DD232509A5 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF LYMPHOTOXINE AND LYMPHOTOXIN-MRNA - Google Patents
METHOD FOR THE PRODUCTION OF LYMPHOTOXINE AND LYMPHOTOXIN-MRNA Download PDFInfo
- Publication number
- DD232509A5 DD232509A5 DD84266738A DD26673884A DD232509A5 DD 232509 A5 DD232509 A5 DD 232509A5 DD 84266738 A DD84266738 A DD 84266738A DD 26673884 A DD26673884 A DD 26673884A DD 232509 A5 DD232509 A5 DD 232509A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- lymphotoxin
- cells
- culture
- medium
- mrna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lymphotoxin und von Lymphotoxin-mRNA fuer die Anwendung zur Prophylaxe und zur Bekaempfung von Tumorzellen. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, mit dem Lymphotoxin sowie Lymphotoxin-mRNA in ausreichender Menge und Reinheit hergestellt werden kann. Das neue Verfahren zur Herstellung von Lymphotoxin oder Lymphotoxin-mRNA wird erfindungsgemaess in der Weise ausgefuehrt, dass mit Viren transformierte Affen-T-Lymphocyten in einem geeigneten Medium in permanenter Kultur gezuechtet werden und das Lymphotoxin oder die Lymphotoxin-mRNA nach an sich bekannten Methoden isoliert wird. Bevorzugt werden erfindungsgemaess als Viren Herpesviren, vorzugsweise jedoch Herpesvirus saimiri oder Herpesvirus ateles, verwendet, sowie als Affen-T-Lymphocyten Zellen aus der Gattung Saguimus.The invention relates to a process for the preparation of lymphotoxin and lymphotoxin mRNA for use in the prophylaxis and for the control of tumor cells. The aim of the invention is to provide a new method by which lymphotoxin and lymphotoxin mRNA can be produced in sufficient quantity and purity. The novel process for producing lymphotoxin or lymphotoxin mRNA is carried out according to the invention in such a way that virus-transformed monkey T lymphocytes are cultivated in a suitable medium in permanent culture and the lymphotoxin or lymphotoxin mRNA is isolated by methods known per se becomes. According to the invention, the viruses used are preferably herpesviruses, but preferably herpesvirus saimiri or herpesvirus ateles, and cells from the genus Saguimus as monkey T lymphocytes.
Description
AP C 08 G/266 738/8 (64 316/18)AP C 08 G / 266 738/8 (64 316/18)
Verfahren zur Herstellung von Lymphotoxin und Lymphotoxin-mRIJA Anwendungsgebiet der Erfindung Process for the preparation of lymphotoxin and lymphotoxin-mRIJA Field of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lymphotoxin und von Lymphotoxin-mRITA. Das erfindungsgemäß hergestellte Lymphotoxin und Lymphotoxin-mRUA wird angewandt zur Prophylaxe und zur Bekämpfung von Tumorzellen.The invention relates to a process for the preparation of lymphotoxin and lymphotoxin mRITA. The lymphotoxin and lymphotoxin mRUA prepared according to the invention are used for the prophylaxis and control of tumor cells.
Aus der Literatur ist bekannt, daß gewisse Zellen von Säugetieren nach geeigneter Stimulation in vitro in der Lage sind, sogenannte Lymphotoxine zu produzieren (siehe beispielsweise Evans in Cancer Immunol, Immunother, 1_2, 181-190 (1983) und Granger et al· in Biology of the Lymphokines ρρ· 141-180, Academic Press 1979). Hierbei stellt Lymphotoxin einer gegebenen Species in vitro kein einheitliches Protein dar, vielmehr werden eine Reihe von Subtypen beschrieben, die sich in Molekulargewicht, Ladung und Stabilität unterscheiden (siehe beispielsweise Granger et al· in Biology of the Lymphokines pp. 141-180, Academic Press 1979)· Im humanen System werden beispielsweise vier Klassen von Lymphotoxinen unterschieden, deren Molekulargewichte in den Bereichen von 10.000 bis 20.000 für JTiLT, 35.000 bis 50.000 für BLt, 70.000 bis 90.000 für osLQ? und 200.000 bis 600.000 für LT-Komplex liegen.It is known from the literature that certain mammalian cells, after appropriate in vitro stimulation, are capable of producing so-called lymphotoxins (see, for example, Evans in Cancer Immunol, Immunother, 1_2, 181-190 (1983) and Granger et al., Biology of the Lymphokines ρρ 141-180, Academic Press 1979). Herein, lymphotoxin does not represent a single protein in vitro in a given species, but rather describes a number of subtypes that differ in molecular weight, charge and stability (see, for example, Granger et al., Biology of the Lymphokines, pp. 141-180, Academic Press 1979) · In the human system, for example, four classes of lymphotoxins are distinguished, their molecular weights ranging from 10,000 to 20,000 for JTiLT, 35,000 to 50,000 for BLt, 70,000 to 90,000 for osLQ? and 200,000 to 600,000 for LT complex lie.
Lymphotoxine besitzen die Fähigkeit, in vitroLymphotoxins have the ability in vitro
a) die maligne Transformation von Zellen zu verhindern (siehe Evans et al. in Int. J. Cancer 2J-, 45-49 (1981) und Eansom et al. in J. Hatl. Cancer Inst· 6£, 741-744 (1982)),a) to prevent the malignant transformation of cells (see Evans et al in Int J. Cancer 2J -.., 45-49 (1981) and Eansom et al in J. Hatl Cancer Inst · 6 £, 741-744 (.. 1982)),
b) cytostatisch oder sogar cytolytisch auf Tumorzellen zu wirken (siehe Evans et al. in Inununopharmacology 3_' 347-359 (1981)) undb) to act cytostatically or even cytolytically on tumor cells (see Evans et al in Inununopharmacology 3_ '347-359 (1981)) and
c) die Empfindlichkeit von Tumorzellen gegenüber, der zellulären Immunabwehr des Organismus zu steigern (siehe Evans et al. in Cell. Immunol. 63., 1-15 (1981) und Ransom et al. in Int. J. Cancer 29_, 451-458 (1982)).c) to increase the sensitivity of tumor cells to enhance the cellular immune defense of the organism (see Evans et al., Cell Immunol 63, 1-15 (1981) and Ransom et al., Int.J. Cancer 29, 451- 458 (1982)).
Desweiteren ist aus der Literatur bekannt, daß Lymphotoxin-Präparationen im Tiermodell auch die Regression von Tumoren herbeiführen können (siehe Khan et al. in Proc Soc. Exptl. Biol. Med. 169, 291-294 (1982)). Lymphotoxine haben daher große Bedeutung für die Prophylaxe und Therapie maligner Erkrankungen.Furthermore, it is known from the literature that lymphotoxin preparations in the animal model can also cause the regression of tumors (see Khan et al., Proc Soc., Ex. Biol. Med. 169 , 291-294 (1982)). Lymphotoxins are therefore of great importance for the prophylaxis and treatment of malignant diseases.
Die bisher bekannt gewordenen Verfahren zur Gewinnung von Lymphotoxinen gehen in den meisten Fällen von primären Zellen aus,. z.B. von Leukozyten-Präparationen aus peripherem Blut oder Tonsillen des Menschen (siehe Williams et al. in J. Immunol. 130, 518-520 (1983)), von Milzzellen von Mäusen (siehe Aksamit et al. in Infect. Immun. 36_, 1028-1035 (1982) und Trivers et al. in J. Immunol. 117, 130-135 (1976)) oder von Leukocyten aus der Bauchhöhle von syrischen Hamstern oder Meerschweinchen (siehe beispielsweise Evans et al. in Int. J. Cancer 2_7_, 45-49 (1981)). Hierbei müssen diese Zellen erst durch Inkubation mit hochmolekularen Mitogenen, z.B. Phytohämagglutinin, zur Produktion von Lymphotoxinen angeregt werden. So konnten auch bisher in den Kulturüberstanden von B-Lymphocyten-Zellinien nur geringe Lymphotoxin-Aktivitäten festgestellt werden (siehe Granger et al. in J. Immunol. 104, 1476 (1970) und Amino et al. in J. Immunol. 113. f 1334-1345 (1974)).The hitherto known methods for obtaining lymphotoxins are based in most cases on primary cells. eg, leukocyte preparations from human peripheral blood or tonsils (see Williams et al., J. Immunol., 130 , 518-520 (1983)), mouse spleen cells (see Aksamit et al., Infect. 1028-1035 (1982) and Trivers et al., J. Immunol., 117 , 130-135 (1976)) or from abdominal cavities of Syrian hamsters or guinea pigs (see, for example, Evans et al., Int. J. Cancer 2_7_ , 45-49 (1981)). These cells must first be stimulated by incubation with high molecular weight mitogens, such as phytohemagglutinin, for the production of lymphotoxins. So far, only low lymphotoxin activities have been found in the culture supernatants of B lymphocyte cell lines (see Granger et al., J. Immunol., 104 , 1476 (1970) and Amino et al., J. Immunol., 113. f 1334-1345 (1974)).
Da nach den bisher angewandten Methoden zur Produktion von Lymphotoxinen nur geringe Mengen und in nur geringer Reinheit hergestellt werden konnten, konnten die bisher herge-Since, according to the methods used hitherto for the production of lymphotoxins, only small amounts and only low purity could be produced, the hitherto used
stellten Lymphotoxine weder bis zur Homogenität gereinigt noch in ausreichenden Mengen für umfangreichere Untersuchungen der antineoplastischen Wirkung am Tiermodell zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus konnte bisher auch noch keine biologisch aktive Lymphotoxin-mRITA nachgewiesen werden; dies ist jedoch die Voraussetzung für die molekulare KLonierung der Lymphotoxin-Gene mittels der Methoden der Gentechnologie,Lymphotoxins were neither purified to homogeneity nor provided in sufficient quantities for more extensive investigations of the antineoplastic action on the animal model. In addition, no biologically active lymphotoxin mRITA has yet been detected; however, this is the prerequisite for the molecular cloning of the lymphotoxin genes by the methods of genetic engineering,
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem Lymphotoxin sowie Lymphotoxin-mRUA in ausreichender Menge und ^einheit hergestellt werden kann«The aim of the invention is to provide a method by which lymphotoxin and lymphotoxin mRNA can be produced in sufficient quantity and quantity.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein geeignetes Ausgangsmaterial aufzufinden, das imstande ist, in einem geeigneten Kulturmedium Lymphotoxin und Lymphotozin-mRliA zu produzieren.The invention has for its object to find a suitable starting material which is capable of producing in a suitable culture medium lymphotoxin and lymphotozine mRliA.
Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß Zellen des sogenannten T-Lymphocyten-Typs von Affen, insbesondere der Gattung Saguinus, beispielsweise die Zellinien L-77/5» A651, A2543, 70ΪΓ2, 1022 und 167O, vorzugsweise jedoch die Zellinien 1022 und 1670, die durch Infektion mit Viren, vorzugsweise mit Herpesviren wie Herpes virus saimiri oder Herpes virus ateles, in vitro oder in vivo transformiert und zu permanentem Wachstum ±n Kultur befähigt wurden, in einem geeigneten Kulturmedium spontan, das heißt, ohne weitere Induktion, erhebliche Mengen an LyphotoxLn und Lymphotoxin-mRUA produzieren.According to the invention, it has now been found that cells of the so-called T lymphocyte type of monkeys, in particular of the genus Saguinus, for example the cell lines L-77/5 "A651, A2543, 70ΪΓ2, 1022 and 167O, but preferably the cell lines 1022 and 1670, the by infection with viruses, preferably with herpesviruses such as herpes virus saimiri or herpes virus ateles, transformed in vitro or in vivo and enabled to permanent growth ± n culture, in a suitable culture medium spontaneously, that is, without further induction, significant amounts of LyphotoxLn and produce lymphotoxin mRUA.
Perner wurde gefunden, dai3 durch Zusatz eines sogn· Stimulators zum Kulturmedium, 25· B. eines literaturbekannten Tumorpromotors wie einem Diterpen-Derivat, vorzugsweise vom Tiglian- oder Daphnan-Iyp» z· B# Mezerein oder eines Esters des Phorbols, vorzugsweise ^-Q-tetradecanoylphorbol-^- -acetat (siehe Diamon et al· in Advances in Cancer Research Vol· 32, seiten 1 bis 74f Academic Press 1980 und Hecker in Garcinogenesis Vol· II, Mechanisms of ™umor Tromotion and Oocarcinogenesis, Seiten 11-48, Raven Press, New York, 1978), in einer Konzentration von 1-1000 ng/ml die Produktion von Lymphotoxin und von Lymphotoxin-mRIIA weiter gesteigert wird·Perner was found dai3 · by adding a sogn · stimulator to the culture medium 25 as a literature known tumor promoter such as a taxane derivative, preferably from Tiglian- or daphnane-IYP "z * B # Mezerein or an ester of phorbol, preferably ^ - Q-tetradecanoylphorbol - ^ - acetate (see Diamon et al · in Advances in Cancer Research Vol 32 ·, s nits 1 to 74 f Academic Press 1980 and Hecker in Garcinogenesis · Vol II, Mechanisms of umor ™ Tromotion and Oocarcinogenesis, pages 11 -48, Raven Press, New York, 1978), in a concentration of 1-1000 ng / ml, the production of lymphotoxin and lymphotoxin-mRIIA is further increased.
Als Kulturmedien kommen hierbei die üblichen serumfreien und serumhaltigen Kulturmedien in Betracht, beispielsweise Eagle's Minimum Essential Medium oder Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 (RPMI1640), denen jeweils fötales Kalbserum und Antibiotica zugesetzt werden kann, vorzugsweise bis zu 10 % fötales Kalbserum, Penicillin und Streptomycin.Suitable culture media are the usual serum-free and serum-containing culture media, for example Eagle's Minimum Essential Medium or Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 (RPMI1640), to each of which fetal calf serum and antibiotics can be added, preferably up to 10% fetal calf serum, penicillin and streptomycin ,
Bei der Produktion der Lymphotoxin-Proteine wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt in der Weise durchgeführt, daß transformierte Zellen nach Zusatz von 10 bis 100 ng/ml 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetat oder Mezerein als Stimulator in einem serumhaltigen, unter bestimmten Bedingungen auch in einem serumfreien Kulturmedium, z.B. in RPMI 1640, 1 bis 7 Tage, vorzugsweise jedoch 3 bis 4 Tage gehalten werden und anschließend das so gebildete Lymphotoxin aus dem Kulturüberstand nach an sich bekannten Methoden abgetrennt, konzentriert und gereinigt wird. Besonders vorteilhaft wird dieses Verfahren jedoch in der Weise durchgeführt, daß die Zellen nach anfänglicher Proliferation in einem serumhaltigen Medium in ein serumarmes, vorzugsweise jedoch serumfreies Medium, übergeführt werden.In the production of lymphotoxin proteins, the method of the invention is preferably carried out in such a way that transformed cells after addition of 10 to 100 ng / ml 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate or mezerein as a stimulator in a serum-containing, under certain conditions also in a serum-free culture medium, eg in RPMI 1640, for 1 to 7 days, but preferably for 3 to 4 days, and then the lymphotoxin thus formed is separated from the culture supernatant by methods known per se, concentrated and purified. However, this method is particularly advantageously carried out in such a way that the cells after initial proliferation in a serum-containing medium in a serum-poor, but preferably serum-free medium, converted.
Bei der Produktion der Lymphotoxin-mRNA wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt in der Weise durchgeführt, daß transformierte Zellen nach Zusatz von 10-100 ng/ml 12-0-tetra-decanoylphorbol-13-acetat oder Mezerein als Stimulator in einem serumhaltigen Kulturmedium, z.B. in RPMI1640 und 10 % fötalem Kalbserum 6-48 Stunden, vorzugsweise 12 bis 24 Stunden inkubiert werden, anschließend die Zellen abgetrennt werden und,nach Zerstörung dieser die mRNA nach an sich bekannten Verfahren isoliert wird.In the production of lymphotoxin mRNA, the method according to the invention is preferably carried out by transforming cells after addition of 10-100 ng / ml of 12-0-tetra-decanoylphorbol-13-acetate or mezerein as a stimulator in a serum-containing culture medium, e.g. are incubated in RPMI1640 and 10% fetal calf serum for 6-48 hours, preferably 12 to 24 hours, then the cells are separated and, after destruction, the mRNA is isolated according to methods known per se.
Bei der Isolierung der so gebildeten Zellkulturprodukte hat sich bei der Reinigung des so erhaltenen Lymphotoxins die Chromatographie über porenkontrolliertes Glas, welche erst-In the isolation of the cell culture products thus formed, in the purification of the lymphotoxin thus obtained, the chromatography on pore-controlled glass, which
mais angewendet wurde, und, nach Zerstörung der Zellmembranen und Entfernen der Zellkerne, die Extraktion der Lymphotoxin-mRNA beispielsweise mit Phenol als besonders geeignet erwiesen. maize was used, and, after destruction of the cell membranes and removal of cell nuclei, the extraction of lymphotoxin mRNA, for example with phenol proved to be particularly suitable.
Die weitere Reinigung des Lymphotoxins erfolgt beispielsweise mittels HPLC.The further purification of the lymphotoxin is carried out, for example, by means of HPLC.
Das so erhaltene Lymphotoxin mit einem Molekulargewicht von 60.000 + 15 % ist, z.B. in wässriger isotonischer Lösung, zur Prophylaxe und zur Bekämpfung von Tumorzellen geeignet.The resulting lymphotoxin having a molecular weight of 60,000 + 15%, e.g. in aqueous isotonic solution, for the prophylaxis and for the control of tumor cells.
Gegenüber dem Stand der Technik weist das erfindungsgemäße Verfahren folgende Vorteile auf:Compared with the prior art, the method according to the invention has the following advantages:
1. Es wird eine homogene Zelipopulation mit unbegrenzter Lebensfähigkeit verwendet, deren Vermehrung in beliebigem Maßstab erweitert werden kann,1. A homogeneous cell population with unlimited viability is used, the multiplication of which can be extended to any scale,
2. die Lymphotoxin-Produktion in diesen Kulturen erfolgt spontan, das heißt es müssen keine hochmolekularen Mitogene zugesetzt werden,2. The production of lymphotoxin in these cultures takes place spontaneously, that is, no high molecular weight mitogens have to be added,
3. die Produktion von Lymphotoxin kann durch niedermolekulare Stimulatoren weiter gesteigert werden,3. the production of lymphotoxin can be further increased by low-molecular stimulators,
4. die Produktion von Lymphotoxin kann in serumfreiem Medium mit hohen Ausbeuten erfolgen; man erhält somit ein hervorragendes Ausgangsmaterial für die weitere proteinchemische Reinigung und4. the production of lymphotoxin can be done in serum-free medium with high yields; This gives an excellent starting material for further protein-chemical purification and
5. die aus den Zellen isolierte RNA zeigt unmittelbar "nachweisbare Lymphötoxin-mRNA-Aktivität und stellt somit ein hervorragendes Ausgangsmäterial für die weitere Anreicherung dieser mRNA. dar, was wiederum eine wesentliche Voraussetzung5. The RNA isolated from the cells immediately shows "detectable lympho-toxin mRNA activity and thus represents an excellent starting material for the further enrichment of this mRNA, which in turn is an essential prerequisite
für die molekulare Klonierung der mRNA darstellt. Die klonierte Affen-Lymphotoxin-mRNA kann wiederum nach bekannten Verfahren als Probe für die Isolierung der homologen humanen Lymphotoxin-mRNA beziehungsweise der entsprechenden Gene verwendet werden.for the molecular cloning of the mRNA. The cloned monkey lymphotoxin mRNA can in turn be used by known methods as a probe for the isolation of the homologous human lymphotoxin mRNA or the corresponding genes.
-7-Ausfühnuigsbeispiel -7- Ausfühnuigsbeispiel
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, ohne diese jedoch zu beschränken:The following examples are intended to illustrate the present invention without, however, limiting it:
Produktion von Ljrmphotoxin durch Herpesvirus-transfonnierte Affen-T-Lymphocyten-Zellinien Production of Ljrmphotoxin by Herpesvirus-Transfected Monkey T Lymphocyte Cell Lines
Die eingesetzten lymphoiden Zellinien wurden in Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 (RPMI 164O) mit Zusatz von 10 % fötalem Kalbserum, Penicillin und Streptomycin in stationärer Kultur bei 37 0C in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid gehalten und dreimal wöchentlich mit frischem Medium verdünnt. In allen Experimenten wurden dichte Kulturen mit frischem Medium 1 : 2 bis 1 : 3 verdünnt, am nächsten Tag nochmals 1 : 3 verdünnt und jeweils 5 ml in einem KuIturflaschchen angesetzt. Die KulturUberstände wurden nach drei Tagen durch Zentrifugieren gewonnen eingefroren und bis zum Test bei -20 0C gelagert·The lymphoid cell lines used were kept in Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 (RPMI 164O) with added 10 % fetal calf serum, penicillin and streptomycin in stationary culture at 37 0 C in an atmosphere of 95 % air and 5% carbon dioxide and three times a week diluted in fresh medium. In all experiments, dense cultures were diluted 1: 2 to 1: 3 with fresh medium, diluted 1: 3 the next day, and 5 ml each were made up in a culture flask. The culture supernatants were harvested by centrifugation after three days frozen and stored until testing at -20 0 C ·
Die nachfolgende Tabelle enthält die in drei verschiedenen Kulturüberständen jeder Zellinie ermittelten Lymphotoxin-Aktivitäten:The following table contains the lymphotoxin activities determined in three different culture supernatants of each cell line:
Referenzen:References:
A = Fleckenstein et al., Int. J. Cancer 19_, 546-554 (1977) B = Abb et al., Cancer Immunol. Immunother. 9_, 219-226 (1980) C = FaIk et al., Bacteriol. Proc. 38_, 191 (1972)A = Fleckenstein et al., Int. J. Cancer 19, 546-554 (1977) B = Abb et al., Cancer Immunol. Immunother. 9, 219-226 (1980) C = Faik et al., Bacteriol. Proc. 38, 191 (1972)
D = Johnson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7j[, 6391-6395 (1981)D = Johnson et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 7j [, 6391-6395 (1981)
E = Kaschka-Dierich et al., J. Virol. 44_, 295-310 (1982)E = Kaschka-Dierich et al., J. Virol. 44, 295-310 (1982)
Übersichtsartikel: Fleckenstein, Biochem. Biophys. Acta 560, 301-342 (1979)Review: Fleckenstein, Biochem. Biophys. Acta 560 , 301-342 (1979)
Zur Produktion größerer Mengen von Zellen wurden an Stelle von stationären Kulturen bewegte Kulturen verwendet. Dazu wurden die Zellen (zum Beispiel der Linie 1670) zum Beispiel in RPMI 1640-Medium mit Zusatz von 10 % fötalem Kalbserum in 1- oder 2-Liter Erlenmeyerkolben auf Rotationsschüttlern gezüchtet (0,5 1 Kultur pro 1 1-Kolben; 1 1 Kultur pro 2 1-Kolben; 40 Umdrehungen pro Minute? 37°C in normaler Atmosphäre) und dreimal wöchentlich mit frischem Kulturmedium im Verhältnis 1:2 bis 1:3 verdünnt. Auf diese Weise ist die Produktion von Kulturüberstand in der Größenordnung von" 10-100 1 wöchentlich ohne weiteres möglich.Moving cultures were used instead of stationary cultures to produce larger numbers of cells. For this purpose, the cells (for example, line 1670) were, for example, in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum in 1- or 2-liter Erlenmeyer flasks on rotary shakers (0.5 1 culture per 1 1 flask, 1 1 Culture per 2 L flask, 40 revolutions per minute (37 ° C in normal atmosphere) and diluted three times a week with fresh culture medium in a ratio of 1: 2 to 1: 3. In this way, the production of culture supernatant in the order of 10-100 1 weekly is readily possible.
Die Produktion von Lymphotoxin in 1670-Zellen war über lange Zeiträume hinweg stabil: nach 9 Monaten in kontinuierlicher Kultur war keine signifikante Abnahme der Lymphotoxin-Aktivität in den Kulturüberständen feststellbar.The production of lymphotoxin in 1670 cells was stable for long periods of time: after 9 months in continuous culture, no significant decrease in lymphotoxin activity was seen in the culture supernatants.
- 10 Charakterisierung des Lymphοtoxins; - 10 characterization of lymphotoxin;
a) Zum biologischen Nachweis von Lymphotoxin-Aktivität wurde folgende Nachweismethode verwendet (modifiziert nach Trivers et al. in J. Immunol. 117, 130-135 und Evans in Cell. Immunol. 63_, 1-15 (1981)):a) The following detection method was used for the biological detection of lymphotoxin activity (modified according to Trivers et al., in J. Immunol., 117 , 130-135 and Evans in Cell, Immunol., 63, 1-15 (1981)):
Transformierte Mauszellen der Zellinie L929 wurden über Nacht mit 1 microCurie 3H-Thymidin/ml Kulturmedium (bevorzugt Eagle's Minimum Essential Medium mit 10% fötalem Kalbserum) kultiviert, dann trypsinisiert und in frischem Kulturmedium mit 5 % fötalem Kalbserum suspendiert. Je 0,5 ml dieser Suspension mit etwa 30.000 Zellen wurden in Kulturschalen (Durchmesser 16 mm) pipettiert und 3-6 Stunden inkubiert. Anschließend wurden serielle Verdünnungen der zu testenden Probe aufgetragen und drei Tage inkubiert (alle Inkubationen bei 37°C). Die Radioaktivität in den Kulturüberständen wurde schließlich im Flüssigszintillationszähler gemessen.Cell line L929 transformed mouse cells were cultured overnight with 1 microCurie 3H-thymidine / ml culture medium (preferably Eagle's minimum essential medium with 10% fetal calf serum), then trypsinized and suspended in fresh culture medium with 5% fetal calf serum. 0.5 ml of this suspension containing about 30,000 cells were pipetted into culture dishes (diameter 16 mm) and incubated for 3-6 hours. Subsequently, serial dilutions of the sample to be tested were applied and incubated for three days (all incubations at 37 ° C). The radioactivity in the culture supernatants was finally measured in the liquid scintillation counter.
Die nachfolgende Abbildung zeigt den Nachweis der Lymphotoxin-Aktivität eines Kulturüberstandes von 1670-Zellen. Jede Verdünnung wurde parallel in 4 Kulturschalen getestet. Nur die Mittelwerte wurden angegeben, die Standardabweichung betrug bei den ersten drei Verdünnungen 3-4 %, bei der höchsten Verdünnung 6 %. Der in diesem Experiment verwendete Kulturüberstand wurde in mehreren hundert Ampullen eingefroren und als Referenzstandard in allen Lymphotoxintests mitgeführt; seine Aktivität wurde willkürlich mit 100 Referenz-Einheiten pro Milliliter (RE/ml) angenommen:The following figure shows the detection of the lymphotoxin activity of a culture supernatant of 1670 cells. Each dilution was tested in parallel in 4 culture dishes. Only the mean values were reported, the standard deviation was 3-4% for the first three dilutions and 6% for the highest dilution. The culture supernatant used in this experiment was frozen in several hundred vials and carried as reference standard in all lymphotoxin assays; its activity was arbitrarily taken at 100 reference units per milliliter (RE / ml):
3000-3000
2000-2000
S 1000-S 1000-
1:2161: 216
1 1=12961 1 = 1296
VERDUENNUNGDILUTION
Kulturüberstand' von 1670-Zellen Kontrollen (Medium)Culture supernatant from 1670 cells controls (medium)
Zum Vergleich wurden Kulturüberstände einer Reihe von menschlichen T-Lymphocyten-Zellinien (MOLT-4, 1301, JURKAT, Karpas-45, CCRP-CEM und CCRF-HSB-2) in dem oben angeführten biologischen Lymphotoxin-Test untersucht. In keinem Fall konnte eine signifikante Steigerung der 3H-Thymidin-Frei-Setzung gegenüber unbehandelten Kontrollen nachgewiesen werden.For comparison, culture supernatants of a series of human T-lymphocyte cell lines (MOLT-4, 1301, JURKAT, Karpas-45, CCRP-CEM and CCRF-HSB-2) were examined in the above-mentioned biological lymphotoxin test. In no case could a significant increase in 3H-thymidine release be demonstrated over untreated controls.
b) Die physikalisch-chemische Charakterisierung der Lymphotoxin-Aktivität in Kulturüberständen der Zellinie 1670 wurde durch folgende Experimente vorgenommen:b) Physico-chemical characterization of lymphotoxin activity in culture supernatants of cell line 1670 was performed by the following experiments:
Stabilität gegenüber thermischer Belastung Stabilität gegenüber saurem pH-Wert Stabilität gegenüber Frieren/Tauen Stabilität gegenüber Natriumdodecylsulfat (SDS) Stabilität gegenüber reduzierenden Agen'tien (2-Mercaptoethanol)Stability to thermal stress Stability to acidic pH Stability to freezing / thawing Stability to sodium dodecyl sulfate (SDS) Stability to reducing agents (2-mercaptoethanol)
Molekulargewichtsbestimmung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)Molecular Weight Determination by High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Stabilitätsprüfungen:The following table shows the results of the stability tests:
Die Aktivität ist sehr stabil gegenüber Mercaptoethanol, gegenüber Erhitzen und mehrere Zyklen von Frieren/Tauen, und wird bei pH 2 innerhalb von 24 Stunden vollkommen zerstört.The activity is very stable to mercaptoethanol over heating and several cycles of freeze / thaw, and is completely destroyed at pH 2 within 24 hours.
Die Experimente zur thermischen und pH-Stabilität sowie gegenüber Frieren/Tauen wurden mit dem Standard-Kulturüberstand von unbehandelten 1670-Zellen in Gegenwart von 10 %Thermal and pH stability and freeze / thaw experiments were performed with the standard culture supernatant from untreated 1670 cells in the presence of 10%.
fötalem Kalbsserum durchgeführt. Die anderen beiden Experimente wurden mit einem über porenkontrolliertes Glas (siehe Beispiel 4) konzentrierten und angereicherten Kulturüberstand von mit Mezerein (20 ng/ml; siehe Beispiel 4) behandelten 1670-Zellen durchgeführt (Proteingehalt 1-2 mg/ml), der nach der Inkubation mit SDS beziehungsweise Mercaptoethanol. mit kompletten Kulturmedium (10 % Kalbsserum) 50fach verdünnt wurde.fetal calf serum. The other two experiments were carried out on a culture supernatant concentrated and enriched with porose-controlled glass (see Example 4) of 1670 cells treated with Mezerein (20 ng / ml, see Example 4) (protein content 1-2 mg / ml) Incubation with SDS or mercaptoethanol. with complete culture medium (10% calf serum) diluted 50-fold.
Das Molekulargewicht des Lymphotoxins aus 1670-Zellen wurde durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie bestimmt (HPLC - siehe nachfolgende Abbildung):The molecular weight of the lymphotoxin from 1670 cells was determined by high pressure liquid chromatography (HPLC - see the following figure):
1 1 1 i I 1 I I Γ 20 30 401 1 1 i I 1 I I Γ 20 30 40
RETENT1ONSZE1T (MINUTEN)RETENT1ONSZE1T (MINUTES)
200 microliter eines über porenkontrolliertes Glas konzentrierten Kulturüberstandes unbehandelter 1670-Zellen wurden mittels HPLC auf einer Anlage der Fa. WATERS aufgetrennt (2 Säulen 1-125? 20 mM Natriumphosphat pH 7, IM NaCl, 0,1 % Tween 20 (Polyoxyethylen-sorbitan-monolaureat,n = 20, M.G.: etwa 1200), 25 % (v/v) Propylenglykol; 0,5 ml pro Minute).200 microliters of a culture supernatant of untreated 1670 cells concentrated over porose-controlled glass were separated by HPLC on a WATERS plant (2 columns 1-125-20 mM sodium phosphate pH 7, 1M NaCl, 0.1% Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan). monolaureate, n = 20, MW: about 1200), 25% (v / v) propylene glycol, 0.5 ml per minute).
0,5 ml - Fraktionen wurden aufgefangen und getestet. Als Eichproteine zur Bestimmung des Molekulargewichts wurden Serumalbumin, Ovalbumin, Trypsinogen und Lysozym im selben System aufgetrennt. Die Analyse zeigte einen einzigen Aktivitätspeak bei einem Molekulargewicht von 60.000 + 15 %,0.5 ml fractions were collected and tested. As calibration proteins for determining the molecular weight, serum albumin, ovalbumin, trypsinogen and lysozyme were separated in the same system. The analysis showed a single activity peak at a molecular weight of 60,000 + 15%,
c) Die wachstumshemmende Wirkung von Kulturüberständen der Zellinie 1670 wurde an einer Reihe von transformierten (Tumor-) Zellinien untersucht. In diesen Versuchen wurden die Tumorzellen (kultiviert in Eagle1 s Minimum Essential Medium mit 10 % fötalem Kalbserum, Penicillin und Streptomycin) in Kulturschalen angesetzt (50.000 Zellen pro Schale mit 3 cm Durchmesser) und einige Stunden später mit Medium oder dem Standard-Kulturüberstand der Zellinie 1670 versetzt (Endkonzentration 16 RE/ml; 3 ml/Schale). Nach 3 oder 4 Tagen Inkubation bei 37°C wurde die Zellzahl pro Schale bestimmt (in allen Experimenten wurden jeweils zwei Schalen parallel mit Lymphotoxin bzw. Medium angesetzt). Bei drei 'Zellinien wurde die Zellzahl täglich bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle bzw. Abbildung dargestellt:c) The growth-inhibiting effect of culture supernatants of cell line 1670 was examined on a series of transformed (tumor) cell lines. In these experiments, the tumor cells (cultured in Eagle 1 s Minimum Essential Medium with 10% fetal calf serum, penicillin and streptomycin) in culture dishes recognized (50,000 cells per dish 3 cm in diameter) and a few hours later with medium or the standard culture supernatant of Cell line 1670 (final concentration 16 RE / ml, 3 ml / dish). After 3 or 4 days of incubation at 37 ° C., the cell number per dish was determined (in each experiment, two dishes were used in parallel with lymphotoxin or medium). For three cell lines the number of cells was determined daily. The results are shown in the following table or figure:
10 "4 * ZELLEN PRO SCHALE10 " 4 * CELLS PER BOWL
o-O-
O-O-
w O-Where-
• Kontrollen O Lymphotoxin• Controls O Lymphotoxin
Diese zeigen, daß Kulturüberstände aus 1670-Zellen die Vermehrung von Tumorzellen verschiedener Spezies hemmen können. Diese Eigenschaft ist charakteristisch für Lymphotoxine (Evans in Cancer Immunol. Immunother. 12^, 181-190 (1983)); sie unterscheidet diese Gruppe von Proteinen insbesondere von den Interferonen, die ebenfalls das Wachstum von Tumorzellen hemmen können, im allgemeinen jedoch spezies-spezifisch sind, wobei insbesondere Humaninterferon auf Mauszellen sehr wenig oder überhaupt nicht aktiv sind.These show that culture supernatants from 1670 cells can inhibit the proliferation of tumor cells of different species. This property is characteristic of lymphotoxins (Evans in Cancer Immunol., Immunother. 12: 181-190 (1983)); it distinguishes this group of proteins, in particular the interferons, which are also capable of inhibiting the growth of tumor cells, but are generally species-specific, with human interferon being very little or not at all active on mouse cells.
Die vorstehend erwähnten transformierten menschlichen T-Lymphocyten-Zellinien sowie die (Tumor-)Zellinien sind literaturbekannt.The above-mentioned transformed human T-lymphocyte cell lines and the (tumor) cell lines are known from the literature.
Die Zellinie 1670 wurde am 28. März 1984 unter der Nummer 1-294 bei der "Collection nationale de cultures de microorganismes (C.N.C.M.), Institut Pasteur, Paris" gemäß Regel 28 des Europäischen Patentübereinkommens hinterlegt.Cell line 1670 was deposited on 28 March 1984 under number 1-294 with the Collection national de cultures de microorganismes (C.N.C.M.) Institut Pasteur, Paris "under Rule 28 of the European Patent Convention.
Beispiel 2 " Example 2 "
Steigerung der Lymphotoxin-Produktion in Affen-T-Lymphocyten-Zellinien durch Diterpen-Verbindungen Increased lymphotoxin production in monkey T lymphocyte cell lines by diterpene compounds
Dichte Kulturen wurden mit frischem Medium 1:2 bis 1:3 verdünnt,, am nächsten Tag nochmals 1:3 verdünnt und jeweils 5 ml derselben Stammkultur in drei Fläschchen aufgeteilt. Die Stimulatoren wurden zugegeben (Stammlösungen 100 microgramm/ml in Dimethylsulfoxid) und die Kulturen wurden drei Tage inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, die überstände eingefroren und bei -200C bis zum Lymphotoxintest aufbewahrt.Densified cultures were diluted 1: 2 to 1: 3 with fresh medium, diluted 1: 3 again the next day, and divided into 5 vials of the same stock culture in 3 vials. The stimulators were added (stock solutions 100 micrograms / ml in dimethylsulfoxide) and the cultures were incubated for three days. Subsequently, the cells were removed by centrifugation, the supernatants frozen and stored at -20 0 C until the lymphotoxin test.
Die folgende Tabelle zeigt die Wirkung von zwei ausgewählten Diterpen-Tumorpromotoren, nämlich 12-0-tetradecanoyl-phorbol'-lS-acetat (TPA) und Mezer ein, auf die Lymphotoxin-Produktion in ausgewählten Affen-T-Lymphocyten-Zellinien:The following table shows the effect of two selected diterpene tumor promoters, 12-0-tetradecanoyl-phorbol-IS-acetate (TPA) and Mezer, on lymphotoxin production in selected monkey T-lymphocyte cell lines:
.' \ : . ' \:
Nach der Proliferation der Zellen in serumhaltigern Medium (analog Beispiel 2) wurden die Zellen in serumfreies Medium übergeführt.After proliferation of the cells in serum-containing medium (analogous to Example 2), the cells were transferred to serum-free medium.
Die nachfolgende Tabelle zeigt einen Vergleich der Lymphotoxin-Produktion in 1670-Zellen analog Beispiel 1 jeweils in serumhältigen und serumfreien Medium in Gegenwart von 20 ng Mezerein/ml:The following table shows a comparison of lymphotoxin production in 1670 cells analogously to Example 1 in each case in serum-containing and serum-free medium in the presence of 20 ng Mezerein / ml:
Die Proteinbestimmung wurde nach der Methode von Bradford (siehe Anal. Biochem. 72, 798 (1976). ^ durchgeführt.Protein determination was performed by the method of Bradford (see Anal.Biochem., 72, 798 (1976).
- 20 Beispiel 4 - 20 Example 4
Konzentration und Reinigung von Lymphotoxin aus 1670-Zellen durch Chromatographie über Säulen aus porenkontrolliertemConcentration and purification of lymphotoxin from 1670 cells by chromatography on columns from pore-controlled
Glas ; Glass ;
1670-Zellen wurden in RPMI-1640 Medium mit 10 % fötalem Kalbserum in rotierenden Erlenmeyerkolben gezüchtet (0.5 1 Kultur in einem 1 1-Kolben, Rotationsgeschwindigkeit 40 , - ·. Umdrehungen pro Minute) . Zellen aus gut wachsenden Kulturen ?' , wurden durch Zentrifugation gewonnen, gewaschen und in serumfreiem RPMI-1640-Medium mit Zusatz von 20 ng/ml Mezerein resuspendiert. Die Suspension wurde in 150 cm -Plastikkulturflaschen (200 ml pro Flasche) drei Tage lang stationär gehalten, anschließend wurde der Kulturüberstand durch Zentrifugation und Filtration gewonnen.1670 cells were grown in RPMI-1640 medium with 10% fetal calf serum in rotating Erlenmeyer flasks (0.5 liter culture in a 1 liter flask, rotation rate 40, - · revolutions per minute). Cells from well-growing cultures ? ' , Were recovered by centrifugation, washed and resuspended in serum-free RPMI-1640 medium supplemented with 20 ng / ml of mezerein. The suspension was kept stationary in 150 cm plastic culture bottles (200 ml per bottle) for three days, then the culture supernatant was recovered by centrifugation and filtration.
Derartig hergestellte Kulturüberstände wurden über 10 ml porenkontrolliertes Glas chromatographiert (Porendurchmesser: 350 Angstroem, Korngröße: 120-200 mesh; Säulendurchmesser: 9 mm, Flußgeschwindigkeit: 140 ml/Stunde). Anschließend wurde die Säule mit 10 mM Natrium-PhosphatpufferThus prepared culture supernatants were chromatographed over 10 ml of pore-controlled glass (pore diameter: 350 angstroms, grain size: 120-200 mesh, column diameter: 9 mm, flow rate: 140 ml / hour). Subsequently, the column was treated with 10 mM sodium phosphate buffer
• .. pH 7.2/1.5 M NaCl gewaschen und schließlich mit dem gleichen• pH 7.2 / 1.5 M NaCl and finally washed with the same
'v' i Puffer in 50 % Ethylenglykol (v/v) eluiert.'v ' i buffer eluted in 50% ethylene glycol (v / v).
Die 'folgende Tabelle gibt die Ergebnisse von zwei derartigen Experimenten wieder:The following table gives the results of two such experiments:
-22-Beispiel 5 -22- Example 5
Nachweis von Lymphotoxin-mRNA-Aktivität in RNA-Präparationen aus 1670- und 1022-Zellen Detection of lymphotoxin mRNA activity in RNA preparations from 1670 and 1022 cells
Die Zellen wurden in 800 ml Zellkulturmedium mit 10 % fötalem Kalbserum bei einer Zelldichte von etwa 5 σ 10^ Zellen/ml suspendiert und mit 20 ng Mezerein/ml versetzt» 20 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in einem geeigneten Puffer (z. B. 10 mM ^ris· HCl pH 7.4, ' 140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2) gewaschen und in 10 ml Lyse-Puffer (zum Beispiel 10 mM Iris.HCl pH 8,4, 140 mM NaCl, 1,5 mM MgCIp, 0,5 % Nonidet-P 40 (nichtionisches Detergens, Warenzeichen) suspendiert· Nach lOminütiger Inkubation im Eisbad wurde die Suspension kurz geschüttelt und die Zellkerne durch Zentrifugation entfernt. Aus dem Überstand der Zentrifugation (= Cytoplasma) wurde durch an sich bekannte "Verfahren, zum Beispiel durch Extraktion mit Phenol (siehe Aviv et al., in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 6£, 1408-1412 (1977)) die RNA isoliert. Sie wurde schließlich in Wasser gelöst (Konzentration etwa 3 bis 5 mg/ml) und mittels an sich bereits bekannter Verfahren in Xenopus laevis - Oocyten translatiert (siehe beispielsweise Colman et al. in Cell .12, 517-526 (1979), Hitchcock et al. in Anal. Biochem. 109, 338-344 (1980) und Oontreras et al, in Anal. Biochem. VQ, 185-187 (1981). Die Translationsprodukte wurden im biologischen Test auf ihre Lymphotoxin-Aktivität überprüft.The cells were suspended in 800 ml of cell culture medium containing 10% fetal calf serum at a cell density of about 5 σ 10 cells / ml and added with 20 ng of Mezerein / ml. Twenty hours later, the cells were harvested by centrifugation, in a suitable buffer (e.g. 10mM HCl · HCl pH 7.4, 140mM NaCl, 1.5mM MgCl 2 ) and dissolved in 10mL of lysis buffer (for example 10mM Iris.HCl pH 8.4, 140mM NaCl, 1mM) , 5 mM MgCIp, 0.5% Nonidet-P suspended 40 (non-ionic detergent, trademarks) · After lOminütiger incubation in an ice bath, the suspension was briefly shaken and the nuclei removed by centrifugation. from the supernatant of the centrifugation (= cytoplasm) was carried on The procedure was known, for example by extraction with phenol (see Aviv et al., in Proc Natl Acad., U.S. 6, 1408-1412 (1977)), which was finally dissolved in water (concentration about 3 to 5 mg / ml) and by methods already known per se in Xenopus laevis - O ocyten translated (see, for example, Colman et al. in Cell .12, 517-526 (1979), Hitchcock et al. in anal. Biochem. 109 , 338-344 (1980) and Oontreras et al, in Anal. Biochem. VQ, 185-187 (1981). The translation products were tested in the biological test for their lymphotoxin activity.
Die folgende Tabelle zeigt die aufgefundene cytotoxische Aktivität in Oocytenüberständen im Vergleich zu RNA-Präparationen aus MOLT-4 Zellen, einer humanen T-Lymphocytenzellinie., deren Kulturüberstände keine nachweisbare Lymphotoxin-Aktivität aufweisen, sowie Überständen von unbehandelten Oocyten:The following table shows the cytotoxic activity found in oocyte supernatants as compared to RNA preparations from MOLT-4 cells, a human T lymphocyte cell line whose culture supernatants have no detectable lymphotoxin activity, and supernatants from untreated oocytes:
Präparatpreparation
Radioaktivität im Überstand (cpm/100 microliter) Verdünnung der Oocyten - Überstände Supernatant radioactivity (cpm / 100 microliter) Oocyte dilution supernatants
1212
4242
147147
514514
Kontrollen (nicht injizierte Oocyten)Controls (uninjected oocytes)
MOLT-4 RNA Expt. 1MOLT-4 RNA Expt. 1
Expt. 2Expt. 2
1670-RNA Expt. 11670 RNA Expt. 1
Expt. 2Expt. 2
Expt. 3Expt. 3
Kontrollencontrols
1670-RNA Expt, 1 1670-RNA ,Expt. 2 4.4001670 RNA Expt, 1 1670 RNA, Expt. 2 4,400
6.100 6.6006,100 6,600
3.3003300
5.000 5.1005,000 5,100
1022-RNA Expt. 1 7.0001022 RNA Expt. 1 7,000
5.0005000
Die Tabelle zeigt, daß alle drei RNA-Präparationen aus 1670-Zellen sowie eine RNA-Präparation aus 1022-Zellen in bis zu 147-facher Verdünnung eine signifikante Steigerung der freigesetzten Radioaktivität bewirkten, während RNA aus MOLT-4-Zellen keine derartige Aktivität aufweist. Diese Experimente zeigen, daß in RNA-Präparationen aus 1670- und 1022-Zellen biologisch aktive Lymphotoxin-mRNA enthalten ist.The table shows that all three RNA preparations from 1670 cells and an RNA preparation from 1022 cells at up to 147-fold dilution caused a significant increase in the released radioactivity, while RNA from MOLT-4 cells has no such activity , These experiments demonstrate that biosynthetic lymphotoxin mRNA is present in RNA preparations from 1670 and 1022 cells.
Claims (13)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19833331108 DE3331108A1 (en) | 1983-08-30 | 1983-08-30 | Process for the preparation of lymphotoxin and of lymphotoxin mRNA |
DE19843417277 DE3417277A1 (en) | 1984-05-10 | 1984-05-10 | Process for the preparation of lymphotoxin and of lymphotoxin mRNA |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DD232509A5 true DD232509A5 (en) | 1986-01-29 |
Family
ID=25813556
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DD84266738A DD232509A5 (en) | 1983-08-30 | 1984-08-29 | METHOD FOR THE PRODUCTION OF LYMPHOTOXINE AND LYMPHOTOXIN-MRNA |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0135797A3 (en) |
KR (1) | KR850001537A (en) |
AU (1) | AU3254884A (en) |
DD (1) | DD232509A5 (en) |
DK (1) | DK411984A (en) |
ES (1) | ES8505407A1 (en) |
FI (1) | FI843384A (en) |
GR (1) | GR80228B (en) |
HU (1) | HU193053B (en) |
IL (1) | IL72797A0 (en) |
NO (1) | NO843431L (en) |
PT (1) | PT79149B (en) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0179127B1 (en) * | 1984-04-13 | 1989-12-13 | Akzo N.V. | Leukoregulin, an antitumor lymphokine, and its therapeutic uses |
IL75318A (en) * | 1984-05-31 | 1994-08-26 | Genentech Inc | Recombinant human lymphotoxin and methods for its recombinant production |
US5683688A (en) * | 1984-05-31 | 1997-11-04 | Genentech, Inc. | Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions |
-
1984
- 1984-08-21 EP EP84109931A patent/EP0135797A3/en not_active Withdrawn
- 1984-08-28 FI FI843384A patent/FI843384A/en not_active Application Discontinuation
- 1984-08-28 GR GR80228A patent/GR80228B/en unknown
- 1984-08-29 HU HU843247A patent/HU193053B/en unknown
- 1984-08-29 DD DD84266738A patent/DD232509A5/en unknown
- 1984-08-29 KR KR1019840005284A patent/KR850001537A/en not_active Application Discontinuation
- 1984-08-29 DK DK411984A patent/DK411984A/en not_active Application Discontinuation
- 1984-08-29 NO NO843431A patent/NO843431L/en unknown
- 1984-08-29 ES ES535484A patent/ES8505407A1/en not_active Expired
- 1984-08-29 IL IL72797A patent/IL72797A0/en unknown
- 1984-08-29 PT PT79149A patent/PT79149B/en unknown
- 1984-08-30 AU AU32548/84A patent/AU3254884A/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GR80228B (en) | 1985-01-02 |
ES535484A0 (en) | 1985-05-16 |
NO843431L (en) | 1985-03-01 |
PT79149B (en) | 1986-11-14 |
EP0135797A2 (en) | 1985-04-03 |
PT79149A (en) | 1984-09-01 |
HU193053B (en) | 1987-08-28 |
FI843384A0 (en) | 1984-08-28 |
KR850001537A (en) | 1985-03-30 |
EP0135797A3 (en) | 1987-11-11 |
AU3254884A (en) | 1985-03-07 |
DK411984D0 (en) | 1984-08-29 |
DK411984A (en) | 1985-03-01 |
FI843384A (en) | 1985-03-01 |
ES8505407A1 (en) | 1985-05-16 |
IL72797A0 (en) | 1984-11-30 |
HUT35278A (en) | 1985-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2819094C2 (en) | ||
DE60115032T2 (en) | USE OF SPERMATOPHYTE PLANT EXTRACTS WITH IMMUNO-MODULATING EFFECT | |
DE3027105A1 (en) | METHOD FOR PRODUCING A FACTOR STIMULATING THE PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF HUMAN GRANULOPOETIC STEM CELLS | |
DE2314076C3 (en) | Process for the production of carcinoembyonic antigen | |
Levin et al. | Partial purification and some properties of an antibacterial compound from Aloe vera | |
DE68910704T2 (en) | Immunomodulating bryostatins. | |
KOBAYASHI et al. | Influence of rat hypothalamic extract on gonadotropic activity of cultivated anterior pituitary cells | |
Albert et al. | Feeding preferences of spruce budworm (Choristoneura fumiferana Clem.) larvae to some host-plant chemicals | |
DD232509A5 (en) | METHOD FOR THE PRODUCTION OF LYMPHOTOXINE AND LYMPHOTOXIN-MRNA | |
DE2016269C3 (en) | Method for extending the viability of lymphocytes separated from the blood | |
Jennings et al. | Preliminary report on permineralized Senftenbergia from the Chester Series of Illinois | |
DE3325131C2 (en) | ||
Trager et al. | The chemical nature of growth factors required by mosquito larvæ: I. Riboflavin and Thiamin | |
DE3331108A1 (en) | Process for the preparation of lymphotoxin and of lymphotoxin mRNA | |
DE3417277A1 (en) | Process for the preparation of lymphotoxin and of lymphotoxin mRNA | |
DE3886511T2 (en) | DETERMINATION OF A LYMPHOCYTE AMPLIFICATION. | |
DE3249215C2 (en) | METHOD FOR PRODUCING HUMAN GAMMA INTERFERON. | |
DE3421731A1 (en) | Human tumour necrosis factor | |
CH646875A5 (en) | METHOD FOR OBTAINING AN INTERFERON AND INTERFERON PRODUCED BY THIS METHOD. | |
DE2016274C3 (en) | Procedure for the separation of leukocytes from whole blood | |
DE68928646T2 (en) | NATURAL HORMON | |
DE2851629A1 (en) | BIOLOGICAL PEPTOLIDE PREPARATION, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND MEDICINAL PRODUCTS CONTAINING THIS PREPARATION | |
Sasner et al. | Studies on aphantoxin from Aphanizomenon flos-aquae in New Hampshire | |
DE4224509C2 (en) | Active ingredient for inhibiting the proliferation rate of liver cells | |
Müller et al. | The “polarizing inducer” in hydra: A reexamination of its properties and its origin |