DD254214A1

DD254214A1 - METHOD FOR DETERMINING THE PROCESS STATE IN FERMENTATION PROCESSES ACCORDING TO THE FED-BATCH PRINCIPLE UNDER SUBSTRATE LIMITATION

Info

Publication number: DD254214A1
Application number: DD27815685A
Authority: DD
Inventors: Erhard Wolleschensky; Claus Helmke; Arnulf Christner; Juergen Groh; Dietmar Beyer
Original assignee: Jenapharm Veb
Priority date: 1985-07-02
Filing date: 1985-07-02
Publication date: 1988-02-17

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Antibiotika mit einzelligen und mycelbildenden Mikroorganismen unter Verwendung von dimeren, oligomeren und polymeren C- und N-Substraten durch Dosierung. Ziel ist ein Verfahren, durch das die dem aktuellen Leistungsvermoegen unter realen Kultivierungsbedingungen entsprechende C-Dosierungsrate bei einer Antibiotikumfermentation bestimmt werden kann. Es wurde ein Dosierungsregime entwickelt, welches die Anwendung von dimeren und oligomeren C-Substraten fuer solche produktbildenden Mikroorganismen gestattet, die die chemisch unterschiedlichen C-Substratmonomeren nach enzymatischer Hydrolyse nicht simultan verwerten. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass als Substrat Saccharose in Verbindung mit einen Dosierungsregime, das eine Zustandserkennung und den periodisch wiederkehrenden, hochaktiven transient-Zustand des mikrobiellen Prozesses erlaubt, eingesetzt wird.The invention relates to the production of antibiotics with unicellular and mycelium-forming microorganisms using dimeric, oligomeric and polymeric C and N substrates by dosing. The aim is a method by which the C dosage rate corresponding to the current performance under real culture conditions can be determined in an antibiotic fermentation. A dosing regimen has been developed that allows the use of dimeric and oligomeric C-substrates for such product-forming microorganisms that do not utilize the chemically distinct C-substrate monomers after enzymatic hydrolysis. According to the invention, the object is achieved by using as the substrate sucrose in conjunction with a dosing regime which allows a state recognition and the periodically recurring, highly active transient state of the microbial process.

Description

Die Herstellung von Antibiotika kann bekanntlich durch Kultivierung von einzelligen oder mycelbildenden Mikroorganismen mit Nährmedien nach dem batch-, semi-batch-, fed-batch- und repeated fed-batch-Prinzip erfolgen (T. Yamane, S. Hirano, J. Ferment. Technol.55,156 bis 165,1977; Yoshida, F., Yamane', T., Nakamoto,K.-J., Biotech. Bioeng. XV, 257 bis 270,1973; R.C.Jones, R. M. Anthony, European J.Appl. Microbiol.4,87 bis 92,1977; Pirt, S. J. J. Appl.chem. Biotechnol.24,415 bis 427,1974). Die durch diese Prinzipien den Kulturen kontinuierlich oder diskontinuierlich zugeführten Substrate sind C- und/oder N-Substrate im monomeren bis polymeren Zustand.The production of antibiotics can be known by culturing unicellular or mycelium-forming microorganisms with nutrient media according to the batch, semi-batch, fed-batch and repeated fed-batch principle (T. Yamane, S. Hirano, J. Ferment. Technol.55.156-165.1977; Yoshida, F., Yamane ', T., Nakamoto, K.J., Biotech., Bioeng XV, 257-270, 1973; RC Jones, RM Anthony, European J. Appl. Microbiol, 4.87 to 92.1977; Pirt, SJJ Appl. Chem. Biotechnol., 24, 4-15, 427, 1974). The substrates which are continuously or discontinuously supplied to the cultures by these principles are C and / or N substrates in the monomeric to polymeric state.

Bei der Dosierung von monomeren, chemisch gleichartigen C-Substraten erfolgt das Zustandekommen eines quasi- steadystate-Zustandes der Kulturen und die Anpassung der Biomassekonzentration an den durch technische Lösungen realisierten Leistungseintrag der Fermentoren ungestört durch konkurrierende C-Monomere. Dieses läßt sich in gleicher Weise durch eine Substratdosierung mit technisch relevanten, dimeren bis polymeren C-Substraten erreichen, wenn diese vorher in die chemisch gleichartigen Monomeren durch chemische Hydrolyse oder durch den enzymatischen Aufschluß durch die Mikroorganismen überführt worden sind.In the metering of monomeric, chemically identical C substrates, the formation of a quasi-steadystate state of the cultures and the adaptation of the biomass concentration to the power input of the fermentors realized by technical solutions are undisturbed by competing C monomers. This can be achieved in the same way by a substrate dosage with technically relevant, dimeric to polymeric C substrates, if they have been previously converted into the chemically identical monomers by chemical hydrolysis or by the enzymatic digestion by the microorganisms.

Der Nachteil des geschilderten Standes der Technik besteht darin, wenn technisch relevante oder gut verfüg bare C-Substrate für die Dosierung zur Anwendung kommen, die aus chemisch unterschiedlichen Monomeren bestehen. In diesem Fall wird der für eine optimale Antibiotikumproduktion notwendig quasi- steady- state-Zustand durch Vorliegen von Substrathierarchien und unterschiedlichen Transportgeschwindigkeiten durch die Zellmembran der produktbildenden Mikroorganismen gestört. Aus der Sicht der Prozeßführung ist bekannt, daß mikrobielle Produktbildner sehr empfindlich sind und bereits auf geringe Änderungen der Umweltbedingungen stark reagieren.The disadvantage of the described prior art is when technically relevant or readily available C substrates for dosing are used, which consist of chemically different monomers. In this case, the quasi-steady-state condition necessary for optimal antibiotic production is disturbed by the presence of substrate hierarchies and different transport velocities through the cell membrane of the product-forming microorganisms. From the point of view of process control, it is known that microbial product formers are very sensitive and already strongly react to minor changes in environmental conditions.

Die gegenwärtig angeordneten Sensoren zur Messung physikalisch-technischer und physikalisch-chemischer Parameter in der flüssigen und gasförmigen Phase des Fermentors beschreiben die Milieubedingungen der Mikroorganismen nur verhältnismäßig grob. (A. Einsele, Swiss Pharma 3 (1981), Nr. 1 bis 2, Seite 17 bis 19). Die Arbeiten zur Entwicklung von Sensoren, die die Konzentrationen der reduzierten Nicotinsäureamid-adenin-dinucleotid, Adenosintriphosphat oder Ribonuoleinsäure messen können, sind im Gange. Es sind jedoch weitere Verbesserungen erforderlich, um auch on-line-Messungen in den Zellen und im Routinebetrieb durchführen zu können. Die zur Zeit unbefriedigende Situation bei on-line-Messungen für Sterilfermentationsprozesse bezüglich Genauigkeit und Langzeitstabilität bietet keine ausreichende Basis, um die an der Zelle herrschenden Umweltbedingungen meßtechnisch exakt zu erfassen und um deren Änderungen quantitativ zu beschreiben. Zur Zeit verwendet man in der Biotechnologie idealisierte Fermentormodelle, die als wesentliche Bedingung einen homogenen Reaktor voraussetzen. Diese nichtstrukturierten Modelle sind nicht in der Lage, genaue Informationen über die momentanen und örtlichen Umweltänderungen zu liefern, unter denen die Mikroorganismen leben. Mit zunehmendem Reaktorvolumen werden damit die Unterschiede zwischen den aktuell herrschenden Umweltbedingüngen, denen die Zellen an den verschiedenen Orten ausgesetzt sind und den gemittelten Verhältnissen mit denen man in den idealisierten Modellen rechnet immer größer. Bei Kulturlösungen mit nichtnewtonschem Fließverhalten ist es außerdem nicht möglich, durch das meist angewendete Prinzip der geometrischen Ähnlichkeit die Misch- und Transportparameter in den einzelnen Maßstabsgrößen invariant zu halten. Insbesondere ändern sich die Gasgeschwindigkeit und die Schergeschwindigkeitsverteilung im Fermentor. Bei Antibiotikumverfahren führt das gegebenenfalls zu morphologischen Veränderungen der Mikroorganismen. Dadurch werden gleichfalls Stofftransporteigenschaften in der Kette bis zum Zellinnern unkontrollierbar variiert. Diese Zustandsänderungen entziehen sich einer exakten Darstellung bzw. quantitativen Darstellung im Modell unter realen Kultivierungsbedingungen.The presently arranged sensors for measuring physical-technical and physico-chemical parameters in the liquid and gaseous phase of the fermenter describe the environmental conditions of the microorganisms only relatively roughly. (A. Einsele, Swiss Pharma 3 (1981), No. 1 to 2, pages 17 to 19). Work is underway to develop sensors that can measure levels of reduced nicotinamide adenine dinucleotide, adenosine triphosphate or ribonucleic acid. However, further improvements are needed to be able to perform on-line measurements in the cells and in routine operation. The currently unsatisfactory situation with on-line measurements for sterile fermentation processes with regard to accuracy and long-term stability does not provide a sufficient basis for accurately measuring the environmental conditions prevailing at the cell and quantitatively describing their changes. At the moment, biotechnologists are using idealized fermenter models, which require a homogenous reactor as an essential condition. These unstructured models are unable to provide accurate information about the current and local environmental changes under which the microorganisms live. With increasing reactor volume, the differences between the currently prevailing environmental conditions to which the cells are exposed in the various places and the averaged conditions which one expects in the idealized models are thus becoming ever greater. In the case of culture solutions with non-Newtonian flow behavior, it is also not possible to keep the mixing and transport parameters in the individual scale variables invariant by the principle of geometric similarity which is usually used. In particular, the gas velocity and the shear rate distribution in the fermentor change. In antibiotic processes, this may lead to morphological changes of the microorganisms. As a result, mass transfer properties in the chain are also varied uncontrollably up to the cell interior. These state changes elude an exact representation or quantitative representation in the model under real cultivation conditions.

Die auftretenden Inhomogenitäten sind mit einer Verminderung des Leistungsvermögens verbunden, die auch mit unerwünschten Nebenproduktsynthesen zusammenhängen können.The inhomogeneities that occur are associated with a reduction in performance, which may also be related to undesirable by-product syntheses.

Die Effizienz des Verfahrens ist somit in einer bestimmten Fermentorgröße nur durch aufwendige AnpassungsexperimenteThe efficiency of the process is thus in a given fermentor size only by consuming adaptation experiments

ermittelbar. determined.

Die zur Festlegung eines Dosierungsregimes verwendeten analytischen Daten aus Probemessungen ermöglichen auch nur eine grobe Einschätzung des Versorgungszustandes, so daß eine präzise Beurteilung des Grades der Limitation der Zellen — wie sie für Mischsubstratdosierungen notwendig ist — nicht gegeben ist.The analytical data from sample measurements used to establish a dosing regime also allow only a rough assessment of the state of supply, so that a precise assessment of the degree of limitation of the cells - as is necessary for mixed substrate dosing - is not given.

Aus den genannten Gründen ist eine Regelung der Substratdosierung mit den bekannten technischen Mitteln nicht befriedigend durchführbar. (Scheigere, K.Chem.lng.Tech.55 (1983) Nr. 12, S.915 bis 924 und Chem. Ing.Tech.56 (1984) Nr.8, S.579 bis 589).For these reasons, a regulation of the substrate dosage with the known technical means is not satisfactory feasible. (Scheigere, K.Chem.lng.Tech.55 (1983) No. 12, pages 915 to 924 and Chem. Ing. Tech. 56 (1984) No. 8, pages 579 to 589).

Die Anwendung adaptiver Regelungsstrategien setzt die Kenntnis geeigneter Zustandserken nurtgsverfahren, die repräsentative Informationen über den Kultivierungszustand zu definierten Zeitpunkten liefern, voraus. Die industriell genutzten Verfahren mit Substratdosierung.zur Herstellung von Antibiotika basieren auf einem in dem jeweiligen Maßstab durch aufwendige Versuche empirisch mit den beschreibenen Mitteln gewonnenen Dosierungsregime in Abhängigkeit von der Fermentationszeit.The application of adaptive control strategies requires the knowledge of suitable conditional nurturing techniques that provide representative information about the culture state at defined times. The industrially used procedures with Substratdosierung.zur production of antibiotics are based on a in the respective scale by elaborate experiments empirically obtained with the described means dosing regimes depending on the fermentation time.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, durch das die dem aktuellen Leistungsvermögen unter realen Kultivierungsbedingungen entsprechende C-Dosierungsrate bestimmt werden kann, die als Grundlage für die rechnergestützte Substratnachdosierung dient.The object of the invention is to provide a method by which the C dosage rate corresponding to the actual performance under real culture conditions can be determined, which serves as the basis for the computer-aided substrate replenishment.

Gleichzeitig ermöglicht es die Anpassung der einzelnen Substratversorgung zur ökonomischen Verwertung bei gegebener Biomassekonzentration für den gesamten Prozeßverlauf.At the same time it allows the adaptation of the individual substrate supply for economic utilization at a given biomass concentration for the entire process.

Ein weiteres Ziel besteht in Effektivitätsaussagen bei scale-up-Untersuchungen.Another goal is to make efficacy statements in scale-up studies.

Der Zweck der Erfindung besteht darin, eine Antibiotikumfermentation mit vergleichbaren oder gesteigerten Leistungen auch dann zu erreichen, wenn dimere oder oligomere C-Substrate dosiert werden, für deren Monomere Substrathierarchien oder/und unterschiedliche Metabolierungsgeschwindigkeiten bei den antibiotikumbildenden einzelligen oder mycelbildenden Mikroorganismen bestehen.The purpose of the invention is to achieve antibiotic fermentation with comparable or enhanced performance even when dimeric or oligomeric C-substrates are dosed, for whose monomers there are substrate hierarchies and / or different rates of metabolism in the antibiotic-forming unicellular or mycelium-forming microorganisms.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Dosierregime zu entwickeln, welches die Anwendung von dimeren und oligomeren C-Substraten für solche produktbildenden Mikroorganismen gestattet, die die chemisch unterschiedlichen C-Substratmonomeren nach enzymatischer Hydrolyse nicht simultan verwerten. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß als Substrat Saccharose in Verbindung mit einem Dosierungsregime, das eine Zustandserkennung und den periodisch wiederkehrenden, hochaktiven transient-Zustand des mikrobiellen Prozesses erlaubt, eingesetzt wird. Es wurde überraschend gefunden, daß durch ein rechnergestütztes Saccharosedosierregime die simultane Verwertung von Fruktose im Beisein von Glucose bei mycelbildenden, penicillinproduzierenden Mikroorganismen erzwungen und damit die genetisch fixierte Hierarchie — Glucose vor Fructose — in ihren Auswirkungen aufgehoben werden kann. Bei der Dosierung von Saccharose als dimeres Substrat wird während der Substratlimitation die Effizienz der Verwertung für die Antibiotikumbildung durch den mycelbildenden Mikroorganismus nicht nur durch die genetisch fixierte, bis jetzt nicht aufhebbare Hierarchie — Glucose vor Fructose bzw. C₆-SubstratevorC₃-Substrate — beeinflußt, sondern auch durch die Geschwindigkeit der strukturellen Entwicklung derfilamentösen Myzelien während der Antibiotikumbildung. Diese strukturelle Entwicklung betrifft insbesondere das Verhältnis der penicillinbildenden apikalen Bereiche zu den dickwandigen, transportkapazitätsgeminderten basalen Abschnitten (Wittler, R.; Schügerl, K. Dechema Monographien, Bd. 35,101 bis 114,1983) Saccharose ist ein Substrat, dessen Energiegehalt geringer als sein Kohlenstoffgehalt (Babel, W., Z. allg. Mikrobiol. 19,671 bis 677,1979). Obwohl die Kohlenstoff/ Energieverhältnisse der C-Substrate sich nicht im Wirkungsgrad widerspiegeln, werden allgemein Substrate mit Energiemangel mit einem höheren energetischen Wirkungsgrad durch den produktbildenden Mikroorganismus verwertet als Substrate mit Energieüberschuß (Heinritz, B. et al. Z. allg. Mikrobiol.22, 535 bis 544,1982).The invention has for its object to develop a Dosierregime, which allows the use of dimeric and oligomeric C-substrates for such product-forming microorganisms that do not utilize the chemically different C-substrate monomers after enzymatic hydrolysis simultaneously. According to the invention, the object is achieved by using sucrose in combination with a dosing regime which permits state recognition and the periodically recurring, highly active transient state of the microbial process. It has surprisingly been found that the computerized Saccharosedosierregime forced the simultaneous utilization of fructose in the presence of glucose in mycelbildenden, penicillinproduzierenden microorganisms and thus the genetically fixed hierarchy - glucose before fructose - can be reversed in their effects. In the dosage of sucrose as a substrate dimeric the efficiency of utilization for the antibiotic production by the mycelbildenden microorganism is genetically fixed not only during the substrate limitation, so far not entail significant hierarchy - Glucose fructose before or C ₆ -SubstratevorC ₃ substrates - influenced but also by the rate of structural development of filamentous mycelia during antibiotic formation. This structural development particularly concerns the ratio of the penicillin-forming apical regions to the thick-walled, transport-capacity-reduced basal sections (Wittler, R. Schügerl, K. Dechema Monographs, Vol (Babel, W., Z. Gen. Microbiol., 19, 671-677, 1979). Although the carbon / energy ratios of the C-substrates are not reflected in efficiency, generally, energy-deficient substrates with higher energy efficiency are utilized by the product-forming microorganism than are substrates with excess energy (Heinritz, B. et al., Z. gen. Microbiol. 535 to 544, 1982).

Die Komplexizität dieser aufgezeigten Sachverhalte mach deutlich, daß es fraglich ist, ob durch ein Substratdosierregime den Mikroorganismen ein Regime aufgezwungen werden kann, der sich in einer gesteigerten, konstanten Biosyntheseleistung äußert.The complexity of these issues makes it clear that it is questionable whether a substrate dosage regime can impose on the microorganisms a regime that manifests itself in an increased, constant biosynthetic performance.

Das Wesen des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die für den Mikroorganismus bemerkbaren wichtigen C-Konzentrationsschwankungen, d.h. physiologisch relevanten Änderungen der Umweltbedingungen, in ihren Auswirkungen — als Reaktion der Zelle unter den herrschenden Bedingungen — ausgewertet werden. Dabei werden vorzugsweise Impulshöhe der C-Dosierung, Dosierungsdauer und -pause sowie Koii-^ntrationsprofil in ihren Wirkungen und nach entsprechenden Auswertungen zur Charakterisierung und Beschreibung des Zustandes der Gesamtkultur herangezogen. Die so gewonnene Antwortfunktion (Informationen über Limitationszustand für Substrate aus dem Primärstoffwechsel) bildet das Kriterium für die Beeinflussung der Stellgrößen unter den realen Kultivierungsbedingungen im industriellen Maßstab. Es dient der Formulierung und Aktualisierung der Steueralgorithmen für die Sauerstoffversorgung durch Drehzahl, Systemdruck und Luftdurchsatz, für die Saccharosedosierung (Dosierregime) durch Arbeits-, Pausenzeit und Dosagemenge derThe essence of the method according to the invention is that the important C concentration variations noticeable for the microorganism, i. physiologically relevant changes in environmental conditions, their effects - in response to the cell under the prevailing conditions - are evaluated. In this case, preferably pulse height of the C dosage, dosage duration and pause and Koii- ^ ntrationsprofil are used in their effects and after appropriate evaluations to characterize and describe the state of the whole culture. The response function obtained in this way (information on the state of limitation for substrates from the primary metabolism) forms the criterion for influencing the manipulated variables under real cultivation conditions on an industrial scale. It is used to formulate and update the control algorithms for oxygen supply by speed, system pressure and air flow, for the sucrose dosage (dosing regime) by working, pause time and dosage amount of

Dosiereinrichtung und für die Biomassekonzentration durch Festlegung des Erntezeitpunktes, des Verdünnungseffektes und ggf. durch Maßnahmen zur Wachstumsbeeinflussung.Dosing device and for the biomass concentration by determining the time of harvest, the dilution effect and possibly by measures to influence growth.

Ausführungsbeispielembodiment

1. Der zu beurteilende Fermentationsprozeß läuft in einer hochinstrumentierten Fermentationsanlage ab, die über die erforderlichen on line-Meßmöglichkeiten verfügt.1. The fermentation process to be assessed is carried out in a highly instrumented fermentation plant, which has the necessary on-line measuring capabilities.

Die Daten der Meßstellen u_S(D...u_S(n) dienen zur Prozeßeinschätzung.The data of the measuring points u _S (D ... u _S (n) are used for process evaluation.

Damit dieses im laufenden Prozeß in rationeller Form geschehen kann, wird die Einschätzung durch ProzeßrechentechnikIn order for this to happen in a rational way in the current process, the assessment is made by process computing

bzw. durch Prozeßmikrorechentechnik unterstützt.or supported by process microchip technology.

Zu diesem Zweck werden die Meßsignale in Form digitaler Meßdaten bereitgestellt, die vom Rechner zur Weiterverarbeitung genutzt werden können. Der zu beurteilende Fermentationsprozeß basiertauf mehreren Substratzuführungen. Dabei handelt es sich um gasförmige, flüssige Substrate oder notwendige Zuschlagstoffe wie Entschäumer oder pH regulierende Reagenzien. Die Prozeßbeurteilung erfolgt unter Verwendung der Substratzuführung s(1) ... s(n). Zur Erzeugung der die Beurteilungsgrundlage bildenden Datenmengen werden die Substratzuführungen charakteristisch für einen bestimmten Zeitpunkt verändert. Dies geschieht so, daß gewisse Änderungen parallel zueinander, phasenverschoben zueinander oder in sequentieller Abfolge erfolgen. Vorzugsweise werden sprungförmige Substratzuführungen benutzt. Die Daten der Meßstellen u_s(1),.., u_s(n) werden in der Zeitspanne der Prozeßreaktionsdauer registriert." Ergänzt um die Datenmenge zur Charakterisierung des Ausgangszustandes vor Manipulationsbeginn und der Datenmenge zur Dokumentation des Prozeßzustandes nach Manipulationsende erhält man die Gesamtdatenmenge zur Beurteilung des aktuellen Prozeßzustandes.For this purpose, the measurement signals are provided in the form of digital measurement data that can be used by the computer for further processing. The fermentation process to be evaluated is based on multiple substrate feeds. These are gaseous, liquid substrates or necessary additives such as defoamers or pH-regulating reagents. The process evaluation is performed using the substrate feed s (1) ... s (n). To generate the datasets forming the basis of the assessment, the substrate feeds are characteristically changed for a specific time. This is done so that certain changes occur parallel to each other, out of phase with each other or in sequential order. Preferably, jump-shaped substrate feeds are used. The data of the measuring points u _{s (1)} , .., u _{s (n)} are registered in the period of the process reaction time. "Supplemented by the amount of data to characterize the initial state before the start of manipulation and the amount of data to document the process state after the end of manipulation, the total amount of data is obtained to assess the current process status.

Die Zustandseinschätzung zum gegebenen Zeitpunkt erfolgt durch Auswertung der Meßdatenprofile, der Antwortimpulsformen — höhen und — breiten von integralen, differentiellen abgeleiteten typischen Daten des aktuellen Parameterstandes erreicht. Durch maschinelle Registrierung der Daten werden auch die Grundlagen für die prozeßüberprüfende Beurteilung gelegt.The state estimation at the given time takes place by evaluation of the measured data profiles, which reaches the response pulse form height and width of integral, differential derived typical data of the current parameter state. Machine-based registration of the data also lays the foundations for the process-reviewing assessment.

Analoge Meßwerte erfordern die Datenspeicherung mit ausreichender Empfindlichkeit und die manuelle Folgenauswertung nach den gleichen Prinzipien.Analog measurements require data storage with sufficient sensitivity and manual consequence evaluation according to the same principles.

2. Der Produktionsfermenter ist ein Rührkessel mit einem geplanten fluiden Nährmedium, das mit einem produktbildenden Penicilliumstamm inokuliert wird. In fermenterbezogener Weise wird durch die Rühreinrichtung und Sterilluftzuführung die Sauerstoffversorgung der Penicilliumkultur und der CO₂-Abtransport aus der fluiden Phase über die Ablufteinrichtung realisiert. Die für eine stetige maximale Produktbildung notwendige Homogenität des Mediums und die Erzeugung der stammspezifischen, genetisch und phänotypisch bedingten, morphologischen Eigenschaften an Myzels werden durch die Rührerkonstruktion und -geschwindigkeit erreicht. Die Technik dieser Arbeitsschritte entspricht dem bekannten und realisierbaren Stand der Technik. Die Benzylpenicillinfermentation verläuft nach dem fed batch-Prinzip. Neben der optimalen Sauerstoffversorgung ist die Saccharosedosierrate die wichtigste Führungsgröße. Dabei erfolgt die Dosierung auf der Basis einer realisierbaren Technologie quasikontinuierlich. Im Gegensatz dazu wird die gepulste Dosierung durch die zyklische Abfolge von Dosierungszeitspanne und Pausenzeitspanne geführt. In diesem Zusammenhang kommen andere Substratnachdosierungen nicht in Betracht. Die Zustandserkennung des Systems basiert im Zusammenhang mit der Impulsdosierung auf dem Meßwert pO₂ und der Meßwertfolge aus der Abgasanalytik. Die kritische untere Grenze für die Sauerstoffversorgung ist bei einem pO2-Wertvon 20% erreicht. Die Wahl der Dosierungs- und Pausenzeiten erfolgt unter Beachtung der stammspezifischen Eigenschaften des mikrowellen Produzenten und eineran den jeweiligen Leistungseintrag angepaßten Biomassekonzentration durch die Vorgabe eines Dosierungsregimes. Dabei beträgt die vom Leistungseintrag abhängige Saccharosedosierrate 1,4g/l χ h und die Arbeitszeitspanne verhält sich zur Pausenzeitspanne wie 1:30. Zur Zustandsbeurteilung wird das Sauerstoffkonzentrationsprofil mikrorechentechnisch als Wertfolge gespeichert und dem entsprechenden Fermentationsabschnitt mit gepulster C-Substratdosierung zugeordnet. Mit zunehmendem Kulturalter ergibt sich eine Rückkopplung aus der Konstanz oder Nichtkonstanz der Abfolge der Sauerstoffkonzentrationsprofile zum Verhältnis von Dosierungs- und Pausenzeit.2. The production fermenter is a stirred tank with a planned fluid nutrient medium which is inoculated with a product-forming Penicillium strain. In a fermenter-related manner, the oxygen supply of the penicillium culture and the CO ₂ removal from the fluid phase via the exhaust air device are realized by the stirring device and sterile air supply. The homogeneity of the medium necessary for a constant maximum product formation and the generation of the strain-specific, genetically and phenotypically conditioned, morphological properties on mycelium are achieved by the stirrer design and speed. The technique of these steps corresponds to the known and realizable state of the art. The Benzylpenicillinfermentation proceeds according to the fed batch principle. In addition to the optimal oxygen supply, the sucrose dosage rate is the most important reference variable. The dosage is based on a feasible technology quasi-continuous. In contrast, the pulsed dosing is guided by the cyclic sequence of dosing period and pause period. In this context, other Substratnachdosierungen not come into consideration. The state recognition of the system is based on the measured value pO ₂ and the measured value sequence from the exhaust gas analysis in connection with the pulse dosing. The critical lower limit for oxygenation is reached at a pO2 of 20%. The choice of dosing and pause times is made taking into account the strain-specific properties of the microwave producer and a biomass concentration adapted to the respective power input by specifying a dosing regime. The Saccharosedosierrate dependent on the power input is 1.4g / l χ h and the working time is at the pause period as 1:30. To assess the state, the oxygen concentration profile is stored as a value sequence in terms of microstructure technology and assigned to the corresponding fermentation section with pulsed C substrate dosage. With increasing age of culture, there is a feedback from the constancy or non-constancy of the sequence of oxygen concentration profiles to the ratio of dosing and pause time.

Claims

Method for determining the process state in fermentation processes according to the fed-batch principle under substrate limitation, characterized in that the dosage of the limiting substrate is interrupted, and / or that a predetermined amount of the limiting substrate is added during the substrate limitation and that in each case the process state changes Measurement of one or more of the parameters dissolved oxygen partial pressure, hydrogen ion concentration, carbon dioxide partial pressure, oxygen and carbon dioxide content in the exhaust air is determined, the measured values being processed analogously or preferably digitally, and the metering amount and / or the pause and working time for metering the limiting substrate, in particular Mixed substrates plant and process conditions is determined and serves as a basis for the control of the metering rate.

Field of application of the invention

The invention relates to a method for state detection and assessment in fermentation processes according to the fedbatch principle under substrate limitation, especially in fermentation processes for the production of antibiotics with unicellular and mycelium-forming microorganisms using dimeric, oligomeric and polymeric C and N substrates by metering.

Characteristic of the known technical solutions