DD255749A1

DD255749A1 - METHOD FOR OBTAINING INDOILAL CALOIDS FROM MUSCLES OF FUNGI AND MEDIUM MEDIUM HEREFUER

Info

Publication number: DD255749A1
Application number: DD29599486A
Authority: DD
Inventors: Jochen Gartz
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1986-11-06
Filing date: 1986-11-06
Publication date: 1988-04-13

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobielle Gewinnung von Indolalkaloiden. Sie ist anwendbar zur Darstellung von Modellsubstanzen fuer die experimentelle psychiatrische Forschung und fuer neurobiologische Untersuchungen. Die Erfindung besteht in der Verwendung eines neuen Naehrmediums, welches synthetisch zusammengesetzt wird und Glukose, Glycin, Ammoniumsuccinat, Phosphate, Spurenelemente und Wuchsstoffe enthaelt. Die Oberflaechenkultivierung erfolgt bei p H 3-7 und 16-32C, die Extraktion und Isolierung der Wirkstoffe nach bekannter Weise. Die erfindungsgemaesse Loesung fuehrt zu hoher und konstanter Ausbeute an Indolderivaten.The invention relates to the microbial recovery of indole alkaloids. It is applicable to the presentation of model substances for experimental psychiatric research and for neurobiological investigations. The invention consists in the use of a new nutrient medium, which is synthetically composed and contains glucose, glycine, ammonium succinate, phosphates, trace elements and growth substances. The surface cultivation is carried out at p H 3-7 and 16-32C, the extraction and isolation of the active ingredients in a known manner. The solution according to the invention leads to a high and constant yield of indole derivatives.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Indolalkaloiden aus der Mycelien höherer Pilze. Sie kann in der pharmazeutischen Industrie zur Herstellung von Wirkstoffen für Psychatrie und Neurobiologie angewendet werden.The invention relates to a method for obtaining indole alkaloids from the mycelia of higher fungi. It can be used in the pharmaceutical industry to manufacture drugs for psychiatry and neurobiology.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Es ist bekannt, daß verschiedene höhere Pilzarten der Gattungen Psilocybe, Pluteus, Inocybe und Panaeolus neurotrope Indolalkaloide wie Psilocybin und Psilocin in den Fruchtkörpern bilden.It is known that various higher species of fungi of the genera Psilocybe, Pluteus, Inocybe and Panaeolus form neurotropic indole alkaloids such as psilocybin and psilocin in the fruiting bodies.

Ein Verfahren (DE 1087321) beschreibt die Gewinnung der Wirkstoffe auch aus Substratmycel und Sklerotien, die durch Anzucht von Pilzarten der Gattungen Psilocybe und Stropharia in Oberflächenkulturen unter Einsatz von Malzextraktlösungen von 4 bis 8% mit Zusatz verschiedener Mineralsalze gezüchtet worden sind.A method (DE 1087321) describes the extraction of the active ingredients also from substrate mycelium and sclerotia, which have been grown by culturing mushroom species of the genera Psilocybe and Stropharia in surface cultures using malt extract solutions of 4 to 8% with addition of various mineral salts.

Der Nachteil des Verfahrens ist, daß unter Verwendung dieses natürlichen, komplexen Substrates nur ein Gehalt der.The disadvantage of the method is that using this natural, complex substrate only a content of.

Trockenmycelien an Psilocybin von 0,28% maximal resultiert. Weiterhin sind durch die von Charge zu Charge schwankende Zusammensetzung dieses Substrates auch stark schwankende Mengen an Indolalkaloiden nachweisbar, so daß oft nur Spuren an Alkaloiden in den Mycelien festzustellen sind.Dry mycelia to psilocybin of 0.28% maximum results. Furthermore, the batch-to-batch composition of this substrate also makes it possible to detect strongly fluctuating amounts of indole alkaloids, so that often only traces of alkaloids are found in the mycelia.

Bei diesen Verfahren muß auch bei konstanten Temperaturen fermentiert werden, was zusätzliche apparative Aufwendungen erfordert.In these methods must be fermented even at constant temperatures, which requires additional equipment expenses.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Indolderivaten aus Pilzmycelien mit hoher und weitgehendst konstanter Ausbeute, welches nicht an konstante Arbeitstemperaturen gebunden ist.The aim of the invention is a process for the production of indole derivatives from mushroom mycelia with high and largely constant yield, which is not bound to constant operating temperatures.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein definiertes Substrat als Nährmedium für die Oberflächenkultur höherer Pilze zu entwickeln und einzusetzen.The invention has for its object to develop a defined substrate as a nutrient medium for the surface culture of higher fungi and use.

Erfindungsgemäß erfolgt die Kultivierung der betreffenden Pilze auf einem synthetischen Nährmedium bei einem pH-Wert von 3-7 und einer Temperatur von 16-32^CC. Daran anschließend wird die Abtrennung und Trocknung der Mycelien, letzteres bei 20-50^cC unter Vakuum bzw. Normaldruck, vorgenommen.According to the invention, the cultivation of the fungi concerned on a synthetic nutrient medium at a pH of 3-7 and a temperature of 16-32 ^C C. Subsequently, the separation and drying of the mycelia, the latter at 20-50 ^c C under vacuum or Normal pressure, made.

Die Extraktion, chromatographische Isolierung und Reinigung erfolgt nach bekannten Methoden.The extraction, chromatographic isolation and purification are carried out by known methods.

Das synthetische Nährmedium besteht ausThe synthetic nutrient medium consists of

— Glucose und/oder Maltose als C-Quelle in Konzentration von 4-8%Glucose and / or maltose as C source in 4-8% concentration

— Glycin und Ammoniumsuccinat als N-Quelle im Verhältnis 9:1 in einer Gesamtkonzentration von 0,5-2%Glycine and ammonium succinate as N-source in the ratio 9: 1 in a total concentration of 0.5-2%

— löslichen Phosphaten in einer Konzentration von 0,01-0,3%Soluble phosphates in a concentration of 0.01-0.3%

— den Spurensalzen Mn, Mg, Fe, Zn, Cu, Mo in Form ihrer wasserlöslichen SalzeThe trace salts Mn, Mg, Fe, Zn, Cu, Mo in the form of their water-soluble salts

— Spuren von Thiamin und Hefeextrakt.- traces of thiamine and yeast extract.

-2- Z5b /4a-2- Z5b / 4a

Ein Zusatz von 0,2% Agar ermöglicht ein schnelles Ausbreiten der Pilzhyphen auf der Oberfläche. Man verfährt so, daß man eine feine Suspension von Mycelflocken zu der sterilisierten Nährlösung unter aseptischen Bedingungen in geeigneten Gefäßen wie z. B. Penicillinkolben oder Fernbachkolben gibt und die Lösungen bei Temperaturen zwischen 16 und 32⁰C 30 bis 50 Tage bebrüten läßt. Nach den Abfiltriern, Waschen der Mycelien mit Wasser, Trocknung bei 20 bis 50°C wird das Mycel nach bekannten Verfahren extrahiert und die Wirkstoffe mittels chromatographischer Methoden abgetrennt. Durch diese Arbeitsweise können vorteilhaft große Ausbeuten an Biomassen erhalten werden. Die resultierenden Mycelien haben einen hohen porzentualen Anteil an Indolalkaloiden akkumuliert, die Einhaltung einer konstanten Fermentationstemperatur ist nicht nötig. Durch die nachfolgenden Beispiele soll die Erfindung näher erläutert werden.An addition of 0.2% agar allows a rapid spread of the fungus hyphae on the surface. The procedure is such that a fine suspension of mycelium flakes to the sterilized nutrient solution under aseptic conditions in suitable vessels such. B. penicillin or Fernbachkolben and incubate the solutions at temperatures between 16 and 32 ⁰ C for 30 to 50 days. After filtering off, washing the mycelia with water, drying at 20 to 50 ° C, the mycelium is extracted by known methods and the active ingredients separated by means of chromatographic methods. By this procedure advantageously large yields of biomass can be obtained. The resulting mycelia have accumulated a high percentage of indole alkaloids, maintaining a constant fermentation temperature is not necessary. By the following examples, the invention will be explained in more detail.

example 1

Man legt von Basisdiosporen der subtropischen Art Psilocybe cubensis (Earle) Sing eine Primärkultur auf 6%igem Malzagar (Agar: 1,5%) an. Nach 3 Wochen wird aseptisch ein Myceistückvon ca. 2 χ 2cm entnommen und in einem 100ml sterilen Kolben, der 20g Sattelfüllkörper und 30 ml Wasser enthält, 10 min geschüttelt, wobei die Füllkörper das Mycel unter Bildung einer feinen Suspension aus Mycelflöckchen zermalmen.One sets of basic diospores of the subtropical species Psilocybe cubensis (Earle) Sing a primary culture on 6% malt agar (agar: 1.5%). After 3 weeks aseptically a myceis piece of about 2 χ 2cm is removed and shaken in a 100ml sterile flask containing 20g saddle filling and 30ml of water for 10 minutes, the fillers crushing the mycelium to form a fine suspension of mycelium flakes.

Je 5ml der Suspension werden zur Beimpfung von einem Liter Nährlösung verwendet, die folgende Zusammensetzung hatte und in 2,4-l-Penicillinkolben angesetzt wurde.Each 5 ml of the suspension is used to inoculate one liter of nutrient solution, which has the following composition and was prepared in 2.4-liter penicillin flasks.

Zusammensetzung der Nährlösung:Composition of the nutrient solution:

80g Glucose, 1 g Ammoniumsukzinat, 9g Clycin, 0,1 g KH₂PO₄,50mg Hefeextrakt, 3mg Thiaminhydrochlorid, 0,2g Agar-Agar, 71 mg Magnesiumsulfat, 0,5mg Zinksulfat, 0,8mg Mangan-(ll)-sulfat, 0,8mg Kupfersulfat, 0,25mg Natriummolybdat und 5mg Eisen-(ll)-sulfat.80g glucose, 1g ammonium succinate, 9g clycine, 0.1g KH ₂ PO ₄ , 50mg yeast extract, 3mg thiamine hydrochloride, 0.2g agar-agar, 71mg magnesium sulfate, 0.5mg zinc sulfate, 0.8mg manganese (II) sulphate, 0.8mg copper sulphate, 0.25mg sodium molybdate and 5mg ferrous sulphate.

Die Lösung wurde mit Wasser auf 11 verdünnt und bei 120⁰C 20min autoklaviert, wobei das Thiaminhydrochlorid als sterile Lösung erst danach zugesetzt wurde. Mit Salzsäure wurde auf pH 3,5 eingestellt, beimpft, innerhalb von 14 Tagen erfolgte bei 18 bis 26⁰C die Bildung einer geschlossenen Myceldecke mit Sklerotien. Nach 50 Tagen wurde über ein Dederonsieb filtriert, mit 500ml Wasser gewaschen, das Mycel 24Std. gefriergetrocknet und die Wirkstoffe extrahiert und isoliert.The solution was diluted with water to 11, and autoclaved at 120 ⁰ C 20 minutes, wherein the thiamine hydrochloride was added as a sterile solution afterwards. With hydrochloric acid was adjusted to pH 3.5, inoculated, within 14 days took place at 18 to 26 ⁰ C, the formation of a closed mycelium cover with sclerotia. After 50 days, was filtered through a Dederonsieb, washed with 500ml of water, the mycelium 24h. freeze-dried and the active ingredients extracted and isolated.

Ausbeute: 26g TrockenmycelYield: 26g dry mycelium

Psilocybingehalt: 1,10%Psilocybin content: 1.10%

Psilocingehalt: 0,2%Psilocin content: 0.2%

Ein Vergleichsansatz mit 6%iger Malzextraktlösung erbrachte 22g Trockenmycel mit einem Psilocybingehalt von 0,15% ohne Bildung des Psilocins.A comparison with 6% malt extract solution yielded 22g dry mycelium with a psilocybin content of 0.15% without formation of psilocin.

Example 2

Es wurde eine Kultur von Inocybe aeruginascens Babos, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde, angelegt. Der einheimische Pilz lieferte nach 40 Tagen Fermentation 22,4g Trockenmycel pro Liter mit einem Psilocybingehalt von 0,3%. Ein analoger Fermentationsansatz mit6%iger Malzextraktlösung ergab pro Liter 16g Trockenmycel mit einem Psilocybingehalt von 0,04%.A culture of Inocybe aeruginascens Babos was prepared as described in Example 1. The native mushroom delivered after 40 days of fermentation 22.4 g dry mycelium per liter with a Psilocybingehalt of 0.3%. An analogous fermentation batch with 6% malt extract solution gave per liter 16 g dry mycelium with a Psilocybingehalt of 0.04%.

Claims

A process for obtaining indole alkaloids from fungus mycelia obtained from surface cultures of psilocybin and psilocin-containing higher fungi, preferably of the genera Psilocybe, Inocybe, Panaeolus and Pluteus, characterized by

- The cultivation of mushroom mycelia on a synthetic nutrient medium

- The cultivation parameters pH 3-7, temperature 16-32 ° C and cultivation time 30 to 50 days

- subsequent separation and drying of the mycelia

- Extraction and chromatographic isolation of the active ingredients.

2. The method according to claim 1, characterized in that the drying of the mycelia at 20-50 ⁰ C under vacuum or atmospheric pressure.

.3. Nutrient medium for surface cultures of higher fungi which can be used for the production of indole derivatives, characterized by the composition

- glucose and / or maltose in concentrations of 4-8%

Glycine and ammonium succinate in the ratio 9: 1 in a total concentration of 0.5-2%

Soluble phosphates in a concentration of 0.01-0.03%

- The trace elements Mg "*, Fe ~ ⁺ , Zn ⁺⁺ , Mn ⁺⁺ , Cu ⁺ ^" and Mo "in the form of their water-soluble salts

- Thiamine and yeast extract in traces as needed

- 0.2% agar as needed.