DD230712A3

DD230712A3 - PROCESS FOR STORING MICROORGANISMS

Info

Publication number: DD230712A3
Application number: DD25900583A
Authority: DD
Inventors: Karin-Dagmar Wendlandt; Ursula Lucas; Edda Bruehl; Alfred N Grigorjan; Natalja V Osokina; Vladimir P Dibcov
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr; Vniiv Biosinteza Belkovych Ves
Priority date: 1983-12-30
Filing date: 1983-12-30
Publication date: 1985-12-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lagerung von Mikroorganismen fuer die Eiweissgewinnung aus C1-Verbindungen, insbesondere von methanoxidierenden Bakterien. Die Erfindung gehoert in das Gebiet der mikrobiologischen Industrie. Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zur Lagerung von Mikroorganismen zu entwickeln, das keine zusaetzlichen Apparate, Bearbeitungsstufen und Chemikalien in grossen Mengen erfordert, wobei die Mikroorganismen waehrend der Lagerung nicht ihre Aktivitaet verlieren duerfen. Es wurde gefunden, dass dies erreicht wird, indem der Biomassesuspension aus dem Fermentor 3 bis 10 Gew.-% Methanol (bezogen auf Biomassetrockensubstanz) zugesetzt werden. Anschliessend wird die so behandelte Biomassesuspension in geschlossenen Behaeltern bei 4 bis 10C gelagert. Die gelagerte Biomassesuspension kann direkt fuer eine erneute Kultivierung als Impfmaterial eingesetzt werden.The invention relates to a method for the storage of microorganisms for the production of protein from C1 compounds, in particular methane-oxidizing bacteria. The invention belongs to the field of the microbiological industry. The invention aims to develop a process for the storage of microorganisms that does not require additional equipment, processing steps and chemicals in large quantities, whereby the microorganisms may not lose their activity during storage. It has been found that this is achieved by adding to the biomass suspension from the fermentor 3 to 10% by weight of methanol (based on biomass dry matter). Subsequently, the thus treated biomass suspension is stored in closed containers at 4 to 10C. The stored biomass suspension can be used directly for a new cultivation as a seed material.

Description

Titeltitle

Verfahren zur Lagerung von MikroorganismenMethod for storage of microorganisms

Field of application of the invention

Die Erfindung gehört in das Gebiet der mikrobiologischen Industrie,.The invention belongs to the field of the microbiological industry.

Speziell angewendet werden kann die Erfindung zur Lagerung von Mikroorganismen für die Eiweißgewinnung aus C.-Verbindungen, insbesondere für methanoxidierende Bakterien.The invention can be used especially for the storage of microorganisms for protein production from C. compounds, in particular for methane-oxidizing bacteria.

Characteristic of the known technical solutions

Verfahren zur Lagerung von Mikroorganismen sind bekannt, insbesondere werden sie durch Kühlung konserviert. Im Urheberschein SU N 505 308 wird aufgezeigt, daß die herkömmlichen Kühlmethoden Nachteile enthalten, da große Kühlkapazitäten erforderlich sind und die mögliche Lagerzeit minimal ist· Deshalb wird vorgeschlagen, daß verschiedene Hefen und Bakterien spec, aus der Kultivierung mit Erdöldestillat aufkonzentriert werden bis 5 bis 20% Trockenmasse und mit einem Gehalt an Kohlenwasserstoffen - 10 %, vorzugsweise 10 bis 50 %, bei 0 bis + 25 ⁰G gelagert werden. Die Kohlenwasserstoffe wirken quasi alsMethods for storage of microorganisms are known, in particular they are preserved by cooling. It is shown in the original SU 505 308 that the conventional cooling methods are disadvantageous in that large cooling capacities are required and the possible storage time is minimal. Therefore, it is suggested that various yeasts and bacteria spec, from cultivation with petroleum distillate, be concentrated to 5 to 20 % Dry matter and with a content of hydrocarbons - 10%, preferably 10 to 50%, be stored at 0 to + 25 ⁰ G. The hydrocarbons act as a kind of

Konservierungsmittel. Mir methanoxidierende Bakterien ist ein Verfahren bekannt, das eine regelmäßige Überimpfung (einmal in zwei Wochen) der Mikroorganismen auf feste und flüssige Nährmedien in einer Methan/Luft-Atmosphäre vor- * -25 sieht (A. N. GRIGORJAN, J. Gen. Microbiol. 6i_ (1970), 203 - 218). Der Nachteil des Verfahrens besteht in derPreservative. Methane oxidizing bacteria are known to have a process of regular inoculation (once every two weeks) of the microorganisms on solid and liquid nutrient media in a methane / air atmosphere (AN GRIGORJAN, J. Gen. Microbiol. 1970), 203 - 218). The disadvantage of the method consists in the

notwendigen häufigen Überimpfung und in der Aufrechterhaltung eines bestimmten Methan/Luft-Gemisches.necessary frequent inoculation and in the maintenance of a certain methane / air mixture.

Methanoxidiereηde Mikroorganismen werden auch aufbewahrt in Porm von Mikroorganismenassoziationen (Methylotrophe und Heterotrophe) auf festen Agarböden (Ju, R. MALASEMO, Y. A. RGMANOVSKAJA, Ju. A-. ÜROCENKO, "Methanoxidierende Mikroorganismen", Verlag Nauka, Moskau 1978). Die Schwierigkeit dieses Verfahrens begründet sich daraus, daß für Jeden methanoxidierenden Bakterienstamm individuell ein heterotropher Begleitstamm ausgewählt werden muß. lach einem anderen Verfahren werden methanoxidierende Bakterien in einem flüssigen Mineralmedium unter einer Methan/Luft-Atmosphäre aufbewahrt unter Druck (Urheberschein SU N 570 640). Nachteilig daran ist, daß spezielle Behälter für einen Druck bis zu 200 atm notwendig sind. In einem weiteren Verfahren müssen die methanoxidierenden Mikroorganismen in Form einer Paste mit einer Feuchtigkeit von 70 bis 80 % im Gemisch mit Silikagel (Gew.-Verhältnis 1 : 1 bis 3:1) aufbewahrt werden (Urheberschein SU N 759 018). Der Nachteil dieser Methode besteht in der Notwendigkeit der Aufkonzentrierung der Biomasse und der Herstellung eines definierten Gemisches mit Silikagel.Methane oxidates of microorganisms are also conserved in the form of microorganism associations (methylotrophs and heterotrophs) on solid agar soils (Ju, R. MALASEMO, YA RGMANOVSKAJA, Ju. A.- ÜROCENKO, "Methane Oxidizing Microorganisms", Nauka Publishers, Moscow 1978). The difficulty of this method is based on the fact that for each methane-oxidizing bacterial strain individually a heterotrophic companion strain must be selected. According to another method, methane-oxidizing bacteria are stored in a liquid mineral medium under a methane / air atmosphere under pressure (copyright SU N 570 640). The disadvantage of this is that special containers for a pressure up to 200 atm are necessary. In another method, the methane oxidizing microorganisms in the form of a paste with a humidity of 70 to 80 % in a mixture with silica gel (weight ratio 1: 1 to 3: 1) must be kept (copyright SU N 759 018). The disadvantage of this method is the necessity of concentrating the biomass and producing a defined mixture with silica gel.

Entsprechend dem Urheberschein SU N 707 325 werden methanoxidierende Mikroorganismen in einer konzentrierten Lösung der Nährsalze gehalten. Diese Methode erfordert einen großen Arbeitsaufwand, da eine konzentrierte Salzlösung, bestehend aus 6 bis 15 Salzen, hergestellt werden muß. Außerdem wurden nach dieser Lagerungsart längere Lagphasen von 24 bis 30 h beim Anwachsen der Kultur beobachtet*According to the copyright SU N 707 325, methane oxidizing microorganisms are kept in a concentrated solution of the nutrient salts. This method requires a great deal of work because a concentrated salt solution consisting of 6 to 15 salts must be prepared. In addition, according to this storage mode, longer storage phases were observed from 24 to 30 h as the culture grew *

Eine weitere Möglichkeit zur Konservierung von methanoxidierenden Mikroorganismen besteht in der Zugabe von 3 bis 5 Gew.-% Ammoniumsulfat zur Biomasse'suspension (Urheberschein SU N 938 616). Dieses Verfahren bedingt.Another possibility for the preservation of methane-oxidizing microorganisms consists in the addition of 3 to 5 wt .-% ammonium sulfate to biomass suspension (copyright SU N 938 616). This procedure requires.

zwar eine Verlängerung der möglichen Lagerungszeit und eine Verkürzung der Lagphase (verglichen mit der o. g. Anwendung von konzentrierte-n Salzlösungen), aber es ist relativ arbeitsaufwendig, da die Mikroorganismen vor der erneuten Kultivierung zentrifugiert bzw. dekantiert und gewaschen werden müssen.Although an extension of the possible storage time and a shortening of the lag phase (compared with the above-mentioned use of concentrated-salt solutions), but it is relatively laborious because the microorganisms must be centrifuged or decanted and washed before re-cultivation.

Object of the invention

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zur Lagerung von Mikroorganismen zu entwickeln, das keine zusätzlichen Apparate, Bearbeitungsstufen und Chemikalien in großen Mengen erfordert, wobei die Mikroorganismen während der Lagerung nicht ihre Aktivität verlieren dürfen·The object of the invention is to develop a process for the storage of microorganisms which does not require any additional equipment, processing steps and chemicals in large quantities, whereby the microorganisms must not lose their activity during storage.

Explanation: the essence of the invention

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Biomassesuspension aus dem Permentor im Originalzustand durch Zusatz minimaler Mengen eines geeigneten Stoffes zu konservieren und dadurch die Aktivität der Mikroorganismen während der Lagerung aufrechtzuerhalten. Ein Maß für die Aktivität ist die Länge der Lagphase beim Anwachsen während der KuI-tivierung nach der Lagerung.The invention is therefore based on the object of preserving the biomass suspension from the per- mentor in the original state by adding minimal amounts of a suitable substance and thereby to maintain the activity of the microorganisms during storage. A measure of the activity is the length of the lag phase on growth during post-storage KuI activation.

' Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Biomasse suspension aus dem Permentor 3 bis 10 Gew.-% Methanol (bezogen auf Biomassetrockensubstanz) zugesetzt werden. Anschließend wird die so behandelte Biomassesuspension in geschlossenen Behältern bei + 4 bis + 10 ⁰C gelagert. Die gelagerte Bakteriensuspension kann direkt für eine erneute Kultivierung als Impfmaterial eingesetzt werden.According to the invention, the object is achieved in that the biomass suspension from the per- mentor 3 to 10 wt .-% methanol (based on biomass dry matter) are added. Subsequently, the thus treated biomass suspension is stored in closed containers at + 4 to + 10 ⁰ C. The stored bacterial suspension can be used directly for a new cultivation as a seed material.

In nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung erläutert.In the following examples, the invention will be explained.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1Exemplary embodiments Example 1

Methanoxidiereηde Bakterien Methylococcus capsulatus wurden im kontinuierlichen Prozeß unter folgenden Bedingungen kultiviert:Methanoxidiereetade bacteria Methylococcus capsulatus were cultivated in a continuous process under the following conditions:

Temperatur: . 42 ⁰C pH-Y/ert: 5,7 'Temperature:. 42 ⁰ C pH-Y / ert: 5,7 '

Begasungsintensität: 75 1/1 · h Begasungsverhältnis: f =.0,84 Nl/h Og/Ul/h CH₄ Durchflußrate: 0,17 h""¹ Gassing: 75 1/1 · h Begasungsverhältnis: f = .0,84 Nl / h Og / Ul / h CH ₄ flow rate: 0.17 h "" ¹

Die Zusammensetzung der Nährlösung war pro Liter aqua destillata (für 1 g Biomasse) folgende:The composition of the nutrient solution was as follows per liter of aqua distillata (for 1 g of biomass):

0,028 ml 35 mg MgSO₇₁ . 7 H₀O 25 mg0.028 ml of 35 mg MgSO.sub ₇₁ . 7 H ₀ O 25 mg

0,785 mg 1,825 mg 1,20 mg0.785 mg 1.825 mg 1.20 mg

0,322 mg CoSO₇₁ . 7 H₀O 0,036 mg0.322 mg CoSO ₇₁ . 7 H ₀ O 0.036 mg

0,109 mg 0,186 mg 0,883 mg0.109 mg 0.186 mg 0.883 mg

0,041 mg H^BO^ 1,286 mg0.041 mg H ^ BO ^ 1.286 mg

0,077 mg0.077 mg

Die pH-Regelung erfolgte mit einer 2 %igen ΝΗ,ΟΗ-Lösung, diese diente gleichzeitig zur Stickstoffversorgung der Organismen.The pH control was carried out with a 2% solution of ΝΗ, dient, this served simultaneously to the nitrogen supply of the organisms.

H₃BO₄ H ₃ BO ₄ (80(80 %i% i gege )) HH KHgPO₄ KHgPO ₄ 2°2 ° MgSO₄ _MgSO4 . 7, 7 Hghg 00 00 CuSO₄ CuSO ₄ . 5, 5 ^H2 ^H 2 00 MnSO₄'MnSO ₄ ' . 4, 4 Hghg 00 PeCl₂ PeCl ₂ . 4, 4 Hghg 00 ZnCIgZnCIg CoSO₄ CoSO ₄ . 7, 7 Hghg 00 NiSO₄ NiSO ₄ . 7, 7 Hghg 00 AIg(SOAIG (SO ₄)₃ ₄ ) ₃ •• 1818 Ca(NO₃ Ca (NO ₃ )g .g. , 4, 4 HH ITa₂MoOITa ₂ MoO 4 *4 * 22 S₂ S ₂ H₃BO₃ H ₃ BO ₃ CrCl₃ CrCl ₃ . 6, 6 Hghg 00

Unter diesen Bedingungen wurde eine Biomassekonzentration von 12 g/l erreicht.Under these conditions, a biomass concentration of 12 g / l was achieved.

Der Fermentorablauf wurde zwecks Wiederanwendung als Impfmaterial mit 5 Gew,-% Methanol versetzt und anschließend im geschlossenen Behälter bei + 4 bis + 10 ⁰C gelagert· Die Lagerungszeit betrug 4,5 Wochen· Bei der nachfolgenden Kultivierung unter den o. g. Bedingungen wurde eine Lagphase von 1 h beobachtet· Bei der Kultivierung desselben Permentorablaufes nach Lagerung bei +4 bis + 10 ⁰C ohne Methanolzusatz betrug die Lagphase 6 h.The fermenter effluent was added for reuse as a seed with 5 wt -% methanol and then stored in a closed container at + 4 to + 10 ⁰ C. · The storage time was 4.5 weeks · In the subsequent cultivation under the above conditions, a lag phase of 1 h observed · When culturing the same Permentorablaufes after storage at +4 to + 10 ⁰ C without addition of methanol, the lag phase was 6 h.

Example 2

Die Kultivierung und Lagerung der methanoxidierenden Bakterien Methylococcus capsulatus erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Lagerungszeit betrug 8 Wochen. Bei der nachfolgenden Kultivierung unter den o· g. Bedingungen wurde eine Lagphase von 2 h beobachtet. Im Unterschied dazu betrug die Länge der Lagphase 9 h, wenn derselbe Permentorablauf ohne Methanolzusatz bei + 4 bis + 10 ⁰C gelagert worden war.The cultivation and storage of the methane oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus was carried out as described in Example 1. The storage time was 8 weeks. In the subsequent cultivation under the o · g. Conditions, a lag phase of 2 h was observed. In contrast, the length of the lag phase was 9 h, when the same Permentorablauf had been stored without methanol addition at + 4 to + 10 ⁰ C.

Claims

invention claim

Process for the storage of microorganisms, in particular methane-oxidizing bacteria, characterized in that the fermenter effluent is stored in the original state with addition of 3 to 10 wt .-% methanol (based on biomass dry matter) at + 4 to + 10 ⁰ G and then directly as a seed material for Cultivation can be used.