DD249282A1

DD249282A1 - PROCESS FOR ENRICHMENT AND RECOVERY OF ALCOHOL OXIDASE

Info

Publication number: DD249282A1
Application number: DD29030786A
Authority: DD
Inventors: Peter Liebs; Joachim Huth; Schrapel; Margrit Passarge; Sedler; Karin Ganzel; Reinhard Renneberg; Klaus Riedel; Heyer; Hans-Georg Mueller
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1986-05-16
Filing date: 1986-05-16
Publication date: 1987-09-02

Abstract

Das Verfahren zur Anreicherung und Gewinnung von Alkoholoxidase (AO) betrifft das Gebiet der technischen Mikrobiologie. Das Ziel der Erfindung besteht darin, AO in Hefen, die auf spezifische Art kultiviert werden, anzureichern und daraus zu gewinnen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass geeignete Hefen mit dem Ziel einer hohen Biomasseausbeute in einem Kohlenhydrat als C-Quelle (vorzugsweise Glucose) enthaltendem Medium unter p H-statischen Bedingungen bei p H 3-7, vorzugsweise 5,0 kultiviert werden, wobei ein p H-Korrekturmittel aus einer methanologischen Lauge und Saeure besteht und vorzugsweise Methanol in Konzentrationen von 20-80%, vorzugsweise 50% zur Induktion der AO eingesetzt wird.The process for the enrichment and recovery of alcohol oxidase (AO) relates to the field of technical microbiology. The object of the invention is to enrich and to recover AO in yeasts which are cultivated in a specific way. According to the invention, the object is achieved by culturing suitable yeasts with the aim of high biomass yield in a carbohydrate medium containing C source (preferably glucose) under p H static conditions at p H 3-7, preferably 5.0 a p H correction agent consists of a methanological lye and acid and preferably methanol in concentrations of 20-80%, preferably 50% for the induction of AO is used.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung und Gewinnung von Alkoholoxidase (AO) in Hefen, die auf spezifische Art kultiviert werden.The invention relates to a process for the enrichment and recovery of alcohol oxidase (AO) in yeasts, which are cultivated in a specific way.

Einsatzgebiete für die Anwendung der Erfindung sind in der mikrobiologisch-biotechnologischen, in der chemischen sowie der Nahrungs- und Genußmittel-Industrie, sowie in der klinischen Diagnostik, Toxikologie und im Umweltschutz.Areas of use for the application of the invention are in the microbiological-biotechnological, in the chemical and the food and beverage industry, as well as in clinical diagnostics, toxicology and environmental protection.

Characteristic of the known technical solutions

Es sind Verfahren zur Gewinnung mikrobieller Biomasse auf der Basis von Methanol als C- und Energiequelle bekannt (WP 200895), wobei vorwiegend fakultativ methylotrophe Hefen der Gattungen Candida, Hansenula, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces undTorulopsis eingesetzt werden. Die gewonnene Biomasse findet Verwendung als Futtermittel. Weiterhin wurden Untersuchungen durchgeführt, die die Gewinnung der intrazellulär lokalisierten AO der auf Methanol kultivierten Hefen zum Ziel haben (Poggenkamp et al., Eur. J. Biochem. 59, 231 [1975], Veenhuis et al., Arch. Microbiol. 111,123 [1976], Tani et al., Agr. Biol. Chem. 36,76 [1972b], Tani et al., Agr. Biol. Chem. 36, 68 [1972 a], Veenhuis et al.. Arch. Microbiol. 120,167 [1979], van Dijkenetal.Arch. Microbiol. 111,137 [1976], Pateletal., Arch. Biochem. Biophys. 120,481 [1981], Bormann et al., Arch. Microbial. · 117,67 [1978], Sahm et al., Eur. J. Biochem. 36, 250 [1973], Ledeboer, A. M. et al., Nucl. Acid. Res. 13,3063 [1985]). Des weiteren sind Verfahren zur Herstellung von AO auf der Basis o.g. Hefen beschrieben (DE 2830327 und EPA 0019937), wobei die AO für analytische Zwecke verwendet wird bzw. Einsatz zur Beseitigung von Sauerstoff in wäßrigen Flüssigkeiten findet (EPA 0071990).Methods are known for obtaining microbial biomass based on methanol as a source of C and energy (WP 200895), predominantly using methylotrophic yeasts of the genera Candida, Hansenula, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces and Torulopsis. The biomass is used as feed. Furthermore, studies have been carried out aimed at obtaining the intracellularly localized AO of the yeasts cultured on methanol (Poggenkamp et al., Eur. J. Biochem. 59, 231 [1975], Veenhuis et al., Arch. Microbiol. Chem. 36, 68 [1972a], Tani et al., Agr. Biol. Chem. 36, 68 [1972 a], Veenhuis et al., Arch. Microbiol., 120,167 [1979], van Dijkenetal.Arch Microbiol 111,137 [1976], Pateletal., Arch. Biochem Biophys. 120,481 [1981], Bormann et al., Arch. Microbial. 117, 67 [1978], Sahm et al Eur. J. Biochem., 36, 250 [1973], Ledeboer, AM et al., Nucl. Acid Res., 13, 3063 [1985]). Further, methods for producing AO are based on the above. Yeasts described (DE 2830327 and EPA 0019937), wherein the AO is used for analytical purposes or use for the removal of oxygen in aqueous liquids finds (EPA 0071990).

Die verwendeten Hefen zeigen allerdings beim Wachstum auf Methanol als C-Quelle ein langsames Wachstum und eine im Vergleich zum Wachstum auf Glucose geringere Biomasseausbeute. Dies gilt sowohl für Batch-Kultivierungen, die Fermentationszeiten bei 1-2% Methanol bis zu 72 Stunden erfordern (Fujii et al., Agric. Biol. Chem. 36, 2297 [1972]) als auch für kontinuierliche Kultivierungen, für die Wachstumsraten von 0,03-0,1 h~¹ beschrieben werden (DE 2830327). Außerdem sind für einen thermotoleranten H. polymorphen Stamm auch Verweilzeiten von 3,5-20 Stunden bekannt.The yeasts used, however, show slow growth when grown on methanol as the C source and lower biomass yield compared to growth on glucose. This applies to both batch cultivations, which require fermentation times of 1-2% methanol up to 72 hours (Fujii et al., Agric. Biol. Chem. 36, 2297 [1972]), as well as for continuous cultivations, for the growth rates of 0.03-0.1 h ~ ^{1 are} described (DE 2830327). In addition, residence times of 3.5-20 hours are known for a thermotolerant H. polymorphic strain.

Dem Nachteil des langsamen Wachstums und der geringen Biomasseausbeute wird von einigen Autoren so begegnet, daß eine Präkultivierung der Hefen auf Glucose erfolgt (was zu einem schnellen Wachstum führt (24Std.) und nachfolgend Methanolzusätze appliziert werden, so daß in weiteren 50 Std. die Zellen zur AO-Gewinnung geerntet werden können [Tani et al., Agr. Biol. Chem. 36, 68 [1972 a]). Aus DE 2830327 ist weiterhin ein Verfahren bekannt, in dem als zusätzliche C- und Energiequellen, die die AO-Bildung nicht katabolitreprimierenden Verbindungen Glycerol, Sorbit oder Xylose verabreicht werden.The disadvantage of the slow growth and the low biomass yield is encountered by some authors so that a pre-cultivation of the yeasts on glucose (which leads to a rapid growth (24h) and subsequently methanol additives are applied, so that in another 50 hrs the cells can be harvested for AO extraction [Tani et al., Agr. Biol. Chem. 36, 68 [1972 a]). From DE 2830327 a method is further known in which are administered as additional C and energy sources, the non catabolite repressing compounds AO formation glycerol, sorbitol or xylose.

Die Unzulänglichkeit der beschriebenen Verfahren liegt darin, daß Kultivierungen auf Methanol einerseits zu langsamen Wachstum und niedriger Zellausbeute führen, bei Fermentation auf Glucose hingegen keine AO gebildet wird. Auch Präkultivierungen auf Glucose mit einem Transfer auf ein Methanolmedium sind gekennzeichnet durch lange Lag- bzw. Adaptationszeiten.The inadequacy of the described method is that cultivations of methanol on the one hand lead to slow growth and low cell yield, on fermentation on glucose, however, no AO is formed. Precultivations to glucose with a transfer to a methanol medium are also characterized by long lag or adaptation times.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein ökonomisches Verfahren zur Anreicherung und Gewinnung von Alkoholoxidase in Hefen zu entwickeln.The aim of the invention is to develop an economical process for the enrichment and recovery of alcohol oxidase in yeasts.

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Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in methylotrophen Hefen bei schnellem Wachstum der Organismen und hoher Zellausbeute gleichzeitig eine Bildung von Alkoholoxidase zu erreichen, so daß nach kurzen Fermentationszeiten die Biomasse geerntet und die Alhoholoxidase isoliert werden kann. Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß Hefen im pH-stat-Verfahren in einem Kohlenhydratmedium kultiviert werden und mit einem methanolischen pH-Korrekturmittel zur Induktion der AO appliziert wird, wobei der aktuelle Spiegel an Methanol entsprechend dem Zuwachs an Biomasse geregelt, d.h. dem jeweiligen physiologischen Zustand der Biomasse angepaßt wird. Als pH-Korrekturmittel hat sich eine methanolische Lauge und/oder Säure, vorzugsweise NaOH und/oder HCI bewährt, bei der Methanolkonzentrationen von 20-80%, vorzugsweise 50% Verwendung finden, wobei die Dosierung ggf. getrennt erfolgt. Als Mikroorganismen eignen sich methylotrophe Hefen der Gattungen Hansenula, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces und Torulopsis sowie vorzugsweise Candida.The invention is based on the object in methylotrophic yeasts with rapid growth of the organisms and high cell yield simultaneously to achieve formation of alcohol oxidase, so that after short fermentation times, the biomass harvested and the Alhoholoxidase can be isolated. According to the invention, this is achieved by culturing yeasts in the pH-stat method in a carbohydrate medium and applying them with a methanolic pH correcting agent to induce the AO, the actual level of methanol being regulated according to the increase in biomass, i. adapted to the respective physiological state of the biomass. As a pH correcting agent, a methanolic lye and / or acid, preferably NaOH and / or HCI has proven to be used in the methanol concentrations of 20-80%, preferably 50% use, the dosage is optionally carried out separately. Suitable microorganisms are methylotrophic yeasts of the genera Hansenula, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces and Torulopsis, and preferably Candida.

Die Fermentationen werden in temperierten, zwangsbelüfteten Fermentoren bei optimaler Durchmischung als kontinuierliches Verfahren oder als repeated-batch-Verfahren durchgeführt. Die Ernte der Biomasse erfolgt in der stationären Wachstumsphase.The fermentations are carried out in tempered, forced-ventilated fermentors with optimum mixing as a continuous process or as a repeated-batch process. The biomass is harvested during the stationary growth phase.

Die AO liegt nach Aufschluß der Zellen im Überstand als Rohextrakt vor und kann entsprechend dem Applikationszweck nach üblichen Verfahren aufgereinigt werden.The AO is present after digestion of the cells in the supernatant as crude extract and can be purified according to the application purpose by conventional methods.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend an Beispielen erläutert:The process according to the invention is explained below by way of examples:

example 1

In einem 5I Fermentor mit einem Arbeitsvolumen von 2,51 wird eine sterile Nährlösung folgender Zusammensetzung gegeben:In a 5I fermentor with a working volume of 2.51, a sterile nutrient solution of the following composition is added:

Glucose: 10g/l (NH₄)₂SO₄:4g/l, KH₂PO₄:1 g/l MgSO₄ · 7H₂O:0,7g/l, KH₂PO₄ · 3H₂O:0,16g/l, NaCI:0,5g/l,Ca(NO₃J₂ · 4H₂O:0,4g/l,Glucose: 10 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ : ₄ g / l, KH ₂ PO ₄ : 1 g / l MgSO ₄ .7H ₂ O: 0.7 g / l, KH ₂ PO ₄ .3H ₂ O: 0, 16 g / l, NaCl: 0.5 g / l, Ca (NO ₃ J ₂ .4H ₂ O: 0.4 g / l,

einer Spurensalzlösung bestehend aus: FeSO₄- 7H₂O:10g/l, ZnSO₄ 7H₂O:80g/l, MgSO₄- 4H₂O:64g/l, CuSO₄ · 5H₂O:8g/l, konz. HCI: 10ml/l, Hefeextrakt (Difco): 1 g/l, Biotin: 50^g/l, Vit. B₁: 250/ig/l.'trace acid solution consisting of: FeSO ₄ - 7H ₂ O: 10g / l, ZnSO ₄ .7H ₂ O: 80g / l, MgSO ₄ - 4H ₂ O: 64g / l, CuSO ₄ .5H ₂ O: 8g / l, conc. HCI: 10 ml / l, yeast extract (Difco): 1 g / l, biotin: 50 g / l, vit. B ₁ : 250 / g / l. '

Der pH-Wert betrug 5,0, die Fermentationstemperatur 30°C. Die Belüftungsrate wurde auf 1001/Std. eingestellt, die Rührgeschwindigkeit auf 1 400 U/min. Die Beimpfung erfolgte mit Candida boidinii (Stammsammlung ZIMET Jena) in einer Dichte von 0,185 (opt. Dichte bei 500 nm und 1 cm Küvettenschichtdicke). Die pH-Statierung wurde mit 1,5 N NaOH und 1,5 N HCI in 50% methanolischer Lösung vorgenommen. Die Fermentation wurde in der stationären Wachstumsphase nach 22Std.The pH was 5.0, the fermentation temperature was 30 ° C. The ventilation rate was set to 1001 / hr. adjusted, the stirring speed to 1 400 U / min. Inoculation was carried out with Candida boidinii (strain collection ZIMET Jena) at a density of 0.185 (optical density at 500 nm and 1 cm cuvette layer thickness). The pH-stating was carried out with 1.5 N NaOH and 1.5 N HCl in 50% methanolic solution. The fermentation was in the stationary growth phase after 22h.

abgebrochen. Die Ausbeute an Frischhefe betrug 60g.canceled. The yield of fresh yeast was 60g.

Der aus Frischhefe durch mechanischen Zellaufschluß und durch Zentrifugation als Überstand gewonnene Rohextrakt enthält AO mit einer spezifischen Aktivität von 0,8 U/mg Protein. Das pH-Optimum des Rohextraktes liegt im kolorimetrischen Test bei Verwendung von Zitratpuffer bzw. Phosphatpuffer zwischen 7 und 8.The crude extract obtained from fresh yeast by mechanical cell disruption and by centrifugation as supernatant contains AO having a specific activity of 0.8 U / mg protein. The pH optimum of the crude extract is between 7 and 8 in the colorimetric test when using citrate buffer or phosphate buffer.

Example 2

In einem 101 Fermentor mit einem Arbeitsvolumen von 7,51 wurde eine sterile Nährlösung in einer Zusammensetzung wie unter Beispiel 1 beschrieben gegeben.In a 101 fermentor with a working volume of 7.51, a sterile nutrient solution in a composition as described in Example 1 was given.

Die Kulturlösung wurde mit Candida boidinii in einer Dichte von 0,2 beimpft (0D₅₀J ££). Der pH-Wert wurde auf 5,0 eingestellt, zur pH-Statierung wurde eine 1,5N methanolische NaOH und 1,5N HCI verwendet, deren Methanolkonzentration 50% betrug. Die Temperatur wurde auf 30°C geregelt, die Belüftungsrate auf 300l/Std. eingestellt. Die Rührgeschwindigkeit betrug 1400U/min. Die Fermentation wurde nach 24Std, nachdem sich die Kultur in der stationären Wachstumsphase befand, abgebrochen. Die AO wurde wie unter Beispiel 1 dargestellt isoliert und charakterisiert. Die Ergebnisse entsprachen den unter Beispiel 1 beschriebenen.The culture solution was mixed with Candida boidinii in a density of 0.2 inoculated (0D ₅₀ J ££). The pH was adjusted to 5.0, for pH-stating a 1.5N methanolic NaOH and 1.5N HCl was used whose methanol concentration was 50%. The temperature was controlled at 30 ° C, the ventilation rate to 300l / h. set. The stirring speed was 1400 rpm. The fermentation was stopped after 24 hours after the culture was in the stationary growth phase. The AO was isolated and characterized as shown in Example 1. The results corresponded to those described in Example 1.

Example 3

Die Fermentation wurde.wie unter Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. In der stationären Phase (nach 24Std. Kultivierung) wurden dem Fermentor 21 Kultursuspension entnommen und wie bereits beschrieben, aufgearbeitet.The fermentation was carried out as described under Example 1. In the stationary phase (after 24 hours of culture) 21 culture suspension were removed from the fermentor and worked up as already described.

Der Fermentor wurde mit 21 frischer Nährlösung befüllt und konnte nach 18Std. geerntet werden.The fermenter was filled with 21 fresh nutrient solution and after 18 hr. be harvested.

Die repeated-batch-Fermentation läßt sich beliebig wiederholen. Die aus der Biomasse isolierte AO entspricht den im Beispiel 1 dargestellten Daten.The repeated-batch fermentation can be repeated as desired. The isolated from the biomass AO corresponds to the data shown in Example 1.

Example 4

Die Fermentation wurde,wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Nach Erreichen der log. Wachstumsphase erfolgte ein kontinuierlicher Zulauf frischer Nährlösung, dereinen D = μ-Wert von 0,15-0,35 hT¹ gewährleistet. Die im Ablauf befindliche Hefe wurde bei 0°C gesammelt und wie unter Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet. Die aus der Biomasse isolierte AO entspricht den im Beispiel 1 dargestellten Daten.The fermentation was carried out as described in Example 1. After reaching the log. Growth phase was a continuous feed of fresh nutrient solution, which ensures a D = μ value of 0.15-0.35 hT ¹ . The yeast in the process was collected at 0 ° C and worked up as described in Example 1. The isolated from the biomass AO corresponds to the data shown in Example 1.

Claims

1. A process for the enrichment and recovery of alcohol oxidase in optionally methylotrophic yeasts, characterized in that one inoculates a sterile nutrient solution having a pH of 3-7 and a fermentation temperature of 25-45 ° C with a yeast, a methanolic pH correction agent added, after entry into the stationary growth phase, the fermentation stops and the alcohol oxidase is isolated by methods known per se.

2. The method according to item 1, characterized in that the pH is 5 and the fermentation temperature at 30 ⁰ C.

3. The method according to item 1, characterized in that one uses as a methanolic pH correction agent, an alkali and / or acid at a methanol concentration of 20-80% and the dosage is optionally carried out separately.

4. The method according to item 1 and 3, characterized in that one uses NaOH and / or HCl in 50% methanolic solution.

5. The method according to item 1, characterized in that one carries out the fermentation as a repeated-batch process.

6. The method according to item 1, characterized in that one carries out the process as a continuous process.