DD210353A1

DD210353A1 - METHOD FOR DETERMINING THE INCLUSION VOLUME OF LIPOSOMES

Info

Publication number: DD210353A1
Application number: DD24359382A
Authority: DD
Inventors: Gerd Vorwieger
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1982-09-29
Filing date: 1982-09-29
Publication date: 1984-06-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Bestimmung des Einschlussvolumens von Liposomen, die nach den meisten der bekannten Verfahren hergestellt werden koennen. Das Verfahren besteht darin, dass die Liposomenbildung in Kupfersulfatloesung durchgefuehrt, der Liposomenloesung Zinkstaub zugesetzt, der sich bildende Kupferniederschlag entfernt und die Menge des in der Liposomenloesung verbleibenden Kupfers bestimmt wird.The invention relates to a method for the rapid determination of the inclusion volume of liposomes, which can be prepared by most of the known methods. The method consists of performing liposome formation in copper sulfate solution, adding zinc dust to the liposome solution, removing the copper precipitate which forms, and determining the amount of copper left in the liposome solution.

Description

Verfahren zur Bestimmung des Einschlußvolumens von Liposomen-Anwendungsgebiet der Erfindung Method for determining the inclusion volume of liposomes - Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen und nicht geräteintensiven Bestimmung des Einschlußvolumens von Liposomen, die nach den meisten der bekannten Verfahren hergestellt werden können.The invention relates to a method for rapid and not device-intensive determination of the inclusion volume of liposomes, which can be prepared by most of the known methods.

Characteristic of the known technical solutions

Liposoken'.. sand-'·--künstliche Vesikel aus PhÖspholipideh» Süit" dein Begriff'werden alle sphärischen Lame11ensysteine, die.einen abgeschlossenen Innenraum umgrenzen, erfaßt - ohne Wertung in 3e-. zug auf Anzahl und Beschaffenheit der Lamellen. Eine Größe, deren Kenntnis vor allem für die nutzung von Liposomen sehr wesentlich ist, ist das Einschluß volumen· (Bezieht man den eingeschlossenen Volumenanteil nicht - wie beim Einschlußvolumen auf das:Vesikellipid, sondern auf das gesamte wäßrige Ausgangsmedium, handelt es sich um die Einschlußkapazität einer Herstellungsmethode für Liposomen)» Die direkte Bestimmung dieser Größe erfolgt über die Bestimmung der in den Liposomen einge-.schlossenen Substanzen· Die Entfernung des äußeren Mediums kann dazu durch Dialyse (J. Mol. Biol. 1_3 (1965), 238j Biophys. 3iochim. Acta _331 (1974), 390·, Chem. Phys. Lipids 1_o (1976) , 142; Proc«. Natl. Acad. Sei. USA 7_5 (1978), 4194; Biophys. Biochim. Acta 601 (1980), 559)? Gelfiltration (Ghem. Phys. Lipids Io (1976), 142), Pelletierung der Liposomen im Schwerefeld (Biophys. Biochim. Acta 649 (1981), 129; Biophys. Biochim. Acta 646 Liposoken '-' - artificial vesicles from pholipideh '' your term 'is used to cover all spherical lamellae which border on a closed interior, without any appreciation of the number and quality of the lamellae , the knowledge of which is very important, especially for the use of liposomes, is the inclusion volume. (If the volume fraction included is not related to the vesicle lipid but to the entire starting aqueous medium, this is the inclusion capacity of a production method for liposomes) »The direct determination of this size is carried out by the determination of the substances incorporated in the liposomes. · The removal of the external medium can be effected by dialysis (J. Mol. Biol. 1_3 (1965), 238j Biophys 1977, 390, Chem. Phys. Lipids 1, 1976, 142; Proc., Natl. Acad., See, USA, 7, 5 (1978), 4194, Biophys., Biochim, Acta 601 (1980), 559). Ge lfiltration (Ghem Phys. Lipids Io (1976), 142), Pelleting of the liposomes in the gravitational field (Biophys. Biochim. Acta 649 (1981), 129; Biophys. Biochim. Acta 646

(1981), 1) oder Waschen über einem Membranfilter (Biophys. J. 28 (1979),-1; Biochemistry V7 (1978)» 3592) erfolgen. Eine direkte Bestimmung durch IMR-Spektroskopie erfordert den Einschluß signalliefernder Verbindungen in die Liposomen'mit nachfolgendem Austausch oder (magnetischer) Modifikation des äußeren Mediums (Science 197 (1977), 224; Biophys. Biochim. Acta 443 (1976) 313; 550 (1979), 201; 5_H (1978), 255; 394 (1975) 483; 375 (1975) 186).(1981), 1) or washing over a membrane filter (Biophys, J. 28 (1979), -1, Biochemistry V7 (1978), 3592). Direct determination by IMR spectroscopy requires the inclusion of signal-providing compounds in the liposomes with subsequent exchange or (magnetic) modification of the external medium (Science 197 (1977), 224; Biophys. Biochim. Acta 443 (1976) 313; 550 (1979 201, 5_H (1978), 255; 394 (1975) 483; 375 (1975) 186).

Unter Anwendung von Kugeigleichungen kann das Einschlußvolumen indirekt bestimmt werden durch HMR-spektroskopische Sichtbarmachung funktioneller Gruppen der lipoide kleiner Liposomes (Biophys. Biochim. Acta 375. (1975), 186; 550 (1979) ·, 157; 601 (1980) 453).Using confectionery equations, the inclusion volume can be determined indirectly by HMR spectroscopic visualization of functional groups of the lipoid small liposomes (Biophys Biochim Acta 375 (1975) 186, 550 (1979), 157, 601 (1980) 453).

Wenn organische Substanzen eingeschlossen werden, kann eine direkte Bestimmung mittels enzymatischer Methoden erfolgen (Chem. Phys. Lipids 16. (1976), 142; Int. J. Radiat. 3,iol. J8 (1980), 537). Mit Hilfe der Dialyse können: kleine Moleküle und Lösungsmittelreste entfernt werden. Dabei ist jedoch ein erheblicher Aufwand an Zeit und Pufferlösung, erforderlich. Effektiver ist die"Abtrennung der Vesikel" vom übrigen Medium durch Gelfiltration. Wegen Adsorption der Liposomes an die Gelmatrix ist das Gel vorher mit einem Vesikelaliquot zu äquilibrieren; die Abtrennung ist nicht immer vollständig.When organic substances are included, direct determination can be made by enzymatic methods (Chem. Phys., Lipids, 16. (1976), 142; Int. J. Radiat., 3, Jol., 1980, 537). With the help of dialysis: small molecules and solvent residues can be removed. However, a considerable amount of time and buffer solution is required. More effective is the "separation of the vesicles" from the remaining medium by gel filtration. Because of adsorption of the liposomes to the gel matrix, the gel must first be equilibrated with a vesicle aliquot; the separation is not always complete.

Bei der wiederholten Pelletierung der Liposomen im -Schwerefeld zur Entfernung des äußeren Mediums haben neben dem Vesikeldurchmesser auch Dichte und Viskosität des Einschlußmediums und evtl. Lösungsmittelreste im Liposom Einfluß. Der Einsatz von. Membranfiltern ist zeitaufwendig,'; da mit sehr kleinen Porendurchmessern gearbeitet werden muß. Generell unterbieten nur die IMR-spektroskopischen und die'enzymatischem Methoden den Zeitaufwand von einer Stunde. Bei beiden sind jedoch zur Erzielung genauer Ergebnisse.entweder aufwendige Konzentrierungsschritte (Druckdialyse; Pelletierung; Membranfiltration) oder/ und Liposomen-Herstellungsverfahren mit hoher Einschlußkapazität erforderlich. Außerdem sind bei der HMR-Spektroskopie sehr empfindliche (hochfrequentige) Geräte notwendig.In the repeated pelletization of the liposomes in the field of gravity to remove the outer medium in addition to the vesicle diameter and density and viscosity of the inclusion medium and any solvent residues in the liposome influence. The use of. Membrane filtering is time consuming, '; because you have to work with very small pore diameters. In general, only the IMR spectroscopic and enzymatic methods reduce the time required for one hour. However, neither of them requires elaborate concentration steps (pressurized dialysis, pelleting, membrane filtration) or / and high entrapped liposome production processes to achieve accurate results. In addition, HMR spectroscopy requires very sensitive (high-frequency) devices.

3 3 Ziel dergoal of

Das Ziel der Erfindung ist die schnelle, genaue und schonende Bestimmung des Einschlußvolumens von Liposomen mit einfachen Mitteln.The aim of the invention is the rapid, accurate and gentle determination of the inclusion volume of liposomes by simple means.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Bestimmung des Einschlußvolumens von Liposomen, zu- entwickeln. .The object of the invention is to develop a new method for determining the inclusion volume of liposomes. ,

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Einschluß-Yolumens von. Liposomen besteht darin, daß die Liposomenbildung in Kupfersulfatlösung durchgeführt, der Liposomenlösung Zinkstaub zugesetzt, der sich bildende. Kupferniederschlag entfernt und die Menge des in der Liposomenlösung /verbleibenden Kupfers bestimmt wird.The inventive method for determining the inclusion Yolumens of. Liposomes is that the liposome formation is carried out in copper sulfate solution, the liposome solution zinc dust added, the forming. Copper precipitate removed and the amount of in the liposome solution / remaining copper is determined.

Um die quantitative Ausfällung des. im äußeren Mediums enthaltenen Kupfers zu garantieren, müssen unabhängig von der Korngröße' des Zin^;fcpu'ivers' bestimmte molare Zink/Kupfe'r-Verhältnisse., z.B. von mindestens 10:1 -eingehalten werden. Dabei ist es günstig, nach Abschluß der Reaktion noch einmal eine geringe Menge Zink zuzugeben, um auch noch evtl. vorhandene Kupferreste aus der Lösung auszufällen. Die Abtrennung des Metallschlammes kann durch Filtration oder durch Zentrifugieren erfolgen. Die anschließende Kupferbestimmung ("eingeschlossenes Kupfer") ist z.B. mit Atomabsorptionsspektroskopie möglich. Der große Zinküberschuß (und auch die Anwesenheit von Lecithin) stört dabei nicht. Eine andere Möglichkeit besteht in der colorimetrischen Kupferbestimmung mit Dithizon.In order to guarantee the quantitative precipitation of the copper contained in the outer medium, irrespective of the grain size 'of the Zin ^; fcpu'ivers' certain molar zinc / Kupfe'r ratios., eg of at least 10: 1 are maintained. It is advantageous to add a small amount of zinc again after completion of the reaction in order to precipitate any remaining copper residues from the solution. The separation of the metal sludge can be carried out by filtration or by centrifugation. The subsequent determination of copper ("enclosed copper") is possible, for example, with atomic absorption spectroscopy. The large excess of zinc (and also the presence of lecithin) does not interfere. Another possibility is the colorimetric determination of copper with dithizone.

Voraussetzung für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß das Medium im Einschlußvolumen einen pH-Wert besitzt, bei dem das Cu~⁺-lon stabil ist. . . .Prerequisite for the application of the method according to the invention is that the medium in the inclusion volume has a pH at which the Cu ^{+ +} ion is stable. , , ,

Das Verfahren beruht auf dem Austausch von Cu~⁺-Ionen im nichteingeschlossenen Medium durch Zn ^⁺-Ionen, es besteht also nicht die Gefahr von osmotischem Streu wie beim Austausch des äußeren Mediums durch äquiosmolare Puffer.The method is based on the exchange of Cu ^{+ +} ions in the non-enclosed medium by Zn ^ ⁺ ions, so there is no danger of osmotic litter as in the exchange of the outer medium by equiosmolar buffers.

Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht in seiner Anwendbarkeit ·auf Liposomensuspensionen niedriger Konzentration.An essential advantage of the invention is its applicability to liposome suspensions of low concentration.

embodiment

Es werden Liposomen nach dem Etherinjektionsverfahren (Biochem. Biophys. Äcta 443 (1976), 629; Ann. N. Y. Acad· Sei. (1978) , .1) in 0,1 M CuSO^-Lö'sung gebildet« Die Lecithinkon- ζentration in der Liposomensuspension beträgt 1nM. 5 ml dieser Suspension werden nach Abkühlung auf Raumtemperatur zu 460 mg Zink in einem wassergekühlten Gefäß gegeben (diese Zinkmenge entspricht 15 Molanteilen bezüglich des Kupfers). Nach 10 s Rühren mit einem Glasstab wird eine weitere Spatelspitze Zink dem Reaktionsgemisch zugesetzt und weitere 10s gerührt. Der sich bildende Metallschlamm wird auf einer Fritt.e abgetrennt. Die relativ schnelle Trennung kann durch gefingen Stickstoffdruck noch beschleunigt werden. Eine Probe der filtrierten Suspension wird- atomabsoptionsspektroskopiseh ausgemessen und anhand-einer vorher ermittelten Eichkurve ausgewertet. Unter Berücksichtigung der Lipidkonzentration..ergibt sich ei.ii Einschlußvolumen von 1 31/moi. Das ..entspricht den bekannten: werten für diese Strukturen, deren tatsächliches Vorliegen mit optischen und elektronenoptischen Methoden nachgewiesen wurde.Liposomes are Formed by the Ether Injection Method (Biochem., Biophys., Octa 443 (1976), 629, Ann., NY Acad., (1978), 1) in 0.1 M CuSO 4 solution. "The lecithin concentration in the liposome suspension is 1nM. After cooling to room temperature, 5 ml of this suspension are added to 460 mg of zinc in a water-cooled vessel (this amount of zinc corresponds to 15 molar parts relative to the copper). After stirring for 10 seconds with a glass rod, another spatula tip of zinc is added to the reaction mixture and stirred for a further 10 seconds. The forming metal sludge is separated on a frit.e. The relatively fast separation can be accelerated by nitrogen pressure. A sample of the filtered suspension is measured by atomic absorption spectroscopy and evaluated on the basis of a previously determined calibration curve. Taking into account the lipid concentration, there is an egg volume of 1 31 / moi. This corresponds to the known values for these structures, the actual presence of which was proven by optical and electron-optical methods.

Claims

invention claim

1. A method for the determination of the inclusion volume of liposomes, characterized in that the liposome formation is carried out in copper sulfate solution, zinc dust is added to the liposome solution, the forming metal sludge is removed and the amount of copper remaining in the liposome solution is determined *

2. The method according to item 1, characterized dai3 the determination of the copper atom absorption spectroscopy or colorimetrisch is performed with dithizone.