DD217239A1 - BIOCHEMICAL PROCESS FOR ENRICHING SECRET PROTEIN-MRNS - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein biochemisches Verfahren zur selektiven Anreicherung des fuer Sekretprotein kodierenden Anteils der mRNS beliebiger Gewebe und Zellkulturen. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, die bekannten Methoden zur Anreicherung spezieller mRNS-Spezies zu ergaenzen und zu erweitern. Erfindungsgemaess werden Signal-Erkennungs-Protein-Praeparate (SRP-Partikel) in immobilisierter Form (traegergebunden) einem in-vitro-Translationssystem zugesetzt. Nach erfolgter Translation, die mit der Bindung derjenigen Ribosomen an die traegergebundenen SRP-Partikel einhergeht, die Sekretprotein-mRNS translatieren, werden die immobilisierten SRP-Partikel samt der an sie gebundenen Ribosomen aus dem Translationssystem abgeschieden, und die angereicherte Sekretprotein-mRNS wird aus dem Komplex SRP-Partikel - Ribosom - Sekretprotein-mRNS isoliert.The invention relates to a biochemical method for selective enrichment of the coding for secretion protein portion of the mRNA of any tissue and cell cultures. It is based on the task of supplementing and expanding the known methods for enriching special mRNA species. According to the invention, signal recognition protein preparations (SRP particles) in immobilized form (carrier-bound) are added to an in vitro translation system. After translation, which accompanies the binding of those ribosomes to the carrier-bound SRP particles that translate secretion protein mRNA, the immobilized SRP particles, together with the ribosomes bound to them, are precipitated from the translation system and the enriched secretion protein mRNA is removed from the Complex SRP particle - ribosome - secretion protein mRNA isolated.
Description
-i--i-
St. HeymannSt. Heymann
"Biochemisches Verfahren zur Anreicherung von SekretproteinmRNS" f "Biochemical method for the enrichment of secretion protein mRNA" f
Die Erfindung betrifft ein biochemisches Verfahren zur selektiven Anreicherung des für Sekretprotein kodierenden Anteils der mRNS beliebiger Gewebe und Zellkulturen· Die mRNS der Sekretproteine zeichnet sich durch eine Nukleotidsequenz aus, die für ein Slgnalpeptid kodiert· Das Signalpeptid adressiert das neuzusynthetisierende Genprodukt an seinen Bestimmungsort· Für die Erkennung des Signalpeptids existiert in der Zelle ein Gebilde aus einem RNS-Molekül und sechs Polypeptidketten (das sog· Signal-Erkennungs-Protein« engl« signal recognition protein« im folgenden als SRP-Partikel bezeichnet). Es lagert sich an den Komplex Ribosoro-mRNS-naszierende Polypeptidkette an, sobald ein Signalpeptid vorhanden ist und arretiert die Translation solange« bis durch Bindung an die Membran des rauhen endoplasmatischen Retikulums die Adressierung des Translationsprodukts eingeleitetThe mRNA of the secretory proteins is characterized by a nucleotide sequence which codes for a peptide. The signal peptide addresses the gene product to be reconstituted to its destination for the secretion protein - coding portion of the mRNA of arbitrary tissue and cell cultures Detection of the signal peptide in the cell consists of an entity of one RNA molecule and six polypeptide chains (the so-called signal recognition protein, hereinafter referred to as SRP particles). It attaches to the complex Ribosoro mRNA-nascent polypeptide chain as soon as a signal peptide is present and arrests translation until it initiates the translation of the translation product by binding to the membrane of the rough endoplasmic reticulum
Anwendungsgebiet ist die molekular- und mikrobiologische« genetische und medizinische Forschung« die sich moderner Methoden der Gentechnik bedient«Field of application is the molecular and microbiological «genetic and medical research», which uses modern methods of genetic engineering «
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Die mRNS-Population repräsentiert die funktionsbedingt exprimierten Gene eines Gewebes oder Zelltyps· Sie setzt sich gewöhnlich aus einer Vielzahl von mRNS-Spezies mit unterschiedlicher Anzahl identischer Kopien zusammen· ; Characteristics of the Known Technical Solutions The mRNA population represents the functionally expressed genes of a tissue or cell type. It is usually composed of a plurality of mRNA species with different numbers of identical copies .
Hör die Lösung vieler Fragestellungen« z« B» der Klonierung von Genen mit geringer Anzahl von inRNS-Kopien, ist es erforderlich» bestimmte snRNS<=Spezi©s aus der· G©samt~mRNS~Population anzureichern«,-Der experimentelle Aufwand bei der Anreicherung ist um so erheblicher* je geringer der prozentuale Anteil der gewünschten raRNS-Spezies an der Gesamtpopulation ist« . ' ' _ ' : : ." If the solution to many questions "cl" gene cloning with low number of inRNA copies, it is necessary "certain snRNAs" = Spezi © sthe·Enrichment of the whole population with the ~ enrichment of the mRNA «, - the experimental effort in the enrichment is all the more significant * the lower the percentage of the desired raRNS species in the total population is«.'' _ ' :: . "
Die bekannten Methoden zur Anreicherung bestimmter mRNS« Spezies setzen detaillierte Kenntnisse über das Gen und/oder anwendungsbereite Nachweissysteme für das Genprodukt voraus.The known methods for enriching certain mRNA species require detailed knowledge of the gene and / or ready-to-use detection systems for the gene product.
- Die Fraktionierung eines Gesamt-raRNS-Präparats nach der physikalischen Länge (durch Zentrifugetion (ζβ B. Speer« A», Thiele, B», Liefescher, D.-H, and Coutelle, Ch« (1981) Acta Biol« Med, Germ« 40« 1095) oder Elektrophorese (z· B. Lehrach, H· Di, Diamond, D β H·« Wozney, 0» fV«and Boedtker (1977) Biochemistry ,16, 4743)) d@r enthaltenen mRNS-Spezies wird meist in Kombination mit Translationstests und anschließendem immunologischem oder funktionellem Nachweis des Genprodukts ausgeführt· Diese Methode gestattet es nicht, zwischen laRNS-Spezies gleicher Länge zu diskriminieren, ' ' ^ . ' ' ' -- The fractionation of a total raRNS preparation according to the physical length (by centrifuge aspiration (ζ β B. spear "A", Thiele, B ', delivery Escher, D.-H, and Coutelle, C. "(1981) Acta Biol" Med , Germ "40" in 1095) or electrophoresis (for example · Lehrach, H · Tue, Diamond, D β H · "Wozney 0" fV "and Boedtker (1977) Biochemistry, 16, 4743)) d @ r contained mRNA species is usually carried out in combination with translation assays and subsequent immunological or functional detection of the gene · This method does not allow to discriminate between laRNS same species length '' ^. '' '-
- Andere Verfahren benutzen zur selektiven Erkennung gewünschter mRNS-Spezies sequenzhomologe (komplementäre) Hybridisationssonden, d. h» Genfragmente oder synthetische Oligonukleotide, zu deren Konstruktion Kenntnisse über die NukleotidseqUenz des Gens erforderlich sind (z· B„ Chan, S, 3», Noyes, K« L·, Agarwal, K. C, and Steiner, D. F. (1979) Proc· Natl. Acad, Sei· U«S»A* 76, 5036 und Noyes, B* .E·.., Hevarech, M.s Stein, Re and Agarwal',. K· C· (^1979) Proc Natl. Acad9 Sei. U,SeA. 76, 1770).Other methods use sequence homologous (complementary) hybridization probes for selective recognition of desired mRNA species; h "gene fragments or synthetic oligonucleotides whose construction requires knowledge of the nucleotide sequence of the gene (eg" Chan, S, 3 ", Noyes, K" L *, Agarwal, K. C, and Steiner, DF (1979) Proc · Natl. Acad, Sei · U «S» A * 76, 5036 and Noyes, B * .E · .., Hevarech, M. s Stein, R e and Agarwal ', K · C · (1979) Proc Natl. Acad 9 See, U, S e A. 76, 1770).
« Praktiziert wird die selektive Imraunopräzipitation von Po-"1-ysomen, die naszierende Polypeptidketfcerc des betreffenden Genprodukts tragen (z0 Be Shapiro, S* Ζ« and Young, D, R9 "Selective imraunoprecipitation of P" 1-ysomes carrying nascent polypeptide ketofacres of the gene product in question is practiced. (Z 0 B e Shapiro, S * Ζ "and Young, D, R 9)
(1981) O. ßiol. Chem. 256, 1495)· Dieses Verfahren setzt die Verfügbarkeit reinen Genprodukts zur Antikörpergewinnung voraus.(1981) O. Biol. Chem. 256 , 1495). This method requires the availability of pure gene product for antibody recovery.
- Zur selektiven Anreicherung spezieller mRNS-Typeri, die von stimulierbaren (induzierbaren) Zelltypen zusätzlich zu dem Satz mRNS synthetisiert werden, der auch im unstimulrerten (nicht-induzierten) Zustand der Zellen vorhanden ist , wird das Verfahren der differentiellen Hybridisation beider mRNS-Sätze mit Hilfe der jeweiligen cDNS angewandt (z. B. Taniguchi, T., Fujii-Kuryama, Y. and Muramatsu, M*. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei· U.S*A* 77, 4003, s. auch OS 3043981).For the selective enrichment of specific mRNA typeri synthesized by stimulable (inducible) cell types in addition to the set of mRNA which is also present in the unstimulated (uninduced) state of the cells, the method of differential hybridization of both sets of mRNAs is included Assistance of the respective cDNA (eg Taniguchi, T., Fujii-Kuryama, Y. and Muramatsu, M *. (1980) Proc Natl Acad., See also US Pat. A * 77, 4003, see also OS 3043981).
Die Erfindung hat das Ziel, die gentechnische Bearbeitung solcher Objekte, deren Sekretproteine von besonderem Interesse sind, bei denen jedoch die Sekretprotein-mRNS nur einen geringen Anteil an der Gesamt-mRNS (< 1 %) darstellt, zu vereinfachen. . ·s ' :'; The object of the invention is to facilitate the engineering of such objects whose secretory proteins are of particular interest, but in which the secretory protein mRNA is only a small fraction of the total mRNA (<1 %) . , · S ':';
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die bekannten Methoden zur Anreicherung spezieller m-RNS-Speziee zu ergänzen und zu erweitern.The invention has for its object to supplement and extend the known methods for enriching special m-RNA species.
Erfindungsgemäß wird in einem in-vitro-Translationssystera isolierte Gesamt-mRNS beliebiger Gewebe und Zellkulturen an freien Ribosomen zur Initiation gebracht· Es werden dem Translationssystem an einem Träger immobilisierte SRP-Partike I zugesetzt, wodurch es während des Translationsprozesses zur selektiven Bindung derjenigen Ribosomen an die immobilisierten SRP-Partiköl kommt, die Sekretprotein-mRNS -Moleküle translatieren. Dann wird der Komplex immobilisierte SRP-Partikel - Ribosora - Sekretprotein-mRNS aus dem Translationssystem abgeschieden und daraus nach üblichen Verfahren die mRNS isoliert.According to the invention, in an in vitro Translationssystera isolated total mRNA of any tissue and cell cultures is brought to free ribosomes for initiation Initially, the translation system to a carrier immobilized SRP particles I are added, whereby it during the translation process for the selective binding of those ribosomes to the immobilized SRP particulate oil comes, which translate secretion protein mRNA molecules. Then, the complex immobilized SRP particle - ribosome - secretion protein mRNA is separated from the translation system and isolated therefrom by conventional methods, the mRNA.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich,. Sekret-With the method according to the invention it is possible. Secretion-
protein~BjRNS -. Spezies aus Gesamt-sRNS beliebiger Gewebe und Zellkulturen anzureicherna wodurch u« a« der Aufwand für die Selektion von Sekretproteingen-Klonen« di© mittels mRNS ab~ hängiger cDNS»Kloni©rung gewonnen werden^ gesenkt wird. Das ist insbesondere für solche Sekretprotein—bjRNS ·» Spezies von Bedeutung, die nur einen geringen Anteil der Gesamt-raRNS der betreffenden biologischen Quells ausmachenβ protein ~ BjRNS -. To enrich species from whole sRNAs of arbitrary tissues and cell cultures , thus reducing the effort for the selection of secretion protein clones, which are obtained by mRNA-dependent cDNA cloning. This is especially β secretion of such protein bjRNS · »species of importance, which represent only a small proportion of the total raRNS the biological relevant wellspring
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25378083A DD217239A1 (en) | 1983-08-08 | 1983-08-08 | BIOCHEMICAL PROCESS FOR ENRICHING SECRET PROTEIN-MRNS |
Applications Claiming Priority (1)
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| DD25378083A DD217239A1 (en) | 1983-08-08 | 1983-08-08 | BIOCHEMICAL PROCESS FOR ENRICHING SECRET PROTEIN-MRNS |
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| Publication Number | Publication Date |
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| DD217239A1 true DD217239A1 (en) | 1985-01-09 |
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ID=5549644
Family Applications (1)
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| DD25378083A DD217239A1 (en) | 1983-08-08 | 1983-08-08 | BIOCHEMICAL PROCESS FOR ENRICHING SECRET PROTEIN-MRNS |
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|---|---|
| DD (1) | DD217239A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999005256A2 (en) * | 1997-07-24 | 1999-02-04 | President And Fellows Of Harvard College | Method for cloning secreted proteins |
-
1983
- 1983-08-08 DD DD25378083A patent/DD217239A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999005256A2 (en) * | 1997-07-24 | 1999-02-04 | President And Fellows Of Harvard College | Method for cloning secreted proteins |
| WO1999005256A3 (en) * | 1997-07-24 | 1999-08-05 | Harvard College | Method for cloning secreted proteins |
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