DD263081A1

DD263081A1 - METHOD FOR INTRODUCING DNA SEQUENCES INTO THE GENOME OF HIGHER PLANTS

Info

Publication number: DD263081A1
Application number: DD30513687A
Authority: DD
Inventors: Helmut Baeumlein; Ronald Bassuener; Rudolf Jung; Klaus Muentz; Gerhard Saalbach; Winfriede Weschke; Ulrich Wobus
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-07-20
Filing date: 1987-07-20
Publication date: 1988-12-21

Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Transformation von Fremdgenen in Pflanzen, vor allem zur Expression bestimmter, ernaehrungsphysiologisch wichtiger Proteine in Pflanzensamen, speziell von Leguminosen oder Getreiden. Dazu wird die Verwendung einer Expressionskassette vorgesehen, die mehrteilig aus einem Vektorplasmid und einer Deletionsmutante besteht und einen unikalen Restriktionsort zur Einligierung einer beliebigen, vor allem aber proteinogenen DNS-Sequenz aufweist, die nach der mit bekannten Mitteln durchgefuehrten Transformation exprimiert wird. FigurThe invention relates to the field of transformation of foreign genes into plants, especially for the expression of certain, nutritionally important proteins in plant seeds, especially of legumes or cereals. For this purpose, the use of an expression cassette is provided, which consists of several parts of a vector plasmid and a deletion mutant and a unique restriction site for Einligierung any, but especially proteinogenic DNA sequence which is expressed according to the transformation carried out by known means. figure

Description

Hierzu 1 Seite ZeichnungenFor this 1 page drawings

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einführen von beliebigen DNS-Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.The invention relates to a method for introducing any desired DNA sequences into the genome of higher plants according to the preamble of claim 1.

Characteristic of the known state of the art

Es ist seit langem bekannt, speziell für diesen Zweck isolierte Gene in höhere Pflanzen einzuschleusen, um auf diese Weise bestimmte, vererbbare Veränderungen im Genom dieser Pflanzen herbeizuführen. Eine Voraussetzung für die Expression der übertragenen Gene ist dabei, daß sie über eine pflanzenspezifische Promotorsequenz verfügen. So ist es beispielsweise bereits gelungen, bestimmte Gene in höheren Pflanzen zu exprimieren, um deren Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide zu verbessern. Man verwendet dazu sogenannte konstitutive Promotoren wie den Promotor des Nopalinsynthase-Gens/1/, den TR-Doppelpromotor/4/ oder den Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohl-Mosaikvirus/5/.It has long been known, especially for this purpose, to introduce isolated genes into higher plants in order to induce certain inheritable changes in the genome of these plants. A prerequisite for the expression of the transferred genes is that they have a plant-specific promoter sequence. For example, it has already been possible to express certain genes in higher plants in order to improve their resistance to antibiotics and herbicides. For this purpose, so-called constitutive promoters are used, such as the promoter of the nopaline synthase gene / 1 /, the TR double promoter / 4 / or the promoter of the 35S transcript of the cauliflower mosaic virus / 5 /.

Diese Promotoren sind in allen oder mindestens in vielen Geweben der manipulierten Pflanzen aktiv, und das ist nicht in jedem Fall erforderlich oder erwünscht. Es sind vielmehr häufig bessere Ergebnisse zu erwarten, wenn die Promotoren nur dort wirksam sind, wo das Pflanzengewebe tatsächlich verändert werden soll. Besonders vorteilhaft wäre es an sich auch, wenn der Vorgang in das günstigste Entwicklungsstadium der Pflanzen fiele. Die angegebenen bekannten Promotoren vermögen diesen Forderungen aber nicht gerecht zu werden. Aus diesem Grunde sind auch schon gewebe- und entwicklungsspezifische Promotoren isoliert worden, wobei man sich entweder sogenannter Promotorsuchplasmide oder des screening in Gen-Banken mit entsprechenden mRNS-Populationen als Hybridisierungsproben bedient; es konnten antheren-, ovarien-, bluten-, blätter-, laubblätter-, stengel-, wurzel- und samenspezifische Gene mit ihren zugehörigen Promotoren isoliert werden/2/. Davon sind vor allem die samenspezifischen Promotoren wegen der Bedeutung von Pflanzensamen für die Ernährung von großer Wichtigkeit. Als ergiebige Quelle für samenspezifische Regulationssequenzen stehen die Promotoren der von verschiedenen Pflanzenarten bereits Monierten und sequentiellen pflanzensamenproteinspezifischen Gene zur Verfügung/3; 6; 7/. Es fehlt jedoch bisher ein universell einsetzbares Übertragungsvehikel für Fremdgene zu deren pflanzensamenspezifischer Expression.These promoters are active in all or at least many tissues of the engineered plants, and this is not always necessary or desirable. On the contrary, better results are often to be expected if the promoters are effective only where the plant tissue is actually to be changed. It would be particularly advantageous in itself, if the process fell into the most favorable developmental stage of the plants. However, the stated known promoters are not able to meet these requirements. For this reason, tissue and development-specific promoters have already been isolated, using either so-called promoter search plasmids or screening in gene banks with corresponding mRNA populations as hybridization probes; it was possible to isolate anther, ovary, bleed, leaves, leaves, stem, root and seed-specific genes with their associated promoters / 2 /. Of these, especially the seed-specific promoters are of great importance for the nutrition because of the importance of plant seeds. As a rich source of seed-specific regulatory sequences are the promoters of the already mapped by different plant species and sequential plant seed protein-specific genes available / 3; 6; 7 /. However, it lacks so far a universally applicable transmission vehicle for foreign genes to their plant seed specific expression.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, Gene in Pflanzensamen zur Expression zu bringen, deren Expressionsprodukte Proteine sind, welche als solche aus den Pflanzensamen zu gewinnen sind oder ihre physiologische Wirkung bei der ernährungsmäßigen Nutzung der Pflanzensamen entfalten.The invention aims to express genes in plant seeds whose expression products are proteins which are to be obtained as such from the plant seeds or develop their physiological action in the nutritional use of the plant seeds.

Explanation of the essence of the invention

Demzufolge hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, für Gene der eingangs näher bezeichneten Art, deren proteinkodierende und regulative DNS-Abschnitte durch Sequenzanalyse ermittelt worden sind, ein geeignetes Transportmittel für die Einschleusung in das Genom der Empfängerpflanzen mit nachfolgender samenspezifischer Expression bereitzustellen, das einfach herstell- und universell anwendbar ist.Accordingly, the invention has set itself the task for genes of the type described in the beginning, whose protein-coding and regulatory DNA sections have been determined by sequence analysis to provide a suitable transport means for introduction into the genome of the recipient plants with subsequent seed-specific expression, which is easy to manufacture - and universally applicable.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die proteinkodierenden DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig aus dem in einem Vektorplasmid befindlichen Gen herausgeschnitten werden, daß die regulativen DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig erhalten bleiben und unter Herbeiführung eines unikalen Restriktionsortes, der im Wirkungsbereich der regulativen DNS-Abschnitte liegt, zu einer Deletionsmutante vereinigt werden, daß die Deletionsmutante aus dem Vektorplasmid isoliert und in einen Pflanzen-Transformationsvektor so einligiert wird, daß der unikale Restriktionsort erhalten bleibt und eine Expressionskassette entsteht, in welcher der Pflanzen-Transformationsvektor die Transformation der gesamten Expressionskassette in höhere Pflanzen übernimmt, daß in den unikalen Restriktionsort der Expressionskassette eine beliebige DNS-Sequenz einligiert wird und daß die DNS-Sequenz in Pflanzensamen höherer Pflanzen exprimiert wird. Es ist zweckmäßig, daß die Expressionskassette auf der Basis eines Gens für ein Protein in Pflanzensamen, beispielsweise von Leguminosen oder Getreiden, konstruiert wird, welches aus einer Genbank selektiert wird, wobei das Gen, welches für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein Legumin/6/kodiert, aus einer Genbank der Ackerbohne selektiert wird. Es ist auch möglich, daß das Gen, welches für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein Vicilin (Anlage 1) kodiert, aus einerAccording to the invention, this object is achieved in that the protein-encoding DNA sections are completely or almost completely excised from the gene located in a vector plasmid, that the regulatory DNA sections are completely or almost completely preserved and to achieve a unique restriction site, in the range of regulatory DNA segments, are combined into a deletion mutant such that the deletion mutant is isolated from the vector plasmid and ligated into a plant transformation vector such that the unique restriction site is conserved to yield an expression cassette in which the plant transformation vector transforms the whole Expression cassette in higher plants takes over that any DNA sequence is ligated into the unique restriction site of the expression cassette and that the DNA sequence is expressed in plant seeds of higher plants. It is convenient that the expression cassette is constructed on the basis of a gene for a protein in plant seeds, for example of legumes or cereals, which is selected from a gene bank, the gene coding for the protein stored in plant seed legumin / 6 / , is selected from a genebank of field bean. It is also possible that the gene coding for the protein stored in plant seeds vicilin (Appendix 1), from a

Genbank der Ackerbohne selektiert wird, genauso wie das Gen, welches für das in Pflanzensamen exprimierte Protein USP (Anlage 2) kodiert. Es ist erforderlich, daß aus einer cDNS-Bank der Ackerbohne Klone mit spezifischen Inserts von Legumin-, Vicilin- oder USP-DNS selektiert und durch Sequenzierung deren cDNS-Nukleotidsequenzen ermittelt werden, und daß die genomische Sequenz eines Proteins mit der zugehörigen cDNS-Nukleotidsequenz verglichen und daraus bestimmt wird, wo sich die proteinkodierenden, die regulativen DNS-Abschnitte und wo sich Intronsequenzen befinden. Im einzelnen ist es dann zweckmäßig, daß das in dem Vektorplasmid vorliegende Gen an einem im proteinkodierenden DNS-Abschnitt gelegenen, unikalen Restriktionsort geschnitten wird, daß die beidseitig vom Restriktionsort gelegenen beiden Teile des proteinkodierenden DNS-Abschnittes entfernt, die beiden so entstandenen Enden des Gens stumpf gemacht und über Linker unter Wiederherstellung eines unikalen Restriktionsortes rezirkularisiert werden. Es ist denkbar, daß die beidseitig vom unikalen Restriktionsort gesetzte Deletion den gesamten proteinkodierenden DNS-Abschnittdes Gens erfaßt, aber günstiger, wenn dies ausschließlich der Signalpeptidsequenz und der durch die Signalpeptidase erkennbaren Proteinstruktur erfolgt, und wenn die Deletion die Signale zum intra- und extrazellulären Transport der Proteine nicht berührt. Es ist auch vorteilhaft, wenn die im Vektorplasmid vorliegende Deletionsmutante mittels Restriktasen gewonnen und in den durch kompatible Restriktasen . geöffneten Pflanzen-Transformationsvektor unter Erhalt der Expressionskassette so einligiert wird, daß der 3'seitig vom Promotor des Gens gelegene unikale Restriktionsort zur Einligierung der DNS-Sequenz erhalten bleibt. Es ist möglich, daß eine DNS-Sequenz, die für ein Protein mit physiologischer Wirkung im menschlichen Organismus kodiert, aus einer cDNS-Bank selektiert wird bzw. aus dieser cDNS-Bank ein Klon selektiert wird, der die vollständige doppelsträngige cDNS-Kopie der mRNS des menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivators enthält. Es ist schließlich möglich, daß die DNS-Sequenz des gesamten proteinkodierenden DNS-Abschnittes mittels Restriktasen gewonnen wird und daß die proteinkodierende DNS-Sequenz des menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivators in den mittels Restriktasen geöffneten unikalen Restriktionsort der Expressionskassette einligiert wird und mit dieser Konstruktion höhere Pflanzen transformiert werden. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren werden beliebige, vor allem proteinkodierende DNS-Sequenzen durch Überführung in eine Expressionskassette in den Zustand der direkten Transformierbarkeit in das Genom höherer Pflanzen versetzt. Ihre Expression erfolgt bevorzugt im Zellgewebe von Pflanzensamen. Die Vielfalt der verfahrensgemäß herstellbaren Expressionskassetten erlaubt eine Wahl nach dem Kriterium des gewünschten intra-oder extrazellulären Ortes der Lokalisation derexprimierten Proteine,Genebank of field bean is selected, as well as the gene encoding the expressed in plant seeds protein USP (Appendix 2). It is necessary that clones from a cDNA bank of the field bean be selected with specific inserts of legumin, vicilin or USP DNA and identified by sequencing their cDNA nucleotide sequences, and that the genomic sequence of a protein with the associated cDNA nucleotide sequence and from where it is determined where the protein coding, the regulatory DNA sections and where intron sequences are located. Specifically, it is then appropriate that the gene present in the vector plasmid is cut at a unique restriction site located in the protein-encoding DNA segment such that the two parts of the protein-encoding DNA segment located on both sides of the restriction site remove the two ends of the gene thus formed dulled and recircularized via linkers to restore a unique restriction site. It is conceivable that the deletion set on both sides by the unique restriction site covers the entire protein-coding DNA segment of the gene, but more favorably if this is exclusively due to the signal peptide sequence and the protein structure recognizable by the signal peptidase, and if the deletion comprises the signals for intracellular and extracellular transport the proteins are not touched. It is also advantageous if the deletion mutant present in the vector plasmid is obtained by means of restrictases and into the compatible restrictases. opened plant transformation vector to obtain the expression cassette is ligated so that the 3'seitig located by the promoter of the gene unique restriction site for the ligation of the DNA sequence is maintained. It is possible that a DNA sequence encoding a protein having physiological activity in the human organism is selected from a cDNA library, or a clone is selected from that cDNA library which contains the complete double-stranded cDNA copy of the mRNA of the human tissue plasminogen activator. Finally, it is possible that the DNA sequence of the entire protein-coding DNA segment is obtained by means of restrictases, and that the protein-coding DNA sequence of the human tissue plasminogen activator is ligated into the restriction-opened, unrestricted restriction site of the expression cassette and higher in this construction Plants are transformed. According to the method of the invention any, especially protein-coding DNA sequences are transferred by conversion into an expression cassette in the state of direct transformability into the genome of higher plants. Their expression preferably takes place in the cell tissue of plant seeds. The variety of expression cassettes that can be prepared according to the method allows a choice according to the criterion of the desired intra- or extracellular location of the localization of the expressed proteins,

embodiment

Die Erfindung wird nachstehend — zum Teil an Hand einer Zeichnung — an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Dabei werden drei Varianten der Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette dargestellt und auf der einzigen Figur der Zeichnung verdeutlicht.The invention will be explained below - in part with reference to a drawing - to an exemplary embodiment. Three variants of the preparation of an expression cassette according to the invention are shown and illustrated on the single figure of the drawing.

a) Konstruktion einer Expressionskassette für das Samenprotein USPa) Construction of an expression cassette for the seed protein USP

Das mit USP bezeichnete ,unbekannte' Samenprotein USP hat ein Molekulargewicht von 30 kD. Seine Funktion konnte noch nicht ermitteltwerden.USP-kodierendemRNS hat einen Anteil von 80%am poly-AtRNS-Gehalt in frühen Stadien sich entwickelnder Samen der Ackerbohne/8/. Durch Translation hybridselektierter mRNS werden USP-spezifische cDNS-Klone identifiziert. Einige dieser cDNS-Klone werden sequentiell und als spezifische Hybridisierungsprobe für die Isolierung entsprechender genomischer Klone aus einer Genbank benutzt/9/. Ein etwa 3,5kb großes Pst-I-Fragment eines genomischen Klones λ Vf 30.1 wird im Sequenzierungsvektor H13 mp 18 und mittels Sanger-Technik/10/ sequentiell. Durch Vergleich der cDNS-Nukleotidsequenzen mit der genomischen Sequenz können nun Promotorbereich, proteinkodierende und regulative DNS-Abschnitte sowie Intronsequenzen bestimmt werden (Anlage 2). Die Klonierung des 3,5 kb großen Pst-I-Fragmentes in einem Vektorplasmid pUC 18 ergibt das für die Konstruktion einer Expressionskassette verwendbare Plasmid pUC 18/Pst30.1 (Fig.). Die in diesem Plasmid jeweils unikalen Restriktionsorte Bstxl am Übergang vom proteinkodierenden zum regulativen DNS-Abschnitt und Hind IM (in der Zeichnung teilweise verkürzend mit H III bezeichnet) im Polylinker des Plasmids werden gespalten. Das restliche Plasmid wird nach Erzeugung glatter Enden mit Hilfe von T₄-Polymerase und Einfügung von Bgl-Il-Linkern zirkularisiert/11/. Es entsteht ein mit pUC18/USPP bezeichnetes Plasmid (Fig.). Das USP-Promotorfragment liegt in diesem Plasmid als ein Bam-Hl-Bgl-Il-Fragment vor und wird in ein durch Bgl-Il-Spaltung geöffnetes Vektorplasmid pGA471/12/ kloniert. Dabei entsteht auf der einen Seite ein weder durch BgI Il noch durch BAM HI spaltbarer, mit BB bezeichneter Ort und auf der anderen Seite ein unikaler Bgl-Il-Ort. Das so konstruierte Plasmid wird mit 471/USPP bezeichnet und ist die Expressionskassette. Es handelt sich um einen für den Ti-Plasmid-vermittelten Gentransfer geeigneten Binärvektor, der in Agrobakterien-Stämme konjugiert und für die Transformation höherer Pflanzen benutzt wird. Der Einbau einer beliebigen DNS-Sequenz in den unikalen Bgl-Il-Ort der Expressionskassette stellt diese unter die Kontrolle des USP-Promotors. Es ist vorteilhaft, die einzubauende DNS-Sequenz mit GATC-Enden zu versehen, d.h., sie sollte als Bam-Hl-, BgI-II-, BcI-I-, San-3A-oder Mbo-I-Fragment vorliegen.The USP designated 'unknown' seed protein USP has a molecular weight of 30 kD. Its function has not yet been determined. USP-encoding RNA has an 80% share of the poly-AtRNS content in early stages of field bean development / 8 /. Translation of hybrid selected mRNAs identifies USP specific cDNA clones. Some of these cDNA clones are used sequentially and as a specific hybridization probe for the isolation of corresponding genomic clones from a library [9]. An approximately 3.5 kb Pst I fragment of a genomic clone λ Vf 30.1 becomes sequential in the sequencing vector H13 mp 18 and by Sanger technique / 10 /. By comparing the cDNA nucleotide sequences with the genomic sequence, promoter region, protein-coding and regulatory DNA segments and intron sequences can now be determined (Appendix 2). The cloning of the 3.5 kb Pst I fragment in a vector plasmid pUC 18 yields the plasmid pUC 18 / Pst30.1 which can be used for the construction of an expression cassette (FIG. The in each case unique restriction site Bstxl in this plasmid at the transition from the protein-coding to the regulatory DNA segment and Hind III (in the drawing partially shortened with H III) in the polylinker of the plasmid are cleaved. The remainder of the plasmid is circularized after generation of blunt ends with the aid of T ₄ polymerase and insertion of Bgl II linkers / 11 /. The result is a pUC18 / USPP designated plasmid (Fig.). The USP promoter fragment is present in this plasmid as a Bam HI Bgl II fragment and is cloned into a Bgl II cleaved vector plasmid pGA471 / 12 /. On the one hand, there is a location that can not be split by BgI Il or BAM HI, designated BB, and on the other side is a unique Bgl-Il location. The plasmid so constructed is designated 471 / USPP and is the expression cassette. It is a binary vector suitable for Ti plasmid-mediated gene transfer, which is conjugated to Agrobacterium strains and used for higher plant transformation. Incorporation of any DNA sequence into the unique Bgl II site of the expression cassette places it under the control of the USP promoter. It is advantageous to provide the DNA sequence to be incorporated with GATC ends, ie it should be present as a Bam HI, Bgl II, Bcl I, San 3A or Mbo I fragment.

b) Konstruktion einer Expressionskassette für das Samenprotein Leguminb) Construction of an expression cassette for the seed protein legumin

Ein Gen LEB4/13; 14/des Samenproteins Legumin liegt in einem Plasmid pUC 18/BgI II4 (Fig.) als ein 4,7kb großes BgI-II-Fragment vor. Dieses Plasmid wird am unikalen BAM-HI-Ort geöffnet und partiell mit der Exonuklease BaI 31 und anschließend zur Entfernung der 3'seitig vom ursprünglichen BAM-HI-Ort gelegenen proteinkodierenden Sequenzen mit Sal I verdaut. Nach der Erzeugung von glatten Enden wird das Plasmid unter Einfügung von BAM-HI-Linkem zirkularisiert. Aus der so entstandenen Plasmid-Schar mit unterschiedlicher Lage des Delektionspunktes wird ein Klon ρΔ4/12 ausgewählt. Der BAM-HI-Linker liegt bei diesem Klon unmittelbar vor dem AUG-Startkodon/13/, so daß die gesamte 5'seitig nichttranslatierte Sequenz erhalten bleibt. Im so erhalten Plasmid wird zusätzlich der unikale Sst-I-Ort im Polylinker durch Einfügung eines Bgl-Il-Linkers in einen Bgl-Il-Ort umgewandelt, wodurch das Promotorfragment als Bgl-Il-Hind-Ill-Fragment isoliert werden kann. Es entsteht ein als ρΔ4/12ΒΒ bezeichnetes Plasmid (Fig.). Das Bgl-Il-Hind-Ill-Promotorfragment wird nun in den Bgl-II-Hind-lll-geöffneten Binärvektor pGA471 wie unter a) beschrieben kloniert. Es entsteht so eine samenspezifische Expressionskassette mit einem unikalen BAM-HI-Ort auf der Basis des Legumin-Promotors analog a).A gene LEB4 / 13; 14 / of the seed protein legumin is present in a plasmid pUC 18 / Bgl II4 (Fig.) As a 4.7 kb Bgl II fragment. This plasmid is opened at the unique BAM-HI site and partially digested with the exonuclease BaI 31, and then digested with Sal I to remove the protein coding sequences 3 'to the original BAM HI site. After generation of blunt ends, the plasmid is circularized with the insertion of BAM HI linkers. A clone ρΔ4 / 12 is selected from the resulting plasmid family with different location of the point of deletion. The BAM HI linker is located in this clone just before the AUG start codon / 13 /, leaving the entire 5 'untranslated sequence intact. In addition, in the plasmid thus obtained, the unique Sst I site in the polylinker is converted to a Bgl II site by insertion of a Bgl II linker, whereby the promoter fragment can be isolated as a Bgl II Hind III fragment. The result is a designated as ρΔ4 / 12ΒΒ plasmid (Fig.). The Bgl II Hind III promoter fragment is now cloned into the Bgl II Hind III opened binary vector pGA471 as described under a). This results in a seed-specific expression cassette with a unique BAM HI site based on the legumin promoter analogously to a).

Aus der Plasmid-Schar kann ferner ein Klon ρΔ4/4 ausgewählt werden, in dessen BAM-HI-Linker drei Nukieotide hinter dem die Signalsequenz kodierenden Bereich geschnitten wird. Durch Umwandlung des unikalen Sst-I-Ortes in einen Bgl-Il-Ort durch Einfügung entsprechender Linker wird der Abschnitt Promotor/Signalsequenz/kodierender Teil als Bgl-Il-Hind-Ill-Fragment isolierbar und kann in den Bgl-ll-Hind-lll-geöffneten Binärvektor pGA471 einkloniert werden. Das so erhaltene Plasmid 471 /leg P ist die Expressionskassette. In ihr stehen die in den Bam-Hl-Ort einklonierten DNS-Sequenzen nicht nur unter der Kontrolle des Legumin-Promotors, sondern darüber hinaus die Genprödukte unter der Kontrolle der Legumin-Signalsequenz,.die eine entsprechende Kanalisierung in vakuoläre Kompartimente gewährleistetFrom the plasmid family a clone ρΔ4 / 4 can further be selected, in whose BAM-HI linker three nucleotides are cut behind the signal sequence coding region. By conversion of the unique Sst I site into a Bgl II site by insertion of appropriate linkers, the promoter / signal sequence / coding part section can be isolated as a Bgl II Hind III fragment and can be inserted into the Bgl II HindIII fragment. lll-opened binary vector pGA471. The plasmid 471 / leg P thus obtained is the expression cassette. In it, the DNA sequences cloned into the Bam Hl site are not only under the control of the legumin promoter, but also the gene products under the control of the legumin signal sequence, which ensures a corresponding channeling into vacuolar compartments

c) Konstruktion einer Expressionskassette für das Samenprotein Vicilinc) Construction of an expression cassette for the seed protein vicilin

Vicilin ist eines der beiden wichtigsten Reserveproteine inden Samen der Ackerbohne. Über isolierte poly A⁺-RNS aus frühen bis mittleren Reifestadien dieser Samen wird doppelsträngige DNS synthetisiert und eine cDNS-Bank eingerichtet, wobei vicilinspezifische Klone mittels Hybridisierungsselektion und in-vitro-Translation der mRNS identifiziert werden/13/. Diese Klone dienen wie oben als Hybridisierungsprobe für die Isolierung entsprechender genomischer Klone. Ein etwa 3,2kb großes Eco-Rl-Fragment wird in einem Sequenzierungs-Vektor M13 mp 18 kloniert und sequentiert/11/. Durch Vergleich mit cDNS-Sequenzen/9/ werden proteinkodierende von regulativen DNS-Abschnitten unterscheiden. Das in ein Plasmid pUC9 umklonierte, 3,2kb große genomische Eco-Rl-Fragment ergibt das Plasmid pUC9/Vid.1 (Fig.). Durch Verdauung mit Xba I wird der Teil des Genes entfernt, der 3'seitig von der Spaltungsstelle der Signalsequenz liegt. Durch Einligieren eines Bgl-Il-Linkers wird das Plasmid zirkularisiert zu dem Plasmid pUC9/VicP-S (Fig.). Der Promotorteil des Vicilin-Genes einschließlich des für die Signalsequenz kodierenden Bereiches wird durch Eco-Rl-Bgl-Il-Verdauung isoliert und in den Eco-RI-Bgl-ll-geöffneten Binärvektor pGA 471 einligiert: es entsteht als Expressionskassette das Plasmid 471/VicP-S (Fig.). Beim Einbau einer beliebigen DNS-Sequenz in den unikalen Bgl-Il-Ort dieses Plasmids steht diese in transgenischen Pflanzen unter der Kontrolle des Vicilin-Promotors und das Genprodukt unter Kanalisierungskontrolle der Vicilin-Signalsequenz.Vicilin is one of the two most important reserve proteins in the seeds of field bean. Double-stranded DNA is synthesized via isolated poly A ⁺ RNA from the early to middle stages of maturation of these seeds, and a cDNA library is set up, identifying vicilin-specific clones by hybridization selection and in vitro translation of the mRNA / 13 /. These clones serve as above as a hybridization probe for the isolation of corresponding genomic clones. An approximately 3.2 kb Eco RI fragment is cloned in a sequencing vector M13 mp 18 and sequenced / 11 /. By comparison with cDNA sequences / 9 /, protein coding will differ from regulatory DNA segments. The 3.2 kb genomic Eco-R1 fragment recloned into a plasmid pUC9 gives the plasmid pUC9 / Vid.1 (FIG. Digestion with Xba I removes that part of the gene that is 3 'to the cleavage site of the signal sequence. By ligating a Bgl II linker, the plasmid is circularized to the plasmid pUC9 / VicP-S (Fig.). The promoter part of the vicilin gene, including the region coding for the signal sequence, is isolated by Eco RI Bgl II digestion and ligated into the Eco RI Bgl II open binary vector pGA 471: the expression plasmid 471 is produced as an expression cassette. VicP-S (Fig.). Upon incorporation of any DNA sequence into the unique Bgl II site of this plasmid, it is under control of the vicilin promoter in transgenic plants and the gene product is under channelization control of the vicilin signal sequence.

Literaturliterature

1 Herera-Estrella, L, A.Depicker, M. van Montagu, J. Schell, Nature (London) 303 (1983) 209-213.1 Herera-Estrella, L, A. Depicker, M. van Montagu, J. Schell, Nature (London) 303 (1983) 209-213.

2 Goldberg, R. B., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B314 (1986) 343-353.2 Goldberg, R.B., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B314 (1986) 343-353.

3 Croy, R. R. D., J. A. Gatehouse (1985) Genetic Engineering of Seed Proteins: current and potential applications, in: Plant Genetic Engineering, ed. J. H. Dodds, Cambridge University Press.3 Croy, R.R.D., J.A. Gatehouse (1985) Genetic Engineering of Seed Proteins: in Plant Genetic Engineering, ed. J.H. Dodds, Cambridge University Press.

4 Veiten, J., L.Veiten, R.Hani, J.Schull, EMBOJ.3 (1984) 2723-2730.4 Veiten, J., L. Veiten, R.Hani, J. Schull, EMBOJ.3 (1984) 2723-2730.

5 Koziel, M. G., T. L.Adams, M.A. Hazlet, D. Damm, J. Miller, D. Dahlbeck, S. Jayne, B. J.SIaskawicz, J. MoI. Appl. Genet. 2 (1984) 549-562.5 Koziel, M.G., T.L. Adams, M.A. Hazlet, D. Damm, J. Miller, D. Dahlbeck, S. Jayne, B. J. Saskawicz, J. MoI. Appl. Genet. 2 (1984) 549-562.

6 Casey, R., C. Domoney, N. Ellis (1986) Legume storage proteins and their genes, Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biol., im Druck.6 Casey, R., C. Domoney, N. Ellis (1986) Legume storage proteins and their genes, Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biol., In press.

7 Müntz, K., C. Horstmann, B.Schlesier, Biol. ZbI. 105 (1986) 107-120.7 Müntz, K., C. Horstmann, B. Schlesier, Biol. ZbI. 105 (1986) 107-120.

8 Bassüner, R., R. Mameuffel, K. Müntz, P. Püchel, P. Schmidt, und E.Weber, Biochem. Physiol. Pflanzen 178 (1983) 665-684.8 Bassüner, R., R. Mameuffel, K. Müntz, P. Püchel, P. Schmidt, and E.Weber, Biochem. Physiol. Plants 178 (1983) 665-684.

9 Patentschrift DD 221756.9 Patent DD 221756.

10 Sanger, F., S. Nicklen, A. R. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74 (1977) 5463.10 Sanger, F., S. Nicklen, A.R. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74 (1977) 5463.

11 Maniatis, T, E. F. Fritsch und J. Sambrock, Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982).11 Maniatis, T, E.F. Fritsch and J. Sambrock, Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982).

12 An, G., B.D.Watson, S.Stachel, M.P.Gordon, E.W.Nester, EMBO J.4(1985) 277-284.12 An, G., B. D. Watson, S.Stachel, M. P. Gordon, E. W. Nester, EMBO J.4 (1985) 277-284.

13 DD-Patentschrift240911.13 DD Patent 240911.

14 Wobus, U.H.Bäumlein, R.Bassüner, U.Heim, R.Jung, K.Müntz, G.Saalbach und W.Wescheke, FEBS Lett. 201 (1986)74-80.14 Wobus, U.H.Bäumlein, R.Bassüner, U. Heim, R. Jung, K. Müntz, G. Salbach and W. Weeschke, FEBS Lett. 201 (1986) 74-80.

Claims

A method for introducing any DNA sequences into the genome of higher plants, preferably proteinogenic DNA sequences for expression in plant seeds, wherein

- First, a complete, such as plant seed protein-specific gene is isolated and

- then the protein-coding and regulatory DNA sections are determined by sequence analysis,

characterized in that

The protein-coding DNA sections are completely or almost completely excised from the gene located in a vector plasmid,

The regulatory DNA segments are completely or almost completely conserved and are combined to form a deletion mutant, resulting in a unique restriction site which lies within the regulatory range of the DNA regulatory regions,

The deletion mutant is isolated from the vector plasmid and ligated into a plant transformation vector in such a way that the unique restriction site is retained and an expression cassette is produced in which the plant transformation vector undertakes the transformation of the entire expression cassette into higher plants,

- In the unique restriction site of the expression cassette any DNA sequence is ligated and

- The DNA sequence is expressed in plant seeds of higher plants.

2. The method according to claim 1, characterized in that the expression cassette is constructed on the basis of a gene for a protein in plant seeds, such as legumes or cereals, which is selected from a gene bank.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the gene which codes for the protein stored in plant seeds legumin is selected from a genebank of field bean.

4. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the gene which codes for the stored in plant seeds protein Vicilin, is selected from a gene bank of field bean.

5. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the gene which codes for expressed in plant seed protein USP, is selected from a gene bank of field bean.

6. The method according to claim 1, characterized in that selected from a cDNS bank of the field bean clones with specific inserts of legumin, vicilin or USP DNA and determined by sequencing their cDNA nucleotide sequences.

7. The method according to claim 1 and 2, one of claims 3 to 5, characterized in that the genomic sequence of a protein with the associated cDNA nucleotide sequence is compared and determined from where the protein-coding, the regulatory DNA sections and where Intron sequences are located.

8. The method according to claim 1, characterized in that the gene present in the vector plasmid is cut at a located in the protein-encoding DNA section unical restriction site, that removes both sides of the restriction site located two parts of the protein-encoding DNA segment, the two resulting ends of the gene are dulled and recircularized via linkers to restore a unique restriction site.

9. The method according to claim 1 and 8, characterized in that the deletions set on both sides of the unique restriction site detects the entire protein-encoding DNA portion of the gene.

10. The method according to claim 1 and 8, characterized in that the deleted on both sides of the unique restriction site deletion relates to the protein-encoding DNA section excluding the signal peptide sequence and recognizable by the signal peptidase protein structure.

11. The method according to claim 1,8 and 10, characterized in that the deletion does not affect the signals for intracellular and extracellular transport of the proteins.

12. The method according to claim 1 and 8, characterized in that the deletion mutant present in the vector plasmid is obtained by means of Restriktasen and ligated in the open by compatible Restriktasen plant transformation vector to obtain the expression cassette so that the 3'seitig of the promoter of the gene located unique Restriction site for einligierung the DNA sequence is maintained.

13. The method according to claim 1, characterized in that a DNA sequence which codes for a protein having physiological activity in the human organism is selected from a cDNA library.

14. The method according to claim 1 and 13, characterized in that a clone is selected from a cDNA library containing the complete double-stranded cDNA copy of the mRNA of the human tissue plasminogen activator.

15. The method according to claim 1,13 and 14, characterized in that the DNA sequence of the entire protein-coding DNA section is obtained by means of restrictases.

16. The method according to claim 1,8 and 12 to 15, characterized in that the protein-encoding DNA sequence of the human tissue plasminogen activator is ligated into the opened by means of Restriktasen unique restriction site of the expression cassette and transformed with this construction, higher plants.