DD238395A1

DD238395A1 - METHOD FOR SELECTIVELY FIXING BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES

Info

Publication number: DD238395A1
Application number: DD27753285A
Authority: DD
Inventors: Hans-Dieter Hunger; Gerhard Behrendt; Andre Rosenthal
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-06-19
Filing date: 1985-06-19
Publication date: 1986-08-20

Abstract

Es wird ein Verfahren zur selektiven Fixierung von Einzelkomponenten aus Gemischen biologisch aktiver Stoffe an Traegermaterialien zur Verfuegung gestellt, das darin besteht, dass die feste Phase mit der den biologisch aktiven Stoff oder das Stoffgemisch enthaltenden fluessigen Phase in Gegenwart eines fluessigen organischen Mediums in Kontakt gebracht wird oder dass nach Aufnahme des biologisch aktiven Stoffes oder des Stoffgemisches durch die feste Phase der Kontakt mit dem organischen Medium erfolgt. Das Verfahren kann vorteilhaft zur Trennung und Fixierung von Nukleinsaeuren, Nukleotiden, Proteinen, Plasmiden, Genfragmenten usw. aus Gemischen an feste Traeger angewendet werden.A process is provided for the selective fixation of individual components from mixtures of biologically active substances to carrier materials, which consists in contacting the solid phase with the liquid phase containing the biologically active substance or the substance mixture in the presence of a liquid organic medium or that after incorporation of the biologically active substance or of the substance mixture by the solid phase, the contact with the organic medium takes place. The method can advantageously be used for the separation and fixation of nucleic acids, nucleotides, proteins, plasmids, gene fragments etc. from mixtures to solid carriers.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Vefahren zur selektiven Fixierung von biologisch aktiven Stoffen an Trägermaterialien. Das Verfahren kann für analytische und präparative Aufgaben in der Molekularbiologie, Biochemie und Medizin angewandt werden.The invention relates to a method for selectively fixing biologically active substances to support materials. The method can be used for analytical and preparative tasks in molecular biology, biochemistry and medicine.

Characterization of the known technical solutions

Die Bindung von biologisch aktiven Stoffen (z. B. Proteine, Nukleinsäuren) an die verschiedendsten Träger ist bekannt, z. B.The binding of biologically active substances (eg proteins, nucleic acids) to the most diverse carriers is known, eg. B.

werden mit Trihalogen-Triazinen aktivierte Trägermaterialien und makromolekulare Massen mit chemisch aktiven Füllstoffen in EP 0134025 beschrieben. Dabei konnten bisher die einzelnen Komponenten von Gemischen der unterschiedlichsten biologisch aktiven Stoffe (besonders wichtig bei Zellaufschlüssen) nur statistisch gleichberechtigt an den Träger gebunden werden. Hierbei wurden die Träger in wässrigen Lösungen in Kontakt mit den biologisch aktiven Stoffen gebracht und ausschließlich in wässrigen Lösungen weiter verarbeitet.trihalogen-triazine-activated support materials and macromolecular compositions with chemically active fillers are described in EP 0134025. In the past, the individual components of mixtures of the most diverse biologically active substances (particularly important in cell disruptions) could only be bound to the carrier with equal statistical significance. In this case, the carriers were brought into contact with the biologically active substances in aqueous solutions and further processed exclusively in aqueous solutions.

Oligonukleotide konnten bisher nicht an Träger dieser Art gebunden werden.Oligonucleotides could not be bound to carriers of this type.

Nitrocellulose bindet nur Nukleinsäurefragmente größer als 50 Nukleotide. Die Fixierung längerer Fragmente erfolgt hierbei durch mehrstündiges Backen bei 80⁰C.Nitrocellulose only binds nucleic acid fragments larger than 50 nucleotides. The fixation of longer fragments takes place here by baking for several hours at 80 ⁰ C.

Weiterhin ist bekannt, Oligonukleotide an Ionenaustauscher zu binden. Dabei kann keine Selektivität erreicht werden, (siehe z. B.Furthermore, it is known to bind oligonucleotides to ion exchangers. In this case, no selectivity can be achieved (see, for example, US Pat.

A. Rosenthal, S. Schwertner, V. Hahn, H. D. Hunger, Solidphase Methods für Sequencing of Nucleic Acids I. Simultaneous Sequencing of different Oligonucleotids Using a New, Mechanically Stable Anion-Exchange Paper, Nucleis Acid Research, Vol. 13, No.4, S. 1173-1184 (1985).A. Rosenthal, S. Schwertner, V. Hahn, HD Hunger, Solid Phase Methods for Sequencing of Nucleic Acids I. Simultaneous Sequencing of Different Oligonucleotides Using a New, Mechanically Stable Anion-Exchange Paper, Nucleis Acid Research, Vol. 4, pp. 1173-1184 (1985).

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein Analyseverfahren für biologisch aktive Stoffe zur Verfügung stehen.The aim of the invention is to provide an analysis method for biologically active substances.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur Verfugung zu stellen, daß die selektive Fixierung von Einzelkomponenten aus Gemischen biologisch aktiver Stoffe an Trägermaterialien erlaubt.The invention is based on the object to provide a method that allows the selective fixation of individual components of mixtures of biologically active substances to support materials.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die feste Phase mit der den biologisch aktiven Stoff oder das Stoffgemisch enthaltenden flüssigen Phase in Gegenwart eines flüssigen organischen Mediums in Kontakt gebracht wird, ode daß nach Aufnahme des biologisch aktiven Stoffes oder des Stoffgemisches durch die feste Phase der Kontakt mit dem organischen Medium erfolgt.According to the invention the object is achieved in that the solid phase is brought into contact with the biologically active substance or the substance mixture containing liquid phase in the presence of a liquid organic medium, ode or that after receiving the biologically active substance or the mixture by the solid phase of Contact with the organic medium is done.

Biologisch aktive Stoffe im Sinne der Erfindung sind z. B. Proteine, Nucleinsäuren, Oligonucleotide, Nucleotide, Aminosäuren, Peptide, Plasmide, Genfragmente usw. Bei der Fixierung der biologisch aktiven Stoffe an Trägersysteme wurde gefunden, daß in Gegenwart organischer Lösungsmittel die einzelnen Verbindungsklassen in diesen organischen Lösungsmitteln bei der nucleophilen Substitution ein unterschiedliches Verhalten aufweisen. Dadurch können aus Gemischen biologisch aktiver Stoffe Einzelkomponenten selektiv zur Reaktion gebracht werden. Überraschend wurde gefunden, daß auf diesem Wege Oligonucleotide und Nucleotide selektiv aus Gemischen abgetrennt und fixiert werden können.Biologically active substances in the context of the invention are z. When fixing the biologically active substances to carrier systems, it has been found that in the presence of organic solvents, the individual classes of compounds in these organic solvents behave differently in nucleophilic substitution respectively. As a result, individual components can be selectively reacted from mixtures of biologically active substances. Surprisingly, it has been found that in this way oligonucleotides and nucleotides can be selectively separated and fixed from mixtures.

Als feste Phase sind in Wasser oder organischen Lösungsmitteln unlösliche anorganische oder organische niedermolekulare oder makromolekulare Stoffe oder deren Gemische geeignet, wobei diese Stoffe zur Ausbildung mindestens einer kovalenten Bindung zum biologisch aktiven Stoff in der Lage sind. Besonders geeignet als feste Phase sind Trägermaterialien, die aus synthetischen und/oder natürlichen Polymeren hergestellt werden und die vor ihrer Verwendung chemisch aktiviert werden. Eine solche Aktivierung kann mit Säurehalogeniden, Bromcyan, Di-oder Polyaldehyden, Diepoxiden, Diisocyanaten, Diazoverbindungen, Carbodiimiden usw. erfolgen.As a solid phase in water or organic solvents insoluble inorganic or organic low molecular weight or macromolecular substances or mixtures thereof are suitable, these substances are capable of forming at least one covalent bond to the biologically active substance. Particularly suitable as the solid phase are support materials which are prepared from synthetic and / or natural polymers and which are chemically activated before use. Such activation can be carried out with acid halides, cyanogen bromide, di- or polyaldehydes, diepoxides, diisocyanates, diazo compounds, carbodiimides, etc.

Als besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren sind makromolekulare Massen, die aus einer makromolekularen Verbindung in einer Konzentration von 5-80 Vol.-%, einer makromolekularen Verbindung mit4,6-Dihalogen-1,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Konzentration von 1-80 Vol.-%, aus 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-Triazin in einer Konzentration von 0,5-50 Vol.-%, aus Metallhalogeniden in einer Konzentration bis zu 20 Vol.-%, ggf. puffernden Substanzen bis zu 5 Vol.-%, ggf. flüssigen Dispersionsmitteln und ggf. weiteren Zusatzstoffen bestehen. Ein Verfahren zur Herstellung solcher, für das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeigneter fester Phasen, wird z.B. in der EP 134025 beschrieben (z.B. CCA-Papier). Die komplexe Zusammensetzung dieser Träger ist besonders für die selektive Fixierung einzelner Komponenten aus biologischen Stoffgemischen geeignet. ι Particularly suitable for the process according to the invention are macromolecular compositions consisting of a macromolecular compound in a concentration of 5-80 vol .-%, a macromolecular compound with 4,6-dihalo-1,3,5-triazine groups in a concentration of 1-80 vol .-%, of 2,4,6-trihalo-1,3,5-triazine in a concentration of 0.5-50 vol .-%, of metal halides in a concentration up to 20 vol .-% , optionally buffering substances up to 5 vol .-%, possibly liquid dispersants and optionally further additives exist. A process for producing such solid phases which are particularly suitable for the process according to the invention is described, for example, in EP 134025 (eg CCA paper). The complex composition of these carriers is particularly suitable for the selective fixation of individual components from biological mixtures. ι

Als organische Lösungsmittel sind mit Wasser mischbare organische Stoffe geeignet. Diesen können bis zu 35 Vol.-% mit Wasser nichtmischbare organische Flüssigkeiten zugesetzt werden. Besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren sind als flüssiges organisches Medium polare Lösungsmittel wie Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Ethanol, Propanol usw.Suitable organic solvents are water-miscible organic substances. These can be added up to 35% by volume of water-immiscible organic liquids. Particularly suitable for the process according to the invention are as liquid organic medium polar solvents such as acetonitrile, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, ethanol, propanol, etc.

Bevorzugt werden als flüssige organische Medien zyklische Ether, z. B. Tetrahydrofuran und Dioxan. Als Zeitpunkt für das Inkontaktbringen des organischen Mediums mit der festen Phase kommt prinzipiell jede Stufe einer Trennoperation mit biologisch aktiven Stoffen in Betracht. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren bei Tüpfel- und Blottingverfahren. Bei diesen Verfahren kann das organische Medium mit der festen Phase vor oder während der Durchführung angewendet werden. Bevorzugt ist die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nach einem Tüpfeloder Blottingprozeß.Are preferred as liquid organic media cyclic ethers, eg. For example, tetrahydrofuran and dioxane. In principle, any stage of a separation operation with biologically active substances comes into consideration as the time for bringing the organic medium into contact with the solid phase. The process according to the invention is particularly suitable for spotting and blotting processes. In these methods, the organic medium may be applied with the solid phase before or during performance. Preferably, the implementation of the method according to the invention after a Püpfeloder blotting process.

Vorteilhaft angewandt wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Fixierung von Ribonukleinsäuren, Desoxiribonukleinsäuren oder Proteinen aus einem komplexen Gemisch biologisch aktiver Substanzen an feste Trägermaterialien. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Fixierung von Nukleinsäurefragmenten an Trägermaterialien, z. B. im genomischen Blotting. Hervorzuheben ist, daß es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals möglich wird, aus komplexen Gemischen heraus Oligonukleotide selektiv an eine feste Phase, insbesondere an Flächenträger zu fixieren.Advantageously, the method according to the invention is used for fixing ribonucleic acids, deoxyribonucleic acids or proteins from a complex mixture of biologically active substances to solid support materials. The method according to the invention for fixing nucleic acid fragments to support materials, eg. B. in genomic blotting. It should be emphasized that it is possible for the first time with the method according to the invention to selectively fix oligonucleotides from complex mixtures to a solid phase, in particular to surface carriers.

embodiments example 1 Blotting of oligonucleotides

Ein nach Maxam und Gilbert-Technik ³²P markiertes, gespaltenes Oligonukleotid (14 Nukleotide: d ACCTACCf⁵UGGTGGT) wurde in einem 20%igen Polyacrylamidgel, 7 M Harnstoff aufgetrennt (Sequenzgel) und das Gel zunächst autoradiographiert.A ³² P-labeled, cleaved oligonucleotide (14 nucleotides: d ACCTACCf ⁵ UGGTGGT) labeled according to Maxam and Gilbert technique was fractionated in a 20% polyacrylamide gel, 7 M urea (sequencing gel) and the gel was first autoradiographed.

Danach wurde das Gel direkt auf der Glasplatte mit einem 0,1 M Phosphatpuffer pH 5,5 + 1 % Essigsäure befeuchtet und ebenfalls befeuchtetes CCA-Papier (EPO 134025) auf das Trenngel aufgelegt. Darüber wurde eine Schicht dickeres Filterpapier (FN 18) und ein Stapel Zellstoff gelegt und unter Beschwerung die Oligonukleotide auf das CCA-Papier übertragen (3 h, Raumtemperatur, Kontrolle mit Handcounter). Anschließend erfolgte die Fixierung der Oligonukleotide über Nacht in einem Dioxanbad (Raumtemperatur).Thereafter, the gel was moistened directly on the glass plate with a 0.1 M phosphate buffer pH 5.5 + 1% acetic acid and also moistened CCA paper (EPO 134025) placed on the separating gel. A layer of thicker filter paper (FN 18) and a stack of pulp were placed over it and the oligonucleotides were transferred to the CCA paper under pressure (3 h, room temperature, control with handcounter). Subsequently, the oligonucleotides were fixed overnight in a dioxan bath (room temperature).

Nach der Fixierung wurde der Träger intensiv in einmal SSC 0,1% SDS bei 65⁰C gewaschen. (1x SSC = 0,15M NaCI 0,015M Natriumeitrat).After fixation, the support was washed extensively in once SSC 0.1% SDS at 65 ^° C. (1x SSC = 0.15M NaCl 0.015M sodium citrate).

Nach der Waschung sind in der Autoradiographie alle Banden sichtbar. Die Sequenz ist eindeutig lesbar. Durch das Verfahren konnten sämtliche Fragmente von 14 bis 1 Nukleotid fixiert werden.After washing, all bands are visible in the autoradiography. The sequence is clearly legible. By the method all fragments of 14 to 1 nucleotide could be fixed.

Als Kontrolle mitgeführtes Filterpapier zeigt keinerlei Fixierung.As a control entrained filter paper shows no fixation.

Example 2

Das Verfahren wurde wie unter Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Anstelle Dioxan wurde Dimethylformamid eingesetzt. Die Sequenz ist auf CCA-Papier vollständig lesbar.The process was carried out as described under Example 1. Instead of dioxane, dimethylformamide was used. The sequence is completely readable on CCA paper.

Beispiel 3 RNS-TüpfeltestExample 3 RNA spot test

Verschiedene Konzentrationen von tRNS (100,75,45,20,10,2 /xg/μΙ) wurden jeweils mit ³²P markierter RNS (1 OOOcpm/μ,Ι) versetzt und auf CCA-Papier aufgetüpfelt (jeweils 1 μΙ).Different concentrations of tRNA (100, 75, 45, 20, 10, 2, xg / μΙ) were each spiked with ³² P-labeled RNA (1 000 cpm / μ, Ι) and spotted on CCA paper (1 μΙ each).

Danach wurden die einzelnen Papierstreifen in verschiedenen Lösungsmitteln bei Raumtemperatur fixiert.Thereafter, the individual paper strips were fixed in various solvents at room temperature.

Ein nicht fixierter Streifen wurde als Kontrolle mitgeführt. Nach der Fixierung erfolgte eine Waschung der Streifen und eine Autoradiographie wie unter Beispiel 1 beschrieben. Als Lösungsmittel wurden verwendet: Ethanol, Formamid, Acetylaceton, Aceton, Adipinsäurediäthylether, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dioxan/Xylol, Dioxan, Xylol, Dibutylether, Essigsäureäthylester, Dimethylformamid, 10% Ethanolamin, Tetrahydrofuran.An unfixed strip was included as a control. After fixation, the strips were washed and autoradiographed as described in Example 1. The following solvents were used: ethanol, formamide, acetylacetone, acetone, adipic acid diethyl ether, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, dioxane / xylene, dioxane, xylene, dibutyl ether, ethyl acetate, dimethylformamide, 10% ethanolamine, tetrahydrofuran.

Davon zeigen nur Dimethylformamid, Dioxan, Acetonitril und Ethanol für RNS an CCA-Papier fixierende Wirkung.Of these, only dimethylformamide, dioxane, acetonitrile and ethanol for RNA show CCA-fixing activity.

Essigsäurediäthylester, Tetrahydrofuran, Acetylaceton, Aceton verringern die RNS-Bindung unter den Normalwert.Acetic acid diethyl ester, tetrahydrofuran, acetylacetone, acetone reduce RNA binding below normal.

Claims

Invention claim:

A process for the selective fixation of biologically active substances from the liquid phase using a solid phase, characterized in that the solid phase is brought into contact with the biologically active substance or the substance mixture containing liquid phase in the presence of a liquid organic medium or after incorporation of the biologically active substance or of the substance mixture through the solid phase, the contact with the organic medium takes place.

2. The method according to item!, Characterized in that are used as the solid phase in water or organic solvents insoluble inorganic or organic low molecular weight or macromolecular substances or mixtures thereof containing groups which form at least one covalent bond to the biologically active substance.

3. The method according to item 1 and 2, characterized in that is used as a solid phase, a macromolecular mass with chemically active fillers, consisting of

- A macromolecular compound in a concentration of 5-80 vol .-%.

From a macromolecular compound with 4,6-dihalo-1,3,5-triazine moieties in a concentration of 1-80% by volume.

From 2,4,6-trihalo-1,3,5-triazine in a concentration of 0.5-50% by volume.

- Of metal halides in a concentration up to 20 vol .-%.

Optionally from buffering substances up to 5 vol.%,

Optionally from a liquid dispersant and
if necessary further additives

consists.

4. The method according to item 1-3, characterized in that as the liquid organic medium one or more water-miscible solvents are used, which may contain up to 35 vol .-% water-immiscible liquids.

5. The method according to item 1-5, characterized in that are used as the liquid organic medium polar solvents such as acetonitrile, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide and ethanol.

6. The method according to item 1-5, characterized in that are used as the liquid organic medium cyclic ethers such as dioxane or tetrahydrofuran.

7. The method according to item 1-6, characterized in that the contacting of the organic medium with the solid phase takes place before or during a spotting or Blottingverfahrens.

8. The method according to item 1-6, characterized in that the contacting of the organic medium with the solid phase by spotting or Blottingverfahren takes place.