DD253184A1 - METHOD FOR PRODUCING STABLE SALMONELLA VACCINE STEM WITH AN ATTENANCE TREATMENT ADJUSTED TO ANY OF THE INDUSTRY SPECIES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lebendimpfstoffen fuer Nutztiere aus stabilen Salmonella typhimurium Ein-, Zwei- und Dreimarker-Impfstaemmen in jeder gewuenschten - am Maeusemodell sich zwischen i. p. LD50102,5 bis 10 7 bis 107 (Wildstamm 101) Keime bewegenden - der Wirtsspezies angepassten Attenuierungshoehe; durch Verwendung von in vitro nicht bzw. 10 8 revertierenden Asparaginsaeure-Auxotrophie Klonen unterschiedlicher Virulenzreduktion als Einmarker-Impfstaemme; in welche bei Bedarf (sowie bei Verwendung von asp-Klonen mit Reversionshaeufigkeiten 10 7) eine zweite und/oder dritte attenuierende Mutation eingebaut wird und zwar ein - hst- bzw. rbt-Marker (DD-WP 218 836 A 1 sowie DD-WP angemeldet)-Stoffwechseldrift-Marker (z. B. funktionell veraenderte RNA-Polymerase oder Gyrase DD-WP 155 294) zwecks Erhoehung der Stabilitaet (Potenzierung der Einzelstabilitaeten) auf Werte 10 14 bzw. 10 21Verminderung oder Verlust der Potenz zur Impfstamm-Infektkettenbildung als Folge gestoerter outer membrane Permeabilitaet (laut WHO-Definition: Attenuierungsmarker)Einstellung der Attenuierungshoehe auf den jeweiligen Optimalwert.The invention relates to a method for the production of live vaccines for farm animals from stable Salmonella typhimurium one-, two- and Dreimarker Impfstaemmen in any desired - on Maeusemodell between i. p. LD50102.5 to 10 7 to 107 (wild strain 101) germinating buds - attenuation levels adapted to the host species; by using in vitro non-responders or aspartic acid auxotrophy cloning different virulence reduction as a single-marker vaccine; in which a second and / or third attenuating mutation is incorporated when needed (and when asp-clones with reversion frequencies 10 7 are used), namely a first or colored marker (DD-WP 218 836 A 1 and DD-WP announced) -Stickwechselrift drift marker (eg, functionally modified RNA polymerase or gyrase DD-WP 155 294) for the purpose of increasing the stability (potentiation of individual Stabilitaeten) to values 10 14 or 10 21Verminderung or loss of potency for Impfstamm-Infektkettenbildung than Sequence of impaired outer membrane permeability (according to WHO definition: Attenuation marker) Sets the attenuation level to the respective optimal value.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stabiler Salmonella Impfstämme mit einer der jeweiligen Wirtsspezies angepaßten Attenuierungshöhe zur Anwendung als Lebendimpfstoff, derenThe invention relates to a method for producing stable Salmonella vaccine strains with an attenuation level adapted to the respective host species for use as a live vaccine, the
— Attenuierungshöhe einer Wirtsspezies angepaßten Virulenzreduktion entspricht — welche einerseits die inapparente Infektion und andererseits die ausreichende (aber zeitlich begrenzte) Persistenz der Impfstämme im Wirtsgewebe als Voraussetzung für eine stabile Immunität garantiert—und am Mäusemodell auf i.p. LD50-Werte zwischen >102'5 bis <107 bis >107 (Wildstamm <101) Keime eingestellt werden kann- attenuation level of a host species matched Virulenzreduktion corresponds to - on the one hand the inapparent infection and on the other hand sufficient (but temporary) persistence of the vaccine strains in the host tissue as a condition for a stable immunity guaranteed and the mouse model IP LD 50 values between> 10 2 '5 until <10 7 to> 10 7 (wild strain <10 1 ) germs can be adjusted
— Stabilität (keine Rückmutation zum Wildstamm unter nicht-selektiven Feldbedingungen) durch Verwendung von in vitro nicht nachweisbar revertierenden Einmarkerstämmen bzw. bei Reversionshäufigkeiten < 10~7 über den Einbau von weiteren ein oder zwei unabhängig voneinander die Übertragbarkeit bzw. die Virulenz reduzierenden Mutationen garantiert wird- Stability (no reverse mutation to the wild strain under non-selective field conditions) is guaranteed by the use of in vitro irreversibly reverting single marker strains or at reversion frequencies <10 ~ 7 via the incorporation of further one or two independently mutagenic or virulence reducing mutations
und die als Impfstoffe aus lebenden Erregern zur aktiven Immunisierung von Nutztieren gegen Salmonellosen geeignet sind.and which are suitable as live-virus vaccines for the active immunization of livestock against salmonellosis.
In den Patentschriften NL-OS 7810480; DD-WP 155294; DD-WP 218836A1; DD-WP 235828A1; (Verfahren zur Herstellung von Lebendimpfstoffen mit zwei oder mehreren unabhängig voneinander, virulenzreduzierenden Markern: pur" sowie Stoffwechseldrift-Mutationen) und DD-WP 218836A1 sowie DD-WP angemeldet (Verfahren zur Herstellung stabiler sowie epidemiologisch-epizootologisch unbedenklicher Lebendimpfstoffe) wurde (n)In the patents NL-OS 7810480; DD-WP 155294; DD-WP 218836A1; DD-WP 235828A1; (Method for producing live vaccines with two or more independently virulence-reducing markers: pure and metabolic drift mutations) and DD-WP 218836A1 and DD-WP filed (method for producing stable and epidemiologically epidemiologically safe live vaccines) has been
— einerseits der Stand der Technik dargelegt, welcher entsprechend der neuesten WHO-Information (ICP/BVM 008/(S) 6144 B, Juli 1981) und den Empfehlungen des Symposiums „Enteric infections in man and animals: Standardization of immunological procedures", Dublin 1982 (in: Developments in Biological Standardization, Vol. 53, S. Karger, Basel) z.Zt. noch gültig ist;On the one hand, the state of the art set forth in accordance with the latest WHO information (ICP / BVM 008 / (S) 6144 B, July 1981) and the recommendations of the symposium "Enteric infections in man and animals: Standardization of immunological procedures", Dublin 1982 (in: Developments in Biological Standardization, Vol. 53, S. Karger, Basle) is currently still valid;
— andererseits Prinziplösungen zur Herstellung von Impfstamm-Mutanten vorgeschlagen, die durch Kopplung von zwei oder mehreren Markern sowie durch Verwendung eines antiepidemischen Markers die Sicherheitsforderungen der WHO erfüllen.- On the other hand, proposed principle solutions for the production of vaccine strain mutants that meet the safety requirements of the WHO by coupling two or more markers and by using an anti-epidemic marker.
Die hohe Immunogenität solcher potentieller Impfstämme beruht auf ihrer restlichen, unterhalb des klinischen Schwellenwertes liegenden Vermehrung im Wirt und der damit verbundenen ausreichenden, aber zeitlich begrenzten Persistenz im Gewebe. Ihre epidemiologisch-epizootologische Unbedenklichkeit basiert auf einer durch Mutation veränderten Permeabilität der outer membrane, erkennbar u.a. an einer Makrolidantibiotika- und Tensidhypersensibilität, wodurch die Keime in der Außenwelt progressiv absterben, so daß Infektketten in der Regel nicht zustande kommen können.The high immunogenicity of such potential vaccine strains is due to their residual, below clinical threshold multiplication in the host and the associated sufficient but temporally limited persistence in the tissue. Their epidemiological-epizootological safety is based on mutation-altered permeability of the outer membrane, recognizable i.a. a macrolide antibiotics and surfactant hypersensitivity, which causes the germs in the outside world to die progressively, so that infection chains usually can not be achieved.
Einzelheiten zum Stand der Technik, einschließlich der gal-E Mutation (Germanier), den Sm-id Mutanten (Likhoded, Shuster) sowie den aro~ Mutanten (Stocker) finden sich in den eingangs zitierten Patentschriften, den Materialien des Symposium „Enteric infections in man and animals: Standardization of immunological procedures", Dublin, 1982 (in: Developments in Biological Standardization, Vol.53, S.Karger, Basel) und folgenden Publikationen:Details of the state of the art, including the gal-E mutation (Germanier), the Sm-id mutants (Likhoded, Shuster) and the aro ~ mutants (Stocker) can be found in the patents cited at the outset, the materials of the symposium "Enteric infections in man and animals: Standardization of Immunological Procedures ", Dublin, 1982 (in: Developments in Biological Standardization, Vol.53, S.Karger, Basle) and the following publications:
— Linde, K., ZbI. Bakt. Hyg., I.Abt. Orig. A 249,203-214 (1981),- Linde, K., ZbI. Bact. Hyg., I. Alb. Orig. A 249,203-214 (1981),
— Linde, K., ZbI. Bakt. Hyg., I.Abt. Orig. A 249, 350-361 (1981),- Linde, K., ZbI. Bact. Hyg., I. Alb. Orig. A 249, 350-361 (1981),
— Linde, K., Wonitzki, Ch., Randhagen, B., ZbI. Bakt. Hyg., I.Abt. Orig. A 250, 478-489 (1981),Linde, K., Wonitzki, Ch., Randhagen, B., ZbI. Bact. Hyg., I. Alb. Orig. A 250, 478-489 (1981),
— Linde, K., Arch, exper. Vet. med., Leipzig 36, 657-772 (1982),Linde, K., Arch, exper. Vet. Med., Leipzig 36, 657-772 (1982),
— Linde, K., Wonitzki, Ch., Beer, J., Randhagen, B., Keller, H.-P., Z. ges. Hyg. 30,141-147 (1984),Linde, K., Wonitzki, Ch., Beer, J., Randhagen, B., Keller, H.-P., Z. ges. Hyg. 30, 141-147 (1984),
— Levine, Myron, M. WORLD HEALTH, April 1986, IX ISSN 0043-8502, p.24-26- Levine, Myron, M. WORLD HEALTH, April 1986, IX ISSN 0043-8502, p.24-26
— WHO/CDD 86.15 Diarrhoeal Disease Control Programme p. 12-13- WHO / CDD 86.15 Diarrhoeal Disease Control Program p. 12-13
— WHO/CDD/86.16 Control of Diarrhoeal Diseases p.71-73.- WHO / CDD / 86.16 Control of Diarrheal Diseases p.71-73.
Die als Stand der Technik oben zitierten Prinziplösungen zur Herstellung von Lebendimpfstoffmutanten weisen folgende Nachteile und deren Ursachen auf:The principle solutions cited above as the prior art for the production of live vaccine mutants have the following disadvantages and their causes:
1. Mutationen zur pur" (gilt nicht für alle Wirtsspezies) bzw. aro" Auxotrophie, deren Attenuierungsgrad vom Metabolitenmangel in vivo abhängt, sowie gal-E Mutanten, bei denen es in vivo infolge einer Anreicherung der UDP-Galaktose zu einer Galaktolyse kommt, gestatten lediglich die Herstellung von hoch attenuierten, im Wirt nur gering sich vermehrenden bzw. unzureichend persistierenden und daher die zelluläre Immunität zeitlich kürzer als möglich stimulierenden Einmarker-Stämmen. Dies gilt besonders für S. typhimurium pur" Lebendimpfstoffmutanten zur Anwendung für Kälber, bei denen — infolge vollständigen Fehlens von nicht-phosphorylierten Purinen — solche Mutanten sich an der Grenze zur Überattenuierung bewegen. Die Einführung eines zweiten virulenz-reduzierenden Markers zwecks Garantierung der WHO-Sicherheits- bzw. Stabilitätsordnungen, führt in der Regel zur Überattenuierung.1. Pure mutations (not all host species) or arootrophy, whose degree of attenuation depends on in vivo metabolite deficiency, and gal-E mutants which undergo galactolysis in vivo as a result of UDP-galactose accumulation, allow only the production of highly attenuated, in the host only slightly proliferating or insufficiently persistent and therefore the cellular immunity temporally shorter than possible stimulating Einmarker strains. This applies in particular to S. typhimurium pur "Live vaccine mutants for use in calves where - due to the complete absence of non-phosphorylated purines - such mutants are near the limits of overattenuation The introduction of a second virulence-reducing marker to guarantee WHO Safety or stability orders, usually leads to Überattenuierung.
2. Die Verwendung des antiepidemischen hst-Markers vermittelt zwar einerseits eine Unterbrechung von Infektketten (laut WHO-Definition zugleich Attenuierungsmarker), die gleichzeitige Galle-Sensibilität verlangt jedoch andererseits bei oraler Immunisierung eine~10fach höhere Dosierung, welche bei Dosen >1010 Keimen/Impfung mit der Gefahr von endotoxischen Nebenwirkungen und höheren Kosten verbunden sein kann, so daß, u.U. die Notwendigkeit besteht, anstelle des hst-Markers auf die Galle-tolerierende rbt-Revertante ausweichen zu müssen (WP-angemeldet) oder insgesamt eine geringere Attenuierungshöhe einzustellen.2. Although the use of the anti-epidemic hst marker mediates an interruption of infection chains (according to the WHO definition at the same attenuation marker), the simultaneous bile sensitivity requires on the other hand with oral immunization a ~ 10 times higher dosage, which at doses> 10 10 germs / Vaccination may be associated with the risk of endotoxic side effects and higher costs, so that there may be a need, instead of the hst marker to avoid the bile-tolerant colored revertant (WP-registered) or set a lower attenuation altogether.
3. Bei Verwendung des Prinzips: Virulenzreduzierung über Stoffwechseldrift-Mutationen (Mutationen in essentiellen Enzymen und Stoffwechselkompartimenten: Selektion über Resistenz gegen Antibiotika und andere Noxen) ergeben sich defacto unbegrenzte Möglichkeiten zur Herstellung von Zwei- oder Dreimarker-Impfstämmen in jeder gewünschten — d.h. der jeweiligen Wirtsspezies angepaßten optimalen — Gesamt-Attenuierungshöhe und damit hoher Immunogenität.3. Using the principle of virulence reduction via metabolic drift mutations (mutations in essential enzymes and metabolic compartments: selection via resistance to antibiotics and other noxious agents) there are, in fact, unlimited possibilities for producing two- or three-marker vaccine strains in any desired - i. optimal optimal overall attenuation level, and thus high immunogenicity, adapted to the respective host species.
Ein bedingter Nachteil dieser Lösung besteht jedoch darin, daß die Stabilitätsprüfung solcher Marker lediglich auf indirektem Wege durch den Nachweis der unveränderten Resistenz- und Attenuierungsparameter (nach > 10 Nährböden- und/oder Tierpassagen) möglich ist; (ein Nachteil, der jedoch bei Verwendung von zwei oder mehreren Driftmutationen — infolge der sich potenzierenden Einzelstabilitäten — nur akademischen Charakter besitzt).A conditional disadvantage of this solution, however, is that the stability test of such markers is possible only indirectly through the detection of the unchanged resistance and Attenuierungsparameter (after> 10 nutrient media and / or animal passages); (a drawback, however, which is only academic in the use of two or more drift mutations due to the potentiating single stabilities).
Ziel der Erfindung ist es, die Beseitigung folgender Nachteile der bekannten technischen Lösungen herbeizuführen:The aim of the invention is to bring about the removal of the following disadvantages of the known technical solutions:
1. Vermeidung einer Überatteriuierung bei Zwei- oder Dreimarker-Impfstammen durch Verwendung von pur" (gilt nicht für alle Wirtsspezies), aro", gal-E Mutationen, welche dem Einmarker-Ausgangsstamm einen hohen — in der Regel — Markerkopplungen ausschließenden Attenuierungsgrad vermitteln.1. Prevention of over-saturation in two- or three-mark vaccine strains by using pure (not valid for all host species), aro ", gal-E mutations, which confer a high level of attenuation, usually excluding marker couplings, to the single-marker outbred strain.
2. Vermeidung des bei ausschließender Verwendung von Stoffwechseldrift-Mutationen (zumindest theoretisch) geltenden Nachteile der nur indirekt möglichen Stabilitätsprüfung der Einzelmarker, durch Einbau von zumindest einem (bzw. bei zusätzlicher Verwendung antiepidemischer Marker von zwei) mit direkten Methoden auf Stabilität prüfbaren Marker (n) in die potentiellen Ein-, Zwei- oder Dreimarker-Impfstämme.2. Avoiding the (at least theoretically) disregarding the use of metabolic drift mutations (at least theoretically) disadvantages of only indirectly possible stability of the individual markers, by incorporating at least one (or with additional use of anti-epidemic markers of two) with direct methods for stability testable markers (n ) into the potential one, two or three marker vaccine strains.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung stabiler, immunogener Salmonella Lebendimpfstoffe in jeder gewünschten, d. h. jeweiligen Wirtsspezies angepaßten Attenuierungshöhe und (in der Regel) mit verminderter Potenz zur Impfstamm-Infektkettenbildung darzulegen, welches bzw. bei welchemThe object of the invention is to provide a method for producing stable, immunogenic Salmonella live vaccines in any desired, d. H. appropriate Attenuierungshöhe adapted to respective host species and (usually) with reduced potency for Impfstamm-Infektkettenbildung set out which or in which
— Mutationen vermeidet, die wie pur" (gilt nicht für alle Wirtsspezies), aro", gal-E eine stark ausgeprägte Virulenzreduktion vermitteln und damit keine bzw. nur eine zu geringe Attenuierungsreserve für einen zweiten und dritten Attenuierungsmarker belassen- Prevents mutations that, like pure (not for all host species), aro ", gal-E mediate a pronounced virulence reduction and thus leave no or only too little attenuation reserve for a second and third attenuation marker
— bei Verwendung des zusätzlichen hst oder rbt-Markers den Impfstämmen eine um den Faktor <10~7 sich potenzierende Stabilitätsanhebung sowie eine antiepidemische Potenz vermittelt- When using the additional hst or colored markers, the vaccine strains are characterized by a factor increase of <10 ~ 7 which enhances the stability and an anti-epidemic potency
— im Falle einer zu geringen Attenuierungshöhe der potentiellen S. tm Einmarker-Impfstämme ohne oder mit zusätzlichem hst- bzw. rbt-Marker (Zwei-marker-Impfstämme) in diese eine zusätzliche — nur mittels indirekter Methode auf Stabilität prüfbare —, die Gesamt-Attenuierungshöhe auf den optimalen Wert anhebende Mutation eingebaut wird, so daß stabile ausgewogen attenuierte Zwei- oder Dreimarker-Impfstämme entstehen.- in the case of an insufficient attenuation level of the potential S. tm single-marker vaccine strains without or with additional hst or colored markers (two-marker vaccine strains) in these an additional testable only for stability by indirect method, the total Attenuierungshöhe on the optimal value raising mutation is incorporated, so that stable balanced attenuated two- or Dreimarker vaccine strains arise.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß von S. tm Wildstämmen stabile, in vitro nicht nachweisbar oder <10~7 revertierende asp~ Klone mit unterschiedlicher Attenuierungshöhe isoliert werden und bei Bedarf in diese nachfolgend ein zweiter und evtl. ein dritter Marker eingeführt wird, welcher mit der Potenz zur Infektkettenbildung interferiert bzw. die Attenuierungshöhe optimiert, so daß stabile, immunogene Ein-, Zwei- oder Dreimarker-Impfstämme hergestellt werden, die unter Verwendung von an sich bekannten Verfahren für die Lebendimpfstoff-Herstellung genutzt werden. Die nachfolgend vorgestellten asp" Marker (differente Genotypen mit unterschiedlicher Attenuierungshöhe) als solche, oder in Kombination mit weiteren von uns entwickelten antiepidemischen und Stoffwechseldrift-Mutationen, haben sich als vorteilhaft erwiesen:This object is achieved according to the invention by isolating stable, in vitro undetectable or <10 ~ 7 reverting asp ~ clones with different attenuation heights from S. tm wild strains and, if necessary, introducing a second and possibly a third marker into these subsequently. which interferes with the potency of infectious chain formation, or optimizes the attenuation level, to produce stable, immunogenic one, two or three marker vaccine strains that are used for live vaccine production using per se known methods. The asp "markers presented below (different genotypes with different levels of attenuation) as such, or in combination with other anti-epidemic and metabolic drift mutations we have developed, have proven advantageous:
— Asparaginsäure-Auxotrophie mit (Klon- bzw. Genotypabhängigen) schwacher, mäßiger oder hoher Attenuierung In der Literatur finden sich lediglich drei Hinweise pauschalen Charakters.- aspartic acid auxotrophy with (clone- or genotype-dependent) weak, moderate or high attenuation Only three clues of a general character are found in the literature.
• Bacon et al.: Brit. J. exp. Path. 31, (1950), 714-724 Drei asp~-Mutanten von Salmonella typhi sind für Mäuse mäßig attenuiertBacon et al .: Brit. J. exp. Path. 31, (1950), 714-724 Three asp ~ mutants of Salmonella typhi are moderately attenuated for mice
• Bacon et al.: Brit. J. exp. Path. 32, (1951), 85-96Bacon et al .: Brit. J. exp. Path. 32, (1951), 85-96
Injektion von Asparaginsäuren senkt bei Mäusen die Letaldosis von S. typhi asp"Injection of aspartic acid lowers the lethal dose of S. typhi asp in mice
• Herzberg: J. Inf. Dis. 110, (1962), 192-203• Herzberg: J. Inf. Dis. 110, (1962), 192-203
Von 7 Salmonella typhimurium asp"-Mutanten sind für Mäuse 1 Klon virulent, 3 (offensichtlich) gering und 3 mäßig attenuiert.Of 7 Salmonella typhimurium asp "mutants, 1 was virulent for mice, 3 (apparently) low and 3 moderately attenuated.
Eine Verwendung dieser durch die Asparaginsäure-Auxotrophie vermittelten Attenuierung wurde bislang nicht beschrieben, da dieA use of this by the aspartic acid auxotrophy mediated attenuation has not been described, since the
• mitgeteilten Attenuierungshöhen vermutlich (irrtümliche) Vorstellungen vermittelte: asp" Einmarker-Impfstämme zu virulent• reported attenuation levels presumably (mistaken) notions: asp "single-marker vaccine strains too virulent
• Markerkopplungen zwecks Erhöhung der Stabilität und Anhebung der Attenuierung erst seit wenigen Jahren und praxisrelevant erstmals durch uns zur Diskussion stehen;• Linking the markers for the purpose of increasing stability and increasing attenuation only for a few years now and for the first time for us to discuss in a practice-relevant way;
• hohen Reversionsraten der meisten Mutanten (trotz — wie eigene Ergebnisse zeigen — Beibehaltung der Attenuierung = offensichtliche Suppressormutanten; vergleichbar der Reversion von Streptomycin-Dependenz zur Independenz) und das berichtete Vorkommen virulenter asp"-Klone• high reversion rates of most mutants (despite - as our own results show - retention of attenuation = obvious suppressor mutants, comparable to the reversion of streptomycin dependency to independency) and the reported occurrence of virulent asp "clones
offensichtlich das Vorurteil prägte: Nutzung dieses Attenuierungsprinzips für die Herstellung von Lebendimpfstoffen ungeeignet.obviously prejudiced: use of this attenuation principle unsuitable for the production of live vaccines.
Wir konnten feststellen, daß asp"-Mutanten von Salmonella typhimurium — geprüft wurden neun Klone mit einer Reversionshäufigkeit von <10~8— in ein Spektrum von Stämmen mit unterschiedlich hoher Virulenzreduktion zerfallen (siehe Tabelle 1 Seite 12)We found that asp "mutants of Salmonella typhimurium - tested nine clones with a reversion frequency of <10 ~ 8 - decay into a spectrum of strains with varying degrees of virulence reduction (see Table 1 page 12)
Diese neun getesteten asp~-Klone lassen sich unter Vorbehalt in wenigstens drei Attenuierungsgruppen unterteilen:These nine tested asp ~ clones can be subdivided under reservation into at least three attenuation groups:
Gruppe I: i.p. LD50 Maus~ 102'3 Keime =1 StammGroup I: ip LD 50 mouse ~ 10 2 ' 3 germs = 1 strain
Gruppell: i.p. LD50 Maus-105 Keime = 4StämmeGroup: ip LD 50 mouse-10 5 germs = 4 strains
Gruppelll: i.p. LD50Maus~ 107 Keime = 4StämmeGroup: ip LD 50 mouse ~ 10 7 germs = 4 strains
Wildstamm: 1.P-LD60MaUSSiO1 Keime t Wild strain: 1.P-LD 60 MaUSSiO 1 germs t
wobei diese drei Gruppen untereinander mittels Transduktion — der Versuch wurde mit den Klonen asp" 23, asp" 12 und asp" 15 (siehe Tabelle 1, Seite 12) durchgeführt—unter Verwendung des Phagen P22zurPrototrophierekombinierbarsind. Zur Herstellung von Einmarker-Impfstämmen (stabile asp"-Deletionsmutanten) oder Mehrmarker-Impfstämmen (zwecks Modifikation der Attenuierungshöhe und/oder Einführung einer antiepidemischen Potenz sowie Erhöhung der Stabilität) mit einer der jeweiligen Wirtsspezies angepaßten (d. h. die unterschiedliche Empfänglichkeit der Wirtsspezies den Salmonella typhimurium bzw. anderer Erreger berücksichtigenden) Attenuierungshöhe, kann daher auf entsprechende asp"-Klone mit unterschiedlich hoher Virulenzreduktion —wie z. B. asp" 23, asp" 10 oder asp" 15 (siehe Tabelle 1, Seite 12)—zurückgegriffen werden. Der unter Beispielen — neben der Isolierung von stabilen asp" Einmarker-Impfstämmen differenter Attenuierungshöhen — beschriebene Aufbau von Zwei- und Dreimarker-Impfstämmen unter Verwendung des Klon asp" 10 gilt sinngemäß für alle asp" Klone (Genotypen) mit geringerem, gleichem oder höherem Attenuierungsgrad.these three groups being mutually combinable by means of transduction-the experiment was carried out with the clones asp "23, asp" 12 and asp "15 (see Table 1, page 12) -using the phage P 22 to the prototrophs. stable asp "deletion mutants) or multi-marker vaccine strains (for the purpose of modifying the attenuation level and / or introducing an antiepidemic potency and increasing stability) with a level of attenuation adapted to the respective host species (ie the different susceptibility of the host species to Salmonella typhimurium or other pathogens) Therefore, it is possible to use corresponding asp "clones with different levels of virulence reduction-such as, for example, asp" 23, asp "10 or asp" 15 (see Table 1, page 12). The construction of two- and three-marker vaccine strains using the clone asp "10 described in addition to the isolation of stable asp" single-marker vaccine strains of different attenuation levels applies mutatis mutandis to all asp "clones (genotypes) with a lower, equal or higher degree of attenuation ,
— Weitere Marker:- Additional markers:
• hst-Mutation (DD-WP 218836A1) bzw. rbt (reversion bile tolerance) Revertantedes hst-Markers zur selektiven Galletoleranz (Patentschrift DD-WP angemeldet).• hst mutation (DD-WP 218836A1) or reversion bile tolerance Revertantedes hst marker for selective gall tolerance (patent DD-WP registered).
Die Stabilität des/der oben angeführten asp" und antiepidemischen Marker ist/sind mit direkten Methoden bestimmbar.The stability of the above-mentioned asp and anti-epidemic markers can be determined by direct methods.
• Stoffwechseldrift-Mutantenz. B. der RNA-Polymerase- oder Gyrase (DD-WP 155294), welche Klon (Genotyp)-spezifisch den Attenuierungsgrad der asp"-Einmarker-lmpfstämme bzw. der asp" hst bzw. rbt Zweimarker-Impfstämme (siehe oben) auf die gewünschte, d.h. Wirtsspezies angepaßte, Gesamtattenuierungshöhe anheben (siehe unter Ausführungsbeispiele).• metabolic drift mutant For example, the RNA polymerase or gyrase (DD-WP 155294), which clone (genotype) -spezifisch specifically the degree of attenuation of the asp "single-marker vaccine strains or the asp" hst or colored two-marker vaccine strains (see above) on desired, ie Host species adapted to increase total attenuation height (see under examples).
Bei Einsatz von asp"-Deletionsmutanten (repair des Defektes in vivo theoretisch möglich, aber unter nicht-selektiven . Feldbedingungen auszuschließen) als Einmarker-Impfstämme; sowie bei Kopplung von mit einer Häufigkeit < 10~7 revertierenden asp" mit antiepidemischen und/oder Stoffwechseldrift-Markern (siehe oben) erhält man Impfstämme für den Einsatz als Lebendimpfstoffe, dieUse of asp "deletion mutants (theoretically possible repair of the defect in vivo but precluded under non-selective field conditions) as single-marker vaccine strains, as well as coupling of recurrent asp <10 ~ 7 with antiepidemic and / or metabolic drift -Markern (see above) obtained vaccine strains for use as live vaccines, the
— unter nicht-selektiven Feldbedingungen als asp"-Deletionsmutanten stabil sind oder bei Zwei bzw. Dreimarkerstämmen mit revertierenden Mutationen über eine Gesamtstabilität von <10"ubzw. <10~21 verfügen,- are stable as asp "deletion mutants under non-selective field conditions or have an overall stability of <10" u or <10 ~ 21 in the case of two or three-mark strains with reverting mutations,
— infolge einer Wirtsspezies-angepaßten ausgewogenen Attenuierung immunogen sind, und- are immunogenic as a result of a host species-adapted balanced attenuation, and
— bei Verwendung eines antiepidemischen Markers nicht oder vermindert zur Impfstamm-Infektkettenbildung befähigt sind, so daß die nach diesem Prinzip hergestellten Impfstämme die WHO-Forderung nach Stabilität, Immunogenität und verminderter Übertragungsfähigkeit vollauf erfüllen.- when using an antiepidemic marker are not or less capable of vaccine strain Infektkettenbildung so that the vaccine strains prepared according to this principle fully meet the WHO requirement for stability, immunogenicity and reduced transmission capacity.
Die nachfolgend angeführten asp" Einmarker-Impfstämme (Reversion in vitro <10"8 bzw. nicht nachweisbar) und Zwei- bzw. Dreimarker-Impfstämme (unter Verwendung von Markern mit einer Reversionshäufigkeit von < 10~7), wie z. B. Salmonella typhimurium (S. tm)The listed below asp "single marker vaccine strains (reversion in vitro <10" 8 or not detectable), and two- and three-marker vaccine strains (using markers with a reversion frequency of <10 ~ 7), such as. Salmonella typhimurium (S. tm)
—S.tmasp"23 i.p. LD50 Maus-102'3 Keime-S.tmasp "23 ip LD 50 mouse 10 2 ' 3 germs
— S.tmasp" 10 i.p. LD50 Maus— 104·3 Keime- S.tmasp "10 ip LD 50 mouse - 10 4 · 3 germs
— S. tm asp" 15 i.p. LD60 Maus - 1067 Keime- S. tm asp "15 ip LD 60 mouse - 10 67 germs
sowie von asp" Klonen dieser Attenuierungshöhe aufgebaute Mehrmarker-Mutante, wie z. B. S.tmasp"10/hstoderrbt i.p. LD50 Maus —105 Keimeand multi-marker mutant constructed by asp "cloning at this attenuation level, such as" Stmasp "10 / h dysfunction ip LD 50 mouse -10 5 germs
— S.tmasp"10/rbt/nal 19 i. p. LD50Maus~ 106 Keime- S.tmasp "10 / color 19 ip LD 50 mouse ~ 10 6 germs
— S.tmasp~10/hst/rif10 i.p. LD50 Maus-106·5 Keime- S.tmasp ~ 10 / hst / rif10 ip LD 50 mouse-10 6 · 5 germs
— S.tmasp"10/hst/rif24 i.p. LD50 Maus-107 Keime- S.tmasp "10 / hst / rif24 ip LD 50 mouse-10 7 germs
sind zur Herstellung von hochimmunogenen Lebendimpfstoffen nach an sich bekannten Verfahren geeignet.are suitable for the production of highly immunogenic live vaccines according to known methods.
Salmonella typhimurium (S. tm) Wildstamm 415 (Institut für Sera und Impfstoffe „Metschnikov", Moskau); i. ρ LD50 Maus < 101 Salmonella typhimurium (S. tm) wild strain 415 (Institute of Sera and Vaccines "Metschnikov", Moscow); i.p. LD 50 mouse <10 1
Nährbödenbreeding grounds
— Nähragar und Nährbouillon (Trockenmedium: SIFIN, Berlin-Weißensee)- nutrient agar and nutrient broth (dry medium: SIFIN, Berlin-Weissensee)
— Minimalmedium (Mm)- Minimal medium (mm)
Modifizierte (Falkow et al., J. Bacteriol. 84,1 303-1 312 11962]) M9-Salzlösung (Daviset Minigioli, J. Bacteriol.60,17-28[195O]) mit bzw. ohne 2,5% gewässertem Agar und 0,5% Dextrose. Das Minimalmedium wird als solches zur Vermehrung desS.tm Wildstammes eingesetztModified (Falkow et al., J. Bacteriol 84.1303-1 312 11962]) M9 saline (Daviset Minigioli, J. Bacteriol. 60, 17-28 [195O]) with or without 2.5% watering Agar and 0.5% dextrose. The minimal medium is used as such for propagation of the S.tm wild strain
— Substituiertes Minimalmedium- Substituted minimal medium
Minimalmedium plus 100^g Asparaginsäure (Reanal, Budapest)/ml MinimalmediumMinimal medium plus 100 g aspartic acid (Reanal, Budapest) / ml minimal medium
— Verwendete Mäuse- used mice
T6-18 Gramm schwere ICR-Mäuse (VEB Versuchstierproduktion Schönwalde)T6-18 gram ICR mice (VEB experimental animal production Schönwalde)
— Vergleichende Prüfung von Wildstamm und Mutanten auf Virulenzverhalten und Immunogenität: i. p. Applikation logarithmisch abgestufter Keimzahlen in 0,5ml physiologischer Kochsalzlösung an jeweils 10 Mäusen- Comparative testing of wild strain and mutants for virulence and immunogenicity: i. p. Application logarithmically graduated bacterial counts in 0.5 ml physiological saline at 10 mice each
• Virulenzverhalten: Bestimmung der Absterbeordnung innerhalb von 2 Wochen• Virulence behavior: Determination of the order of death within 2 weeks
·· Immunogenität: Belastung der die Immunisierung überlebenden bzw. tolerierenden Mäuse am 15.Tag i. p. mit Wildstamm-Keimen (> 100 LD50) in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung und Bestimmung der Anzahl der innerhalb von 2 Wochen sterbenden Mäuse· Immunogenicity: challenge the immunization-surviving or tolerant mice ip on day 15 with wild-type (> 100 LD 50 ) in 0.5 ml saline and determine the number of dying mice within 2 weeks
Prüfung der Stabilität der MarkerTesting the stability of the markers
— asp--Marker:- asp markers:
108und 109 Keime der Impfstämme werden auf Minimalmedium gespatelt und nach 48 sowie 72 Stunden Bebrütung bei 370C die Zahl gewachsener Kolonien bestimmt10 8 and 10 9 germs of the vaccine strains are spatulated on minimal medium and determined after 48 and 72 hours incubation at 37 0 C the number of grown colonies
Stabilitätsforderung:Stability requirement:
• Für Einmarker-Impfstämme: Reversionshäufigkeit <10~8 bzw. in vitro nicht nachweisbar• For single-marker vaccine strains: reversion frequency <10 ~ 8 or undetectable in vitro
• FürMehrmarker-lmpfstämme: Reversionshäufigkeit <10"7 • For multi-marker vaccine strains: reversion frequency <10 " 7
— hst- und rbt-Marker- hst and colored markers
siehe DD-WP 231491 und DD-WP angemeldetsee DD-WP 231491 and DD-WP registered
— Rifampicin- (RNA-Polymerase) und Nalidixinsäure-Resistenz (Gyrase) siehe DD-WP 155294- Rifampicin (RNA polymerase) and nalidixic acid resistance (gyrase) see DD-WP 155294
Herstellung von asp"-Mutanten und Auswahl eines geeigneten Klons: Die Isolierung von Asparagin-auxotrophen Phänotypen erfolgt mit an sich bekannten Verfahren (MNG-Mutagenese, Penicilinscreening und replica plating; sinngemäß gilt ein Gleiches für Spontanmutanten sowie Transposon-Mutagenese).Preparation of Asp "Mutants and Selection of a Suitable Clone: The isolation of asparagine auxotrophic phenotypes is carried out by methods known per se (MNG mutagenesis, penicillin screening and replica plating, analogously for spontaneous mutants and transposon mutagenesis).
Die bei diesem Vorgehen isolierten asp~-Klone wurden hinsichtlich ihrer Stabilität überprüft und alle Stämme mit einer Reversiohshäufigkeitzur Prototrophie von <10~8 auf ihr Virulenzverhalten am i. p. Mäusemodell getestet. Nachfolgende Tabelle 1 orientiert über die Zahl der stabilen Klone und ihr sich unter Vorbehalt auf wenigstens drei Gruppen verteilendes Virulenzverhalten.The isolated in this procedure asp ~ clones were checked for stability and all the tribes with a Reversiohshäufigkeitzur prototrophy of <10 -8 tested for their virulence on ip mouse model. Table 1 below shows the number of stable clones and their virulence behavior, which is subject to reservations about at least three groups.
Sialmonella Typhimurium: Einfluß der Asparaginsäure-Auxotrophie auf das Virulenzverhalten; getestet in zwei getrennten Versuchen bei neun Klonen (Genotypen mit einer Reversionshäufigkeit s 10~8 am i. p. MäusemodellSialmonella Typhimurium: Influence of aspartic acid auxotrophy on virulence behavior; tested in two separate experiments on nine clones (genotypes with a reversion frequency s 10 ~ 8 on the ip mouse model
15 6,8 6,5 13 6,5 7,515 6.8 6.5 13 6.5 7.5
16 7,0 7,0 18 7,5 7,5 11 8,0 7,016 7.0 7.0 18 7.5 7.5 11 8.0 7.0
Wildstamm <1 < 1Wild strain <1 <1
Die Asparaginsäure-Auxotrophie mit einer in vitro nicht nachweisbaren bzw. < 10~8 betragenden Reversion zur Prototrophie wie z.B. 'Aspartic acid auxotrophy with in vitro undetectable or <10 ~ 8 reversion to prototrophy such as'
— S. tm asp~ 23 i. p. LD50 Maus —102'3 Keime- S. tm asp ~ 23 ip LD 50 mouse -10 2 ' 3 germs
— S. tm asp" 10i. p. LD50 Maus ~104'3 Keime- S. tm asp "10i.p. LD 50 mouse ~ 10 4 ' 3 germs
— S. tm asp" 15 i.p. LD50 Maus-106·7 Keime- S. tm asp "15 ip LD 50 mouse-10 6 · 7 germs
sind als Einmarker-Impfstämme für die Herstellung von Lebendimpfstoffen geeignet.are suitable as single-marker vaccine strains for the production of live vaccines.
Für die nachfolgend unter Beispiel 2,3 und 4 beschriebene Herstellung der Zwei- bzw. Dreimarker-Impfstämme wurde beispielsweise aus der Gruppe Il — asp~-Mutante mit mäßig ausgeprägter Attenuierungshöhe — der Klon asp~ 10 verwendet, sinngemäß läßt sich ein Gleiches mit asp" Klonen geringerer oder höherer Attenuierung durchführen, um die jeweils gewünschte Wirtsspezies angepaßte Attenuierungshöhe einzustellen.For the production of the two- or three-marker vaccine strains described below under Examples 2, 3 and 4, for example, the clone asp ~ 10 was used from the group II-asp ~ mutant with a moderately pronounced attenuation height. Analogously, the same with asp Perform cloning of lower or higher attenuation to set the attenuation level matched to the particular host species.
Herstellung der Zweimarker-Impfstämme asp~/hst und asp~/rbt durch Einbau der antiepidemischen Marker in die asp" 10Preparation of the two-marker vaccine strains asp ~ / hst and asp ~ / colored by incorporation of the anti-epidemic markers in the asp "10
Einmarker-Mutante:Single marker mutant:
In den oben beschriebenen S. tmasp" 10 Klon wurde, wie in DD-WP 218836A1 bzw. DD-WP angemeldet beschrieben, ein hst- bzw. rbt-Marker mit einer Stabilität < 10"7 eingebaut, wodurch stabile asp~/hst bzw. rbt Zweimarker-Impfstämme entstehen wieIn the S. tmasp "10 clone described above, as described in DD-WP 218836A1 or DD-WP, a hst or colored marker with a stability <10" 7 was incorporated, whereby stable asp ~ / hst resp colored two-mark vaccine strains arise as
z.B. asp" 10/hst oder asp" 10 rbt mit einer Gesamtstabilität von <10"14 eg asp "10 / hst or asp" 10 colored with an overall stability of <10 " 14
Einbau des dritten attenuierenden Stoffwechseldrift-Markers, einer Rifampicin-Resistenz (RNA-Polymerase)-Mutation bzw. Nalidixinsäure-Resistenz- (Gyrase)-Mutation mit zusätzlicher Attenuierung, welche am Mäusemodell die i. p. LD50-Werte des S.Incorporation of the third attenuating metabolic drift marker, a rifampicin resistance (RNA polymerase) mutation or nalidixic acid resistance (gyrase) mutation with additional attenuation, which on the mouse model shows the ip LD 50 values of the S.
tm-Zweimarkerstammes asp" 10hst bzw. rbt von ~105 Keime auf 106 bis 107 Keime anhebt:tm two-mark stem asp "10hst or colored by ~ 10 5 germs on 10 6 to 10 7 germs raises:
Von den oben beschriebenen S. tm asp" 10hst bzw. rbt Zweimarkerstämmen wurde wie in DD-WP 155294 beschrieben, mittels spontaner Mutation Rifampicin-Resistenzm'utanten bzw. Nalidixinsäuremutanten hergestellt und am i. p. Mäusemodell diejenigen Klone ausgelesen und überprüft, welche den i.p. LD50-Wert der S. tm asp" lOhstbzw. rbtZweimarkerstämme vonAs described in DD-WP 155294, rifampicin-resistant mutenants or nalidixic acid mutants were prepared from the above-described S. tm asp "10hst or colored groups, and the clones were read and checked on the ip mouse model which contained the ip LD 50 Value of S. tm asp "lOhstbzw. colored twins of
~105 Keimen um 1-2 log. Stufen anhoben.~ 10 5 germs around 1-2 log. Raised levels.
Über das i. p. Virulenzverhalten und die Immunogenität der auf diese Weise hergestellten Dreimarker-Impfstämme sowie die Vorläufer-Impfstämme asp" 10 und asp" 10/asp~ 10/hst bzw. asp" 10/rbt orientiert Tabelle 2About the i. p. Virulence behavior and the immunogenicity of the Dreimarker vaccine strains prepared in this way and the precursor vaccine strains asp "10 and asp" 10 / asp ~ 10 / hst or asp "10 / colored oriented Table 2
Vergleichende Attenuierungshöhe und Immunogenität von Einmarker-Impfstamm S. tm asp" 10, Zweimarker-Impfstämme S. tm asp" 10/hst bzw. rbt sowie den Dreimarker-Impfstämmen S. tm asp" 10/rbt/nal 19; asp" 10/hst/rif 10 und asp"/hst/rif 24 am i. p. MäusemodellComparative level of attenuation and immunogenicity of single-marker vaccine strain S. tm asp "10, two-marker vaccine strains S. tm asp" 10 / hst, and the three-marker vaccine strains S. tm asp "10 / color 19; asp" 10 / hst / rif 10 and asp "/ hst / rif 24 on the ip mouse model
asp" 10 asp" 10 asp" 10 asp" 10 asp" 10 asp" 10asp "10 asp" 10 asp "10 asp" 10 asp "10 asp" 10
Wildstamm-Kontr.Wild strain Contr.
hst rbt rbt hst hsthst colored beer
nal19 rif 10 rif 24nal19 rif 10 rif 24
4,3 5,0 5,0 6,0 6,5 7,04.3 5.0 5.0 6.0 6.0 7.0
-90% -95% -95% -95% -95% -95%-90% -95% -95% -95% -95% -95%
0%0%
Die in Tabelle 2 aufgeführten Zwei- und Dreimarker-Impfstämme sind — als Beispiel für weitere nach gleichem Schema mit anderen asp" Ausgangsklonen (gleicher, geringerer oder höherer Attenuierung) aufgebauten Mehrmarker-Impfstämmen — für die Herstellung von Lebendimpfstoffen geeignet.The two- and three-marker vaccine strains listed in Table 2 are suitable for the production of live vaccines, as examples of further multi-marker vaccine strains constructed in the same way with other asp) starting clones (equal, lower or higher attenuation).
Herstellung von S. tm asp"/Stoffwechseldrift Zweimarker-Impfstämmen zur Verwendung als Lebendimpfstoff. In einen geeigneten asp" Klon (ohne antiepidemischen Marker) wird sinngemäß entsprechend Beispiel 3 eine geeignete Stoffwechseldrift-Mutation eingebaut.Preparation of S. tm asp "/ Metabolism Drone Two-marker vaccine strains for use as a live vaccine A suitable metabolic drift mutation is incorporated in a suitable asp" clone (without anti-epidemic markers) analogously to Example 3.
(Es ist auch möglich — obwohl ein rein akademisches Anliegen — solche Zweimarker-Impfstämme dadurch zu erhalten, indem man von einem unter Beispiel 3 beschriebenen Drei marker-Impfstamm den antiepidemischen Marker experimentell zur Wildtyp-Toleranz revertiert.)(It is also possible, although purely academic, to obtain such two-marker vaccine strains by experimentally reverting the antiepidemic marker to wild-type tolerance from a Three Marker vaccine strain described in Example 3.)
Abtrennung der Einmarker-Impfstämme S. tm asp", der Zweimarker-Impfstämme S. tm asp" 10/hst bzw. rbt und der Dreimarker-Impfstämme S. tm asp" 10/hst bzw. rbt/rif bzw. nal von WildstämmenSeparation of the single-marker vaccine strains S. tm asp ", the two-marker vaccine strains S. tm asp" 10 / hst or colored and the three-marker vaccine strains S. tm asp "10 / hst or rbt / rif or nal of wild strains
Die Impfstämme unterscheiden sich von Wildstämmen wie in Tabelle 3 ausgewiesen. The vaccine strains differ from wild strains as shown in Table 3.
Abtrennung der Impfstämme von Wildstämmen durch nachweisbares oder fehlendes Wachstum auf unterschiedlichen NährbödenSeparation of vaccine strains from wild strains by detectable or lacking growth on different nutrient media
Massenkultur, Präparation und Anwendung der Impfstämme:Mass culture, preparation and application of vaccine strains:
Zur Herstellung des Lebendimpfstoffes werden die Impfstämme z. B. in einem halbsynthetischen Nährmedium bei 370C bis zum Ende der logarithmischen Phase im Fermentor gezüchtet. Die Bakteriensuspensionen werden als Lyophilisat (oder als Flüssigdosen) präpariert. Der so erhaltene Impfstoff wird in der Regel als einmalige Dosis von 107 bis 1010 Lebendkeimen an Nutztiere oral (evtl. parenteral) verabreicht.For the production of the live vaccine vaccine strains z. B. in a semi-synthetic nutrient medium at 37 0 C until the end of the logarithmic phase in the fermentor bred. The bacterial suspensions are prepared as lyophilisate (or as liquid doses). The vaccine thus obtained is usually administered as a single dose of 10 7 to 10 10 live germs to farm animals orally (possibly parenterally).
An Stelle einer zwei- bis dreimaligen Applikation eines an der Grenze zur Uberattenuierung sich bewegenden Impfstammes bestehen die AlternativenInstead of two to three applications of a vaccine strain moving at the border to the over-attenuation, the alternatives exist
— Einsatz eines etwas geringer attenuierenden Impfstammes, oder- Use of a slightly lower attenuating vaccine strain, or
— Erstimmunisierung mit einem an der Grenze zur Uberattenuierung sich bewegenden Impfstamm und Booster nach angemessener Zeit mit einem Impfstamm geringerer Attenuierungshöhe.- Initial immunization with a vaccine strain and booster moving at the border of overabundance after a reasonable time with a vaccine strain of lower attenuation level.
Claims (6)
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD86295162A DD253184A1 (en) | 1986-10-10 | 1986-10-10 | METHOD FOR PRODUCING STABLE SALMONELLA VACCINE STEM WITH AN ATTENANCE TREATMENT ADJUSTED TO ANY OF THE INDUSTRY SPECIES |
EP87114770A EP0263528B1 (en) | 1986-10-10 | 1987-10-09 | Live salmonella vaccine with a host species-adapted attenuation and an anti-epidemic potential |
DE3751641T DE3751641D1 (en) | 1986-10-10 | 1987-10-09 | Live Salmonella vaccines with host species-adjusted attenuation levels and anti-epidemic potency |
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DD86295162A DD253184A1 (en) | 1986-10-10 | 1986-10-10 | METHOD FOR PRODUCING STABLE SALMONELLA VACCINE STEM WITH AN ATTENANCE TREATMENT ADJUSTED TO ANY OF THE INDUSTRY SPECIES |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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DD86295162A DD253184A1 (en) | 1986-10-10 | 1986-10-10 | METHOD FOR PRODUCING STABLE SALMONELLA VACCINE STEM WITH AN ATTENANCE TREATMENT ADJUSTED TO ANY OF THE INDUSTRY SPECIES |
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1986
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