DD236346A1 - METHOD FOR THE ENZYMATIC ABOLITION OF THIOL PROTECTION GROUPS - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf die enzymatische Abspaltung von Thiol-Schutzgruppen bei Aminosaeure- und Peptidderivaten im Rahmen der Peptidsynthese. Das Verfahren dient der Gewinnung von Peptidderivaten, die Thiol-Komponenten enthalten, bei hoher Reinheit der Produkte, hoher Ausbeute und schonenden Reaktionsbedingungen. Die Erfindung beinhaltet die enzymatische Abspaltung von S-Phenacetamidomethyl- oder S-Phenoxyacetamidomethyl-Gruppen in einem Zwei-Stufen-Prozess, wobei Enzyme vom Typ der Penicillinamidohydrolasen zum Einsatz kommen. Die Enzympraeparate koennen auch in immobilisierter Form angewendet werden.The invention relates to the enzymatic cleavage of thiol protecting groups in amino acid and peptide derivatives in the context of peptide synthesis. The method is for the recovery of peptide derivatives containing thiol components, with high purity of the products, high yield and gentle reaction conditions. The invention involves the enzymatic cleavage of S-phenacetamidomethyl or S-phenoxyacetamidomethyl groups in a two-step process using enzymes of the penicillinamidohydrolase type. The enzyme preparations can also be used in immobilized form.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren der Peptidsynthese und ihrer Randgebiete, soweit die Aminosäure Cystein bzw. ihre Homologen (wie z. B. Homocystein), die entsprechenden Desaminoderivate oder Decarboxyverbindungen Verwendung finden.The invention relates to a method of peptide synthesis and its peripheral regions, as far as the amino acid cysteine or its homologs (such as, for example, homocysteine), the corresponding deamin derivatives or decarboxy compounds are used.
Zur Verwendung thiolgruppen-haltiger Verbindungen bei der Peptidsynthese ist es notwendig, die SH-Funktion temporär zu schützen. In der Fachliteratur sind dazu etwa 100 Schutzgruppen beschrieben (Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 1-15, The Royal Society of Chemistry, London 1968-1984; E. Wünsch [Ed.]: Synthese von Peptiden, Houben-Weyl Vol. 15/1 und 15/2,To use thiol group-containing compounds in peptide synthesis, it is necessary to temporarily protect the SH function. About 100 protective groups have been described in the literature (Amino Acids, Peptides and Proteins, Volumes 1-15, The Royal Society of Chemistry, London 1968-1984, E. Wünsch [Ed.]: Synthesis of Peptides, Houben-Weyl Vol 15/1 and 15/2,
G. Thieme Verlag, Stuttgart 1974). Allgemein ist bekannt, daß die Abspaltung von Thiolschutzgruppen drastische Bedingungen erfordert (z. B. Natrium in flüssigem Ammoniak, flüssiger Fluorwasserstoff, Iod in Methanol, Quecksilbersalze, Trifluormethansulfonsäure), wobei häufig Nebenreaktionen beobachtet werden, welche Ausbeute und Reinheit der Produkte beeinträchtigen.G. Thieme Verlag, Stuttgart 1974). Generally, it is known that cleavage of thiol protecting groups requires drastic conditions (e.g., sodium in liquid ammonia, liquid hydrogen fluoride, iodine in methanol, mercury salts, trifluoromethanesulfonic acid), often causing side reactions which affect the yield and purity of the products.
Die vorteilhaften Eigenschaften von S-Acylamidomethyl-Schutzgruppen als S-Schutzgruppen bei der Synthese thiolhaltiger Peptide bzw. ihrer Disulfidderivate (D. F. Veber, J. D. Milkowski, R. G. Denkewalter, R. Hirschmann: Tetrahedron Lett. 1968, 3057;The advantageous properties of S-acylamidomethyl protecting groups as S-protecting groups in the synthesis of thiol-containing peptides or their disulfide derivatives (D.F. Veber, J.D. Milkowski, R.G. Denkewalter, R. Hirschmann: Tetrahedron Lett., 1968, 3057;
D. F. Veber, J. D. Milkowski, S. L Varga, R. G. Denkewalter, R. Hirschmann: J. Amer. Chem. Soc. 94, 9456 [1972]; H. Arold, M. Eule in: Peptides 1972 [Eds. H. Hanson, H.-D. Jakubke] p. 78, North-Holland. Publ. Co, Amsterdam 1973; P. Hermann, E. Schreier: ibid.D.F. Veber, J.D. Milkowski, S.L. Varga, R.G. Denkewalter, R. Hirschmann: J. Amer. Chem. Soc. 94, 9456 [1972]; H. Arold, M. Eule in: Peptides 1972 [Eds. H. Hanson, H.-D. Jakubke] p. 78, North Holland. Publ. Co, Amsterdam 1973; P. Hermann, E. Schreier: ibid.
p. 123; R. G. Denkewalter, D. F. Veber, F. W. Holly, R-. Hirschmann: J. Amer. Chem. Soc. 91, 502 [1969]; P. Hermann, E. Schreier: J.p. 123; R.G. Denkewalter, D.F. Veber, F.W. Holly, R-. Hirschmann: J. Amer. Chem. Soc. 91, 502 [1969]; P. Hermann, E. Schreier: J.
prakt. Chem. 316, 719 [1974]) werden durch die bisher bekannten Abspaltungsmethoden (z. B. Hg2+-lonen, I2 in Methanol) eingeschränkt.prakt. Chem. 316, 719 [1974]) are limited by the previously known cleavage methods (eg Hg 2+ ions, I 2 in methanol).
Ziel der Erfindung ist, unter Beibehaltung der S-Acylamidorriethyl-Schutzgruppen für die Thiol-Funktion, bei der Synthese Thiol-haltiger Aminosäure- und Peptidderivate eine schonende, selektive, ökonomisch befriedigende Abspaltungsmethode für Thiolschutzgruppen einzuführen, die hochreine Produkte liefert.The aim of the invention, while maintaining the S-Acylamidorriethyl protective groups for the thiol function, in the synthesis of thiol-containing amino acid and peptide derivatives to introduce a gentle, selective, economically satisfactory cleavage method for Thiolschutzgruppen that provides high purity products.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Enzyme zur Abspaltung von S-Acylamidomethyl-Gruppen einzusetzen und damit die Mangel der bisherigen Verfahrensweise zu überwindenThe invention has for its object to use enzymes for the removal of S-Acylamidomethyl groups and thus to overcome the shortcoming of the previous procedure
Merkmale der Erfindung sind deshalb gemäß Schema 1Features of the invention are therefore according to Scheme 1
Sn z 37m' 'Acyl-ΠΗ-CrL.-S-R + H2O »· H2Ii-CH2-S-R + Acyl-OHSn z 37m "acyl-ΠΗ-CrL.-SR + H 2 O". H 2 Ii-CH 2 -SR + acyl-OH
Schema 1 H2OScheme 1 H 2 O
spontanspontaneous
2V , CH2O, HS-R 2V , CH 2 O, HS-R
- 2 - 7b3 8/- 2 - 7b3 8 /
1. Die Abspaltung der S-Schutzgruppe in einem Zweistufenprozeß ablaufen zu lassen, wobei nur der erste Schritt enzymkatalysiert abläuft, der zweite Schritt spontan erfolgt und die gewünschte Thiolverbindung liefert.1. To run the cleavage of the S-protecting group in a two-step process, wherein only the first step is enzyme-catalyzed, the second step takes place spontaneously and provides the desired thiol compound.
2. In der 1. Phase solche Enzyme einzusetzen, die vom Amidohydrolase-Typ sind und deren Spezifität besonders auf den Acylrest der zu spaltenden Bindung ausgerichtet ist.2. In the first phase to use such enzymes that are of the amidohydrolase type and whose specificity is particularly aligned with the acyl residue of the bond to be cleaved.
3. Solche Acylamidomethyl-Schutzgruppen einzusetzen, deren Acylrest den Erfordernissen der Spezifität der einzusetzenden Enzyme vom Amidohydrolase-Typ entspricht.3. To use those acylamidomethyl protective groups whose acyl radical corresponds to the requirements of the specificity of the amidohydrolase-type enzymes to be used.
Erfindungsgemäß werden Enzyme vom Typ der Penicillinamidohydrolasen (EC 3.5.1.11) aus Mikroorganismen eingesetzt. Es werden Peptide, dieThiol-haltige Bausteine enthalten, unter Verwendung von S-Phenylacetamidomethyl- oder S-Phenoxyacetamidomethyl-Schutzgruppen oder anderen S-Acylamidomethyl-Schutzgruppen, die eine oben geschilderte Substratfunktion besitzen, aufgebaut und zum gewünschten Zeitpunkt der Synthese in wäßriger Lösung oder in der Mischung, von Wasser mit organischen Lösungsmitteln im pH-Bereich der optimalen Wirkung dem katalytischen Einfluß der Penicillinamidohydrolasen ausgesetzt. Dies kann im homogenen oder heterogenen System erfolgen, wobei auch die Penicillinamidohydrolasen an lösliche oder unlösliche makromolekulare Träger gebunden oder anderweitig immobilisiert sein können. Reaktionstemperatur und Enzym/Substrat-Verhältnis werden durch Vorversuche ermittelt und optimiert. Die nach diesem Abspaltungsprozeß erhaltenen Thiol-Verbindungen können in gewünschter Weise weiter umgesetzt werden, z. B. zu Disulfiden.According to the invention enzymes of the type of penicillin amidohydrolases (EC 3.5.1.11) are used from microorganisms. Peptides containing thiol-containing building blocks are constructed using S-phenylacetamidomethyl or S-phenoxyacetamidomethyl protecting groups or other S-acylamidomethyl protecting groups which have a substrate function as described above, and at the desired time of synthesis in aqueous solution or in water the mixture of water with organic solvents in the pH range of the optimal effect exposed to the catalytic influence of Penicillinamidohydrolasen. This can be done in a homogeneous or heterogeneous system, whereby the penicillin amidohydrolases can also be bound or otherwise immobilized on soluble or insoluble macromolecular carriers. Reaction temperature and enzyme / substrate ratio are determined and optimized by preliminary experiments. The thiol compounds obtained after this cleavage process can be further reacted in the desired manner, for. B. to disulfides.
1. In einer Inertgasatmosphäre werden bei pH 7 und 310 Kin 10%igem Dimethylformamid 0,2 mmol1. In an inert gas atmosphere at pH 7 and 310 Kin 10% dimethylformamide 0.2 mmol
tert.-Butyloxycarbonyl-S-Phenoxyacetamidomethyl-L-cystein mit 1 mg teilgereinigter Penicillinamidohydrolase aus Bakterien (T. A. Savidge, M. Cole: Methods Enzymol. 43, 705 [1975]) oder Pilzen (H. Vanderhaeghe: Methods Enzymol. 43, 721 [1975]) inkubiert. Nach Erreichen des quantitativen Umsatzes wird das entstandene tert.-Butyloxycarbonyl-L-cystein nach bekannter Verfahren zum Disulfid oxydiert, isoliert und nach Rekristallisation aus Essigsäureethylester/Hexan werden in 90%iger Ausbeute Kristalle von Di-tert.-butyloxycarbonyl-L-cystin vom Fp. 418-419 K erhalten. Das Präparat ist in mehreren Lösungsmittelgemischen chromatographisch einheitlich.tert-butyloxycarbonyl-S-phenoxyacetamidomethyl-L-cysteine with 1 mg of partially purified penicillinamidohydrolase from bacteria (TA Savidge, M. Cole: Methods Enzymol., 43, 705 [1975]) or fungi (H. Vanderhaeghe: Methods Enzymol., 43, 721 [1975]). After reaching the quantitative conversion, the resulting tert-butyloxycarbonyl-L-cysteine is oxidized by known methods to the disulfide, isolated and after recrystallization from ethyl acetate / hexane are crystals of di-tert-butyloxycarbonyl-L-cystine in 90% yield Received fp 418-419 K. The preparation is chromatographically uniform in several solvent mixtures.
2. Analog wie im Beispiel 1 werden 0,2 mmol S^henacetamidomethyl-glutathion, die nach bekannten Verfahren aus tert.-Butyloxycarbonyl-L-glutamyl-(a-tert.-butylester)-Y-S-phenacetamidomethyl-L-cysteinyl-glycin gewonnen wurden, mit 1 mg Penicillinamidohydrolase aus Bakterien inkubiert. Das entstandene Glutathion wurde mit Wasserstoffperoxid zum Disulfid oxydiert und durch Säulenchromatographie an einem Molsieb gereinigt. In 77%iger Ausbeute wird Glutathion-disulfid mit einem Fp. 448-453 K erhalten. [cc]2 D° = -105°.2. Analogously to Example 1 0.2 mmol S ^ henacetamidomethyl glutathione, which by known methods from tert-butyloxycarbonyl-L-glutamyl (a-tert-butyl ester) -YS-phenacetamidomethyl-L-cysteinyl-glycine were incubated with 1 mg penicillinamidohydrolase from bacteria. The resulting glutathione was oxidized to disulfide with hydrogen peroxide and purified by column chromatography on a molecular sieve. In 77% yield glutathione disulfide with a mp. 448-453 K is obtained. [cc] 2 D ° = -105 °.
3. Tert.-butyloxycarbonyl-S-phenacetamidomethyl-L-cystein wurde bei pH 7,6 und 318 K in Gegenwart von 1 % Dimethylformamid durch eine immobilisierte Penicillinamidohydrolase (kovalent gebunden an Copolymerisat von 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylendimethacrylat welches durch Epoxydgruppen modifiziert war) analog Beispiel 1 zu tert.-Butyloxycarbonyl-L-cystein umgesetzt.3. Tert-butyloxycarbonyl-S-phenacetamidomethyl-L-cysteine was immobilized at pH 7.6 and 318 K in the presence of 1% dimethylformamide by an immobilized penicillin amidohydrolase (covalently bonded to a copolymer of 2-hydroxyethyl methacrylate and ethylene dimethacrylate which had been modified by epoxy groups). reacted analogously to Example 1 to tert-butyloxycarbonyl-L-cysteine.
4. S-Phenacetamidomethyl-ß-mercaptopropionsäure (10~13 mol/l) wurde bei pH 8 und 298 K durch Penicillinamidohydrolase aus Bakterien zu ß-Mercaptopropionsäure umgesetzt.4. S-phenacetamidomethyl-.beta.-mercaptopropionic acid (10 ~ 13 mol / l) was reacted at pH 8 and 298 K by penicillin amidohydrolase from bacteria to give β-mercaptopropionic acid.
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