DD231373A5 - PROCESS FOR PREPARING 15 ALPHA-HYDROXY-4-ANDROSENES-3,17-DION - Google Patents

PROCESS FOR PREPARING 15 ALPHA-HYDROXY-4-ANDROSENES-3,17-DION Download PDF

Info

Publication number
DD231373A5
DD231373A5 DD85272911A DD27291185A DD231373A5 DD 231373 A5 DD231373 A5 DD 231373A5 DD 85272911 A DD85272911 A DD 85272911A DD 27291185 A DD27291185 A DD 27291185A DD 231373 A5 DD231373 A5 DD 231373A5
Authority
DD
German Democratic Republic
Prior art keywords
dione
androstene
hydroxy
fermentation
cbs
Prior art date
Application number
DD85272911A
Other languages
German (de)
Inventor
Karl Petzoldt
Original Assignee
������@������������k��
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ������@������������k�� filed Critical ������@������������k��
Publication of DD231373A5 publication Critical patent/DD231373A5/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J53/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by condensation with a carbocyclic rings or by formation of an additional ring by means of a direct link between two ring carbon atoms, including carboxyclic rings fused to the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton are included in this class
    • C07J53/002—Carbocyclic rings fused
    • C07J53/004—3 membered carbocyclic rings
    • C07J53/008—3 membered carbocyclic rings in position 15/16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
    • C07J1/0003—Androstane derivatives
    • C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/12—Acting on D ring

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

1. Process for the manufacture of 15 alpha-hydroxy-4-androstene-3,17-dione by the microbiological hydroxylation of 4-androstene-13,17-dione characterised in that Penicillium stoloniferum CBS P 102, Penicillium melinii CBS P 30 or Fusarium oxysporum f. vasinfectum ATCC 7808 are used for the fermentation.

Description

Beispiel 2Example 2

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden unter Verwendung des Stammes Penicillium melinii (CBS P 30) 15g 4-Androsten-3,17-dion in 75 Stunden Kontaktzeit zu 11,7g 15a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 191-194°C umgewandelt.Under the conditions of Example 1 using the strain Penicillium melinii (CBS P 30) 15g 4-androstene-3,17-dione in contact time of 75 hours to 11.7 g of 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione from Melting point 191-194 ° C converted.

Beispiel 3Example 3

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden unter Verwendung des Stammes Fusarium oxysporum f. vasinfectum ATCC 22,5g 4-Androsten-3,17-dion in 24 Stunden Kontaktzeit zu-19,36g 15a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 197°C umgewandeltUnder the conditions of Example 1, using the strain Fusarium oxysporum f. vasinfectum ATCC 22.5g of 4-androstene-3,17-dione converted to 19.36g of 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione of melting point 197 ° C in 24 hours of contact time

B. Beispiel zurVerwendung des 15a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dions Example of using the 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione

a) Eine Lösung von 40g 15a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion in 200mi Pyridin wird im Eisbad abgekühlt und dann tropfenweise mit 25,7ml Benzoylchlorid versetzt. Nach 30 Minuten Rühren bei Eisbadkühlung wird mit 3,2 ml Wasser versetzt und weitere 30 Minuten gerührt. Die Reaktionslösung wird dann in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Dabei beginnt das Fällungsprodukt ölig zu werden, es wird daher in Methylenchlorid aufgenommen. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Es werden 53g rohes 15a-Benzoyloxy-4-androsten-3,17-dion als Öl erhalten.a) A solution of 40 g of 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione in 200 ml of pyridine is cooled in an ice bath and then treated dropwise with 25.7 ml of benzoyl chloride. After stirring for 30 minutes with ice-bath cooling, 3.2 ml of water are added and the mixture is stirred for a further 30 minutes. The reaction solution is then stirred into ice-water, and the resulting precipitate is filtered off with suction and washed with water. In this case, the precipitate starts to become oily, it is therefore taken up in methylene chloride. The organic phase is washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated. There are obtained 53 g of crude 15a-benzoyloxy-4-androstene-3,17-dione as an oil.

b) 101,5g Trimethylsulfoxoniumiodid werden in 11 Dimethylsulfoxyd mit 17,88g NaOH 1,5 Stunden bei Raumtemperatur kräftig gerührt, das NaOH ist dann weitgehend in Lösung gegangen. Unter Argon und Wasserkühlung werden dann 53g T5a-Benzoyloxy-4-androsten-3,17-dion in 200ml Dimethylsulfoxyd gelöst, innerhalb 5 Minuten in das Reaktionsgemisch eingetragen, das anschließend 1,5 Stunden nachgerührt wird. Die Reaktionslösung wird dann, unter Zusatz von ca. 2kg NaCI, in die 10fache Menge Eiswasser eingerührt. Der ausgefällte Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 5O0C getrocknet. Man erhält 31 g der rohen Methylen-Verbindung 15ß,16/3-Methylen-4-androsten-3,17-dion. Die gesamte wäßrige Phase wird mit Diethylether extrahiert, die Etherphase wird mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und eingedampft. Es werden nochmals 6g rohe Methylen-Verbindung 15/3,16/3-Methylen-4-androsten-3,17-dion erhalten. Niederschlag und Etherextrakt werden zusammengefaßt und an Kieselgel mit einem Aceton-Hexan-Gradienten (201,0-25% Aceton) chromatographiert. Man eluiert 22,7g 15,8,16/3-Methylen-4-androsten-3,17-dion. Eine aus Diisopropylether umkristallisierte Probe schmilzt bei 185-186,5°C.b) 101.5 g of trimethylsulfoxonium iodide are stirred vigorously in 11 dimethylsulfoxide with 17.88 g of NaOH for 1.5 hours at room temperature, the NaOH is then largely gone into solution. 53 g of T5a-benzoyloxy-4-androstene-3,17-dione are then dissolved in 200 ml of dimethyl sulfoxide under argon and water cooling, added to the reaction mixture over the course of 5 minutes, which is subsequently stirred for 1.5 hours. The reaction solution is then, with the addition of about 2 kg NaCl, stirred into 10 times the amount of ice water. The precipitated precipitate is washed with water and dried in vacuo at 5O 0 C. 31 g of the crude methylene compound 15β, 16/3-methylene-4-androstene-3,17-dione are obtained. The entire aqueous phase is extracted with diethyl ether, the ether phase is washed with saturated NaCl solution, dried over Na 2 SO 4 and evaporated. A further 6 g of crude methylene compound 15 / 3,16 / 3-methylene-4-androstene-3,17-dione are obtained. Precipitate and ether extract are combined and chromatographed on silica gel with an acetone-hexane gradient (201.0-25% acetone). 22.7 g of 15,8,16 / 3-methylene-4-androstene-3,17-dione are eluted. A sample recrystallized from diisopropyl ether melts at 185-186.5 ° C.

c) Eine Lösung von 22,7g 15/3,16/3-Methylen-4-androsten-3,17-dion in 397 ml Methylpyrrolidon wird im Eisbad abgekühlt, unter Argon mit 90,8g Kaliumethylat versetzt und 10 Minuten gerührt. Dann werden innerhalb 5 Minuten 34,1 ml Propargylalkohol zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird weitere 15 Minuten gerührt und in die 10fache Menge Eiswasser eingerührt. Man neutralisiert mit verdünnter Schwefelsäure, entfernt einen eventuellen Überschuß mit NaHCO3 und sättigt mit Natriumchlorid. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 6O0C getrocknet. Man erhält 30,2g, die aus Essigester mit Aktivkohle umkristallisiert werden. Ausbeute 18,6g eines Gemisches aus 17/3-Hydroxy-17a-(3-hydroxy-1-propionyl)-15/3,16/3-rnethylen-4-androsten-3-on und 17/3-Hydroxy-17a-(3-hydroxy-1-propinyl)-15/3,1 eß-methylen-S-androsten-S-on vom Schmelzpunkt 224,60C.c) A solution of 22.7 g of 15 / 3,16 / 3-methylene-4-androstene-3,17-dione in 397 ml of methylpyrrolidone is cooled in an ice bath, combined under argon with 90.8 g of potassium ethylate and stirred for 10 minutes. Then 34.1 ml of propargyl alcohol are added dropwise within 5 minutes. The reaction mixture is stirred for a further 15 minutes and stirred into 10 times the amount of ice water. It is neutralized with dilute sulfuric acid, any excess is removed with NaHCO 3 and saturated with sodium chloride. The precipitate is filtered off, washed with water and dried in vacuo at 6O 0 C. This gives 30.2 g, which are recrystallized from ethyl acetate with activated charcoal. Yield 18.6 g of a mixture of 17/3 hydroxy-17a (3-hydroxy-1-propionyl) -15 / 3,16 / 3-methyl-4-androsten-3-one and 17/3 hydroxy-17a - (3-hydroxy-1-propynyl) -15 / 3.1 eß-methylene-S-androsten-S-on of melting point 224.6 0 C.

Eine Lösung von 18,6g dieses Gemisches in 172ml Tetrahydrofuran und 172ml Methanol wird unter Argon mit 8,6ml 2N Natronlauge versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann in die 10fache Menge Eiswässer, das 10ml 2N Schwefelsäure enthält, eingerührt. Man sättigt mit Kochsalz, saugt den ausgefällten Niederschlag ab und wäscht mit Wasser. Nach dem Trocknen bei 600C im Vakuum werden 18,2g 17/3-Hydroxy-17a-(3-hydroxy-1-propinyl)-15/3,16j8-methylen-4-androsten-3-on erhalten. Schmelzpunkt 222,50C.A solution of 18.6 g of this mixture in 172 ml of tetrahydrofuran and 172 ml of methanol is added under argon with 8.6 ml of 2N sodium hydroxide solution and stirred for 15 minutes at room temperature. The reaction mixture is then stirred into 10 times the amount of ice water containing 10 ml of 2N sulfuric acid. It is saturated with sodium chloride, the precipitate is filtered off with suction and washed with water. After drying at 60 0 C in vacuo 18.2 g 17/3-hydroxy-17a- (3-hydroxy-1-propynyl) -15 / 3,16j8-methylene-4-androsten-3-one are obtained. Melting point 222.5 0 C.

d) 18,2g ^jS-Hydroxy-^a-O-hydroxy-i-propinyO-IS^ie/S-methylen^-androsten-S-on werden in einem Gemisch aus 84ml Tetrahydrofuran und 84ml Methanol nach Zusatz.von 5,6g Tristtriphenyl-phosphin-rhodiumOl-chlorid bei Raumtemperatur und Normaldruck bis zur Sättigung mit Wasserstoff hydriert. Reaktionszeit: 5 Stunden.d) 18.2 g of 1S-hydroxy-1-hydroxy-1-i-propyl O-isl / S-methylene-s-rust-S-on are dissolved in a mixture of 84 ml of tetrahydrofuran and 84 ml of methanol after addition of 5.6 g Tristtriphenyl-phosphine-rhodiumOl-chloride hydrogenated at room temperature and atmospheric pressure to saturation with hydrogen. Reaction time: 5 hours.

Die Substanz geht bei der Hydrierung vollständig in Lösung. Anschließend wird die Hydrierlösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Rohprodukt von 18,0g ^ß-Hydroxy-^a-O-hydroxypropylMS/Sje/S-methylen^-androsten-S-on wird zur nächsten Umsetzung direkt verwendet.The substance is completely dissolved in the hydrogenation. Subsequently, the hydrogenation solution is evaporated to dryness in vacuo. The resulting crude product of 18.0 g of β-hydroxy-α-O-hydroxypropylMS / Sje / S-methylene-androstene-S-on is used directly for the next reaction.

e) Eine Lösung von 18g des ^ß-Hydroxy-^QHS-hydroxypropyll-ISß.ie/S-methylen^-androsten-S-on-Rohprodukt in 238ml Pyridin wird mit einer Lösung von 47,6g CrO3 in 118ml Wasser und 119ml Pyridin versetzt und 6 Stunden bei 70°C gerührt. Die Reaktionsiösung wird anschließend in 4I Essigester eingerührt. Man dekantiert von den ausgeschiedenen Chromsalzen ab und wäscht die Essigesterphase mit Wasser. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird das pyridinhaltige Rohprodukt mit einem Aceton-Hexan-Gradienten (201, 0-40% Aceton) an Kieselgel chromatographiert. Man erhält 11,3g, die nach dem Verreiben mit Diisopropylether 9,72g 15^,16/8-Methylen-3-oxo-17a-pregn-4-en-21,17-carbolacton vom Schmelzpunkt 179-180°C ergeben.e) A solution of 18 g of the ^ ß-hydroxy- ^ QHS-hydroxypropyl-ISß.ie / S-methylene ^ -androsten-S-on crude product in 238ml of pyridine with a solution of 47.6g CrO 3 in 118ml of water and 119 ml of pyridine and stirred at 70 ° C for 6 hours. The reaction solution is subsequently stirred into 4 l of ethyl acetate. It is decanted from the precipitated chromium salts and the ethyl acetate phase is washed with water. After drying and evaporation, the pyridine-containing crude product is chromatographed on silica gel with an acetone-hexane gradient (201, 0-40% acetone). This gives 11.3 g, which give after trituration with diisopropyl ether 9.72 g of 15 ^, 16/8-methylene-3-oxo-17a-pregn-4-ene-21,17-carbolactone of melting point 179-180 ° C.

f) Eine Lösung von 150g ISfrieß-Methylen-S-oxo-^a-pregn^-en^i^-carbolacton in 1,51 Dioxan wird mit 150ml o-Ameisensäuretriethylester und 150 ml Dioxan/conc. Schwefelsäure versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird mit 13,5ml Pyridin versetzt, mit 8,11 Dichlormethan verdünnt, mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Es werden 160g kristallines 3-Ethoxy-15/3,16/3-methylen-17a:- pregna-S.ö-dien^i.n-carbolacton erhalten, welche ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt werden.f) A solution of 150 g of isocyanate-methylene-S-oxo-α-pregn ^ -en ^ i ^ -carbolactone in 1,51 dioxane with 150 ml of triethyl o-formate and 150 ml of dioxane / conc. Sulfuric acid and stirred for 1 hour at room temperature. The reaction solution is treated with 13.5 ml of pyridine, diluted with 8.11 dichloromethane, washed with water, dried over magnesium sulfate and evaporated in vacuo. There are obtained 160 g of crystalline 3-ethoxy-15 / 3,16 / 3-methylene-17a: - pregna-S-diene-i-n-carbolactone, which are used without further purification in the next stage.

g) Eine Suspension von 160g 3-Ethoxy-15)8,16/3-methylen-17o;-pregn-3,5-dien-21,17-carbolacton in 6I Aceton wird bei Raumtemperatur mit 26,5 ml Pyridin, 375 ml Wasser und 117,6g-Natriumacetat versetzt und auf O0C abgekühlt. Dazu gibt man portionsweise 87,1 g N-Bromsuccinimid und rührt 30 Minuten bei 00C nach. Anschließend engt man im Vakuum bei einer Badtemperatur von 2O0C weitgehend ein. Der ausgefallene Feststoff wird mit 500 ml Dichlormethan gelöst, mit 8,81 Ether verdünnt und zweimal mit je 2,21 Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Magnesiumsulfat engt man im Vakuum ein. Man erhält 174g e-Brom-löß.ie^-methylen-S-oxo-^a-pregn^-en^^^-carbolacton als öliges Rohprodukt, das ohne Reinigung weiter umgesetzt wird.g) A suspension of 160 g of 3-ethoxy-15) 8,16 / 3-methylene-17o; -pregn-3,5-diene-21,17-carbolactone in 6 l of acetone at room temperature with 26.5 ml of pyridine, 375 ml of water and 117.6 g sodium acetate and cooled to 0 ° C. To this are added portionwise 87.1 g of N-bromosuccinimide and stirred for 30 minutes at 0 0 C after. Then concentrated in vacuo at a bath temperature of 2O 0 C largely a. The precipitated solid is dissolved with 500 ml of dichloromethane, diluted with 8.81 ether and washed twice with 2.21 of water. After drying over magnesium sulfate, concentrated in vacuo. This gives 174 g of e-bromo-löß.ie ^ -methylen-S-oxo-a-pregn ^ -en ^^^ - carbolactone as an oily crude product, which is further reacted without purification.

Eine Lösung von 201 g e-Brom-iö&ie/S-methylen-S-oxo-na-pregn^-en^i^-carbolacton in 1,9751 Dimethylformamid wird mit 102,3g Lithiumbromid und 86,5g Lithiumcarbonat 1,5 Stunden bei 100°C gerührt. Nach dem Abkühlen fällt man in 181 Eiswasser, saugt den ausgefallenen Niederschlag ab, wäscht mehrmals mit Wasser nach und trocknet den Rückstand über Nacht im Trockenschrank. Das erhaltene Rohprodukt von 180g wird durch eine Drucksäule an feinem Kieselgel mit Dichlormethan/Aceton (100/0-98:2) gereinigt.A solution of 201 g of e-bromo-iso-S-methylene-S-oxo-n-pregn ^ -en-1-carbolactone in 1.9751 dimethylformamide is treated with 102.3 g of lithium bromide and 86.5 g of lithium carbonate for 1.5 hours stirred at 100 ° C. After cooling, it is poured into 18 l of ice water, the precipitate is filtered off with suction, washed several times with water and the residue is dried overnight in a drying oven. The resulting crude product of 180 g is purified by a pressure column on fine silica gel with dichloromethane / acetone (100 / 0-98: 2).

Man erhält 106g IS&ieß-Methylen-S-oxo-^a-pregna^e-dien^i^-carbolacton als Öl, welches nach Umkristallisation aus Aceton-Diisopropylether bei 179,50C schmilzt.This gives 106 g of IS & ieß-methylene-S-oxo-a-pregna ^ e-dien ^ i ^ -carbolactone as an oil, which melts after recrystallization from acetone-diisopropyl ether at 179.5 0 C.

Claims (1)

Patentanspruch:Claim: Verfahren zur Herstellung von 15a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion durch mikrobiologische Hydroxylierung von 4-Androsten-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Fermentation Mikroorganismen der Spezies Penicillium stoloniferum (CBS P 102), Penicillium melinii (CBS P 30) oder Fusarium oxysporum f. vasinfectum (ATCC 7808) verwendet.Process for the preparation of 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione by microbiological hydroxylation of 4-androstene-3,17-dione, characterized in that for the fermentation microorganisms of the species Penicillium stoloniferum (CBS P 102), Penicillium melinii (CBS P 30) or Fusarium oxysporum f. vasinfectum (ATCC 7808). Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention Die Erfindung betrifft ein neues mikrobiologisches Herstellungsverfahren von 15a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion, das als Zwischenprodukt für die Herstellung von Arzneimitteln geeignet ist.The invention relates to a novel microbiological production process of 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione, which is suitable as an intermediate for the preparation of medicaments. Bekannte technische LösungenWell-known technical solutions Es ist seit langem bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen die Fähigkeit besitzen. Steroide in der 15a-Position zu hydroxylieren (US-Patentschrift 2889255). Auch das 4-Androsten-3,17-dion wurde bereits mehrfach in der 15a-Position hydroxyliert. (W.Chamey a. H.L.Herzog: Micobial Transformations of Steroids, Academic Press, New York, 1967, Seite 107,108). Soweit man der Literatur entnehmen kann, wurden dabei die besten Ergebnisse erzielt, wenn man zur Fermentation Mikroorganismen der Species Fusarium lini (CBS) (Helvetica Chimca Acta 46,1963,889 f.) oder Penicillium spec (ATCC 11598) (Endocrinology 83; 1968,349) verwendet. Für eine technische Herstellung von 15a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion sind diese bekannten Verfahren zu aufwendig, da bei ihnen nicht einmal 100 mg 4-Androsten-3,17-dion pro Liter Fermentationskultur und pro Tag Fermentationsdauer umgewandelt werden.It has long been known that many microorganisms have the ability. To hydroxylate steroids at the 15a position (U.S. Patent No. 2,889,255). The 4-androstene-3,17-dione has also been hydroxylated several times in the 15a position. (W.Chamey, H.L.Herzog: Micobial Transformations of Steroids, Academic Press, New York, 1967, page 107.108). As far as can be seen from the literature, the best results were obtained by fermenting microorganisms of the species Fusarium lini (CBS) (Helvetica Chimca Acta 46, 1963, 889 f.) Or Penicillium spec (ATCC 11598) (Endocrinology 83, 1968 , 349). For a technical production of 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione, these known processes are too complicated, since not even 100 mg of 4-androstene-3,17-dione are converted per liter of fermentation culture and per day of fermentation time , Aus der US-Patentschrift 4036695 ist andererseits bekannt, daß man das zum 4-Androsten-3-1,7-dion isomere 18-Methyl-4-estren-3,17-dion in hohen Substratkonzentrationen in der 15a-Position hydroxylieren kann, wenn man zur Fermentation Mikroorganismen der Species Penicillium raistrickii (ATCC 10490) verwendet. Überraschenderweise verläuft die Fermentation von 4-Androsten-3,17-dion mit diesem Mikroorganismus äußerst unbefriedigend.On the other hand, it is known from US Pat. No. 4,036,695 that the 18-methyl-4-estrene-3,17-dione isomer can be hydroxylated to the 4-androstene-3-1,7-dione in high substrate concentrations in the 15a-position, when using for fermentation microorganisms of the species Penicillium raistrickii (ATCC 10490). Surprisingly, the fermentation of 4-androstene-3,17-dione with this microorganism is extremely unsatisfactory. Ziel der ErfindungObject of the invention Es ist Ziel der Erfindung, diese Nachteile weitgehend auszuräumen.
Wesen der ErfindungIt is an object of the invention to largely overcome these disadvantages.
Essence of the invention Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die mikrobiologischen Parameter des Verfahrens zu verändern. Es wurde gefunden, daß man überraschenderweise 4-Androsten-3,17-dion recht gut in der 15 α-Position hydroxylieren kann, wenn man zur Fermentation Mikroorganismen der Spezies Penicillium stoloniferum (CBS P 102), Penicillium melinii (CBS P 30) oder Fusarium oxysporum f. vasinfectum (ATCC 7808) verwendet.The invention has for its object to change the microbiological parameters of the process. Surprisingly, it has surprisingly been possible to hydroxylate 4-androstene-3,17-dione in the 15α-position when fermenting microorganisms of the species Penicillium stoloniferum (CBS P 102), Penicillium melinii (CBS P 30) or Fusarium oxysporum f. vasinfectum (ATCC 7808). Diese Fermentation wird unter den Bedingungen durchgeführt, die man üblicherweise bei der mikrobiologischen Hydroxylierung von Steroiden mit Pilzkulturen anwendet. So werden zunächst in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten Fermentationsbedingungen, wie zum Beispiel Auswahl des günstigsten Nährmediums, des geeigneten Substratlösungs- oder Suspensionsmittels, der Substratkonzentration, der technischen Bedingungen wie Temperatur, Belüftung, pH-Wert und der optimalen Zeiten für Germination, Substratzugabe und Substratkontakt am Enzym des Mikroorganismus analytisch, insbesondere dünnschichtchromatographisch, ermittelt.This fermentation is carried out under the conditions commonly used in the microbiological hydroxylation of steroids with fungal cultures. Thus, first in generally customary preliminary tests, the most favorable fermentation conditions, such as selection of the most favorable nutrient medium, the appropriate Substratlösungs- or suspending agent, the substrate concentration, the technical conditions such as temperature, ventilation, pH and the optimal times for germination, substrate addition and substrate contact on the enzyme of the microorganism analytically, in particular by thin-layer chromatography, determined. Es ist zweckmäßig, das Substrat in einer Konzentration von etwa 1000 bis 5000mg pro Liter Nährmedium einzusetzen. Der pH-Wert wird vorzugsweise auf einen Bereich von 5 bis 7 eingestellt. Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von 20 bis 40°C, vorzugsweise von 25 bis 350C. Zur Belüftung werden vorzugsweise 0,5 bis 5 Liter Luft pro Minute pro Liter Kulturbrühe zugeführt. Die Umwandlung des Substrats wird zweckmäßigerweise durch dünnschichtchromatographische Analyse verfolgt. Die Fermentationszeit beträgt etwa 30 bis 90 Stunden.It is expedient to use the substrate in a concentration of about 1000 to 5000 mg per liter of nutrient medium. The pH is preferably adjusted to a range of 5 to 7. The cultivation temperature is in the range of 20 to 40 ° C, preferably 25 to 35 0 C. For ventilation, preferably 0.5 to 5 liters of air per minute per liter of culture broth supplied. The conversion of the substrate is conveniently followed by thin layer chromatographic analysis. The fermentation time is about 30 to 90 hours. Das erhaltene 15a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion ist ein wertvolles Zwischenprodukt, welches sich beispielsweise zur Herstellung von 15/3,16ß-Methylen-4-androsten-3,17-dion (US-Patentschrift 3470160) oder von 15/3,160-Methylen-3-oxo-17apregna-4,6-dien-21,17-carbolacton (US-Patentschrift 4129564) eignet.The resulting 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione is a valuable intermediate which can be used, for example, to prepare 15 / 3,16β-methylene-4-androstene-3,17-dione (US Pat. No. 3,470,160) or US Pat 15 / 3,160-methylene-3-oxo-17 a-pregna-4,6-diene-21,17-carbolactone (US Patent 4,129,564) is suitable. Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens und zur Verwendung des Verfahrensprodukts.
A. Beispiele zur Erläuterung des erfindungsgemäßen VerfahrensThe following examples serve to illustrate the process of the invention and to use the process product.
A. Examples for explaining the method according to the invention Beispiel 1example 1 Ein 2-l-Erlenmeyerkolben, der 500ml einer 30 Minuten bei 1200C im Autoklaven sterilisierten Nährlösug enthaltend 3,0% Glucose, 1,0% Corn steep liqour 0,2% Natriumnitrat, 0,1 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 0,002% Eisen(ll)-sulfat-Heptahydrat und 0,05% Kaliumchlorid wird mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Penicillium stoloniferum (CBS P102) beimpft und 2V2Tage bei 28°C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt.A 2-liter Erlenmeyer flask, sterilized in an autoclave at 120 500 ml of a 0 C for 30 minutes Nährlösug containing 3.0% glucose, 1.0% corn steep liqour 0.2% sodium nitrate, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.2% Dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002% iron (II) sulfate heptahydrate and 0.05% potassium chloride are inoculated with a slant culture of the strain Penicillium stoloniferum (CBS P102) and on a rotary shaker for 2½ days at 28 ° C shaken. Mit 250 ml dieser Anzuchtkultur wird ein 20-l-Vorfermenter beimpft, der mit 151 eines 60 Min. bei 121 °C und 1,1 bar Überdruck sterilisierten Mediums, enthaltend 1,0% Corn steep liqour, 1,0% Stärkezucker, 1,0% Sojapuder, 0,2% Natriumnitrat, 0,1 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 0,002% Eisen(ll)-sulfat-Heptahydrat und 0,05% Kaliumchlorid gefüllt ist.With 250 ml of this seed culture, a 20-l Vorfermenter is inoculated with 151 of a 60 min. At 121 ° C and 1.1 bar overpressure sterilized medium containing 1.0% corn steep liquor, 1.0% starch sugar, 1 , 0% soybean powder, 0.2% sodium nitrate, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.2% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002% iron (II) sulfate heptahydrate, and 0.05% potassium chloride. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 290C und 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (15 l/Min.) und Rühren (220U/Min.) 24 Stunden germiniert.With the addition of silicone SH as an antifoam is germinated at 29 0 C and 0.7 bar overpressure with aeration (15 l / min.) And stirring (220U / min.) For 24 hours. Danach werden 0,91 dieser Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und damit ein 20-l-Hauptfermenter beimpft, der mit 141 eines wie oben sterilisierten Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie die Vorfermenterkultur beschickt ist. Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden unter Vorfefmenterbedingungen wird eine sterilfiltrierte Lösung von 22,5g 4-Androsten-3,17-dion in 200ml Dimethylformamid hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet. Nach 60 Stunden Kontaktzeit wird die Kulturbrühe dreimal mit je 101 Methylisobutylketon extrahiert, die Extrakte werden vereinigt und zunächst im Umlaufverdampfer konzentriert, anschließend bei 5O0C Badtemperatur im Vakuum am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Den.Rückstand wäscht man zur Entfernung des Antischaummittels mit Hexan kristallisiert schließlich aus Methylisobutylketon. Nach dem Absaugen und Trocknen erhält man 18,4g 15a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 193-1960C.Thereafter, 0.91 of this culture is removed under sterile conditions to inoculate a 20 L main fermenter charged with 141 of a nutrient medium of the same composition as the pre-fermenter culture sterilized as above. After a growth phase of 12 hours under Vorfefmenterbedingungen a sterile-filtered solution of 22.5g 4-androstene-3,17-dione in 200ml dimethylformamide is added and stirred and aerated. After 60 hours of contact time, the culture broth is extracted three times with 101 methyl isobutyl ketone, the extracts are combined and concentrated first in a rotary evaporator, then concentrated at 5O 0 C bath temperature in a rotary evaporator to dryness. Den.Rückstand was washed to remove the antifoam agent with hexane finally crystallized from methyl isobutyl ketone. After filtration with suction and drying, 18.4 g of 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione of melting point 193-196 0 C.
DD85272911A 1984-02-02 1985-01-31 PROCESS FOR PREPARING 15 ALPHA-HYDROXY-4-ANDROSENES-3,17-DION DD231373A5 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19843403862 DE3403862A1 (en) 1984-02-02 1984-02-02 METHOD FOR PRODUCING 15 (ALPHA) -HYDROXY-4-ANDROSTEN-3,17-DIONE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DD231373A5 true DD231373A5 (en) 1985-12-24

Family

ID=6226738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DD85272911A DD231373A5 (en) 1984-02-02 1985-01-31 PROCESS FOR PREPARING 15 ALPHA-HYDROXY-4-ANDROSENES-3,17-DION

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0150782B1 (en)
JP (1) JPS60241897A (en)
AT (1) ATE54329T1 (en)
DD (1) DD231373A5 (en)
DE (2) DE3403862A1 (en)
HU (1) HU192668B (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU227238B1 (en) 2006-09-15 2010-12-28 Richter Gedeon Nyrt Process for obtaining selectively monohydroxylated 3,17-diketo steroid compounds, purification and separation thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2889255A (en) * 1954-08-17 1959-06-02 Upjohn Co 15-hydroxylation of steroids by gibberella and fusarium

Also Published As

Publication number Publication date
DE3403862A1 (en) 1985-08-08
HU192668B (en) 1987-06-29
EP0150782B1 (en) 1990-07-04
JPS60241897A (en) 1985-11-30
ATE54329T1 (en) 1990-07-15
DE3578498D1 (en) 1990-08-09
EP0150782A2 (en) 1985-08-07
EP0150782A3 (en) 1986-07-02
HUT36865A (en) 1985-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3876769T2 (en) MICROBIOLOGICAL PRODUCTION OF 9-ALPHA-HYDROXY-17-KETO-STEROIDS.
EP0018515B1 (en) Process for the preparation of chenodeoxycholic acid and intermediate products
DE3883973T2 (en) 1-2 DEHYDRATION OF STEROID-21 ESTERS WITH A. SIMPLEX.
CH618704A5 (en)
EP0150782B1 (en) Process for the preparation of 15 alpha-hydroxy androst-4-ene-3,17-dione
DE2712861A1 (en) HYDROXYLATED 1 ALPHA, 2 ALPHA-METHYL STEROIDS
EP0139907B1 (en) Process for the preparation of estrane derivatives
EP0027829B1 (en) Process for the preparation of 9-alpha-hydroxy-4-androstene-3,17-dione
DE1904544C3 (en) Process for the microbiological conversion of 3 ß-hydroxy-5,6-epoxy steroids into 6-hydroxy-3-ketoA <· 4 -steroids
DE2746298A1 (en) 4-Androstene-3,17-di:one derivs. - intermediates for steroid(s) prepd. by fermenting a 5-androstene-17-one deriv. with Colletotrichum phomoides
EP0505514B1 (en) PROCESS FOR PRODUCING $g(b)-CARBOLINE DERIVATES
DD264221A5 (en) PROCESS FOR THE PREPARATION OF 6 ALPHA, 9 ALPHA-DIFLUOR-11 BETA, 17 ALPHA-DIHYDROXY-16 ALPHA-METHYL-4-PREGNENE-3,20-DION AND THEIR DERIVATIVES
EP0114984B1 (en) Process for the preparation of 3,11-alpha dihydroxy-1,3,5(10) estratriene derivatives
EP0013405B1 (en) Process for the preparation of 19-hydroxy steroids of the androstane and pregnane series
EP0019162B1 (en) 12-alpha-hydroxy steroids and their preparation
DE2450106C2 (en) Novel 1α-hydroxysteroids, processes for their preparation and pharmaceuticals containing them
DE1593384C3 (en) Biochemical process for the production of aldosterone
DE1904543C3 (en) Process for the microbiological conversion of 3 ß-hydroxy-5,6-epoxy steroids into 6-hydroxy-3-keto-A4 steroids
EP0377009B1 (en) 1$g(b),15$g(a)-DIHYDROXY-1$g(a)-METHYL-5$g(a)-ANDROSTAN-3,17-DIONE, ITS PREPARATION AND USE
AT235476B (en) Process for the preparation of the new 11β, 21-dihydroxy-16α-alkyl-4,17 (20) -pregnadien-3-ones
DE1768203C3 (en) Process for the production of 3 ß, 11 ß-hydroxy-5 a, 6 a-epoxysteroids by microbiological means
DE2921052A1 (en) IN AEROBIC FERMENTATION FOR THE INTRODUCTION OF A 12 BETA HYDROXY GROUPS IN THE AGLY COMPONENT OF 12-DESOXY HEART GLYCOSIDES COMPATIBLE FROM FOREST SOILS AVAILABLE FROM MICROORGANISMS AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF 12 BETAXIDE
DE2539261A1 (en) 1-Alpha, 17-beta-dihydroxy estr-4-ene-3-ones - progestative agents, with low androgenic activity used in menstrual irregularities and menopausal conditions
DE2209746A1 (en) 6 BETA, 11 ALPHA-DIHYDROXY-16 ALPHA, 17 ALPHA-EPOXY-4-PREGNEN-3,20-DIONE
DE2850047A1 (en) METHOD FOR PRODUCING 9 ALPHA -HYDROXY-4-ANDROSTEN-3,17-DION

Legal Events

Date Code Title Description
VZ Disclaimer of patent (art. 11 and 12 extension act)