DD261933A3

DD261933A3 - Biotechnical process for the production of invertase

Info

Publication number: DD261933A3
Authority: DD
Publication date: 1988-11-16

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Invertase aus aktiver Backhefe, das vorzugsweise in der Lebensmittelindustrie eingesetzt wird. Entsprechend der Zielstellung der Erfindung werden die Hefezellen einer aktiven Backhefesuspension mechanisch mit Hilfe einer Spindelmuehle aufgeschlossen. Die Abtrennung der Zelltruemmer von der invertasehaltigen Loesung erfolgt durch Separation. Mit Hilfe eines Schichtenfilters wird die Loesung einer Klaerfiltration unterzogen. Die Reinigung, Aufkonzentrierung und Entkeimung wird in einer kombinierten Ultra- und Mikrofiltrationsanlage vorgenommen, wobei zunaechst mittels der Ultrafiltration die Reinigung und Aufkonzentrierung im Kreislauf mit Hilfe eines Diafiltrationsschrittes erfolgt und erst danach die Entkeimung durch die Mikrofiltration vorgenommen wird.The invention relates to a biotechnical process for the production of invertase from active baker's yeast, which is preferably used in the food industry. According to the object of the invention, the yeast cells of an active yeast suspension are mechanically digested using a spindle mill. Separation of the cell trunks from the invertase-containing solution is carried out by separation. With the help of a layer filter, the solution is subjected to a Klaerfiltration. The cleaning, concentration and sterilization is carried out in a combined ultrafiltration and microfiltration plant, wherein initially by means of ultrafiltration, the purification and concentration in the circulation takes place by means of a diafiltration step and only then the sterilization by microfiltration is performed.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung bezieht sich auf ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung des Enzyms Invertase aus aktiver Backhefe, das vorzugsweise in der Lebensmittelindustrie eingesetzt wird.The invention relates to a biotechnical process for the preparation of the enzyme invertase from active baker's yeast, which is preferably used in the food industry.

Characteristic of the known state of the art

Es sind eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Invertase aus Hefen bekannt. Im wesentlichen sind die Verfahren durch folgende Arbeitsschritte gekennzeichnet:There are a variety of methods for producing invertase from yeasts known. In essence, the methods are characterized by the following steps:

— Aufschluß der Hefezellen zur Freisetzung der Invertase- Disruption of the yeast cells to release the invertase

— Trennung der Invertase von den Zellbestandteilen- Separation of the invertase from the cell components

— Konzentrierung und Reinigung der invertasehaltigen LösungConcentration and purification of the invertase-containing solution

— Stabilisierung der Invertase- stabilization of the invertase

So ist z.B. bekannt, die Zellzerstörung mittels organischer Lösungsmittel z.B. mitToluen durchzuführen. Nach Beendigung der Plasmolyse/Autolyse erfolgt eine Trennung der nicht gelösten Hefezellen z. B. durch Fiiterpressen. Nach einer entsprechenden pH-Wert-Einstellung des Autolysates erfolgt die Invertasegewinnung über eine mehrmals durchzuführende Acetonfällung. Nach weiteren Trenn- und Löseschritten wird die gewonnene Invertaselösung z. B. mittels Vakuumverdampfer von Lösungsmittelresten befreit und aufkonzentriert. Anschließend wird mit Glycerol stabilisiert (Waldschmidt—Leitz, E., und Balls, A. K., in Handbuch der Lebensmittelchemie Bd. ll/2.Teil, Springer Verlag Berlin 1935, S.734-738).For example, e.g. known, the cell destruction by means of organic solvents, e.g. to perform with Toluen. After completion of the plasmolysis / autolysis, a separation of the undissolved yeast cells z. B. by Fiiterpressen. After an appropriate pH adjustment of the autolysate, the invertase recovery takes place via an acetone precipitation to be carried out several times. After further separation and dissolution steps, the recovered invertase solution is z. B. freed of solvent residues by means of a vacuum evaporator and concentrated. It is then stabilized with glycerol (Waldschmidt-Leitz, E., and Balls, A.K., in Handbuch der Lebensmittelchemie Bd. Ll / Part 2, Springer Verlag Berlin 1935, pp. 734-738).

Die Nachteile dieses Verfahrens bestehen vor allem darin, daß mitunter Rückstände des giftigen Toluens in der Invertaselösung verbleiben, der Zellaufschluß langwierig ist, was die Gefahr der Verkeimung erhöht, und die erreichten Ausbeuten und Aktivitäten gering sind, wobei der Energieaufwand relativ hoch ist.The disadvantages of this method are mainly that sometimes residues of toxic toluene remain in the invertase solution, the cell digestion is tedious, which increases the risk of microbial contamination, and the yields and activities achieved are low, the energy consumption is relatively high.

Auch die zusätzliche Behandlung des durch den Toluenzusatz erhaltenen Autolysats mittels Papain sowie durch weitere Maßnahmen wie Adsorption an Aluminiumhydroxyd oder Calciumphosphat, Elution mit Laktatlösung, Wasser oder Saccharoselösung, Fällung mit Alkohol oder Pikratlösung, Dialyse und sonstige Reinigungsoperationen führen zu keiner wesentlichen Effektivierung des Verfahrens (Hartmeier, W., GORDIAN, 78,320-324 [1978]). Ein weiteres bekanntes Verfahren wurde in dem DD-PS 1401 beschrieben.The additional treatment of the obtained by the addition of toluene autolysate using papain and by other measures such as adsorption on aluminum hydroxide or calcium phosphate, elution with lactate, water or sucrose solution, precipitation with alcohol or picrate solution, dialysis and other cleaning operations do not lead to any significant effect of the process (Hartmeier , W., GORDIAN, 78, 320-324 [1978]). Another known method has been described in DD-PS 1401.

Nach der üblichen Hefezüchtung wird eine Wirkstoffanreicherung (Hexosidasen) in der Hefemasse vorgenommen. Es folgt eine Aufkonzentrierung durch Separation mit anschließendem Zusatz freisetzend wirkender Stoffe wie Grünmalz bzw. dessen diastatischen Wirkstoffe einschließlich Cytase.After the usual yeast breeding an active ingredient enrichment (hexosidases) is made in the yeast mass. This is followed by a concentration by separation with subsequent addition of releasing substances such as green malt or its diastatic agents including cytase.

Die Zellzerstörung erfolgt durch Ultraschalleinwirkung auf die rotierende Hefemasse. Nach der Freisetzung der Hefeinhaltsstoffe erfolgt die Trennung der Invertaselösung von den Zelltrümmern und sonstigen festen Bestandteilen durch Separation. Die Reinigung des Zellsaftes wird mit Hilfe von schwach saurem Austauscherharz vorgenommen.The cell destruction takes place by the action of ultrasound on the rotating yeast mass. After release of the yeast ingredients, the separation of the invertase solution from the cell debris and other solid components occurs by separation. The cleaning of the cell juice is carried out with the aid of weakly acidic exchange resin.

Der Nachteil dieses Verfahrens besteht vor allem darin, daß der hohe technisch-technologische Aufwand und die damit verbundene komplizierte Verfahrensführung sowie der hohe Energieaufwand und der relativ hohe Zeitaufwand zur Freisetzung der Hefeinhaltsstoffe verbunden mit der zu geringen Ausbeute bzw. erreichbaren Aktivität der gewonnenen Invertase es unrentabel machen.The disadvantage of this method is, above all, that the high technical and technological complexity and the associated complicated process control and the high energy consumption and the relatively high time required to release the Hefeihaltsstoffe associated with the low yield or achievable activity of the recovered invertase it unprofitable do.

Bekannt ist weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung von löslicher Invertase aus Hefe sowie in der DE-PS 2626626 beschrieben.Also known is a method for obtaining soluble invertase from yeast and described in DE-PS 2626626.

Dieses Verfahren ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß durch die Einwirkung von Cellulasen, Proteasen und Lipasen auf die Hefezellen sich die Plasmolyse und Autolyse vollzieht. Als Ausgangshefe wird sprühgetrocknete Hefe, die anschließend resuspendiert wird, eingesetzt. Nach erfolgter Plasmolyse/Autolyse erfolgt die Abtrennung der unlöslichen Zellfragmente und anschließend wird das Filtrat in Hefeextrakt und Invertase mittels Ultrafiltration getrennt. Danach erfolgt eine Stabilisierung bzw. Standardisierung der Invertase mittels Glycerol- oder Sorbitollösung. Auch bei diesem Verfahren zeigt sich, daß der Energieaufwand relativ hoch ist. Die Aufschlußzeiten sind ebenfalls nach wie vor hoch (8-2Oh), was zur Verkeimung und damit zu Aktivitätsverlusten führen kann. Außerdem besteht beim Einsatz der Sprühtrocknung der Hefe und der damit verbundenen hohen Temperaturführung (bis 24O⁰C) die Gefahr der partiellen Inaktivierung des Enzyms.This process is characterized essentially by the fact that the action of cellulases, proteases and lipases on the yeast cells results in plasmolysis and autolysis. The starting yeast used is spray-dried yeast, which is subsequently resuspended. After completion of the plasmolysis / autolysis, the separation of the insoluble cell fragments takes place and then the filtrate is separated into yeast extract and invertase by means of ultrafiltration. This is followed by stabilization or standardization of the invertase by means of glycerol or sorbitol solution. Also in this method shows that the energy consumption is relatively high. The digestion times are also still high (8-2Oh), which can lead to bacterial contamination and thus to loss of activity. In addition, there is the risk of partial inactivation of the enzyme when using the spray-drying of the yeast and the associated high temperature control (up to 24O ⁰ C).

In den DD-PS 110425 und 116135 werden Verfahren zur Gewinnung von Hefeextrakten, Hefeglycan, Hefeproteinisolate mit herabgesetztem Nucleinsäuregehalt beschrieben.DD-PS 110425 and 116135 describe methods for obtaining yeast extracts, yeast glycans, reduced-nucleic acid yeast protein isolates.

Die Hefezellen (Bier- oder Backhefe) werden danach in.bekannter Weise z. B. durch Hochdruckhomogenisieren, Zerreiben in einer Sand- oder Kolloidmühle, Zerkleinern mittels Schallwellen, wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen, lytische Enzyme und dergleichen aufgeschlossen. Es folgt eine Wärmebehandlung zwecks Abtrennung der Nucleinsäure vom Protein.The yeast cells (beer or baker's yeast) are then in.bekannte manner z. By high pressure homogenization, trituration in a sand or colloid mill, crushing by sonic waves, repeated freeze-thaw cycles, lytic enzymes, and the like. This is followed by a heat treatment to remove the nucleic acid from the protein.

Danach erfolgt eine nicht näher beschriebene Abtrennung der unlöslichen Proteinproduktfraktion von der löslichen Fraktion. Die Gewinnung des Hefeextraktes, Hefeglycans und Hefeproteinisolates mit herabgesetztem Nucleinsäuregehalt erfolgt durch Zentrifugieren, Vakuumkonzentration und Trocknen.This is followed by unspecified separation of the insoluble protein product fraction from the soluble fraction. Recovery of the yeast extract, yeast glycans and reduced protein nucleic acid nucleic acid isolate is accomplished by centrifugation, vacuum concentration and drying.

Diese Verfahren dienen in erster Linie der Gewinnung von Hefeproteinisolaten mit herabgesetztem Nucleinsäuregehalt, Hefeglycanen und Hefeextrakten.These methods are primarily for the recovery of low-nucleic acid yeast protein isolates, yeast glycans, and yeast extracts.

Die Verfahrensschritte ähneln im wesentlichen zwar denen, die bei der Invertasegewinnung angewandt werden, es wurden jedoch in den Erfindungen keine Hinweise für eine Übertragbarkeit der vorgeschlagenen Lehre auf die Gewinnung von Invertase gegeben.While the process steps are substantially similar to those used in invertase recovery, there has been no suggestion in the inventions of the transferability of the proposed teaching to the recovery of invertase.

Insbesondere das vorzugsweise vorgeschlagene Hochdruckhomogenisierungsverfahren zur Zellzertrümmerung und die vorgeschlagenen Wärmebehandlungsverfahren lassen Zweifel an einer effektiven Invertaseherstellung aufkommen.In particular, the preferably proposed high-pressure homogenization process for cell fragmentation and the proposed heat treatment processes cast doubt on effective invertase production.

In der DE-PS 2639129 werden Verfahren zur Abtrennung von Enzymen beschrieben, bei denen die Enzyme durch AufschließenIn DE-PS 2639129 processes for the separation of enzymes are described in which the enzymes by digestion

z. B. von Bierhefezellen und/oder Behandeln mit Detergentien solubilisiert werden und mit den Zelltrümmem bzw. Zellen zwischen verschiedenen Phasen eines wäßrigen Mehrphasensystems mit einem Gehalt an mindestens einem Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierte Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrrolidone und Polysaccharide gebildeten Gruppen und mindestens einem anorganischen Salz oder mit einem Gehalt an mindestens zwei Hochmolekularen verteilt wird und anschließend die Phasen voneinander z. B. durch Fällung, Ultrafiltration, Dialyse, Gelpermeation, Adsorbtion, Ionenaustausch oder Elektrophorese getrennt werden.z. B. of brewer's yeast cells and / or treatment with detergents and with the Zelltrümmem or cells between different phases of an aqueous multiphase system containing at least one high molecular weight from optionally substituted polyalcohols, polyethers, polyesters, polyvinylpyrrolidones and polysaccharides groups and at least an inorganic salt or containing at least two high molecular weight is distributed and then the phases from each other z. B. by precipitation, ultrafiltration, dialysis, gel permeation, adsorption, ion exchange or electrophoresis.

In der vorgeschlagenen Lehre wird zwar davon gesprochen, daß beliebige Enzyme gewonnen werden können, konkret wird aber nur auf Pullulanasen bzw. Maltasen bezug genommen. Die mit dem vorgeschlagenen Verfahren erreichten Ergebnisse hinsichtlich Aktivitäten und Ausbeuten im Verhältnis zum notwendigen Mittelaufwand können jedoch nicht befriedigen.In the proposed teaching is indeed spoken of that any enzymes can be obtained, concretely, however, referred only to pullulanases or maltases. However, the results achieved with the proposed method in terms of activities and yields in relation to the necessary funds can not satisfy.

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein energieökonomisches biotechnisches Verfahren zur Herstellung von hochaktiver und hochreiner Invertase aus Backhefe zu entwickeln, in dem keine organischen Lösungsmittel oder andere Chemikalien und/oder Enzyme verwendet und kurze Herstellungszeiten erreicht werden. Weiterhin soll das Verfahren durch den Einsatz entsprechender Ausrüstungen leicht beherrschbar und unkompliziert sein sowie kontinuierlich arbeiten können, wobei gleichzeitig eine hohe Ausbeute an konzentrierter Invertase erreicht werden soll und die anfallenden Abfall- bzw. Nebenprodukte weiter verarbeitet werden können.The object of the invention is to develop an energy-economical biotechnical process for the production of highly active and highly pure invertase from baker's yeast, in which no organic solvents or other chemicals and / or enzymes are used and short production times are achieved. Furthermore, the method should be easily manageable and uncomplicated by the use of appropriate equipment and be able to work continuously, at the same time a high yield of concentrated invertase to be achieved and the resulting waste or by-products can be further processed.

Explanation of the essence of the invention

Die Hefezellen einer aktiven Backhefesuspension mit einer Hefetrockensubstanz (HTS) von ca. 10% und einer Temperatur von 8-15°C werden in einer Spindelmühle kontinuierlich aufgebrochen, wobei die eingesetzten Mikroglaskugeln einen Durchmesser von 0,5-1,2 mm aufweisen und die Drehzahl der Rührwelle 2 500-4000 U/min beträgt. In einem nachfolgenden Separator erfolgt kontinuierlich die Grobtrennung zwischen Zelltrümmer und invertasehaltiger Lösung. Um Enzymausbeuteverluste zu vermeiden wird vor der Entschlammung der Zulauf der Suspension gestoppt und der Rotor ca. 5 min mit Wasser gespült, wobei der Schlammraum erst dann entleert wird, wenn am Produktauslauf des Separators klares Wasser austritt. Die anschließende kontinuierliche Klärfiltration der invertasehaltigen Lösung erfolgt über einen Schichtenfilter, wobei die Filterschichten eine Durchlässigkeit von 425-475 l/h · m² aufweisen. Die Klarseiten der Filterschichten werden dabei zusätzlich mit Filterpapier unterlegt, wobei die Filterschichten vor Beginn der Filtration ca. 20min gewässert werden. Die Druckdifferenz zwischen Filterein-und-ausgang darf während der Filtration nicht größer als 200-25OkPa sein.The yeast cells of an active yeast suspension with a yeast dry matter (HTS) of about 10% and a temperature of 8-15 ° C are broken up continuously in a spindle mill, wherein the glass microspheres used have a diameter of 0.5-1.2 mm and the Speed of the stirring shaft 2 is 500-4000 rpm. In a subsequent separator, the coarse separation between cell debris and invertase-containing solution takes place continuously. In order to avoid enzyme yield losses, the feed of the suspension is stopped before the desludging and the rotor is rinsed with water for about 5 minutes, the sludge space being emptied only when clear water emerges from the product outlet of the separator. The subsequent continuous clarification filtration of the invertase-containing solution takes place via a layer filter, wherein the filter layers have a permeability of 425-475 l / h · m ² . The clear sides of the filter layers are additionally underlaid with filter paper, wherein the filter layers are watered for about 20 minutes before the beginning of the filtration. The pressure difference between the filter inlet and outlet must not exceed 200-25OkPa during filtration.

Der Schichtenfilter ist so geschaltet, daß neben dem Filtrationsprozeß ein Kreislauf möglich ist, so daß die Entstehung eines Überdruckes, der zur Beschädigung der Filterplatten führen kann, vermieden wird. Der durch die Kreislauffahrweise verbleibende Rest der zu klärenden Invertaselösung wird erneut der Separation unterzogen.The layer filter is connected so that in addition to the filtration process a cycle is possible, so that the emergence of an overpressure, which can lead to damage of the filter plates, is avoided. The remainder of the invertase solution to be clarified by the circulation procedure is again subjected to separation.

Die Reinigung, Aufkonzentrierung und Entkeimung der Invertaselösung erfolgt über eine kombinierte Ultra- und Mikrofiltrationsanlage. Die Ultrafiltrationstrenneinheit ist zu der Mikrofiltrationstrenneinheit so angeordnet, daß zunächst die Lösung über die Ultrafiltrationstrenneinheit gereinigt und aufkonzentriert und danach zur Entkeimung über die Mikrofiltrationstrenneinheit geleitet wird.The cleaning, concentration and sterilization of the invertase solution takes place via a combined ultrafiltration and microfiltration system. The ultrafiltration separation unit is arranged to the microfiltration separation unit by first cleaning and concentrating the solution through the ultrafiltration separation unit and thereafter passing it through the microfiltration separation unit for sterilization.

Die Durchlässigkeit der in der Ultrafiltrationstrenneinheit eingesetzten UF Membranen beträgt 80-140 l/h · m², wobei der Eingangsdruck ca. 0,15-0,4 und der Ausgangsdruck ca. 0,1-0,3MPa beträgt. Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität der Flachmembranen werden zwischen Membranen und Filterableitplatten Stützgewebe, beispielsweise Vliesmaterial eingesetzt.The permeability of the UF membranes used in the ultrafiltration separation unit is 80-140 l / h · m ^2, wherein the input pressure is about 0.15-0.4 and the output pressure is approximately 0,1-0,3MPa. To increase the mechanical stability of the flat membranes supportive fabric, such as nonwoven material are used between membranes and Filterableitplatten.

Die Invertaselösung wird durch die Ultrafiltrationstrenneinheit auf ca. Vio eingeengt. Zur weiteren Reinigung des Invertaselösungskonzentrates erfolgt eine zusätzliche Diafiltration über die Ultrafiltrationstrenneinheit. Das Konzentrat wird dabei im Verhältnis 1:1 mit Wasser verdünnt und solange im Kreislauf diafiltriert, bis das Ausgangsvolumen an Konzentrat wieder erreicht ist.The invertase solution is concentrated by the ultrafiltration separation unit to about Vio. For further purification of the invertase solution concentrate, additional diafiltration takes place via the ultrafiltration separation unit. The concentrate is diluted 1: 1 with water and diafiltered in the circulation until the starting volume of concentrate is reached again.

Nach dieser Ultra- und Diafiltration wird die gereinigte Invertasekonzentratlösung zur Abtrennung der in der Lösung enthaltenen denaturierten Proteine sowie Mikroorganismen über die Mikrofiltrationstrenneinheit geleitet. Der Porendurchmesser des eingesetzten Mikrofiltermaterials beträgt 0,2 μπι, wobei der Eingangsdruck 0,3 MPa nicht überschreiten soll. Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität des eingesetzten Filtermaterials wird, wie bei der Ultrafiltrationstrenneinheit beschrieben, ein Stützgewebe eingesetzt.After this ultrafiltration and diafiltration, the purified invertase concentrate solution is passed through the microfiltration separation unit to separate the denatured proteins and microorganisms contained in the solution. The pore diameter of the microfilter material used is 0.2 .mu.m, wherein the inlet pressure should not exceed 0.3 MPa. To increase the mechanical stability of the filter material used, as described in the ultrafiltration separation unit, a support fabric is used.

Mit der anschließenden, an sich bekannten, Stabilisierung wird die Lösung auf eine Aktivität von ca. 1 500 U · ml"¹ eingestellt und lagerfähig gemacht.With the subsequent stabilization, which is known per se, the solution is adjusted to an activity of about 1500 × ml ^-1 and stored.

Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Invertasepräparaten hoher spezifischer Aktivität (400-800 U/mg) für die, für analytische Zwecke, ein besonderes Interesse besteht, in dem die Diafiltration in der oben beschriebenen Weise 3—8mal wiederholt wird.Particularly suitable is the process of the invention for the preparation of invertase preparations of high specific activity (400-800 U / mg) for which, for analytical purposes, there is a particular interest in which the diafiltration is repeated 3-8 times in the manner described above.

Die nach der vorgenannten Verfahrensweise erreichte Ausbeute an glycerolstabilisierter Invertaselösung beträgt 75%, bezogen auf die eingesetzte aktive Backhefe.The yield of glycerol-stabilized invertase solution achieved by the aforementioned procedure is 75%, based on the active baker's yeast used.

Ausführungsbeispielembodiment

Mit Hilfe einer Skizze soll das Ausführungsbeispiel erläutert werden.With the help of a sketch, the embodiment will be explained.

120kg bei 2-4⁰C gelagerte aktive Backhefe (HTS 30-33%) wird mit 240I Wasser in einem Misch-und Temperierbehälter 1 angesetzt. Nach ca. 30 min entsteht eine homogene Hefesuspension mit einer HTS von 10—15%, die bei einer Temperatur zwischen 10-12⁰C gehalten wird.120kg stored at 2-4 ⁰ C active baker's yeast (HTS 30-33%) is set with 240I water in a mixing and tempering 1. After about 30 minutes, a homogeneous yeast suspension with a HTS of 10-15%, which is maintained at a temperature between 10-12 ⁰ C is formed.

Die gekühlte Suspension wird danach über eine Dosierpumpe 2 einer kontinuierlich arbeitenden Spindelmühle 3 zugeführt. Der Aufschluß der Hefezellen erfolgt dabei in einem wassergekühlten ca. 3-l-Mahltopf, der mit ca. 2400g Mikroglaskugeln von 0,8 bis 1 mm gefüllt ist. Die Drehzahl der Rührwelle beträgt ca. 3000 U/min und der Suspensionsdurchsatz 16 l/h. Die aufgeschlossene Hefesuspension läuft über den oberen Auslauf des Mahltopfes in einen Misch- und Temperierbehälter 4. Über eine Dosierpumpe 5 wird die Suspension einem Separator 6 zugeführt. Hier wird der überwiegende Teil der Zelltrümmer von der invertasehaltigen Lösung abgetrennt. Aus dem Produktablauf des Separators 6 läuft die von den Zelltrümmern weitgehend befreite Phase in einen Zwischenbehälter 7. Die Zulaufgeschwindigkeit der zu separierenden Suspensionen beträgt ca. 50 l/h. Der Separator 6 ist dabei jeweils nach ca. 0,75h zu entschlammen. Um größere Enzymausbeuteverluste zu vermeiden, wird vor der Entschlammung der Zulauf der Hefesuspension gestoppt und der Rotor solange mit Wasser gespült, bis am Produktauslauf klares Wasser austritt.The cooled suspension is then fed via a metering pump 2 to a continuously operating spindle mill 3. The digestion of the yeast cells is carried out in a water-cooled approximately 3-liter grinding pot, which is filled with about 2400 g of glass microspheres 0.8 to 1 mm. The speed of the stirrer shaft is about 3000 U / min and the slurry flow rate 16 l / h. The disrupted yeast suspension passes through the upper outlet of the grinding pot in a mixing and tempering 4. About a metering pump 5, the suspension is fed to a separator 6. Here, the vast majority of cell debris is separated from the invertase-containing solution. From the product flow of the separator 6, the phase substantially freed from the cell debris passes into an intermediate container 7. The feed rate of the suspensions to be separated is about 50 l / h. The separator 6 is in each case deslimed after about 0.75 h. In order to avoid larger enzyme yield losses, the feed of the yeast suspension is stopped before the desludging and the rotor is rinsed with water until clear water emerges at the product outlet.

Dann wird das Steuerwasser eingeschaltet und der Schlamm entleert.Then the control water is turned on and the sludge emptied.

Aus dem Zwischenbehälter 7 wird die invertasehaltige Lösung mit Hilfe einer Dosierpumpe 8 zu einem Schichtenfilter 9 zum Zwecke der Klärfiltration geführt.From the intermediate container 7, the invertase-containing solution is guided by means of a metering pump 8 to a layer filter 9 for the purpose of Klärfiltration.

Die Klärung erfolgt durch die Verwendung von Filterschichten vom Typ KP-10A(40 χ 40cm) mit einer Durchlässigkeit von ca.The clarification is carried out by using filter layers of type KP-10A (40 χ 40cm) with a permeability of approx.

Um die Filtratqualität zu erhöhen, wird die Klarseite der Filterschichten mit Filterpapier Niederschlag 291 (40 χ 40cm) unterlegt.To increase the filtrate quality, the clear side of the filter layers is backed with filter paper precipitation 291 (40 χ 40cm).

Die eingelegten Filterschichten werden vor Beginn der Filtration ca. 20min gewässert.The inserted filter layers are watered for about 20 minutes before starting the filtration.

Die Filtrationsgeschwindigkeit wird auf ca. 80-100 l/h eingestellt. Die max. Druckdifferenz zwischen Filterein- und -ausgang darf dabei nicht größer als 200 bzw. 250 kPa sein.The filtration rate is set to about 80-100 l / h. The max. The pressure difference between the filter inlet and outlet must not be greater than 200 or 250 kPa.

Der Schichtenfilter 9 ist dabei so geschaltet, daß neben dem Filtrationsprozeß ein Mediumkreislauf vorhanden ist, so daß die Entstehung eines Überdruckes, der zum vorzeitigen Zerstören des Filtermaterials führen kann, vermieden wird.The layer filter 9 is connected so that in addition to the filtration process, a medium circuit is present, so that the emergence of an overpressure, which can lead to premature destruction of the filter material, is avoided.

Der durch die Kreislauffahrweise verbleibende Rückstand der zu klärenden, invertasehaltigen Lösung wird nach der abgeschlossenen Klärfiltration erneut dem Separator 6 zugeführt.The residue left behind by the circulation procedure of the invertase-containing solution to be clarified is fed again to the separator 6 after the completed clarification filtration.

Die weiter zu verarbeitende Lösung wird in einen Zwischenbehälter 10 überführt. Die weitere Reinigung, Auf konzentrierung und Entkeimung der invertasehaltigen Lösung erfolgt in einer speziellen, kombinierten Ultra-Mikrofiltrationsanlage 11.The solution to be processed is transferred to an intermediate container 10. Further purification, concentration and sterilization of the invertase-containing solution takes place in a special, combined ultra-microfiltration system 11.

Das auf einem Gestell befindliche Plattenpaket wird mit 5 m² Filterfläche für die Ultrafiltration und 4m² für die Mikrofiltration benutzt. Für die Ultrafiltrationstrenneinheit 12 werden UF-Membranen mit einer Durchlässigkeit von 80-140 l/h · m² vom Typ CAM-UF-120-CP (VEB Zellstoff- und Zellwollewerke Wittenberge) eingesetzt. Dieser Typ sichert eine Selektivität, bezogen auf Invertase von mehr als 99%. Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität wird zusätzlich zwischen Membran und Filterableitplatte ein Stützgewebe aus Vliesmaterial angeordnet.The plate pack on a rack is used with 5 m ² filter surface for ultrafiltration and 4m ² for microfiltration. For the ultrafiltration separation unit 12 UF membranes with a permeability of 80-140 l / h · m ^{2 of} the type CAM-UF-120-CP (VEB pulp and cellulose factory Wittenberge) are used. This type ensures selectivity to invertase greater than 99%. To increase the mechanical stability, a support fabric made of nonwoven material is additionally arranged between the membrane and Filterableitplatte.

Die Mikrofiltrationseinheit 13 ist mit Kernspurmikrofilter aus Polyester (ZfK AdW Rossendorf) mit einem Porendurchmesser von 0,2pm bespannt. Auch dieses Filtermaterial wird zur Erhöhung der Stabilität mit Vliesmaterial gestützt.The microfiltration unit 13 is covered with polyester core track microfilters (ZfK AdW Rossendorf) with a pore diameter of 0.2 μm. Also, this filter material is supported to increase the stability with nonwoven material.

Aus dem Zwischenbehälter 10 wird die invertasehaltige Lösung mit Hilfe einer Dosierpumpe 14 durch einen Doppelrohrkühler 15 in die Ultrafiltrationseinheit 12 gepumpt. Die Lösung wird nach dem Überströmungsprinzip über die Filterplatten geführt, wobei Moleküle mit einem Molgewicht größer als 150000 zurückgehalten werden.From the intermediate container 10, the invertase-containing solution is pumped by means of a metering pump 14 through a double-tube cooler 15 into the ultrafiltration unit 12. The solution is passed over the filter plates according to the overflow principle, whereby molecules having a molecular weight greater than 150,000 are retained.

Die Permeatablaufgeschwindigkeit liegt dabei bei ca. 80—1401/h bei einem Ausgangsdruck von 0,1-0,3MPa. Die Invertaseaktivität im Permeat liegt dabei unter 0,5%.The permeate discharge rate is approximately 80-1401 / h at an outlet pressure of 0.1-0.3 MPa. The invertase activity in the permeate is below 0.5%.

Die nach der Klärfiltration erhaltene Lösung wird durch die Ultrafiltration auf Vio des Volumens eingeengt. Das nach der Ultrafiltration erhaltene Konzentrat wird anschließend mit Wasser im Verhältnis 1:1 verdünnt und zum Zweck einer weiteren Reinigung im Kreislauf über die Ultrafiltrationstrenneinheit 12 diafiltriert, bis das Ausgangsvolumen des Konzentrates wieder erreicht ist.The solution obtained after the clarification filtration is concentrated by ultrafiltration to Vio of the volume. The concentrate obtained after the ultrafiltration is then diluted with water in the ratio 1: 1 and diafiltered over the ultrafiltration separation unit 12 for the purpose of further purification, until the starting volume of the concentrate has been reached again.

Durch die Blockierung des Ultrafiltrationskreislaufes wird das im Zwischenbehälter 10 befindliche ultra-bzw. diafiltrierte Konzentrat über eine Dosierpumpe 16 über den Kühler 15 zur Mikrofiltrationseinheit 13 befördert. Dort werden die im Konzentrat enthaltenen denaturierten Proteine sowie Mikroorganismen, die die Produktqualität beeinträchtigen, abgetrennt Die vorgenannte aktive Filterfläche wird auf einen Durchsatz von ca. 20 l/h eingestellt, wobei der Eingangsdruck nicht größer als 0,3MPa sein soll.By blocking the ultrafiltration circuit located in the intermediate container 10 is ultra or. Diafiltrierte concentrate via a metering pump 16 via the radiator 15 to the microfiltration unit 13 promoted. There, the denatured proteins contained in the concentrate as well as microorganisms, which affect the product quality, separated The above-mentioned active filter surface is set to a throughput of about 20 l / h, the input pressure should not be greater than 0.3MPa.

Die gereinigte, aufkonzentrierte und entkeimte Invertaselösung wird in einen Misch- und Temperierbehälter 17 eingebracht und dort mit Glycerol im Verhältnis 1:1 vermischt und damit stabilisiert. Die Ausbeute der stabilisierten Invertaselösung beträgt 90 kg auf eingesetzte aktive Backhefe).The purified, concentrated and sterilized invertase solution is introduced into a mixing and tempering tank 17 where it is mixed with glycerol in the ratio 1: 1 and thus stabilized. The yield of the stabilized invertase solution is 90 kg on active baker's yeast used).

Claims

Biotechnical process for the production of invertase from active yeast in the active baker's yeast, suspended with a yeast dry matter (HTS) of 30-33% with the aid of water to an HTS of about 10% and adjusted to a temperature of 10-12 ° C. , characterized in that the yeast cells of this suspension in a known per se spindle mill 3 by means of glass microspheres with a diameter of 0.5 to 1.2 mm and a Rührwellendrehzahl of 2 500-4000 U / min are continuously broken, then in a known separator 6 is an invertase-containing solution is obtained, being stopped before the desludging the feed of the suspension and the rotor is rinsed with water until clear water emerges at the product outlet, then the solution is subjected to a known Klärfiltration using a layer filter 9 , wherein the filter layers have a permeability of 425-475 l / h · m ² , the clear sides of the filter layers to are additionally underlaid with filter paper and prior to the Klärfiltration this filter layers are watered for about 20min with water, the pressure difference between the filter inlet and outlet during filtration is still greater than 200-25OkPa, the layer filter is switched so that in addition to the filtration process a Kreislauffahrweise is possible and the remainder of the invertase solution to be clarified is again subjected to the separation, then the solution of a combined ultrafiltration and microfiltration plant 11 is supplied so that first the solution passes through the ultrafiltration separation unit 12, subjected in a diafiltration circuit and then on the Microfiltration separation unit 13, wherein the permeability of the UF membranes used in the ultrafiltration separation unit 80-140 l / h · m ² , the inlet pressure 0.15-0.4 and the outlet pressure 0.1-0.3 MPa between membranes and Filterableitplatten Stützgewebe example If the nonwoven material is arranged, the solution is first concentrated by the ultrafiltration separation unit 12 to about Vio, then the concentrate is diluted 1: 1 with water and diafiltered in the circulation until the starting volume of concentrate is reached again, then the purified invertase concentrate solution the microfiltration separation unit 13 is passed, wherein the pore diameter of the inserted microfiltration material is 0.2 pm and the inlet pressure is not greater than 0.3 MPa and the filter material as in the ultrafiltration separation unit 12 is provided with a support fabric and then the Invertasekczentratlösung stabilized in a conventional manner , standardized and made-up.

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