Hohn, R., Dennis, ES), pp 11-17, New York 1985 IA / Muller, AJ, Almond, RR, Schiemann, J., Simoens, C. Inze, D., Mol. Gen. Genet., 207 (1987), p.

Claims

1. A process for the production of proteinogenic agents using genetically engineered organisms, characterized in that

A coupled DNA sequence coding for a proteinogenic agent is coupled with those control sequences which ensure their expression in higher plants,

- the chimeric gene thus formed is integrated into the genome of plant cells,

- regenerated whole plants from the transformed plant cells and these are propagated and

- The proteinogenic agents are obtained from the harvested plants.

2. Process according to claim characterized in that the DNA sequence encodes an industrially or pharmaceutically usable enzyme.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the DNA sequence encodes a protease.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the DNA sequence for calf-specific pre-prochymosin or prochymosin encodes.

5. The method according to claim 1, characterized in that the DNA sequence encodes a non-enzymatic active ingredient.