DD246307B1 - METHOD OF PREPARING PFROPIC OPOLYMERS FOR THE OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS - Google Patents
METHOD OF PREPARING PFROPIC OPOLYMERS FOR THE OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESISInfo
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Description
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pfropfcopolymeren, die in der Festphasensynthese von Oligonucleotiden verwendet werden können.The invention relates to a process for the preparation of graft copolymers which can be used in the solid-phase synthesis of oligonucleotides.
Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt primär in der molekularbiologischen und gentechnologischen Forschung, darüber hinaus aber auch bei der industriemäßigen Nutzung der Gentechnologie.The field of application of the invention is primarily in molecular biological and genetic engineering research, but also in the industrial use of genetic engineering.
Als eine der beiden Basismethoden zur Festphasensynthese von Oligonucleotiden ist das sogenannte Phosphattriesterverfahren (S.A. Narang et al.. Methods Enzymol., Acad. Press 1980, 65,610) bekannt und weitgehend eingeführt. In diesem Verfahren werden als Träger, d.h. als Verbindungen, die in den verwendeten Lösungsmittelsystemen unlöslich sind und an denen die wachsende Oligonucleotidkette aufgebaut wird, wobei letztere durch einfache Filtration aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden kann, bisher unter anderem substituierte Acrylamid-Copolymerisats (M. J. Gait, S. G. Popov et al., Nucleic Acids Rea., Symp. Ser. No7,1980,242) sowie vernetzte Polystyrene (K. Miyoshi, T. Miyake et al.. Nucleic Acids Res. 1980,8,5473) eingesetzt. Wird jedoch einer der Träger aus diesen Verbindungsklassen herangezogen, so ergeben sich für das Phosphattriesterverfahren Effektivitätsverluste, denn diese Träger weisen gegenüber den einzusetzenden verschiedenen Lösungsmitteln unterschiedliche Quellbarkeit sowie bei wachsender Oligonucleotidkette eine Änderung im chemischen Verhalten auf; außerdem kann bei ihnen die Zugänglichkeit der auf dem Träger befindlichen Ankergruppen noch nicht befriedigen. Weiterhin tritt beim Kettenaufbau in 3'-5'-Richtung Depurinisierung des Desoxyadenosins bei Abspaltung der 5'-Tritylschutzgruppe im sauren pH-Bereich ein. In Verbindung mit dem Bemühungen, diese Nachteile des Trägerverfahrens zu überwinden, ist weiterhin über die Herstellung und den Einsatz von auf Polytetrafluorethylen-Pulver (PTFE-Pulver) gepfropften funktionalisierten Polystyrenen als Träger in der Festphasensynthese von Oligonucleotiden berichtet worden (V. K. Potapov, V. P. Veiko et al., Nucleic Acids Res. 1979, 6,2041; V. K. Potapov, S. I.Türkin et al., Dokl. Akad., Nauk SSSR 1978, 241,1352; O. N. Koroleva, V. K. Potapov et al., Chim. Prirod. Sojedinenij 1984,20,362). Die Pfropfpolymerisate werden hiernach durch Bestrahlung des PTFE-Pulvers im Vakuum mit y=Strahlung sowie anschließendes Überdestillieren einer definierten Menge Styren in das evakuierte Reaktionsgefäß hergestellt (Flüssigphasenpfropfung).As one of the two basic methods for the solid phase synthesis of oligonucleotides, the so-called phosphate triester method (S.A. Narang et al., Methods Enzymol., Acad., Press 1980, 65, 610) is known and widely introduced. In this process, as carriers, i. as compounds which are insoluble in the solvent systems used and on which the growing oligonucleotide chain is built up, the latter being able to be separated from the reaction mixture by simple filtration, hitherto inter alia substituted acrylamide copolymerizate (MJ Gait, SG Popov et al., Nucleic Acids Rea., Symp. Ser., No.7, 1980, 422) and cross-linked polystyrenes (Miyoshi, Miyake, et al., Nucleic Acids Res. 1980, 8, 5473). However, if one of the carriers from these classes of compounds is used, then the phosphate triester process will suffer from loss of effectiveness, since these carriers have different swellability compared with the various solvents to be used, and a change in the chemical behavior as the oligonucleotide chain grows; In addition, they can not satisfy the accessibility of the anchor groups located on the support. Furthermore, depurinization of the deoxyadenosine occurs in chain formation in the 3'-5 'direction when the 5'-trityl protective group is split off in the acidic pH range. In addition, in an effort to overcome these drawbacks of the carrier process, the preparation and use of polytetrafluoroethylene powder (PTFE powder) grafted functionalized polystyrenes as carriers in the solid phase synthesis of oligonucleotides has been reported (VK Potapov, VP Veiko et 1979, 6, 2141; VK Potapov, SITurkin et al., Dokl. Akad., Nauk SSSR 1978, 241, 1352; ON Koroleva, VK Potapov et al., Chim. Prirod., Sojedinenij 1984., Nucleic Acids Res , 20.362). The graft polymers are then prepared by irradiation of the PTFE powder under vacuum with y = radiation and then distilling over a defined amount of styrene into the evacuated reaction vessel (liquid phase grafting).
Bei dieser Methode entstehen jedoch keine einheitlichen, reproduzierbaren Produkte, d. h. hinsichtlich derErzielung definierter Pfropfgrade weist sie nur ein geringes Maß an Reproduzierbarkeit auf. Weiterhin entsteht bei dieser Methode der Herstellung von Pfropfcopolymeren ein hoher Anteil an Homopolymeren des'Styrens, der durch langwierige Extraktion mit organischen Lösungsmitteln vor dem Einsatz als Träger für die Oligonucleotidsynthese abgetrennt werden muß. Durch das unvollständige Eindringen des Styrens in die Hohlräume bzw. Poren der Partikel des PTFE-Pulvers wird außerdem nur eine ungleichmäßige Oberflächen-Pfropfung «rreicht. Dies hatzurfolge, daß derGrad der Zugänglichkeit der Ankergruppen bzw. derwachsenden Oligonucleotidketten nicht genügend hoch sowie in Abhängigkeit von den Herstellungsbedingungen ungleichmäßig und nicht gut reproduzierbar ist. Beim Phosphattriesterverfahren unter Einsatz von nach o.g. Verfahren gepfropften Trägern resultieren damit in der Regel vergleichsweise niedrige Oligonucleotidausbeuten, wie Übersicht 1 zeigt.However, this method does not produce uniform, reproducible products, ie. H. in terms of achieving defined graft levels, it has only a small degree of reproducibility. Furthermore, in this method of preparation of graft copolymers, a high proportion of homopolymers des'Styrens, which must be separated by tedious extraction with organic solvents before use as a carrier for oligonucleotide synthesis. Due to the incomplete penetration of the styrene into the cavities or pores of the particles of the PTFE powder, moreover, only an uneven surface grafting is achieved. This has the consequence that the degree of accessibility of the anchor groups or of the growing oligonucleotide chains is not sufficiently high and is uneven and not well reproducible, depending on the production conditions. In the phosphate triester method using o. Procedure grafted carriers thus result in generally comparatively low oligonucleotide yields, as overview 1 shows.
Bekannt ist andererseits ein Verfahren zur strahlenchemischen Herstellung von Pfropfcopolymeren (Patentschrift DD 135499; K. Friese et al.. Plaste und Kautschuk 29 (1982) S. 17-19), bei dem sowohl nach der Vorbestrahlungs-als auch nach der Synchronbestrahlungsmethode in der Gasphase mit Styren gepfropfte Polyolefine (Polyethylen, Polypropylen und Poly-1 buten) in technologisch besonders einfacher Verfahrensweise erhalten werden. Hierbei wurden die Pfropf produkte hergestellt, indem kompakte Partikel (unporöse Pulver,Granulat) bis ins Innere so gleichmäßig gepfropft wurden, daß sie in ihrer Struktur und in ihren physikalischen und anwendungstechnischen "Eigenschaften wie Zug- und Schlagfestigkeit oder Dehnung mit den nach der wesentlich aufwendigeren Flüssigphasen-Pfropfung erhaltenen Pfropfprodukten völlig gleichwertig waren. Diese Pfropfprodukte waren jedoch als Trägermaterial für die Oligonucleotidsynthese nicht geeignet.On the other hand, a process for the radiation-chemical preparation of graft copolymers is known (Patent DD 135499, K. Friese et al., Plaste and Kautschuk 29 (1982) pp. 17-19), in which both after the pre-irradiation as well as after the synchronous irradiation method in the Gas phase with styrene-grafted polyolefins (polyethylene, polypropylene and poly-1-butene) can be obtained in a technologically particularly simple procedure. In this case, the graft products were prepared by compact particles (non-porous powders, granules) were grafted so evenly inside that they in their structure and in their physical and performance characteristics such as tensile and impact strength or elongation with the after much more expensive However, these graft products were not suitable as carrier material for oligonucleotide synthesis.
Ziel der Erfindung y Aim of the invention y
Die Erfindung verfolgt das Ziel, für die Festphasensynthese von Oligonucleotiden gut verwendbare Pfropfcopolymere des Polytetrafluorethylen-Polystyren-Typs bereitzustellen.The invention aims to provide for the solid phase synthesis of oligonucleotides, useful polytetrafluoroethylene-polystyrene type graft copolymers.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur strahlenchemischen Herstellung von Pfropfcopolymeren des Polytetrafluorethylen-Polystyren-Typs zu beschreiben, das in definierten Pfropfgraden mit guter Reproduzierbarkeit herstellbare Produkte liefert, die, eingesetzt als Träger in der Oligonucleotidsynthese, zu höheren Ausbeuten führen.The invention has for its object to describe an improved process for the radiation-chemical production of graft copolymers of the polytetrafluoroethylene-polystyrene type, which produces in defined graft levels with good reproducibility producible products that, used as carriers in the oligonucleotide synthesis, lead to higher yields.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe wie folgt gelöst:According to the invention, this object is achieved as follows:
Zur Herstellung von Pfropfcopolymeren des Polytetrafluorethylen-Polystyren-Typs, die eine gute Eignung für die Festphasensynthese von Oligonucleotiden aufweisen, wird das an sich bekannte strahlenchemische Verfahren der Gasphasenpfropfung (synonyme Bezeichnung: strahlenchemische Pfropfpolymerisation in der Gasphase) herangezogen. Verfahrensgemäß wird das flüssige Monomere durch Erwärmen zunächst verdampft. Durch Durchleiten von Inertgas, vorzugsweise von Stickstoffgas, welches sich dabei mit dem Styren-Dampf sättigt, wird dieses dampfförmige Monomere während der Reaktionsdauer kontinuierlich zu dem mit Polymerpulver gefüllten Pfropfreaktor geleitet. In diesem Reaktor, der gleichzeitig der energiereichen ionisierenden Strahlung einer y^oder Elektronen-Bestrahlungsanlage ausgesetzt ist (Synchronbestrahlung), findet bei einer Einsatztemperatur von 400C bis 800C und bei einem (Rest-)Sauerstoffgehalt unter 200 ppm die Pfropfreaktion zwischen dem PTFE-PuIver und dem kontinuierlich zugeführten dampfförmigen Styren statt, wobei das Pulver zweckmäßigerweise durch Wirbeln oder Rütteln bewegt wird. Die Bestrahlung erfolgt mit einer Dosisleistung von 0,1 kGy/h bis 10,0 kGy/h zeitgleich zur Pfropfung, und die Bestrahlung wird auf das PTFE-Pulverwieauf das den Reaktor durchströmende dampfförmige Styren gleichermaßen erstreckt. Die Bestrahlung wird gleichfalls für die Dauer von 1 Stunde bis zu 10 Stunden vorgenommen.For the preparation of graft copolymers of the polytetrafluoroethylene-polystyrene type, which have a good suitability for the solid phase synthesis of oligonucleotides, the per se known radiation-chemical gaseous phase grafting method (synonymous name: radiation-chemical graft polymerization in the gas phase) is used. According to the method, the liquid monomer is first evaporated by heating. By passing inert gas, preferably nitrogen gas, which saturates with the styrene vapor, this vaporous monomer is passed continuously during the reaction time to the filled with polymer powder graft reactor. In this reactor, which is simultaneously exposed to the high-energy ionizing radiation of a y ^ or electron irradiation system (synchronous irradiation), takes place at an operating temperature of 40 0 C to 80 0 C and at a (residual) oxygen content below 200 ppm, the grafting reaction between the PTFE powder and the continuously supplied vaporous styrene, the powder is suitably moved by whirling or shaking. The irradiation is carried out at a dose rate of 0.1 kGy / h to 10.0 kGy / h simultaneously with the grafting, and the irradiation is likewise extended to the PTFE powder jet on the vaporous styrene flowing through the reactor. The irradiation is also carried out for a period of 1 hour to 10 hours.
Die voranstehende Darlegung zur Verfahrensvorschrift für die Herstellung von Pfropfcopolymeren des PTFE-Pölystyren-Typs, die als Trägermaterial in der Oligonucleotidsynthese einsetzbar sind, stützt sich auf den überraschenden Befund, daß anders als in der bekannten strahlenchemischen Pfropfung von Polyolefinen mit Styren (in diesem Fall lieferten die Gas- und die Flüssigphasenvariante stets gleich gut für den dortigen Einsatzzweck verwendbare Pfropfprodukte) ausschließlich das in der Gasphase mit Styren gepfropfte PTFE-Pulver zu Materialien mit Parametern führte, wie sie für den genannten Einsatzzweck hinsichtlich Pfropfgrad, Quellverhalten, Ausbeute/Stufe sowie Gesamtausbeute zu fordern waren. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist weiterhin durch die folgenden Teilschritte gekennzeichnet: Zu Verfahrensbeginn, d.h. nach Einbringen des PTFE-Pulvers, wird die gesamte Pfropfapparatur, entweder durch genügend langes Durchspülenmit Inertgas, vorzugsweise mit reinem Stickstoff, oder durch nacheinanderfolgendes Evakuieren und Spülen mit Inertgas, vorzugsweise mit reinem Stickstoff, von Sauerstoff befreit. Die Bestrahlung wird mit Hilfe einer ^Bestrahlungsanlage durchgeführt.The above statement on the procedure for the preparation of graft copolymers of the PTFE-Pölystyren-type, which are used as a carrier material in the oligonucleotide synthesis, based on the surprising finding that unlike in the known radiation-chemical grafting of polyolefins with styrene (in this case provided the gas and the liquid phase variant always equally well for the purpose there usable grafting products) exclusively in the gas phase with styrene-grafted PTFE powder led to materials with parameters, as they for the stated application in terms of grafting, swelling behavior, yield / level and overall yield were demanding. A preferred embodiment of the method is further characterized by the following substeps: At the beginning of the procedure, i. after incorporation of the PTFE powder, the entire grafting apparatus is deoxygenated, either by sufficiently purging with inert gas, preferably with pure nitrogen, or by successively evacuating and purging with inert gas, preferably pure nitrogen. The irradiation is carried out with the aid of an irradiation facility.
Für die Herstellung der Träger eignen sich insbesondere poröse, volimunöse PTFE-Pulver mit Partikelgrößen zwischen 0,1 mm und 2,0 mm, vorzugsweise zwischen 0,5 mm und 1,0 mm. Gegenüber der Flüssigphasenpfropfung nach Potapov entsteht bei verfahrensgemäßem Vorgehen ein wesentlich geringerer Anteil an Homopolymeren des Styrens, der durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln wie Ethylacetat oderToluen vom Pfropfpolymeren entfernt wird.Porous, voluminous PTFE powders having particle sizes between 0.1 mm and 2.0 mm, preferably between 0.5 mm and 1.0 mm, are particularly suitable for the preparation of the supports. Compared to Potapov liquid phase grafting, the procedure according to the procedure produces a significantly lower proportion of homopolymers of the styrene, which is removed from the graft polymer by extraction with organic solvents, such as ethyl acetate or toluene.
Die Pfropfreaktion wird fortgeführt, bis der Pfropfgrad, definiert als in Prozent angegebene Massezunahme des Trägerpolymeren im Ergebnis der Pfropfung, bezogen auf die Ausgangsmasse des Polymeren, einen Wert zwischen 5% und 50%, vorzugsweise zwischen 5% und 20%, erreicht hat. Dieser Parameter zur Bewertung der Qualität der hergestellten Copolymerisate wird nach Trocknung der extrahierten Pfropfprodukte hinreichend zuverlässig nach einer modifizierten Elementaranalyse bestimmt, bei • der dersystematische Fehler, der aus dem Umstand, daß reines PTFE-Pulver nur unvollkommen zur Verbrennung gebracht werdenlcann, mit Hilfe einer Eichkurve korrigiert wird (vgl. Abbildung).The grafting reaction is continued until the degree of grafting, defined as the percent increase in mass of the carrier polymer as a result of the grafting based on the starting material of the polymer, has reached between 5% and 50%, preferably between 5% and 20%. This parameter for evaluating the quality of the copolymers produced is determined after drying the extracted graft products sufficiently reliably by means of a modified elemental analysis, with the dersystematic error resulting from the fact that pure PTFE powder can only be incompletely incinerated by means of a calibration curve corrected (see figure).
Die nachdem beschriebenen Verfahren hergestellten Pfropfcopolymere wurden mit sehr guter Reproduzierbarkeit und jeweils wohldefinierten Pfropfgraden erhalten. Bei anschließender Oligonucleotidsynthese wurden die günstigsten Ergebnisse mit solchen verfahrensgemäß hergestellten Pfropfcopolymeren erzielt, die einen Pfropfgrad vorzugsweise zwischen 5% und 20% aufwiesen. Gegenüber den nach der Potapov-Methoder hergestellten Pfropfcopolymeren (mit jeweils gleichem Pfropfgrad) verfügen die nach verfahrensgemäßer Pfropfung erhaltenen Träger über signifikant erhöhte Gesamtausbeuten in der Oligonucleotidsynthese (vgl. beiliegende Übersichten 1 bis 3)The graft copolymers produced by the processes described were obtained with very good reproducibility and well-defined grafting degrees. In subsequent oligonucleotide synthesis, the most favorable results were achieved with such graft copolymers prepared according to the method, which had a degree of grafting preferably between 5% and 20%. Compared with the graft copolymers prepared according to the Potapov method (each with the same degree of grafting), the carriers obtained according to the method according to grafting have significantly increased overall yields in the oligonucleotide synthesis (see enclosed overviews 1 to 3).
Die Vorteile des dargestellten Verfahrens werden weiterhin darin gesehen, daß The advantages of the illustrated method are further seen in that
— unter den Reaktionsbedingungen des Triesterverfahrens eine lösungsmittelunabhängigeZugängfichkeit der funktioneilen Gruppen besteht, was den Syntheseaufbau sowohl in 3'-5'-Richtung wie auch 5V3'-Richtung erlaubt;A solvent-independent accessibility of the functional groups exists under the reaction conditions of the triester method, which allows the synthesis in both the 3'-5 'direction and the 5V3' direction;
— für die erhaltenen Träger bei Pfropfgraden biszu 25% in Pyridin-keine Quellung beobachtet wird, was die Verwendung von Säulenreaktoren bei hoher Durchflußrate ermöglicht;- for the resulting carriers at graft levels up to 25% in pyridine - no swelling is observed, which allows the use of column reactors at high flow rate;
— die erhaltenen Träger unter den verwendeten Reaktionsbedingungen chemisch inert sind, undThe resulting supports are chemically inert under the reaction conditions used, and
— keine sterische Hinderung beim Kettenaufbau beobachtet wird.- No steric hindrance is observed in the chain construction.
1. 60g poröses Polytetrafluorethylen-Pulver mit Partikelgrößen zwischen 0,4mm und 1,2mm werden in einem temperierbaren Wirbelbettreaktor 3 Stunden durch Evakuieren und Spülen mit Reinst-Stickstoff von Sauerstoff befreit. Danach wird ein mit Styren bei 600C gesättigter Stickstoffstrom von 120l/Stunde durch den auf 700C erwärmten Reaktor geleitet und mit der Bestrahlung begonnen. Die Dosisleistung der eingesetzten Kobalt-60-Bestrahlungsanlage betrug im Reaktor 1 kGy/Stunde. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden (entspricht einem Pfropfgrad von 20,3%, bestimmt nach modifizierter Elementaranalyse) wird das Pfropfprodukt dem Reaktor entnommen und solange mit siedendem Ethylacetat extrahiert, bis kein Homo-Polystyren mehr nachweisbar ist (Fällung des Extraktes mit Methanol).1. 60g porous polytetrafluoroethylene powder with particle sizes between 0.4mm and 1.2mm are released in a temperature-controlled fluidized bed reactor for 3 hours by evacuation and rinsing with pure nitrogen of oxygen. Thereafter, a saturated with styrene at 60 0 C nitrogen flow of 120 l / hr is passed through the heated to 70 0 C reactor and starting the irradiation. The dose rate of the cobalt-60 irradiation system used was 1 kGy / hour in the reactor. After a reaction time of 4 hours (corresponds to a degree of grafting of 20.3%, determined by modified elemental analysis), the graft product is removed from the reactor and extracted with boiling ethyl acetate until homo-polystyrene is no longer detectable (precipitation of the extract with methanol).
Dieses Pfropfcopolymere ergab bei der Oligonucleotidsynthese die in Übersicht 2 angegebenen Ausbeuten/Stufe (berechnet aus der isolierten Endausbeute) sowie Gesamtausbeuten.This graft copolymer gave in the oligonucleotide synthesis the yields / levels given in Table 2 (calculated from the final isolated yield) as well as overall yields.
2. 50g poröses PTFE-Pulver mit Partikelgrößen zwischen 0,5mm und 2mm werden durch mehrmaliges Evakuieren und Spülen mit Stickstoff von Sauerstoff befreit und in einem Wirbelreaktor auf 40 0C erwärmt. Dann wird ein mit Styrendampf gesättigter Stickstoffstrom von 120 l/h durch die Schicht des PTFE-Pulvers geleitet. Die Sättigung des Stickstoffstromes mit Styrendampf wird erreicht, indem der Stickstoff durch eine mit Füllkörpern gefüllte, auf 350C temperierte Kolonne, auf deren Kopfständig flüssiges Styren gepumpt wird, geleitet wird. Gleichzeitig wird dabei mit der Gammastrahlung von Co-60 mit einer Dosisleistung von 1 kGy/h bestrahlt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde wird das Pfropfprodukt dem Reaktor entnommen und 15 Stunden mit siedendem Ethylacetat extrahiert; danach ist kein lösliches Homopolystyren mehr nachweisbar (Fällung mit Methanol). Der Pfropfgrad beträgt 5%.2. 50g porous PTFE powder with particle sizes between 0.5mm and 2mm are freed of oxygen by repeated evacuation and purging with nitrogen and heated to 40 0 C in a vortex reactor. Then, a stream of nitrogen saturated with styrene vapor of 120 l / h is passed through the layer of PTFE powder. The saturation of the nitrogen flow with styrene vapor is achieved by passing the nitrogen through a column filled with packing, tempered to 35 0 C column, is pumped to the head of liquid styrene is pumped. At the same time it is irradiated with the gamma radiation of Co-60 at a dose rate of 1 kGy / h. After a reaction time of 1 hour, the graft product is removed from the reactor and extracted with boiling ethyl acetate for 15 hours; thereafter, no soluble homopolystyrene is detectable (precipitation with methanol). The grafting degree is 5%.
Übersicht 1: Oligonucleotidausbeuten im Verfahren nach V.K. Potapov (entnommen aus O.N.Koroleva, V.K.Potapovetal., 1984, a.a.O.)Table 1: Oligonucleotide yields in the V.K. Potapov (taken from O.N. Koroleva, V.K. Potapovetal., 1984, supra)
Übersicht 2: Oligonucleotidausbeuten mit einem Träger, hergestellt unter den Verfahrensbedingungen gemäß Ausführungsbeispiel 1Table 2: Oligonucleotide yields with a carrier, prepared under the process conditions according to embodiment 1
Übersicht 3: Beispiele für verfahrensgemäße Reaktionsbedingungen zur Herstellung von PTFE-Styren-Pfropfcopolymeren als Träger für die OligonucleotidsyntheseTable 3: Examples of reaction conditions for the preparation of PTFE styrene graft copolymers as supports for oligonucleotide synthesis
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