DD228565A1

DD228565A1 - PROCESS FOR PREPARING THE RESTRICTASE HIND III

Info

Publication number: DD228565A1
Application number: DD84263500A
Authority: DD
Inventors: Sonja Mebel; Irina Lapaeva; Siglinde Rustenbach; Boris Rebentish; Svetlana Murashko; Elena Vavilova
Original assignee: Staatl Inst F Immunpraeparate
Priority date: 1984-05-29
Filing date: 1984-05-29
Publication date: 1985-10-16
Also published as: DD228565C2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Restriktase H ind III. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung der Restriktase H ind III aus einem Bakterienstamm, der fuer den Menschen nicht pathogen ist, keine besonderen Ansprueche an die Zuechtungsmethode stellt und selektiv nur diesen Typ Restriktase bildet. Erfindungsgemaess wird zur Gewinnung der Restriktase H ind III der Bakterienstamm Bordetella bronchiseptica W 543 ZIMET 11017 in an sich bekannter Weise gezuechtet und abgetoetet und aus der erhaltenen Bakterienmasse in an sich bekannter Weise die Restriktase H ind III gewonnen. Anwendungsgebiete sind die Humanmedizin, Genetik und pharmazeutische Industrie.The invention relates to a process for the preparation of the restrictase H ind III. The aim of the invention is to obtain the restrictase H ind III from a bacterial strain which is not pathogenic to humans, does not make any special demands on the breeding method and selectively forms only this type of restrictase. According to the invention, to obtain the restrictase H ind III, the bacterial strain Bordetella bronchiseptica W 543 ZIMET 11017 is grown and killed in a manner known per se, and the bacterial mass obtained is used to obtain the restrictase H ind III in a manner known per se. Areas of application are human medicine, genetics and the pharmaceutical industry.

Description

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Mebel, Sonja, Prof.Dr«se·; Lapaeva, Irina, Dr.med.Y/iss.; Rebentiä, Boris, Kand.ined.Wiss.; Rustenbach, Siglinde, Dipl.-Biol.; MuraÜiko, Svetlana; Vavilova, ElenaMebel, Sonja, Prof. Dr. Se ·; Lapaeva, Irina, Dr.med.Y / iss .; Rebentiä, Boris, Kand.ined.Wiss .; Rustenbach, Siglinde, Dipl.-Biol .; MuraUiko, Svetlana; Vavilova, Elena

Verfahren zur Herstellung der Restriktase H ind IIIProcess for the preparation of the restrictase H ind III

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung der Restriktase H ind III.The invention relates to a method for obtaining the restrictase H ind III.

Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Mikrobiologie und genetic engineering.Areas of application of the invention are microbiology and genetic engineering.

Characteristic of the known technical solutions

Mikroorganismen, die die Restriktase (Endonuclease) H ind III produzieren, sind Haemophilus influenzae und Bordetella pertussis. Die wesentlichen Schwierigkeiten bei der Arbeit mit diesen Stämmen bestehen darin, daß sie pathogen für den Menschen sind, besondere Forderungen an den Nährboden stellen, relativ geringe Menge Bakterien pro Nährbodeneinheit bilden, in einem Stamm mehrere Endonucleasen vereinigen, wodurch die Isolierung und Gewinnung reiner Permente außerordentlich schwierig ist.Microorganisms that produce the endonuclease H ind III are Haemophilus influenzae and Bordetella pertussis. The major difficulties in working with these strains are that they are pathogenic to humans, make special demands on the nutrient medium, form relatively small amounts of bacteria per nutrient unit, combine several endonucleases in one strain, thereby greatly improving the isolation and recovery of pure pergolas difficult.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist die Gewinnung der Restriktase H ind III aus einem Bakterienstamm, der selektiv nur diesen Typ Restriktase produziert, nicht pathogen für die Menschen ist und keine besonderen Ansprüche an die Züchtungsnährböden stellt.The aim of the invention is to obtain the restrictase H ind III from a bacterial strain which selectively produces only this type of restrictase, is not pathogenic for humans and does not place any special demands on the culture media.

Explanation of the essence of the invention

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung der Restriktase H ind III ist dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm Bordetella bronchiseptica W 543 (ZIMET 4404J ) in an sich bekannter Weise gezüchtet und abgetötet wird, die Restriktase H ind III aus der Bakterienmasse nach an sich bekannter Methode gewonnen wird_e The inventive method for obtaining the Restriktase H ind III is characterized in that the bacterial strain Bordetella bronchiseptica W 543 (ZIMET 4404J ) is grown and killed in a conventional manner, the Restraktase H ind III is obtained from the bacterial mass according to a known method _e

Die Anwendung des erfindungsgemäßen Stammes ZIMET Ί4ό1ψ gestattet, große Bakterienmengen für die Gewinnung der reinen Restriktase H ind III bereitzustellen· Der Stamm ZIMET MOlf wächst auf kostenarmen Uährmedien unter leicht zu handhabenden Züchtungsbedingungen und hat eine kurze Yermehrungszeit· Da der Stamm ZIMET 4404+ nur die Restriktase H ind III bildet, sind aufwendige Reinigungsverfahren nicht notwendig. Damit wird ein erheblicher Vorteil gegenüber den bisher verwendeten Bakterienstämmen, z.B. Haemophilus influenzae erreicht.The use of the strain ZIMET Ί4ό1ψ according to the invention allows to provide large amounts of bacteria for the recovery of pure restrictase H ind III · The strain ZIMET MOlf grows on low-cost Uährmedien under easy-to-handle breeding conditions and has a short YMehrehrungszeit · Since the strain ZIMET 4404+ only the Restrictase H ind III forms, complex purification processes are not necessary. This is a significant advantage over the previously used bacterial strains, such as Haemophilus influenzae achieved.

embodiment

1. Charakterisierung des Stammes1. Characterization of the strain

Der Stamm Bordetella bronchiseptica ZIMET ήΊΟ^Ψ ist dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien morphologisch kleine gramnegative kokkoide Stäbchen von 0,3 bis 0,5 σ 0,8 bis 2,0 /um sind, die elektronenmikroskopisch peritriche Geißeln aufweisen» Auf Bordet-Gengou-Agar bildet der Stamm grau-weißliche glatte konvexe Kolonien mit glattem Rand, die nach 24 h 0,8 bis 1,0 mm Durchmesser erreichen. Auf Kohle-Kasein-Agar bildet der Stamm grau-gelbliche Kolonien mit glatten Rändern, die sich leicht abheben und verreiben lassen und nach 24 h 0,8 bis 1,0 mm Durchmesser besitzen. Der Stamm bildet kein Pigment. Auf Pepton-Agar "Difco" werden Kolonien gelblicher Farbe, die nach 24 h einen Durchmesser von 1,5 bis 2,0 mm erreichen, sich leicht abheben und verreiben lassen, gebildet. In flüssigem Hährboden nach Cohen-Wheeler wächst der Stamm ohne Pigmentbildung unter aeroben Bedingungen durch Bewegung im Schüttelapparat öder durch Belüftung im Fermentor. Die Bakteriensuspension ist grau-weißlicher Farbe. Die optimale Wachstumstemperatur beträgt 33 bis 36 ⁰C. AlsThe strain Bordetella bronchiseptica ZIMET ήΊΟ ^ Ψ is characterized in that the bacteria are morphologically small gram-negative cocoa rods of 0.3 to 0.5 σ 0.8 to 2.0 / um, which have electronic microscopic peritrich flagella »Auf Bordet-Gengou Agar makes the trunk grayish-white smooth convex colonies with a smooth margin reaching 0.8 to 1.0 mm diameter after 24 hours. On charcoal casein agar, the stem forms grayish-yellowish, smooth-edged colonies that are easy to lift off and rub, and have 0.8 to 1.0 mm diameter after 24 hours. The stem does not form a pigment. On peptone agar "Difco" colonies of yellowish color, which reach a diameter of 1.5 to 2.0 mm after 24 h, can be easily lifted off and rubbed. In Cohen-Wheeler liquid agar, the strain grows without pigmentation under aerobic conditions by agitation in the shaker or by aeration in the fermentor. The bacterial suspension is greyish-white in color. The optimal growth temperature is 33 to 36 ^° C. As

Stickstoff-, Kohlehydrat- und Energiequelle werden Aminosäuren verstoffwechselt.Nitrogen, carbohydrate and energy source are metabolized amino acids.

Der Stamm fermentiert Zitrate, reduziert Uitrat zu Nitrit, enthält Urease und Katalase. Der Stamm enthält das für Bordetella bronchiseptica spezifische Agglutinogen 12. Der Stamm wird in lyophilisierter Form aufbewahrt.The strain ferments citrates, reduces uric acid to nitrite, contains urease and catalase. The strain contains the Bordetella bronchiseptica specific agglutinogen 12. The strain is stored in lyophilised form.

Herstellung von H ind IIIPreparation of H ind III

Die feuchte Bakterienmasse wird suspendiert in einer Lösung, die 10 mM K-Phosphat mit dem pH 7, 0,1 mM EDTA und 7 mM 2-Mercaptoethanol enthält. Dazu wird Lysozym 100 / ug/ml, Phenylmethylsulfonylfluorid 2,5./Ug/ml und 1 mM. Ua-Azid gegeben· Das Gemisch wird durch Ultraschall zerkleinert. Die Zellbruchstücke werden bei 100000 U/min 60 min bei +2 ⁰C abzentrifugiert. Der Überstand wird bis zti 0,1 m HaCl-Lösung gebracht und auf eine Säule mit Phosphozellulose (P Il-Whatman) gegeben. Die Säule wird vorher mit einem 2- bis 3-fachen Säulenvolumen des oben genannten Puffers, dem eine 0,1 m UaCl-Lösung zugesetzt wurde, gewaschen« Die Eluierung erfolgt im linearen Gradienten 0,1 bis 1,0 m NaCl-Lösung in oben genanntem Puffer und wird in Fraktionen gesammelt. Gleiche Mengen a 3 nil jeder Fraktion werden 1 h. bei 37 ⁰C mit 1 /Ug der DNS vom Phagen Lambda im Puffer, der 50 mM Iris HCl - pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 20 mM UaCl enthält, inkubiert und anschließend im Agarose-Gel elektrophoretisch analysiert. Das Ferment läßt sich zwischen 0,2 und 0,3 m NaCl-Lösung eluieren. Fraktionen mit spezifischer Aktivität werden vereinigt, gegen oben genannten Puffer dialysiert und über eine Säule mit Mono-Q des Geräts FPLC (Pharmacia) gegeben. Die Substanz mit spezifischer Aktivität, die frei von unspezifischen Nukleasen ist, läuft durch die Säule durch und wird durch Dialyse gegen oben genannten Puffer, dem 50 % Glycerin und 50 mM NaCl zugesetzt sind, konzentriert. Das erhaltene konzentrierte Ferment, das als B öl bezeichnet wird, hat eine spezifische Aktivität von 1000 E/ml« 1 Einheit entspricht der Aktivität der minimalen Menge des Ferments, die benötigt wird, um 1 /Ug Phagen-DUS innerhalbThe wet bacterial mass is suspended in a solution containing 10 mM K-phosphate with pH 7, 0.1 mM EDTA and 7 mM 2-mercaptoethanol. For this, lysozyme is 100 μg / ml, phenylmethylsulfonyl fluoride 2.5 μg / μg / ml and 1 mM. Ua-azide added · The mixture is crushed by ultrasound. The cell debris are centrifuged at 100,000 rpm for 60 min at +2 ⁰ C. The supernatant is brought to about 0.1 M HaCl solution and placed on a column of phosphocellulose (P II-Whatman). The column is previously washed with a 2 to 3 times column volume of the above buffer to which a 0.1 M UaCl solution has been added. The elution is carried out in a linear gradient of 0.1 to 1.0 M NaCl solution in above buffer and is collected in fractions. Equal amounts of a 3 nil of each fraction are added 1 h. at 37 ^° C. with 1 μg of phage lambda DNA in the buffer containing 50 mM Iris HCl-pH 8.0, 10 mM MgCl ₂ , 20 mM UaCl, and then analyzed electrophoretically in an agarose gel. The ferment can be eluted between 0.2 and 0.3 M NaCl solution. Fractions of specific activity are pooled, dialyzed against the above buffer, and passed through a Mono-Q column of FPLC (Pharmacia). The substance having specific activity free of nonspecific nucleases passes through the column and is concentrated by dialysis against the above buffer containing 50 % glycerol and 50 mM NaCl. The resulting concentrated ferment, referred to as oil, has a specific activity of 1000 U / ml. 1 unit corresponds to the activity of the minimum amount of enzyme needed to produce 1 / ug phage DUS within

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1 h bei 37 C vollständig zu spalten. Aus 1 g Bakterienfeuchtmasse werden 7000 Einheiten gewonnen.1 h at 37 C to split completely. From 1 g of bacterial wet mass 7000 units are obtained.

Bestimmung des gewonnenen Ferments als Restriktase H ind III.Determination of the recovered enzyme as a restrictase H ind III.

Zur Bestimmung der durch das Ferment B öl erkennbaren Reihenfolge der nucleotide auf dem ^Hsiteⁿ wurde die Hydrolyse verschiedener DNS durchgeführt. Es wurden die DHS der Phagen Lambda und <j)X 174 El, des Virus SY 40 und des Plasmids pBR 322 untersucht. Die Elektrophorese der hydrolysierten DUS zeigte, daß das Ferment B öl an dem Punkt AACCTT wirkt und somit die spezifische Wirkung der Restriktase H ind III aufweist (Fuchs, C, E,C. Rosenvold, A, Honigmann, W. Szybalski: Gene 10 (1980) 357-370).To determine the oil recognizable by the enzyme B sequence of the nucleotide at the ^H site ^{n is} the hydrolysis of various DNA was performed. The DHS of the phages lambda and <j) X 174 El, the virus SY 40 and the plasmid pBR 322 were investigated. The electrophoresis of the hydrolyzed DUS showed that the B fermentation oil acts at the point AACCTT and thus has the specific effect of the H ind III restriction enzyme (Fuchs, C, E, C. Rosenvold, A, Honigmann, W. Szybalski: Gene 10 (FIG. 1980) 357-370).

Claims

invention claim

Process for the preparation of the restrictase H ind III from a bacterial strain, characterized in that the strain Bordetella bronchiseptica ZIMET Ή04 ^ * is cultivated and killed in a manner known per se.