DD159993A1

DD159993A1 - IMMUNOSORBENTCHROMATOGRAPHIC CLEANING OF ALKALINE PHOSPHATASE FROM KAELBERDARM

Info

Publication number: DD159993A1
Application number: DD23121981A
Authority: DD
Inventors: Anton Horn; Jose F Yero; Helga Endmann; Margarete Schulze; Renate Bublitz; Heidi Ehle
Original assignee: Anton Horn; Jose F Yero; Helga Endmann; Margarete Schulze; Renate Bublitz; Heidi Ehle
Priority date: 1981-06-29
Filing date: 1981-06-29
Publication date: 1983-04-20
Also published as: DD159993B1

Abstract

Es wird ein Reinigungsverfahren der alkalischen Phosphatase aus Kaelberdarm beschrieben, welches aus einem Rohextrakt in einem Schrift eine Anreicherg. d. Enzyms um den Faktor 50-250 ermoeglicht. Die Reinigung erfolgt ueber Bindung des Enzyms an einen traegerfixierten Antikoerper gegen Darmphosphatase. Die Desorption des Komplexes erfolgt mit Wiederfindung um 80 % im alkalischen pH-Bereich, unterstuetzt durch Chaotrope Substanzen und anderer Effektoren.A purification process of alkaline phosphatase from calf intestine is described which comprises a crude extract from a crude extract. d. Enzyme by a factor of 50-250 possible. Purification takes place via binding of the enzyme to a carrier-fixed antibody against intestinal phosphatase. The desorption of the complex occurs with recovery by 80% in the alkaline pH range, supported by chaotropic substances and other effectors.

Description

Titel der ErfindungTitle of the invention

Immunosorbent^chromatographische Reinigung von alkalischer Pliosphatase aus KälberdarmImmunosorbent chromatographic purification of calf intestinal alkaline pliosphatase

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung wird zweckmäßigerweise auf dem Gebiet der Enzymologie und dem Gebiet der .industriellen Gewinnung von Biochemikalien, zur ökonomischen Gewinnung von alkalischer Phosphatase für die biochemische und klinischchemische Analytik verwendet. Sie kann auch auf anderen Gebieten, bei denen alkalische Phosphata.se zum Einsatz kommt, genutzt werden.The invention is suitably used in the field of enzymology and the field of .industrial recovery of biochemicals, for the economic recovery of alkaline phosphatase for biochemical and clinical chemical analysis. It can also be used in other areas where alkaline Phosphata.se is used.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm ist ein Enzym, das mit hoher spezifischer Aktivität gereinigt v/erden kann und welche sich diirch hohe Stabilität auszeichnet» Für das Enzym sind stabile Substrate bekannt, die den Nachweis des Enzyms mittels Absorptions·" und Pluoreszenzmessung erlauben» Diese Eigenschaften haben dazu geführt, daß dieses Enzym im zunehmenden Maße als Markerenzym für Enzyminiraunassays eingesetzt wird« Alle bisher bekannten Verfahren zur Reinigung des Enzyms sind relativ aufwendige Mehrschrittverfahren* Pur einige neuere Verfahren wurden neben den klassischen Mitteln der Enzymreinigung wie Pällungsschritte mit konzentrierten Salzlösungen und organischen .Lösungsmitteln, Äffinitätschromatographieche Schritte eingebaut. Die Vielzahl der aufwendigen'Schritte führt dazu, daßCalf intestinal alkaline phosphatase is an enzyme which can be purified with high specific activity and which is characterized by high stability. Stable substrates are known for the enzyme, which allow the detection of the enzyme by means of absorption and plueascence measurements led to the fact that this enzyme is increasingly being used as a marker enzyme for enzyme in vitro assays. "All previously known methods for purifying the enzyme are relatively expensive multi-step methods. Purely some newer methods were used in addition to the classical means of enzyme purification, such as precipitation steps with concentrated salt solutions and organic solvents. The multiplicity of elaborate steps leads to the fact that

kommerziell erhältliche Enzymchargen, die die für Enzymimmunassays notwendige Reinheit besitzen,. vergleichsweise sehr teuer sind«commercially available enzyme lots having the purity required for enzyme immunoassays. are comparatively very expensive «

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, alkalische Phosphatase aus Kälberdarm mit einem einfachen und spezifischen Verfahren zu hoher spezifischer Aktivität mit wenigen Reinigungsschritten zu reinigen«The aim of the invention is to clean alkaline phosphatase from calf intestine with a simple and specific method to high specific activity with few cleaning steps «

Wesen der ErfindungEssence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, alkalische Hiosph.ata.se aus Kälberdarm durch Iiranunosorbentchromatographie z.u reinigen« Gemäß der Erfindung wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Antikörper gegen reine alkalische "Phosphatase erzeugt und als Iminunosorbentien trägerfixiert zur Reinigung des Enzyms, ohne Vorreinigung, verwendet v/erden. . The invention has for its object to clean alkaline Hiosph.ata.se calf intestine by Iiranunosorbentchromatographie "According to the invention, this object is achieved in that antibody produced against pure alkaline" phosphatase and carrier immobilized as Iminunosorbentien for purification of the enzyme, without prepurification used v / earth.

Die Mängel, die den bisher bekannten Verfahren anhaftens nämlich die Vielzahl der notwendigen Reinigungsschritte, werden dadurch umgangen, daß man. als hochspezifisches, die alkalische Phosphatase und fast ausschließlich nur die alkalische Phosphata.se adsorbierendes Material einen Antikörper gegen dieses Enzym benutzt, der an eine feste Matrix gebunden ist. Im Gegensatz zu den meisten anderen affinitäts-chromatographischen Verfahren kann die Adsorption des Enzyms an diesem trägergebundenen Antikörper direkt aus einem Rohextrakt ohne vorherige Vorreinigung erfolgen« Die Qualität und Effizienz des Schrittes hängt sehr wesentlich von der Qualität des zu fixierenden Antikörpers ab· Wird ein absolut reines Enzym zur Antikörpergewinnung eingesetzt, ist. es möglich, höchstgereinigtes Enzym mit einem Säulenschritt aus .dem Rohextrakt zu gewinnen, wenn die. Desorption des Immunkomplexes mit geeigneten Desorbentien unter schonenden Bedingungen erfolgt« Die Auswahl.dieser Desorptionsbedingungen bestimmt auch die Häufigkeit mit der die Immunosorbentchromatogra.ph.ie mit ein und derselben Antikörpersäule durchge-The deficiencies adhering to the previously known methods namely the large number of necessary purification steps, are avoided by the fact that. as a highly specific material that adsorbs alkaline phosphatase and almost exclusively only the alkaline phosphata. se an antibody against this enzyme bound to a solid matrix. In contrast to most other affinity-chromatographic methods, the adsorption of the enzyme on this carrier-bound antibody can be carried out directly from a crude extract without prior pre-purification. "The quality and efficiency of the step depends very much on the quality of the antibody to be fixed Enzyme used for antibody recovery is. it is possible to obtain highly purified enzyme from the crude extract by one column step when the. The selection of these desorption conditions also determines the frequency with which the immunosorbent chromatogra.ph.

führt werden kann» EId v/eiterer Vorteil dieser Technik besteht darin» daß zur' wiederholten Antikörpergewinnung ein einmal immunisiertes Tier leicht durch Boosterung reaktiviert v/erden kann. .The advantage of this technique is that a once-immunized animal can be easily reactivated by boosting to obtain repeated antibody recovery. ,

Ausführungsbeispielembodiment

Aus 2 in Kälberdünndarmstücken (Duodenum und oberes. Jejunum) frisch geschlachteter Kälber wird die Dsnnschleimhaut gewonnen und zu Acetontrockenpulv.er verarbeitete Das Acetontrockenpulver wird mit n-Butanol extrahiert und mit IJatriuniacetat-Magnesiumacetat (0.01 M) im.Homogenisator aufgeschlossene Bach Zentrifugation wird der Überstand des Rohextraktes 2 Stunden bei Zimmertemperatur mit 60 ml gepackten Irnmunoadsorbent, bestehend aus AH-Sepharose 4 B₅ an die Antikörper von 9 ml Antiserum kovalent gebunden wurden, gerührt. Das Immunogel wird abfiltriert und mit PBS-Tween (137 πώϊ NaCl₅ 2.68 mM KCl, 10 ml Phosphat, 0.02 % IaIi₀, 0*05 % Tween pH = 7.4) gewaschen bis bei 280 nm keine Extinktioneänderung auftritt. 60 ml Immunogel binden etwa 10 000 Internationale Einheiten alkalische Phosphatase. Die Slution des Enzyms erfolgt mit 0.5 M NaJ in 0.2 M Borat oder ITitrat und 20 mM Phosphat pH = 11.4 und beträgt 65-75 %° Das Enzym wird dann gegen eine Lösung von 80. mM Tris, 2 mM MgCl₂ und 0.025 mM ZnCl₂ pH ~ dialysiert und über eine -DEAE-Cellulose-Säule weiter gereinigt. Dabei v/erden Premdproteine gebunden, während das Enzym im Durchlauf erscheint und durch Ultrafiltration mit einer Amiconapparatur über eine UM-20 E Diaflo-Membran konzentriert v/erden kann. An der DEAE-Cellulose-Säule treten kaum Verluste .auf'(80-90 % Wiederfindung). Das Enzym hat am Schluß der Reinigung eine spezifische Aktivität von 1 000-2 000 IU/mg Protein (bei 25 ⁰C, p-Nitrophenylphosphat in Diäthanolamin, 0.05 M MgCl₂, pH = 9.8)..From 2 calf intestine pieces (duodenum and upper jejunum) of freshly slaughtered calves, the mucosa of the dermis is recovered and processed into acetone dry powder. The acetone dry powder is extracted with n-butanol and Bach supernatant is stirred with IJatriuniacetate-magnesium acetate (0.01 M) in the homogenizer of the crude extract was stirred for 2 hours at room temperature with 60 ml of packed Irnmunoadsorbent consisting of AH-Sepharose 4 B ₅ covalently bound to the antibodies of 9 ml of antiserum. The immunogel is filtered off and washed with PBS-Tween (137 πώϊ NaCl ₅ 2.68 mM KCl, 10 ml phosphate, 0.02 % Iai ₀ , 0 * 05 % Tween pH = 7.4) until no change in extinction occurs at 280 nm. 60 ml of immunogel bind about 10,000 International Units of alkaline phosphatase. Slution of the enzyme is carried out with 0.5 M NaJ in 0.2 M borate or ITitrate and 20 mM phosphate pH = 11.4 and is 65-75 %. The enzyme is then applied against a solution of 80 mM Tris, 2 mM MgCl ₂ and 0.025 mM ZnCl ₂ pH ~ dialysed and further purified via a DEAE-cellulose column. Premix proteins are bound while the enzyme appears in the run and can be concentrated by ultrafiltration with an Amicon apparatus via a UM-20 E Diaflo membrane. Hardly any losses occur on the DEAE cellulose column (80-90 % recovery). The enzyme has at the end of cleaning a specific activity of 1000-2000 IU / mg of protein (at 25 ⁰ C, p-nitrophenyl phosphate in diethanolamine, 0.05M MgCl _2, pH = 9.8) ..

Zur Stabilisierung des Enzyms erfolgt eine Dialyse gegenTo stabilize the enzyme is dialyzed against

*J* J

eine Lösung aus 3 M HaCl, 0.1 JaM ZnGl₂ und 0.03 M Triethanolamin. pH = 7.6 . a solution of 3 M HaCl, 0.1 JaM ZnGl ₂ and 0.03 M triethanolamine. pH = 7.6.

Claims

invention claim

1. Immunosorbent chromatogridographic purification of alkaline phosphata.se from calf intestine characterized by,. that antibody produced against pure alkaline phosphatase and used as Irnmuoosorbentien carrier fixed for purifying the enzyme without pre-purification of the crude enzyme used ο /

.Immunosorbentchromatographische cleaning according to item 1, characterized in that as antibodies preferential.-Wise early antibodies are used for carrier fixation.

3. Immunosorbent Chromatography Purification according to items 1 and 2, characterized in that the immunosorbents used are prepared under such conditions that more than 1 IU of alkaline phosphatase are bound per 1 μl of coupled antiserum. «

4 Immunosorbent chromatographic purification according to items 1 and 3, characterized in that the carrier fixation of the antibody is carried out over at least 10 intermediate groups.

Iirimunosorbent chromatographic purification according to item 1, characterized in that the enzyme used for the immunization is purified by means of polyacrylamide electrophoresis, is localized in the gel via activity determination and injected as a gel enzyme suspension of foreign protein into the animal for antibody production.

6r Aisunosorbentchromatographische cleaning according to item 1, characterized in that the adsorption of the enzyme from a crude extract with an activity of 2-20 IU / ml.

7. Inimunosorbentchromatographische cleaning according to item 1 and 4, characterized in that the crude extract is obtained after butanol extraction treatment »

8. Ixninunosorbentchromatographische- cleaning according to item 1, characterized in that the desorption of Bnzymimmunkomplexeß in a millieu with pH values of 10-11 * 8 preferably at pH 11.4 «

9 "immunosorbent chromatographic purification according to item 1 and 6, characterized in that are used to improve the desorption chaotropic substances in the concentration range of 0 .1 - 0 * 5 mH.

10 "Immunoborbentchromatographische cleaning according to item 1, characterized in that as Bndrc-inigungsinittel Premdproteinadsorption of DEAE-cellulose at pH 7ο 5 in 80 mM Tris.