DD233852A1 - PROCESS FOR PRODUCT SYNTHESIS WITH MICROORGANISMS USING RECOMBINANT PLASMIDES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von bakteriellen Produktionsstaemmen unter Anwendung gentechnischer Methoden zur in-vitro-Rekombination von DNA. Ziel der Erfindung ist die Erzeugung von rekombinanten Plasmiden mit hoher genetischer Stabilitaet und hoher Produktsyntheseleistung sowie ihre praktische Nutzung zur Steigerung von bakteriellen Produktionssynthesen. Das Wesen der Erfindung besteht in- der Entwicklung einer neuartigen, als "Puzzle-Methode" bezeichneten Variante der bekannten "shot gun"-Klonierung, die das Zufallsprinzip auf die Erzeugung eines breiten Spektrums von verschiedenartigen rekombinanten Plasmiden anwendet und zur Isolierung von hoch exprimierenden, genetisch stabilen rekombinanten Plasmiden genutzt wird.-der Steigerung von Produktsynthesen durch Duplikation von rekombinanten Produktgenen und dadurch bedingten Gen-Dosis-Effekt unter Anwendung von natuerlicherweise stabilen Vektorplasmiden mit invertiert repetitiven Sequenzen.Anwendungsgebiete der Erfindung sind alle Verfahren zur Steigerung der Produktbildung unter Einsatz gentechnisch erzeugter Bakterien in der industriellen Mikrobiologie.The invention relates to a process for the production of bacterial production strains using genetic engineering methods for the in vitro recombination of DNA. The aim of the invention is the production of recombinant plasmids with high genetic stability and high product synthesis efficiency as well as their practical use for increasing bacterial production syntheses. The essence of the invention is the development of a novel variant of the known "shot gun" cloning, referred to as the "puzzle method", which applies the random principle to the generation of a broad spectrum of diverse recombinant plasmids and to isolate highly expressing, the increase in product syntheses by duplication of recombinant product genes and consequent gene dose effect using naturally stable vector plasmids with inverted repetitive sequences. Fields of application of the invention are all methods for enhancing product formation using genetically engineered Bacteria in industrial microbiology.
Description
Die Vielzahl und Vielfalt dieser Faktoren mit Einfluß auf die genetische Stabilität von rekombinanten Plasmiden läßt erkennen, daß ihre Stabilisierung unter Umständen einen erheblichen Aufwand erfordert.The variety and variety of these factors affecting the genetic stability of recombinant plasmids suggests that their stabilization may require considerable effort.
Eine weniger aufwendige Methode zur Stabilisierung besteht in der Reklonierung des rekombinanten Gens aus einem instabilen rekombinanten Plasmid in ein anderes, besser geeignetes Plasmid, das empirisch zu ermitteln ist. Beispiele für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode sind in den Erfindungsanmeldungen G. STEINBORN et al. (1983) „Verfahren zur Herstellung von hitzestabiler alpha-Amylase" und R. BORRISS et al. (1983) „Verfahren zur Herstellung von Bacillus-ß-GIukanase" enthalten. Nach diesen Erfindungen wurden rekombinante Gene für alpha-Amylase bzw. /3-Glukanase aus einem durch Primärklonierung erhaltenen instabilen rekombinanten Plamid in andere Plasmidvektoren rekloniert. Bei Reklonierung in das Streptococcen-Plasmid pDB101 (BEHNKE, D., MAHLKE, M., HARTMANN, M., WALTER, F.: Plasmid 2,605-616,1979) konnten für beide Gene (im Falle der/3-Glukanase für ein hochexprimierendes Produktgen) rekombinante Plasmide abgeleitet werden, die in Bacillus-Wirtsstämmen ohne Selektionsdruck stabil repliziert und exprimiert werden. Die Reklonierung erfolgte in üblicherweise mittels einer groß schneidenden Restriktase, die kohäsive Enden erzeugt, hier in beiden Fällen mittels EcoRI in die unikale EcoRI-Spaltstelle von pDB101.Eine besondere Bedeutung der beiden Erfindungen liegt in dem Ergebnis, daß bei unabhängigen Reklonierungen von unterschiedlichen Donorfragmenten mit unterschiedlichen Produktgenen in die gleiche Spaltstelle des Vektorplasmids in beiden Fällen stabile rekombinante Plasmide erzeugt werden konnten. Dadurch wird für diese Erfindung im Unterschied zum PALVA-Patent eine Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit des Verfahrens für wenigstens zwei unterschiedliche Produktgene nachgewiesen. Die Bedeutung der Erfindungen wird aber vor allem dadurch begrenzt, daßA less expensive method for stabilization consists in the recloning of the recombinant gene from an unstable recombinant plasmid to another, more suitable plasmid, which is to be determined empirically. Examples of the successful application of this method are described in the invention applications G. STEINBORN et al. (1983) "Method for producing heat-stable alpha-amylase" and R. BORRISS et al. (1983) "Method for producing Bacillus-β-glucanase". According to these inventions, recombinant genes for alpha-amylase and / 3-glucanase were recloned from an unstable recombinant plamide obtained by primary cloning into other plasmid vectors. Upon recloning into the streptococcal plasmid pDB101 (BEHNKE, D., MAHLKE, M., HARTMANN, M., WALTER, F .: Plasmid 2,605-616, 1979), for both genes (in the case of / 3-glucanase for a highly expressing gene) recombinant plasmids are stably replicated and expressed in Bacillus host strains without selection pressure. The recloning was carried out usually by means of a large cutting restrictase which produces cohesive ends, here in both cases by EcoRI in the unique EcoRI cleavage site of pDB101. A special meaning of the two inventions lies in the result that in independent recloning of different donor fragments with different product genes in the same cleavage site of the vector plasmid in both cases stable recombinant plasmids could be generated. As a result, in contrast to the PALVA patent, a reproducibility and applicability of the method for at least two different product genes is demonstrated for this invention. The significance of the inventions but is limited primarily by the fact that
— nur Ergebnisse über die Nutzung einer speziellen Restriktase-Spaltstellevon pDB101 zur Reklonierung und Erzeugung von stabilen rekombinanten Plasmiden vorliegen,There are only results from the use of a particular restriction site cleavage site of pDB101 for the recloning and generation of stable recombinant plasmids,
— keine Ergebnisse zu den Ursachen der genetischen Stabilität von pDB101 und davon abgeleiteten Plasmiden enthalten sind sowie- no results on the causes of genetic stability of pDB101 and derived plasmids are included as well
— ihre Kopienzahl (5 Kopien/Zelle) nur auf niedrigem bis mittlerem Niveau liegt und dadurch ein entsprechend geringer Gen-Dosis-Effekt in der plasmidkodierten Produktbildung erreicht wird.- Their copy number (5 copies / cell) is only at low to medium level and thus a correspondingly low gene dose effect in the plasmid-encoded product formation is achieved.
Wegen seiner erfolgreichen Anwendung für eine reproduzierbare Erzeugung von stabilen rekombinanten Plasmiden (s.o.) verdient pDB101 größtes Interesse; vergleichbare Plasmidvektoren für industriell genutzte Bakterien sind nicht bekannt. Die ersten positiven Ergebnisse zur Nutzung von pDB101 berechtigten jedoch noch nicht zu der Schlußfolgerung, daß sich dieser Vektor allgemein für viele verschiedene Produktgene, in unterschiedlichen Insertionsorten und in verschiedenen Wirtsstämmen nutzen läßt. Neben weiteren praktischen Erfahrungen sind dafür vor allem Ergebnisse zu solchen plasmidalen Funktionen und strukturellen Besonderheit notwendig, die in pDB101 und abgeleiteten rekombinanten Plasmiden für die genetische Stabilität verantwortlich sind.Because of its successful application for reproducible production of stable recombinant plasmids (see above), pDB101 deserves great interest; comparable plasmid vectors for industrially used bacteria are not known. The first positive results for the use of pDB101, however, did not justify the conclusion that this vector can generally be used for many different product genes, in different insertion sites and in different host strains. In addition to further practical experience, results for such plasmid functions and structural peculiarities are necessary, which are responsible for genetic stability in pDB101 and derived recombinant plasmids.
Als strukturelle Besonderheit sind in pDB101 und verwandten Streptococcen-Plasmiden lange, invertiert repetitive Sequenzen (d.h. zwei homologe, entgegengesetzt orientierte DNA-Sequenzen) enthalten, die bei pDB101 ca. 75% des Plasmidmoleküls einnehmen. Diese invertierten Repeats ermöglichen die Transformation von Plasmidmonomeren in kompetente Zellen von B. subtilis und haben dadurch für die Etablierung von B. subtilis als Klonierungswirt Bedeutung erlangt (DOI, R. H.: In RÜSSEL, G. E.: Biotechnology and genetic engineering reviews, Vol.2, pp.121-155. Intercept 1984). Weitere biologische Funktionen der invertierten Repeats, u.a. für die Stabilisierung von Plasmiden, sind nicht bekannt.As a structural feature, pDB101 and related streptococcal plasmids contain long, inverted repetitive sequences (i.e., two homologous, oppositely oriented DNA sequences) occupying approximately 75% of the plasmid molecule in pDB101. These inverted repeats allow the transformation of plasmid monomers into competent B. subtilis cells and have thereby gained importance for the establishment of B. subtilis as a cloning host (DOI, RH: In RÜSSEL, GE: Biotechnology and genetic engineering reviews, Vol.2, pp .121-155, Intercept 1984). Other biological functions of the inverted repeats, i.a. for the stabilization of plasmids are not known.
Das Ziel der Erfindung besteht in der Erzeugung von rekombinanten Plasmiden, die bei hoher genetischer Stabilität und Expression in geeigneten bakteriellen Wirtsstämmen unter Fermentationsbedingungen eine reproduzierbare im Vergleich zu herkömmlichen Produktionsstämmen erhöhte Produktbildung gewährleisten.The object of the invention is the production of recombinant plasmids which, with high genetic stability and expression in suitable bacterial host strains under fermentation conditions, ensure a reproducible product formation compared to conventional production strains.
Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Entwicklung und Erprobung von neuartigen Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten Plasmiden, die in geeigneten Wirtsstämmen bei hoher genetischer Stabilität eine hohe Produktbildung ermöglichen. Dazu werden folgende Prinziplösungen angestrebt:The object of the invention is the development and testing of novel methods for the production of recombinant plasmids which allow high product formation in suitable host strains with high genetic stability. For this purpose, the following principle solutions are sought:
— Klonierung oder Reklonierung von Produktgenen in genetisch stabilen Plasmidvektoren unter Anwendung des Zufallsprinzips auf die Erzeugung von Donorfragmenten und Insertionsorten sowie auf ihre Kombination bei der Ligation, so daß ein breites Spektrum unterschiedlicher rekombinanter Plasmide erhalten wird und stabile, hoch exprimierende rekombinante Plasmide als positive Kombinationen ausgelesen werden.Cloning or recloning of product genes in genetically stable plasmid vectors using the random principle on the generation of donor fragments and insertion sites as well as their combination in the ligation so that a broad spectrum of different recombinant plasmids is obtained and stable, highly expressing recombinant plasmids are read out as positive combinations become.
— Steigerung der Produktbildung durch Erhöhung der Gen-Dosis von rekombinanten Produktgenen.- Increasing product formation by increasing the gene dose of recombinant product genes.
— Ermittlung von geeigneten Bakterienstämmen als Wirtstämme, die unter geeigneten Fermentationsbedingungen alle Voraussetzungen für eine hohe Stabilität des rekombinanten Plasmids und hohe Expression des rekombinanten Gens sowie für eine effektive Exkretion und hohe Stabilität des Genproduktes erfüllen.Determination of suitable bacterial strains as host strains which, under suitable fermentation conditions, fulfill all requirements for high stability of the recombinant plasmid and high expression of the recombinant gene as well as for effective excretion and high stability of the gene product.
Entsprechend umfaßt die Erfindung drei Teile, deren wesentlicher Inhalt im folgenden dargestellt wird.Accordingly, the invention comprises three parts, the essential content of which is shown below.
1. Entwicklung und Nutzung der „Puzzle-Methode" als eine neue Variante des „shot gun"-Verfahrens Die Entwicklung dieser Methode geht davon aus, daß erfahrungsgemäß nach Klonierung oder Reklonierung die Spezifizät des Donorfragmentes und des Insertionsortes im Vektorplasmid einen wesentlichen Einfluß auf die Stabilität und Expression eines rekombinanten Plasmids haben kann. Dieser Einfluß ergibt sich aus der Wechselwirkung von Genfunktionen des Donorfragmentes (bes. von starken Promotoren und Terminatoren) mit benachbarten Genfunktionen des Vektorplasmids (bes. der Plasmid-Replikation und -Partition). Entsprechend sind bei verschiedenen Kombinationen von unterschiedlichen Donorfragmenten mit unterschiedlichen Insertionsorten verschiedene rekombinante Plasmide zu erwarten, die sich hinsichtlich Stabilität und Expression unterscheiden. Unter anderem sind auch hoch stabile und zugleich hoch exprimierende rekombinante Plasmide zu erwarten, die erfindungsgemäß für industrielle Fermentationen genutzt werden sollen. Davon ausgehend wird die „Puzzle-Methode" (Abb. 1) entwickelt, die eine neue Variante des üblichen „shotgun"-Verfahrens darstellt. Erfindungsgemäß werden sowohl die Donor- als auch die Vektor-DNA durch die gleiche oder eine isoschizomere, kleinschneidende Restriktase (z. B. Hhal, Hpall, Mbol, Mspl, Sau3A) behandelt, wobei die Restriktasebehandl'ung für Donor- und Vektor-DNA in unterschiedlichem Maße erfolgt. Die Donor-DNA wird partiell verdaut, so daß verschiedene Donorfragmente von überwiegend 2 bis 6kb entstehen, die das zu klonierende Gen mit hoher Wahrscheinlichkeit in aktiver (d. h. ungeschnittener) Form enthalten. Dagenen wird das Vektorplasmid nur in geringem Maße behandelt, so daß mit1. Development and Use of the "Puzzle Method" as a New Variation of the "Shot Gun" Method The development of this method assumes that, according to experience, after cloning or recloning, the specificity of the donor fragment and the insertion site in the vector plasmid has a significant influence on the Stability and expression of a recombinant plasmid may have. This influence results from the interaction of gene functions of the donor fragment (especially strong promoters and terminators) with adjacent gene functions of the vector plasmid (in particular the plasmid replication and partition). Accordingly, different combinations of different donor fragments with different insertion sites different recombinant plasmids are to be expected, which differ in terms of stability and expression. Among other things, highly stable and at the same time highly expressing recombinant plasmids are to be expected, which according to the invention are to be used for industrial fermentations. Based on this, the "puzzle method" (Fig. 1) is developed, which represents a new variant of the usual "shotgun" method. According to the invention, both the donor and the vector DNA are treated by the same or an isoschizomeric, small-cutting restrictase (eg Hhal, Hpall, Mbol, Mspl, Sau3A), the restrictionase treatment for donor and vector DNA to varying degrees. The donor DNA is partially digested to produce various donor fragments of predominantly 2 to 6kb, which are likely to contain the gene to be cloned in active (i.e., uncut) form. Dagenen the vector plasmid is treated only to a small extent, so that with
statistischer Wahrscheinlichkeit pro Plasmidmolekül nur in einer von vielen möglichen Spaltstellen geschnitten wird und so eine Population von unterschiedlich liniearisierten Molekülen des Vektorplasmids entsteht. Bei anschließender Ligation entstehen dann unterschiedliche rekombinante Plasmide, die sich hinsichtlich Größe und Spezifität des Donorfragments, Orientierung seiner Insertion und hinsichtlich des Insertionsortes im Vektorplasmid unterscheiden. Nach Transformation des Ligationsgemisches in einen geeigneten Wirtstamm sind schließlich Plasmidtransformanten mit solchen rekombinanten Plasmiden zu selektieren, bei denen Donorf ragment und Insertionsort nach der Art eines Puzzlespiels für hohe Stabilität und Expression des rekombinanten Plasmids kombiniert worden sind.statistical probability per plasmid molecule is cut only in one of many possible cleavage sites and so creates a population of differently linearized molecules of the vector plasmid. Subsequent ligation results in different recombinant plasmids which differ in terms of size and specificity of the donor fragment, orientation of its insertion and location of insertion in the vector plasmid. Finally, after transformation of the ligation mixture into a suitable host strain, plasmid transformants are to be selected with such recombinant plasmids in which the donor fragment and insertion site have been combined in a puzzle-like manner for high stability and expression of the recombinant plasmid.
Steigerung des Gen-Dosis-Effektes durch Duplikation von rekombinanten Genen nach Insertion in eine invertiert repetitive Sequenz von VektorplasmidenIncreasing the gene dose effect by duplication of recombinant genes after insertion into an inverted repetitive sequence of vector plasmids
DieserTeil der Erfindung geht von dem bekannten Ergebnis aus, daß bei Reklonierung in die unikale EcoRI-Schnittstelledes Streptococcen-Plasmids pDB101 extrem stabile rekombinante Plasmide (u.a. auch für ein hoch exprimierendes/3-Glukanase-Gen) in Bacillus-Wirtsstämmen erhalten wurden. Aus dieser positiven Erfahrung ergibt sich die Fragestellung, ob sich pDB101 grundsätzlich (d. h. nicht nur für spezielle rekombinante Gene und bei Insertion in seine unikale EcoRl-Schnittstelle) für die Erzeugung von stabilen rekombinanten Plasmiden in Bacillus nutzen läßt. Die Bearbeitung dieser Fragestellung erfolgt zunächst am Beispiel des hoch exprimierenden Gens für mesophile alpha-Amylase von B. amyloliquefaciens und unter Anwendung der erfindungsgemäßen „Puzzle-Methode" (Abb. 1). Für die Anwendung der „Puzzle-Methode" bietet pDB101 gute Voraussetzungen, da es auf Grund seiner Größe viele Schnittstellen für kleinschneidende Restriktasen enthält und dadurch viele verschiedene Insertionsorte für die Klonierung in pDB101 genutzt werden können. In diesem Teil der Erfindung werden alle Untersuchungen unter Laborbedingungen und im Wirtsstamm B. subtilis GSB2611 ausgeführt, der auf Grund seines Defektes in der chromosomal kodierten Amylasebildung eine Plasmidkodierte Amylasebildung sensibel nachweisen läßt.This part of the invention is based on the known finding that when recloned into the unique EcoRI site of the streptococcal plasmid pDB101, extremely stable recombinant plasmids (including for a high-expressing / 3-glucanase gene) were obtained in Bacillus host strains. This positive experience raises the question of whether pDB101 can be used in principle (ie not only for specific recombinant genes and for insertion into its unique EcoRI site) for the generation of stable recombinant plasmids in Bacillus. This question is first dealt with using the example of the highly expressive gene for mesophilic alpha-amylase of B. amyloliquefaciens and using the "puzzle method" according to the invention (Figure 1) .PDB101 offers good prerequisites for the application of the "puzzle method" Because of its size, it contains many cleavage sites for small-cutting restrictases, allowing many different sites to be used for cloning into pDB101. In this part of the invention, all investigations are carried out under laboratory conditions and in the host B. subtilis GSB26 11 , which due to its defect in the chromosomally encoded amylase formation sensitively detect a plasmid-encoded amylase formation.
Ausgangspunkt für die experimentelle Bearbeitung der Fragestellung ist die Primärklonierung des Gens für mesophile alpha-Amylase, die nach dem üblichen „shot gun"-Verfahren erfolgt und zur Isolierung des hoch exprimierenden, aber instabilen rekombinanten Plasmids pSB6 führt (Abb.2).The starting point for the experimental processing of the question is the primary cloning of the gene for mesophilic alpha-amylase, which takes place according to the usual "shot gun" method and for the isolation of the highly expressive but unstable recombinant plasmid pSB6 leads (Figure 2).
11 Zur Herkunft der Stämme s. Ausführungsbeispiel 1.1. 11 The origin of the trunks s. Embodiment 1.1.
Als Gendonor wird B. Amyloliquefaciens ATCC238441'verwendet, da sich dieser Stamm durch eine extrem hohe chromosomal kodierte Amylasebildung auszeichnet. Aus dem instabilen Plasmid pSB6 wird das rekombinante Amylasegen nach der erfindungsgemäßen „Puzzle-Methode" in das Vektorplasmid pDB101 rekloniert. Wie zu erwarten, wird durch diese Reklonierung ein Spektrum von verschiedenen rekombinanten Plasmiden erhalten, die sich nach dem Grad der Plasmidstabilität und dem Expressionsniveau der plasmidkodierten Amylasebildung vier Gruppen zuordnen lassen (instabilniedrig exprimierend, stabil-niedrig exprimierend; instabil-hoch exprimierend; stabil-hoch exprimierend). Unter einer Vielzahl von rekombinanten Plasmiden werden nurzwei stabile, hoch exprimierende Plasmide (pSB17, pSB20) gefunden, die unter der Zielstellung ihrer praktischen Nutzung eingehend untersucht werden. Ihre Restriktionsanalyse ergibt, daß bei pSB17 der rekombinative Einbau des Amylasegens in der nicht repetitiven Sequenz US1 von pDB101 erfolgt ist. Die Isolierung von pSB17 beweist, daß in pDB101 neben der unikalen EcoRI-Spaltstelle auch andere unikale Insertionsorte in der nichtrepetitiven Sequenz US1 für die Erzeugung von stabilen, hoch exprimierenden rekombinanten Plasmiden geeignet sind. Von besonderer Bedeutung für die Erfindung erweist sich das rekombinante Plasmid pSB20, bei dem im Unterschied zu pSB17 das rekombinante Amylasegen in duplizierter Form vorliegt (Abb.3). Entsprechend dieser Duplikation kodiert pSB20 im Vergleich zu pSB17 (mit nur einem rekombinanten Amylasegen pro Plasmidmolekül) bei gleicher Kopienzahl eine bis zu zweifache Amylasebildung. Dieser Gen-Dosis-Effekt wird bei relativ hoher Amylasebildung ausgeprägt, die hier jedoch wegen Nutzung von Labormedien und des Wirtssystems B. subtilis 168 noch kein ökonomisch bedeutendes Niveau erreicht.As a gene donor B. amyloliquefaciens ATCC23844 1 'is used, since this strain is characterized by an extremely high chromosomally encoded amylase formation. From the unstable plasmid pSB6, the recombinant amylase gene is recloned into the vector plasmid pDB101 according to the "puzzle method" according to the invention As expected, this recloning results in a spectrum of different recombinant plasmids which vary according to the degree of plasmid stability and the level of expression of the plasmids can be assigned to four groups (unstably low-expressing, stable-low-expressing, unstable-high expressing, stable-high expressing) Among a large number of recombinant plasmids, only two stable, highly expressing plasmids (pSB17, pSB20) are found which are below the target position Their restriction analysis shows that pSB17 has undergone recombinative incorporation of the amylase gene in the non-repetitive sequence US1 of pDB101, and isolation of pSB17 demonstrates that other unique sites of insertion into pDB101 are located adjacent to the unique EcoRI site d he non-repetitive sequence US1 are suitable for the generation of stable, high-expression recombinant plasmids. Of particular importance for the invention is the recombinant plasmid pSB20, in which, in contrast to pSB17, the recombinant amylase gene is present in a duplicated form (FIG. 3). According to this duplication pSB20 encodes in comparison to pSB17 (with only one recombinant amylase gene per plasmid molecule) up to twice the amylase formation with the same copy number. This gene dose effect is pronounced with relatively high amylase production, which, however, does not reach an economically significant level due to the use of laboratory media and the B. subtilis 168 host system.
In pSB20 sind die beiden Duplikate des rekombinanten Amylasegens in zwei getrennten, identischen Donorfragmenten enthalten, die an homologen Stellen der beiden Sequenzen des invertierten Repeats von pDB101 und ebenfalls invertiert inseriert sind.In pSB20, the two duplicates of the recombinant amylase gene are contained in two separate, identical donor fragments which are inserted at homologous sites of the two sequences of the inverted repeats of pDB101 and also inverted.
11 Zur Herkunft der Stämme s. Ausführungsbeispiel 1.1. 11 The origin of the trunks s. Embodiment 1.1.
Diese Identität beweist, daß solche Genduplikationen in zwei Schritten entstehen:This identity proves that such gene duplications arise in two steps:
1. Insertion eines Donorfragmentes mit einem Amylasegen in nur eine Sequenz des invertierten Repeats1. Insertion of a donor fragment with an amylase gene into only one sequence of the inverted repeats
2. Duplikation des inserierten Donorfragmentes durch homologe Rekombination.2. Duplication of the inserted donor fragment by homologous recombination.
Zusätzliche Beweise werden durch die Charakterisierung der hoch exprimierenden, im Unterschied zu pSB20 aber instabilen rekombinanten Plasmide pSB16 und pSB18 erhalten, die ebenf^1''- nach der „Puzzle-Methode" erzeugt worden sind. Aus diesen instabilen rekombinanten Plasmid&n entstehen spontan stabile rekombinante Plasmide mit dupliziertem Amylasegen, u. a. das Plasmid pSB21, das in seiner Struktur mit pSB20 übereinstimmt. Darausfolgt, daß nach Klonierung in das invertierte Repeat von pDB101 erst die identische Duplikation des rekombinanten Inserts zur genetischen Stabilität des rekombinanten Plasmids führt. Da die instabilen Plasmide pSB16 und pSB18 unabhängig voneinander erzeugt wurden und von diesen stabile Plasmide mit dupliziertem Produktgen wiederholt und in verschiedenen Wirtsstämmen abgeleitet werden können, stellt die erfindungsgemäße Erzeugung von stabilen, hoch exprimierenden rekombinanten Plasmiden einen reproduzierbaren Prozeß dar.Additional evidence obtained by the characterization of high expression, in contrast to pSB20 but unstable recombinant plasmids pSB16 and pSB18 that ebenf ^ 1. '' - after the "puzzle method" have been generated from these unstable recombinant plasmid & n arise spontaneously stable recombinant It follows that, after cloning into the inverted repeat of pDB101, identical duplication of the recombinant insert results in genetic stability of the recombinant plasmid, as the unstable plasmids pSB16 and pSB18 were generated independently of each other and can be repeated from these stable plasmids with duplicated product gene and derived in different host strains, the inventive production of stable, highly expressing recombinant plasmids represents a reproducible process.
Die bisherige Darstellung des Wesens der Erfindung beschränkt sich im 2.Teil auf ein Gen für mesophile alpha-Amylase, auf das Vektorplasmid pDB101, auf die „Puzzle-Methode" zur Reklonierung des rekombinanten Produktgens und den Wirtsstamm B. subtilis GSB26. Diese Art der Darstellung erfolgt im Interesse einer besseren Anschaulichkeit, soll die Erfindung aber nicht auf einen speziellen Faifder Erzeugung eines stabilen, hoch exprimierenden rekombinanten Plasmids beschränken. Die erfindungsgemäße „Puzzle-Methode" ist nicht nur zur Reklonierung aus einem rekombinanten Vektor, sondern auch zur Klonierung aus einem komplexen Genträger (chromosomaler DNA) anwendbar und ist nicht auf die Nutzung von Plasmidvektoren mit invertiertem Repeat beschränkt, sofern durch Klonierung oder Reklonierung inPart 2 of the present invention is limited to a mesophilic alpha-amylase gene, the vector plasmid pDB101, the "puzzle method" for recloning the recombinant product gene, and the host strain B. subtilis GSB26 The invention is not intended to limit the invention to a specific production of a stable, highly expressing recombinant plasmid The "puzzle method" according to the invention is not only for recloning from a recombinant vector, but also for cloning one complex carrier (chromosomal DNA) is applicable and is not limited to the use of plasmid vectors with inverted repeat, if by cloning or recloning in
üblicherweise verwendete Plamide mit unikaler Sequenz auf Grund eines Puzzle-Effektes stabile, hoch exprimierende rekombinante Plasmide erzeugt werden können. Ebenso ist die erfindungsgemäße Nutzung von Plasmidvektoren mit invertiertem Repeat zur Erzeugung von Genduplikationen nicht auf das spezielle PlasmidpDBI 01 und auf die Anwendung der „Puzzle-Methode" beschränkt; alternativ kann die Klonierung oder Reklonierung in invertierte Repeats nach dem an sich bekannten „shot gun"-Verfahren mittels großschneidender Restriktasen (z. B. BamHI, Bell, BgIII, EcoRI, Hindlll) erfolgen, sofern in dem betreffenden invertierten Repeat entsprechende unikale Spaltstellen enthalten sind. Entsprechend ist die Erfindung allgemein anwendbar auf:Commonly used single-sequence plaques based on a puzzle effect can produce stable, high-expression recombinant plasmids. Likewise, the use according to the invention of inverted repeat plasmid vectors for generating gene duplications is not restricted to the specific plasmid pDBI 01 and to the application of the "puzzle method", alternatively the cloning or recloning into inverted repeats can be carried out according to the "shot gun" known per se. Procedure by means of large cutting restrictases (eg BamHI, Bell, BglII, EcoRI, HindIII), provided that corresponding ununiform cleavage sites are contained in the respective inverted repeat. Accordingly, the invention is generally applicable to:
— beliebige homologe oder heterologe Produktgene, die keine für die Wirtszelle toxischen Produkte kodierenAny homologous or heterologous product genes which do not encode products toxic to the host cell
— beliebige Bakterien als Wirtszellen, sofern sie sich für eine hohe genetische Stabilität des rekombinanten Plasmids und hohe Expression des rekombinanten Produktgens sowie effektive Exkretion und hohe Stabilität des Genproduktes eignen- Any bacteria as host cells, provided they are suitable for high genetic stability of the recombinant plasmid and high expression of the recombinant product gene and effective excretion and high stability of the gene product
— vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, solche stabilen Vektorplasmide mit invertiertem Repeat, das sich zur Duplikation von rekombinanten Produktgenen nutzen läßtPreferably, but not exclusively, such stable inverted repeat vector plasmids which can be used for duplication of recombinant product genes
— verschiedene Wege zur Erzeugung von solchen Genduplikationen.- different ways of producing such gene duplications.
Neben der „Puzzle-Methode" sind u.a. folgende alternative Verfahren zur Duplikation von Produktgenen in Vektorplasmiden mit invertiertem Repeat anwendbar:In addition to the "puzzle method," the following alternative methods of duplicating product genes in inverted repeat vector plasmids are applicable, inter alia:
— Einmalige Klonierung oder Reklonierung nach dem üblichen „shot gun"-Verfahren mittels großschneidender Restriktasen in eine Sequenz des invertierten Repeats mit nachfolgender spontaner Genduplikation- One-time cloning or recloning according to the usual "shot gun" method by means of large cutting restrictases into a sequence of the inverted repeats with subsequent spontaneous gene duplication
— zweifache, schrittweise Klonierung oder Reklonierung von zwei identischen Donorfragmenten nach dem üblichen „shot gun"-Verfahren mittels großschneidender Restriktasen in eine Sequenz des invertierten Repeats mit nachfolgender spontaner Genduplikation- Two-fold, stepwise cloning or recloning of two identical donor fragments according to the usual "shot gun" method by means of large cutting restrictases into a sequence of the inverted repeats with subsequent spontaneous gene duplication
— zweifache, schrittweise Klonierung oder Reklonierung von zwei identischen Donorfragmenten nach dem üblichen „shot gun"-Verfahren mittels großschneidender Restriktasen in zwei homologe Schnittstellen des invertierten Repeats.- Two-fold, stepwise cloning or recloning of two identical donor fragments according to the usual "shot gun" method by means of large cutting restrictases into two homologous interfaces of the inverted repeats.
3. Ermittlung von Wirtsstämmen für eine praktische Nutzung von hochexprimierenden rekombinanten Plasmiden Während im 2.Teil der Erfindung die Erzeugung und Untersuchung von stabilen, hoch exprimierenden rekombinanten Plasmiden unter Nutzung von Laborstämmen gut charakterisierter Wirtsstämme (z. B. B. subtilis 168) erfolgt, werden im 3. Teil der Erfindung geeignete Bakterien als Wirtsstämme für eine praktische Nutzung dieser rekombinanten Plasmide ermittelt. Als Kriterien für ihre Eignung werden die Stabilität des rekombinanten Plasmids in Abwesenheit von Selektionsdruck sowie eine möglichst hohe und reproduzierbare plasmidkodierte Produktbildung gewertet, die die Produktbildung durch herkömmliche Produktionsstämme mehrfach übertrifft. Dabei wird der Gen-Dosis-Effekt durch die erfindungsgemäße Genduplikation (s. Teil 2 der Erfindung) auf hohem Niveau der Produktbildung ausgeprägt, so daß dieser Gen-Dosis-Effekt zu einer ökonomisch bedeutenden Steigerung der Produktbildung führt (Abb. 4, Abb. 5).3. Determination of host strains for a practical use of highly expressing recombinant plasmids While in the second part of the invention the production and investigation of stable, highly expressing recombinant plasmids is carried out using laboratory strains of well characterized host strains (eg BB subtilis 168) Part of the invention detects suitable bacteria as host strains for a practical use of these recombinant plasmids. Criteria for their suitability are the stability of the recombinant plasmid in the absence of selection pressure and the highest possible and reproducible plasmid-coded product formation, which exceeds the product formation by conventional production strains several times. In this case, the gene dose effect is expressed by the gene duplication according to the invention (see Part 2 of the invention) at a high level of product formation, so that this gene dose effect leads to an economically significant increase in product formation (FIG. 5).
Die Ermittlung von geeigneten Wirtsstämmen erfolgt auf empirische Weise nach Transformation von hoch exprimierenden Plasmiden in verschiedene Bakterien, da ihre Eignung in komplexer Weise von Eigenschaften des rekombinanten Plasmids und der Wirtszelle sowie von exogenen Faktoren abhängt. Getestet werden vorzugsweise solche Bacillus-Stämme, die für das entsprechende Genprodukt eine hohe chromosomal kodierte Syntheseleistung aufweisen und nach Möglichkeit auch schon als industriell genutzte Produktbildner etabliert sind. Die Testung konzentriert sich besonders auf B. amyloliquefaciens, da sich Stämme von B. amyloliquefaciens (ohne rekombinantes Plasmid) bereits international bei industriellen Fermentationen für Massenenzyme vielfach bewährt haben.The identification of suitable host strains is carried out empirically after transformation of highly expressing plasmids into different bacteria, as their suitability depends in a complex manner on properties of the recombinant plasmid and the host cell and on exogenous factors. Preferably, those Bacillus strains are tested which have a high chromosomally encoded synthesis performance for the corresponding gene product and, if possible, have already been established as industrially used product formers. The testing focuses particularly on B. amyloliquefaciens, as strains of B. amyloliquefaciens (without recombinant plasmid) have already proven internationally in industrial fermentations for mass enzymes many times.
Geeignete Bakterienstämme mit einem stabilen, hoch exprimierenden rekombinanten Plasmid werden als potentielle Produktionsstämme einer an sich bekannten submersen Fermentation unterworfen, die Produktbildung wird im Vergleich zum Donor- und Rezipientenstamm sowie zu herkömmlichen Produktionsstämmen bestimmt, und das plasmidkodierte Produkt wird aus der Kulturlösung isoliert.Appropriate bacterial strains containing a stable, highly expressing recombinant plasmid are subjected to a known submerged fermentation as potential production strains, product formation is determined relative to the donor and recipient strain, and to conventional production strains, and the plasmid-encoded product is isolated from the culture solution.
Durch die erfindungsgemäßen Verfahren (Puzzle-Methode", Genduplikation) werden gentechnisch veränderte Mikroorganismen als potentielle Produktionsstämme gewonnen, die die Produktbildung herkömmlicher Produktionsstämme mehrfach übertreffen. Diese Steigerung der Produktbildung wird bei gleichem Energie-, Material- und Zeitaufwand sowie bei gleicher Fermentationskapazität erreicht, so daß sich die Erfindung in einer mehrfachen Steigerung der Produktivität bei Fermentationen auswirkt.By the methods according to the invention ("puzzle method", gene duplication) genetically modified microorganisms are obtained as potential production strains, which exceed the product formation of conventional production strains several times.This increase in product formation is achieved with the same energy, material and time expenditure and with the same fermentation capacity, so that the invention affects in a multiple increase in productivity in fermentations.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind für verschiedene Produktsynthesen nutzbar und können bei verschiedenen Mikroorganismen angewendet werden, sofern stabile Plasmidvektoren zur Verfügung stehen. Die Anwendung der „Puzzle-Methode" beschränkt sich nicht auf die Klonierung in ein invertiertes Repeat zur Erzeugung von Genduplikationen, sondern ist grundsätzlich für Klonierungen geeignet. Vorteilhaft ist ihre Anwendung zur Erzielung von bestimmten Puzzle-Effekten (Plasmidstabilität, hohe Expression von rekombinanten Genen), für die Nutzung von wenig charakterisierten Vektorplasmiden und für Rekloniorungen, bei denen auf die Nutzung von Linkern oder Adaptoren verzichtet wird.The processes according to the invention can be used for various product syntheses and can be applied to various microorganisms, provided stable plasmid vectors are available. The application of the "puzzle method" is not limited to the cloning into an inverted repeat for the generation of gene duplications, but is basically suitable for cloning, its application being advantageous for achieving certain puzzle effects (plasmid stability, high expression of recombinant genes). , for the use of poorly characterized vector plasmids and for reconclusions in which the use of linkers or adapters is omitted.
Ausführungsbeispiele — Exemplary embodiments
I. Erzeugung von stabilen, hoch exprimierenden rekombinanten Plasmiden für mesophile alpha-Amylase unter Nutzung der „Puzzle-Methode" und des Vektorplasmids pDB101I. Generation of stable, high-expression recombinant plasmids for mesophilic alpha-amylase using the "puzzle method" and vector plasmid pDB101
Die experimentelle Bearbeitung erfolgt nach Abb. 1 in mehreren Schritten und wird entsprechend in den folgenden Kapiteln 1.1 bis 1.5 dargestelltThe experimental processing is carried out according to Fig. 1 in several steps and will be presented accordingly in the following chapters 1.1 to 1.5
1.1. Primärklonierung des Gens für mesophile alpha-Amylase nach dem „shot gun"-Verfahren 1.1. Primary cloning of the mesophilic alpha-amylase gene by the shot gun method
— Restriktaseverdauung: Chromosomale DNA des Gendonors B. amyloliquefaciens ATCC23844 (INGLE, M. B., BOYER, E. W.: In „Microbiology 1976", pp. 420-426. Washington 1976), isoliert nach der Methode von SAITO und MIURA (SAITO, H., MIURA, K.-l.: Biochim. Biophys. Acta 72, 619-629,1963), und Plasmid-DNA des Vektors pGB354 (BEHNKE, D., GILMORE, M. S., FERRETTI, J. J.: In „Microbiology 1982", pp. 239-242. Washington 1982), isoliert nach der Methode von CRYCZAN et al. (GRYCZAN, T. J., CONTENTE, S., DUBNAU, D.: J. Bacteriol. 134,318-329.1978), werden mittels Bell in getrennten Ansätzen verdaut. In 100ml Verdauungsgemisch sind enthalten: 10 bis 20/xg DNA, 1 Enzymeinheit Bell pro 3 bis 4^g DNA, 10^g 10fach konzentrierter Bcll-Puffer (Zusammensetzung nach Katalog derBethesda ResearchRestrictase digestion: Chromosomal DNA of the gene donor B. amyloliquefaciens ATCC23844 (INGLE, MB, BOYER, EW: "Microbiology 1976", pp. 420-426, Washington 1976) isolated by the method of SAITO and MIURA (SAITO, H., et al. MIURA, K.-l .: Biochim., Biophys., Acta 72, 619-629, 1963), and plasmid DNA of the vector pGB354 (BEHNKE, D., GILMORE, MS, FERRETTI, JJ: In "Microbiology 1982", p 239-242, Washington 1982), isolated according to the method of CRYCZAN et al. (GRYCZAN, T.J., CONTENTE, S., DUBNAU, D .: J. Bacteriol., 134, 318-329, 1978) are digested by Bell in separate batches. In 100 ml digestion mixture are included: 10 to 20 / xg DNA, 1 enzyme unit Bell per 3 to 4 ^ g of DNA, 10 ^ g 10-fold concentrated Bcll buffer (composition according to the Bethesda Research
Laboratories 1981/82). Nach4.Std. Inkubation bei45°C wird die Bcll-Verdauung durch Behandlung mit Phenol-Chloroform (1:1) beendet. Phenol wird durch Schütteln (4x) mit Äther extrahiert, die geschnittene DNA in 0,3 M Na-Acetat — 80% Äthanol gefällt, 3x mit Äthanol (80%) gewaschen und mit gleichem Volumen TE-Puffer(1 OmM Tris-HCI; 1 mM EDTA; pH 7,5) gelöst.Laboratories 1981/82). Nach4.Std. Incubation at 45 ° C, BcII digestion is terminated by treatment with phenol-chloroform (1: 1). Phenol is extracted by shaking (4x) with ether, the cut DNA in 0.3 M Na acetate - 80% ethanol precipitated, washed 3 times with ethanol (80%) and with the same volume of TE buffer (1 OmM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 7.5).
— Ligation: Restriktase — behandelte DNA des Gendonors und des Vektorplasmids werden 12 Std. bei 120C in folgendem Gemisch (Gesamtvolumen 100μ.Ι) ligiert: 8 jug Donor-DNA; 2^g Vektor-DNA; 10OmM Tris-HCI (pH 7,5); 5mM MgCI2; 5mM DTT; 1 Enzymeinheit Ligase pro 1 μg DNA; 0,4mM ATP. Die Ligation wird durch 10min Hitzebehandlung bei 650C beendet.- Ligation: Restrictase - treated DNA of the gene donor and the vector plasmid are 12 hrs. At 12 0 C in the following mixture (total volume 100μ.Ι) ligated: 8 jug donor DNA; 2 ^ g of vector DNA; 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 5mM MgCl 2 ; 5mM DTT; 1 enzyme unit of ligase per 1 μg of DNA; 0.4mM ATP. The ligation is terminated by 10 minutes of heat treatment at 65 0 C.
— Plasmidtransformation und Selektion: Das Ligationsgemisch wird nach der Methode von CHANG und COHEN (CHANG, S., COHEN, S. N.: Molec. gen. Genet. 168,111-115.1979) in Protoplasten des Amylase-defekten Wirtsstammes B.subtilis GSB26/1/ transformiert. Zur Stabilisierung der Protoplasten wird dem Medium SMMP 0,4% Serumalbumin zugesetzt. Das Transformationsgemisch wird auf DM3-Regenerationsmedium — 5^g Cm/ml — 1 % unlösliche Stärke plattiert, und die Selektionsplatten werden 3 Tage bei 37°C inkubiert. CmR-P!asmidtransformanten werden mit einer Häufigkeit von V2 x 10~4pro regenerierte Protoplasten und davon 10~4Amy+Cmr-Transformanten erhalten. Eine Amy+Cmr-Transformante mit hoher Amylasebildung und hinreichender Stabilität wird für die weitere Bearbeitung ausgewählt. Aus dieser Transformante wird nach der Methode von GRYCZAN et al. (GRYCZAN, T. J., CONTENTE, S., DUBNAU, D.: J. Bacteriol. 134,318-329.1978) ein rekombinantes Plasmid isoliert, das sich vom Vektorplasmid pGB354 durch ein zusätzliches 5,4kb (Bcll)-Insert unterscheidet (Abb.2). Das so erzeugte rekombinante Plasmid wird mit „pSB6" bezeichnet, die Plasmidtransformante erhält die Stammbezeichnung „B.subtilis GSB26 (pSB6)".- Plasmid transformation and selection: The ligation mixture is transformed into protoplasts of the amylase-defective host strain B.subtilis GSB26 / 1 / by the method of CHANG and COHEN (CHANG, S., COHEN, SN: Molec. Gen. Genet., 168, 11-11-5, 1979) , To stabilize the protoplasts, 0.4% serum albumin is added to the medium SMMP. The transformation mixture is plated on DM3 regeneration medium - 5 ^ g Cm / ml - 1% insoluble starch, and the selection plates are incubated for 3 days at 37 ° C. Obtained Cm R -P asmidtransformanten! With a frequency of V2 x 10 ~ 4 per regenerated protoplasts and including 10 ~ 4 Amy + Cm r transformants. An Amy + Cm r transformant with high amylase formation and sufficient stability is selected for further processing. From this transformant is by the method of GRYCZAN et al. (GRYCZAN, TJ, CONTENTE, S., DUBNAU, D .: J. Bacteriol., 134, 318-329, 1978) isolated a recombinant plasmid that differs from the vector plasmid pGB354 by an additional 5.4 kb (BcII) insert (Fig. , The recombinant plasmid thus produced is designated "pSB6", the plasmid transformant is given the strain "B.subtilis GSB26 (pSB6)".
Die Plasmidtransformante B.subtilis GSB26 (pSB6) wurde am 21.9.84 im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, hinterlegt.The plasmid transformant B.subtilis GSB26 (pSB6) was detected on 21.9.84 in the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the AdW of the GDR, 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, deposited.
GSB26 ist eine Streptomycin-resistente Mutante des Ausgangsstammes QB1133 sacA321 arol906 metB5 amyE (STEINMETZ, M., KUNST, F., DEDONDER, R.: Molec. gen. Genet. 148,281-285.1976)GSB26 is a streptomycin-resistant mutant of the parent strain QB1133 sacA321 arol906 metB5 amyE (STEINMETZ, M., KUNST, F., DEDONDER, R .: Molec. Gen. Gen. 148, 281-285, 1976)
.2. Charakterisierung des durch Primärklonierung erhaltenen instabilen rekombinanten Plasmids pSB6.2. Characterization of the unstable recombinant plasmid pSB6 obtained by primary cloning
— Restriktionsanalyse von pSB6: Zur Charakterisierung von pSB6 mittels Restriktasen werden die gleichen Methoden der Restriktasebehandlung und Gelektrophorese wie in STEINBORN et al. (Erfindungsanmeldung 1983), angewendet. Durch Einfach-, Zweifach- und Dreifachverdauungen mit verschiedenen Restriktasen und Auftrennung in Agarose- und Polyacrylamidgelen wird für pSB6 die Restriktionskarte nach Abb. 2 ermittelt. Das durch Primärklonierung inserierte Bcll-Fragment hat eine Größe von 5,4kb und zeigt auf der Seite der EcoRI-Schnittstelle eine weitgehende Übereinstimmung mit dem von PALVA (PALVA, I.: Gene 19,81-87.1982) aus einem anderen Donorstamm von B.amyloliquefaciens klonierten Fragment. Nach den Ergebnissen von PALVA befindet sich das funktionsfähige Amylasegen im Pvull-Pvull bzw. Bcll-BamHI-Subfragment von pSB6.- Restriction analysis of pSB6: For the characterization of pSB6 by means of Restrictases the same methods of Restraktasebehandlung and gel electrophoresis as in STEINBORN et al. (Invention patent application 1983). By single, double and triple digests with different restrictases and separation in agarose and polyacrylamide gels, the restriction map for pSB6 is determined according to Fig. 2. The BclI fragment inserted by primary cloning has a size of 5.4 kb and shows, on the side of the EcoRI site, a broad agreement with that of PALVA (PALVA, I .: Gene 19, 81-87, 1982) from another donor strain of B. amyloliquefaciens cloned fragment. According to the results of PALVA, the functional amylase gene is located in the Pvull-Pvull or BclI-BamHI subfragment of pSB6.
— Nachweis der Plasmid-kodierten Bildung von mesophileralpha-Amylase durch B.subtilis GSB26(pSB6): Bei Retransformation von pSB6 in den Plasmid-freien, Amylase-defekten Wirtsstamm GSB26 ist in allen Fällen, korreliert mit dem gelelektrophoretischen Nachweis von pSB6, ein gekoppelterTransfer des Phänotyps Amy+Cmr nachweisbar. Da die Transformation nach der für Plasmid-DNA spezifischen PEG-Protoplasten-Methode nach CHANG und COHEN (CHANG, S., COHEN, S.N.: Molec. gen. Genet. 168,111-115.1979) erfolgt, kann chromosomale Transformation als Ursachefür diesen Cotransfer ausgeschlossen werden. Ein zusätzlicher Nachweis für die Plasmid-kodierte Amylasebildung ergibt sich aus der spontanen Segregation von pSB6 aus GSB26 (s. u.), bei der in allen Fällen mit dem Plasmidverlust auch Cm' und Amy+eliminiert werden. Hinsichtlich des Grades der Hitzestabilität stimmt die von pSB6 in B. subtilisGSB26 kodierte Amylase mit der chromosomal kodierten mesophilen alpha-Amylase des Donorstammes B. amyloliquefaciens ATCC23844 überein (Inaktivierung auf 0,1% Restaktivität nach 60min bei 85"C).- Demonstration of the plasmid-encoded formation of mesophileralpha-amylase by B.subtilis GSB26 (pSB6): In retransformation of pSB6 into the plasmid-free, amylase-defective host strain GSB26, a coupled transfer is in all cases correlated with the gel electrophoretic detection of pSB6 of the phenotype Amy + Cm r detectable. Since the transformation is carried out according to the plasmid DNA-specific PEG protoplast method according to CHANG and COHEN (CHANG, S., COHEN, SN: Molec. Gen. Genet., 168, 11-11-11, 1979), chromosomal transformation can be excluded as cause for this co-transfer , Additional evidence for plasmid-encoded amylase formation results from the spontaneous segregation of pSB6 from GSB26 (see below), which also eliminates Cm 'and Amy + with plasmid loss in all cases. With regard to the degree of heat stability, the amylase encoded by pSB6 in B. subtilis GSB26 is consistent with the chromosomally encoded mesophilic alpha-amylase of the donor strain B. amyloliquefaciens ATCC23844 (inactivation to 0.1% residual activity after 60 min at 85 ° C).
Zur Charakterisierung der Plasmid-kodierten Amylasebildung wird die alpha-Amylase-Aktivität in Überständen von Flüssigkulturen in TBY-Vollmedium (1 % bactotryptone, Difco — 0,5% yeast extract, Difco — 0,5% NaCI; pH 7,0) — 5% lösliche Stärke — 10μg Cm/ml nach48Std. Kulturdauer bei 37°C bestimmt. Zur Ermittlung der Hitzestabilität wird die Hitzebehandlung des Kulturüberstandes in Anwesenheit von 2mM CaCI ausgeführt. Die quantitative Bestimmung der alpha-Amylase-Aktivität erfolgt mittels Spofa-alpha-Amylase-Testtabletten.To characterize the plasmid-encoded amylase formation, the alpha-amylase activity in supernatants of liquid cultures in TBY-complete medium (1% bactotryptone, Difco - 0.5% yeast extract, Difco - 0.5% NaCl, pH 7.0) - 5% soluble starch - 10μg Cm / ml after 48h Culture time determined at 37 ° C. To determine the heat stability, the heat treatment of the culture supernatant is carried out in the presence of 2 mM CaCl. The quantitative determination of the alpha-amylase activity is carried out by means of spofa-alpha-amylase test tablets.
— Einfluß von Selektionsdruck auf die genetische Stabilität und Plasmid-kodierte Amylasebildung von pSB6: Unter Selektionsdruck (10/ng Cm/ml) ist für GSB26 (pSB6) nach Langzeitkultivierung (>30 Generationen) in TBY-Vollmedium-5% lösliche Stärke keine Plasmidsegregation nachweisbar. Die Plasmid-kodierte Amylasebildung erreicht ein 2- bis 3faches Niveau über dem bereits hohen Ausgangsniveau des Donorstammes ATCC23844, und die Kopienzahl (bestimmt nach WEISBLUM, G., GRAHAM, M. Y., GRYCZAN, T., DUBNAU, D.: J. Bacteriol. 137,635-643.1979) von pSB6 beträgt 20/Zelle. Dagegen ist bei Langzeitkultivierung ohne Selektionsdruck ein Plasmidverlust bei 20 bis 80% der Zellen feststellbar, und die Amvlasebildung führt zu entsprechend reduzierten Aktivitäten. Die genetische Instabilität von pSB6 beschränkt sich nicht auf B.subtilis GSB26, sondern ist auch für andere Bacillus-Wirtsstämmb feststellbar. Hinsichtlich der hohen Expression des rekombinanten Amylasegens erfüllt pSB6 eine wesentliche Anforderung für seine Nutzung in Produktionsstämmen, ist jedoch wegen seiner genetischen Instabilität in Abwesenheit vom Selektionsdruck- Influence of selection pressure on genetic stability and plasmid-encoded amylase formation of pSB6: Under selection pressure (10 / ng Cm / ml), no plasmid segregation is observed for GSB26 (pSB6) after long-term cultivation (> 30 generations) in TBY full-medium 5% soluble starch detectable. The plasmid-encoded amylase formation reaches a 2 to 3-fold level above the already high starting level of the donor strain ATCC23844, and the copy number (determined according to WEISBLUM, G., GRAHAM, MY, GRYCZAN, T., DUBNAU, D .: J. Bacteriol. 137,635-643,1979) of pSB6 is 20 / cell. In contrast, in long-term cultivation without selection pressure a plasmid loss in 20 to 80% of the cells is detectable, and the Amvlasebildung leads to correspondingly reduced activities. The genetic instability of pSB6 is not limited to B.subtilis GSB26, but is also detectable for other Bacillus host strains. In view of the high expression of the recombinant amylase gene, pSB6 fulfills an essential requirement for its use in production strains, but because of its genetic instability it is in the absence of selection pressure
dafür nicht geeignet not suitable for it
I.3. Reklonierung des rekombinanten Gens für mesophile alpha-Amylase nach der „Puzzle-Methode"I.3. Recloning of the recombinant mesophilic alpha-amylase gene using the "puzzle method"
— Restriktaseverdauung: DNA des rekombinanten Dohorplasmids pSB6 und des Vektorplasmids pDB101 (BEHNKE, D., MAHLKE, M„ HARTMANN, M., WALTER, F.: Plasmid 2, 605-616.1979) werden in getrennten Ansätzen mit der kleinschneidenden Restriktase Sau3A behandelt. In 100μΙ Verdauungsgemisch sind enthalten: 10 bis 20/xg Plasmid-DNA, 0,5μ1 Sau3A unbekannter Aktivität, 10μ,110fach konzentrierter Sau3A-Puffer (Zusammensetzung nach Katalog der New England Bio Labs 1983/84). Bei Variation der Behandlungszeit erfolgt die Sau3A-Behandlung für beide Plasmide in unterschiedlichem Maße: Das Donorplasmid wird partiell gespalten, so daß überwiegend Fragmente von 2 bis6kb entstehen (gemessen an einem λ Hindlll-Standard). Das Vektorplasmid wird dagegen nur so kurzzeitig behandelt, daß überwiegend nur eine Linearisierung, nicht aber eine Fragmentierung resultiert. Als Standard für die Linearisierung von pDB101 dient EcoRI-verdaute DNA von pDB101 (pDB101 hat nur eine unikale EcoRI-Spaltstelle).Restriction digestion: DNA of the recombinant dohor plasmid pSB6 and the vector plasmid pDB101 (BEHNKE, D., MAHLKE, M. HARTMANN, M., WALTER, F .: Plasmid 2, 605-616, 1979) are treated in separate batches with the small-cutting restrictase Sau3A. In 100μΙ digestion mixture are included: 10 to 20 / xg plasmid DNA, 0.5μ1 Sau3A unknown activity, 10μ, concentrated 110x Sau3A buffer (composition according to New England Bio Labs 1983/84 catalog). When varying the treatment time, the Sau3A treatment for both plasmids takes place to varying degrees: The donor plasmid is partially cleaved, so that predominantly fragments of 2 to 6kb arise (measured on a λ HindIII standard). By contrast, the vector plasmid is only treated so briefly that predominantly only one linearization results, but not fragmentation. As standard for the linearization of pDB101 EcoRI-digested DNA of pDB101 (pDB101 has only one unique EcoRI cleavage site).
— Ligation: Ausführung wie unter 1.1. beschrieben- Ligation: execution as in 1.1. described
— Transformation und Selektion: Das Ligationsgemisch wird wie unter 1.1. nach der Methode von CHANG und COHEN (1979) in Protoplasten von B.subtilis GSB26 amyE transformiert. Es werden Emr-Plasmidtransformanten mit einer Häufigkeit von 1CT3 pro regenerierte Protoplasten erhalten, von denen 1CT2 zugleich Amy+ sind. Aus drei unabhängigen Versuchen werden 150 repräsentative Amy+Cmr-Plasmidtransformanten isoliert und charakterisiert. Erwartungsgemäß (s. Darlegung des Wesens der Erfindung, Teil 1) führt die Reklonierung nach der „Puzzle-Methode" zu einem Spektrum unterschiedlicher rekombinanter Plasmide, so daß die 150 Plasmidtransformanten hinsichtlich des Niveaus der Amylasebildung und des Grades der Plasmidstabilität im wesentlichen vier Gruppen zuzuordnen sind:- Transformation and selection: The ligation mixture is as in 1.1. transformed into protoplasts of B.subtilis GSB26 amyE according to the method of CHANG and COHEN (1979). Em r plasmid transformants are obtained at a frequency of 1CT 3 per regenerated protoplasts, of which 1CT 2 are Amy + at the same time. From three independent experiments, 150 representative Amy + Cm r plasmid transformants are isolated and characterized. As expected (see the essence of the invention, part 1), recloning according to the "puzzle method" results in a spectrum of different recombinant plasmids so that the 150 plasmid transformants are essentially grouped into the levels of amylase formation and degree of plasmid stability are:
Amylasebildung Plasmidstabilität rekombinante PlasmideAmylase formation Plasmid stability Recombinant plasmids
— gering instabil- slightly unstable
— gering stabil- low stability
— hoch instabil pSB9,15,16,18- highly unstable pSB9,15,16,18
— hoch stabil pSB17,20- highly stable pSB17,20
Die überwiegende Mehrheit dieser Plasmidtransformanten ist durch ein niedriges Niveau der Piasmid-kodierten Amylasebildung charakterisiert. Von der Plasmidtransformanten mit hoher Amylasebildung (ca. 10fach im Vergleich zur ersten Gruppe) enthalten vier Transformanten ein instabiles und zwei Transformanten ein stabiles rekombinantes Plasmid. Unter der Zielstellung ihrer praktischen Nutzung konzentriert sich die weitere Charakterisierung zunächst (s. 1.4) auf diese beiden stabilen, hochexprimierenden rekombinanten Plasmide, die mit „pSB17" und „pSB20" bezeichnet werden; die.entsprechenden Plasmidtransformanten erhalten die Stammbezeichnung B.subtilis GSB26 (pSB17) bzw. GSB26 (pSB20).The vast majority of these plasmid transformants are characterized by a low level of piasmide encoded amylase formation. Of the plasmid transformants with high amylase production (about 10-fold compared to the first group), four transformants contain one unstable and two transformants a stable recombinant plasmid. Under the goal of their practical use, further characterization initially (see 1.4) focuses on these two stable, high-expression recombinant plasmids, designated "pSB17" and "pSB20"; The corresponding plasmid transformants are given the strain designation B.subtilis GSB26 (pSB17) or GSB26 (pSB20).
Die Plasmidtransformanten B.subtilis GSB26 (pSB17) und GSB26 (pSB20) wurden am 21.9.84 im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, hinterlegt.The plasmid transformants B.subtilis GSB26 (pSB17) and GSB26 (pSB20) were synthesized on September 21, 1984 in the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the AdW of the GDR, 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, deposited.
1.4. Charakterisierung der durch Reklonierung nach der „Puzzle-Methode" erhaltenen stabilen rekombinanten Plasmide pSB17 und pSB201.4. Characterization of the stable recombinant plasmids pSB17 and pSB20 obtained by recloning according to the "puzzle method"
— Charakterisierung der Piasmid-kodierten Bildung von mesophiler alpha-Amylase durch GSB26(pSB17) und GSB26(pSB20): Der Nachweis der Piasmid-kodierten Bildung von mesophiler alpha-Amylase erfolgt hier nach den gleichen Kriterien wie unter 1.2. Spontane Plasmidsegregation kann bei pSB17 und pSB20 nicht als Kriterium genutzt werden, da beide rekombinanten Plasmide in GSB26 extrem stabil sind: Nach Langzeitkultivierung (>30 bis 50 Generationen) in TBY-5%-lösliche Stärke ist für pSB17 und pSB20 sowohl mit als auch ohne Selektionsdruck (10Mg Em/ml) keine strukturelle Änderung oder Segregation dieser rekombinanten Plasmide feststellbar. Entsprechend hat Selektionsdruck durch Em auch keinen Einfluß auf das Niveau der Piasmid-kodierten Amylasebildung. Sie erreicht bei GSB26 (pSB17) etwa das Niveau des Plasmid-freien Donorstammes ATCC23844, während GSB26 (pSB20) eine 2fach höhere Amylasebildung erreicht (Abb. 3). Diese 2fache Amylasebildung kodiert pSB20 im Vergleich zu pSB17 bei gleicher- Characterization of the piasmide-encoded formation of mesophilic alpha-amylase by GSB26 (pSB17) and GSB26 (pSB20): The detection of the piasmide-encoded formation of mesophilic alpha-amylase follows the same criteria as under 1.2. Spontaneous plasmid segregation can not be used as a criterion in pSB17 and pSB20 because both recombinant plasmids are extremely stable in GSB26: After long-term cultivation (> 30 to 50 generations) in TBY-5% soluble starch is for both pSB17 and pSB20 both with and without Selection pressure (10 μg Em / ml) no structural change or segregation of these recombinant plasmids detectable. Accordingly, selection pressure by Em also has no effect on the level of piasmide-coded amylase formation. In GSB26 (pSB17) it reaches approximately the level of the plasmid-free donor strain ATCC23844, while GSB26 (pSB20) achieves a 2-fold higher amylase formation (Figure 3). This 2-fold amylase formation encodes pSB20 in comparison to pSB17 in the same
— Kopienzahl, worin beide rekombinanten Plasmide mit dem Vektorplasmid pDB101 (5 Kopien pro Zelle; bestimmt nach WEISBLUM, B., GRAHAM, M. Y., GRYCZAN, T., DUBNAU, D.: J. Bacteriol. 137, 635-643.1979) übereinstimmen. - copy number, wherein both recombinant plasmids with the vector pDB101 (5 copies per cell; determined according Weisblum, B., Graham, MY, Gryczan, T., Dubnau, D .: J. Bacteriol 137, 635-643.1979.) Match.
— Restriktionsanalyse von pSB17 und pSB20: Dazu werden die gleichen Methoden der Restriktasebehandlung und Gelelektrophorese wie in STEINBORN et al. (Erfindungsanmeldung 1983) angewendet. Nach Restriktasebehandlung wird gelelektrophoretisch nachgewiesen, daß bei pSB17 (21,7kb) das rekombinante Amylasegen in der nicht repetitiven Sequenz US1 vonpDB101 (17,85 kb) inseriert ist. Daraus kann geschlossen werden, daß neben der EcoRI-Spaltstelle auch andere Insertionsorte in der unikalen Sequenz US1 von pDB101 für die Erzeugung von stabilen rekombinanten Plasmiden geeignet sind.- Restriction analysis of pSB17 and pSB20: For this purpose, the same methods of Restraktasebehandlung and gel electrophoresis as in STEINBORN et al. (Invention application 1983) applied. After restriction analysis, it is demonstrated by gel electrophoresis that the recombinant amylase gene in pSB17 (21.7 kb) is inserted in the non-repetitive sequence US1 of pDB101 (17.85 kb). It can be concluded that in addition to the EcoRI site other insertion sites in the unique sequence US1 of pDB101 are suitable for the generation of stable recombinant plasmids.
Zu einem besonders interessanten und originellen Ergebnis führt die Restriktionsanalyse von pSB20. Wie aus der Restriktionskarte in Abb. 4 ersichtlich, enthält pSB20 eine Duplikation des rekombinanten Amylasegens, wobei die beiden Amylasegene in je einem Donorfragment gleicher Größe, invertiert und an gleichen Orten der beiden homologen Sequenzen des invertierten Repeats von pDB101 inseriert sind. Der Nachweis dieser Genduplikation führt zu der Schlußfolgerung, daß die durch pSB20 im Vergleich zu pSB17 kodierte zweifache Amylasebildung (s.o.) durch Gen-Dosis-Effekt bedingt ist.The restriction analysis of pSB20 leads to a particularly interesting and original result. As can be seen from the restriction map in FIG. 4, pSB20 contains a duplication of the recombinant amylase gene, wherein the two amylase genes are inverted in a donor fragment of the same size, inverted and in the same locations of the two homologous sequences of the inverted repeats of pDB101. The proof of this gene duplication leads to the conclusion that the double amylase formation (see above) coded by pSB20 in comparison to pSB17 is caused by gene dose effect.
1.5. Enstehung der Genduplikation im pSB201.5. Genesis of gene duplication in pSB20
Die Identität der Duplikation in pSB20 ist dadurch erklärbar, daß solche Duplikationen unter Anwendung der „Puzzle-Methode" und Nutzung eines Vektorplasmids mit invertiertem Repeat in zwei aufeinanderfolgenden Schritten entstehen: Primär wird durch Reklonierung ein Donorfragment in eine Sequenz des invertierten Repeats inseriert, sekundär wird dieses Insert spontan durch homologe Rekombination dupliziert.-Neben der Identität der Duplikation in pSB20 ergeben sich dafür weitere Hinweise durch die Charakterisierung der hochexprimierenden, im Unterschied zu pSB20 aber instabilen rekombinanten Plasmide pSB18 und pSB18, die ebenfalls durch Reklonierung nach der „Puzzle-Methode' erhalten wurden (s. I.3.). Nach Kultivierung von Plasrnidtransformanten mit diesen instabilen rekombinanten Plasmiden lessen sich folgende Derivate nachweisen:The identity of the duplication in pSB20 can be explained by the fact that such duplications arise using the "puzzle method" and using an inverted repeat vector plasmid in two consecutive steps: Primarily, by recloning, a donor fragment is inserted into a sequence of the inverted repeat, becoming secondary This insert is spontaneously duplicated by homologous recombination. In addition to the identity of the duplication in pSB20, further evidence is provided by the characterization of the highly expressing, but unlike pSB20, unstable recombinant plasmids pSB18 and pSB18, which are also purified by recloning according to the "puzzle method". After culturing plasmid transformants with these unstable recombinant plasmids, the following derivatives can be detected:
— mit stabilem, nicht rekombinantem Plasmid, nach Restriktionsanalyse identisch mit dem Vektorplasmid pDB101- with stable, non-recombinant plasmid, according to restriction analysis identical to the vector plasmid pDB101
— mit stabilem, rekombinantem Plasmid, identisch mit pSB20, also mit Duplikation des rekombinanten AmylasegensWith stable, recombinant plasmid, identical to pSB20, ie with duplication of the recombinant amylase gene
— PlasmidfreieSegreganten.- Plasmid-free organisms.
Das gleiche Spektrum von Derivaten ist auch für eine repräsentative Anzahl von Transformanten nachweisbar, die durch Retransformation von pSB16 oder pSB18 bei niedriger Plasmidkonzentration (die eine Cotransformation von verschiedenen Plasmiden ausschließt) in andere Wirtsstämme von B.subtilis, u.a. auch in eine recE-Mutanten, erhalten werden. Diese Ergebnisse führen zu folgenden Schlußfolgerungen:The same spectrum of derivatives is also detectable for a representative number of transformants produced by retransformation of pSB16 or pSB18 at low plasmid concentration (which excludes cotransformation of various plasmids) to other B.subtilis host strains, et al. also in a recE mutant. These results lead to the following conclusions:
— Die beiden homologen Sequenzen des invertierten Repeats stabilisieren in unbekannter Weise das Vektorplasmid pDB101The two homologous sequences of the inverted repeat stabilize the vector plasmid pDB101 in an unknown manner
— Durch Insertion in nur eine der beiden homologen Sequenzen wird ihre Homologie gestört und dadurch das Plasmid destabilisiert.- Insertion into only one of the two homologous sequences their homology is disturbed and thereby destabilized the plasmid.
— Eine Restabilisierung des Plasmids ist durch Deletion oder aber identische Duplikation des störenden Inserts möglich, die durch recE-unabhängige interplasmide oder intraplasmidale Rekombination erfolgt- Restabilization of the plasmid is possible by deletion or identical duplication of the interfering insert, which occurs by recE-independent interplasmide or intraplasmidale recombination
— Das Entstehen von Plasmid-freien Derivaten kann auf die Segregation von instabilen Plasmiden (der Ausgangsplasmide pSB16bzw. pSB18odervon Derivaten, bei denen die Rekombination keine homologen Sequenzen des invertierten Repeats ergeben hat) zurückgeführt werden.The emergence of plasmid-free derivatives can be attributed to the segregation of unstable plasmids (the starting plasmids pSB16 and pSB18od, respectively, of derivatives in which the recombination did not yield homologous sequences of the inverted repeats).
6. Ermittlung von geeigneten Wirtsstämmen für die praktische Nutzung von pSB17 und pSB20 Es werden solche Bacillus-Stämme als Wirtsstämme erprobt, die selbst eine hohe chromosomal kodierte Amylasebildung aufweisen und auch unter Fermentationsbedingungen eine hohe chromosomal und Plasmid-kodierte Amylasebildung erwarten lassen:6. Identification of Suitable Host Strains for the Practical Uses of pSB17 and pSB20 Bacillus strains are tested as host strains which themselves have a high chromosomally encoded amylase formation and can be expected to have a high chromosomally and plasmid-encoded amylase formation even under fermentation conditions:
— B.amyloliquefaciens ATCC23844(DonorstammfürdiePrimärklonierung,s. 1.1.)B.amyloliquefaciens ATCC23844 (donor strain for primary cloning, see 1.1.)
— B.amyloliquefaciens 10A4(Herkunft: D.M.ELLIS, Columbus)B.amyloliquefaciens 10A4 (origin: D.M.ELLIS, Columbus)
— B.subtilisZF178, B.subtilisCM4: Hochleistungsstämme für chromosomal kodierte alpha-Amylase, entwickelt bzw. unter industriellen Bedingungen erprobt vom ITM Berlin.B.subtilis ZF178, B. subtilis CM4: high performance strains of chromosomally encoded alpha-amylase, developed or tested under industrial conditions by ITM Berlin.
In diese Bacillusstämme werden die rekombinanten Plasmide pSB17 und pSB20 nach der PEG-Protoplasten-Methode (CHANG, S., COHEN, S. N.: Molec. gen. Genet. 168,111-115.1979) transformiert und pro Wirtsstamm wenigstens drei der so erhaltenen Plasmidtransformanten charakterisiert. Die Charakterisierung erfolgt zunächst in TBY-5% lösliche Stärke und ergibt, daß die getesteten Stämme in unterschiedlichem Maße als Wirtsstämmefür eine praktische Nutzung von pSB17 und pSB20 geeignet sind. B.subtilis CM4 und B.amyloliquefaciens 10A4 werden von der weiteren Bearbeitung ausgeschlossen, dabei CM4 häufig Wirtszellderivate mit geringer Amylasebildung auftreten und bei 10A4eine beträchtliche Plasmidinstabilität (bis 80% Plasmidverlsutnach >30 Generationen) beobachtet wird. Besonders kritisch wird die Plasmidstabilität für den Wirts- und zugleich Donorstamm ATCC23844 untersucht, da die Homologie der chromosomalen Inserte von pSB17 und pSB20 mit dem bakteriellen Chromosom von ATCC23844 eine DeStabilisierung der rekombinanten Plasmide erwarten läßt. Eine solche DeStabilisierung wird widerlegt: Aus 12 Subkulturen von vereinzelten Kolonien, erhalten nach Langzeitkultivierung (>50 Generationen) in TBY-5% lösliche Stärke, kann in jedem Falle das Plasmid pSB20 in unveränderter Form reisoliert werden. Alle Plasmidpräparate ergeben im Vergleich zum Ausgangsplasmid gleiche Restriktase-Verdauungsmuster und bei Retransformation in Protoplasten von GSB26 wieder Plasmidtransformanten mit dem gleich hohen Niveau der Plasmid-kodierten Amylasebildung wie beim Ausgangsstamm GSB26 (pSB20). Zur Charakterisierung der Plasmid-kodierten Amylasebildung in Abhängigkeit vom Wirtsstamm werden bei Kultivierung in TBY-5% lösliche Stärke die Ergebnisse nach Abb.4 erhalten:The recombinant plasmids pSB17 and pSB20 are transformed into these Bacillus strains by the PEG protoplast method (CHANG, S., COHEN, S. N .: Molec. Gen. Genet., 168, 11-11-11, 1979) and at least three of the plasmid transformants thus obtained are characterized per host strain. The characterization initially occurs in TBY-5% soluble starch and indicates that the strains tested are to varying degrees suitable as host strains for convenient use of pSB17 and pSB20. B.subtilis CM4 and B.amyloliquefaciens 10A4 are excluded from further processing, with CM4 common host cell derivatives with low amylase formation occurring and with 10A4 considerable plasmid instability (up to 80% plasmid apparent after> 30 generations) is observed. Particularly, the plasmid stability for the host and at the same time donor strain ATCC23844 is investigated, since the homology of the chromosomal inserts of pSB17 and pSB20 with the bacterial chromosome of ATCC23844 can be expected to de-stabilize the recombinant plasmids. Such a de-stabilization is refuted: From 12 subcultures of isolated colonies, obtained after long-term cultivation (> 50 generations) in TBY-5% soluble starch, in any case, the plasmid pSB20 can be reisolated in unmodified form. All plasmid preparations give in comparison to the starting plasmid same Restriktase digestion patterns and retransformation in protoplasts of GSB26 again plasmid transformants with the same high level of plasmid-encoded amylase formation as in the parent strain GSB26 (pSB20). To characterize the plasmid-encoded amylase formation as a function of the host strain, the results obtained according to FIG. 4 are obtained on cultivation in TBY-5% soluble starch:
— pSB17 und pSB20 exprimieren in ZF178 und ATCC23844 eine mehrfach höhere Amylasebildung als in GSB26- pSB17 and pSB20 express multiple levels of amylase formation in ZF178 and ATCC23844 compared to GSB26
— Wie die chromosomal kodierte Amylasebildung erreicht auch die Plasmid-kodierte Amylasebildung in ATCC23844 ein bis zu 2fach höheres Niveau als in ZF178Like chromosomally encoded amylase formation, plasmid-encoded amylase formation in ATCC 23844 reaches up to 2-fold higher levels than in ZF178
— Im Vergleich zu pSB17 exprimiert pSB20 in ATCC23844 (ebenso wie in GSB26) ein annähernd 2faches Niveau der Amylasebildung, während diese unterschiedliche Expression in ZF178 nicht erfolgt.Compared to pSB17, pSB20 in ATCC23844 (as well as in GSB26) expresses approximately 2-fold levels of amylase formation, whereas this differential expression does not occur in ZF178.
Vergleichbare Ergebnisse zur Plasmid-kodierten Amylasebildung werden für den Wirtsstamm ATCC23844 auch in industriell genutzten Fermentermedien erhalten, wie in Abb.5 am Beispiel des Fermentermediums FMM5 (1 % Maisstärke; 1 % Weizenfeinschrot; 1,25% Sojaschrot; 1,5% (NH4I2HPO4; 0,075% KCI; 0,025% MgSO4 x 7 H2O; 0,01 % CaCI2 9% Stärkehydrolysat; 0,7% Lactose; 0,75% Harnstoff; Zusammensetzung nach Angaben des ITM Berlin) dargestellt. Die Amylasebildung der Plasmidtransformanten ATCC3844 (pSB17) und ATCC23844 (pSB20) übertrifft die Amylasebildung des Plasmidfreien Wirtsstammes etwa 2- bzw. 4fach. Daraus folgt, daß die Duplikation des rekombinanten Amylasegens in pSB20 auch bei Kultivierung in Fermentermedium einen entsprechenden Gen-Dosis-Effekt bedingt. Dieser Gen-Dosis-Effekt ist hier auf hohem Niveau der Amylasebildung (vgl. Abb. 5 u. Abb.4) wirksam und gewinnt dadurch eine erhebliche ökonomische Bedeutung.Comparable results for plasmid-encoded amylase formation are also obtained in the industrially used fermenter media for the host strain ATCC23844, as shown in Fig. 5 using the fermenter medium FMM5 (1% corn starch, 1% wheat fines, 1.25% soybean meal, 1.5% (NH 4 I 2 HPO 4 ; 0.075% KCl; 0.025% MgSO 4 x 7 H 2 O; 0.01% CaCl 2 9% starch hydrolyzate; 0.7% lactose; 0.75% urea; composition according to ITM Berlin) The amylase formation of the plasmid transformants ATCC3844 (pSB17) and ATCC23844 (pSB20) exceeds the amylase formation of the plasmid-free host strain approximately 2-fold or 4-fold It follows that the duplication of the recombinant amylase gene in pSB20 also has a corresponding gene dose effect when cultivated in fermenter medium This gene dose effect is effective here at a high level of amylase formation (see Fig. 5 and Fig. 4) and thus acquires considerable economic importance.
Die Plasmidtransformanten B.amyloliquefaciens ATCC23844 (pSB17) und ATCC23844 (pSB20) wurden am 21.9.84 im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, hinterlegt.The plasmid transformants B. amyloliquefaciens ATCC23844 (pSB17) and ATCC23844 (pSB20) were synthesized on September 21, 1984 in the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the AdW of the GDR, 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, deposited.
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|---|---|---|---|
| DD26792184A DD233852B1 (en) | 1984-10-03 | 1984-10-03 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF ALPHA AMYLASE |
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| DD233852B1 DD233852B1 (en) | 1987-11-18 |
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ID=5560969
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997031118A1 (en) * | 1996-02-22 | 1997-08-28 | Zeneca Limited | Production of proteins, plasmids coding therefor and organisms containing such plasmids |
-
1984
- 1984-10-03 DD DD26792184A patent/DD233852B1/en not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997031118A1 (en) * | 1996-02-22 | 1997-08-28 | Zeneca Limited | Production of proteins, plasmids coding therefor and organisms containing such plasmids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD233852B1 (en) | 1987-11-18 |
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