DD148297A1

DD148297A1 - PROCESS FOR PREPARING PROTHROMBIN COMPLEX CONCENTRATES WITH REDUCED THROMBOGENICITY

Info

Publication number: DD148297A1
Application number: DD21797779A
Authority: DD
Inventors: Guenter Dornheim; Horst Wegner
Original assignee: Bezirks Inst Fuer Blutspende U
Priority date: 1979-12-21
Filing date: 1979-12-21
Publication date: 1981-05-20

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Prothrombinkomplexkonzentraten aus zitrathaltigem Ausgangsmaterial mit verminderter Thrombogenizitaet bei ihrer therapeutischen Anwendung am Menschen bei Mangelzustaenden an einem oder mehreren Faktoren des Prothrombinkomplexes. Das erfindungsgemaesze Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dasz bei Verwendung von Adsorptionsmitteln, die unter Prozeszbedingungen zwar die Faktoren des Prothrombinkomplexes nicht aber den natuerlichen Proteaseinhibitor Antithrombin III absorbieren bzw. abgeben, den Prothrombinkomplexkonzentraten Antithrombin III und Heparin zugesetzt werden. Die Menge zugesetzten Antithrombin III und Heparin wird so bemessen, dasz einmal eine irreversible Neutralisation der zum Zeitpunkt der Zugabe der beiden Substanzen bereits aktivierten Gerinnungsfaktoren erfolgt und dasz zum anderen eine Stabilisierung des Prothrombinkomplexkonzentrates fuer den Zeitraum zwischen dem Aufloesen des Iyophilisierten Konzentrates und seiner therapeutischn Anwendung erfolgt.The present invention relates to a process for the preparation of prothrombin complex concentrates of citrate-containing starting material having reduced thrombogenicity in their therapeutic use in humans in deficiency states of one or more factors of the prothrombin complex. The process according to the invention is characterized by the fact that when using adsorbents which under process conditions absorb the factors of the prothrombin complex but not the natural protease inhibitor antithrombin III, the prothrombin complex concentrates antithrombin III and heparin are added. The amount of added antithrombin III and heparin is such that once an irreversible neutralization of the coagulation factors already activated at the time of addition of the two substances takes place and, on the other hand, a stabilization of the prothrombin complex concentrate takes place for the period between the dissolution of the lyophilized concentrate and its therapeutic application ,

Description

Berlin,d.5.12.1979 0730 DD/18Berlin, d.5.12.1979 0730 DD / 18

Verfahren zur Herstellung von Prothrombinkomplexkonzentraten mit verminderter ThrombogenizitätProcess for the preparation of prothrombin complex concentrates with reduced thrombogenicity

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrates der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X (Prothrombinkomplex) mit verminderter Thrombogenizität zur Erhöhung der Sicherheit bei der Therapie von Mangelzuständen eines oder mehrerer dieser 4· Gerinnungsfaktoren.The invention relates to a method for producing a concentrate of the coagulation factors II, VII, IX and X (prothrombin complex) with reduced thrombogenicity for increasing the safety in the therapy of deficiency states of one or more of these 4 coagulation factors.

Characteristic of the known technical solutions

Prothrombinkomplexkonzentrate, die aus Humanzitratplasma oder zitrathaltigen Humanplasmafraktionen durch Adsorption an DEAE-Zellulose oder DEAE-Sephadex hergestellt werden, enthalten unterschiedliche Mengen aktivierte Gerinnungsfaktoren IX a, Xa und XI a, wobei zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch offen ist, ob nicht auch andere aktivierte Faktoren bzw. deren Reaktionsprodukte in den Prothrombinkomplexkonzentraten vorhanden sind·Prothrombin complex concentrates prepared from human nitrate plasma or citrate-containing human plasma fractions by adsorption to DEAE-cellulose or DEAE-Sephadex contain different amounts of activated coagulation factors IX a, Xa and XI a, although it is still unclear at this time whether other activated factors or whose reaction products are present in the prothrombin complex concentrates

Diese aktivierten Gerinnungsfaktoren oder deren Reaktionsprodukte werden für bei Patienten beobachtete gefährliche Nebenwirkungen wie Thrombosen und disseminierte intravasale Gerinnung verantwortlich gemacht, die gehäuft bei Patienten mit Lebererkrankungen, Früh- und Neugeborenen sowie nach großen operativen Eingriffen beobachtet werden.These activated coagulation factors or their reaction products are believed to be responsible for dangerous side effects observed in patients, such as thrombosis and disseminated intravascular coagulation, which are more commonly seen in patients with liver disease, premature and neonatal, and after major surgery.

Gerinnungsfaktoren mit thrombogener Wirkung in Prothrombinkomplexkonzentraten für den klinischen Bedarf sind in vitro mittels Humanplasma (NAPTT-Test) als Substrat nachweisbar.Coagulation factors with thrombogenic effects in prothrombin complex concentrates for clinical use can be detected in vitro using human plasma (NAPTT test) as a substrate.

Nach H_#S. Kingdon et. al· (Potentially thrombogenic materialsAccording to H _# S. Kingdon et. al (Potentially thrombogenic materials

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in factor IX concentrates, Thrombos. Diathes. Haemorrhin factor IX concentrates, thrombosis. Diathes. Haemorrh

(1975) 617-631) korreliert die in einem Reaktionsansatz mit nicht kontaktaktiviertem Normalplasma und einem partiellen Thromboplastin durch das Prothrombinkomplexkonzentrat eintretende Verkürzung der Gerinnungszeiten mit den Ergebnissen der in vivo-Untersuchungen der Konzentrate am Kaninchen nach dem Modell von Wessler et» al· (Biologie assays of a thrombosisinducing activity in human serum, J. Appl. Physiol. 14 (1959) 943). (1975) 617-631), the shortening of the coagulation times occurring in a reaction mixture with non-contact-activated normal plasma and a partial thromboplastin by the prothrombin complex concentrate correlates with the results of the in vivo investigations of the concentrates in rabbits according to the model of Wessler et al. (Biologie Assays of a thrombosisinducing activity in human serum, J. Appl. Physiol., 14 (1959) 943).

Zur Charakterisierung der Menge vorhandener aktivierter Gerinnungsfaktoren kann der Quotient aus der Gerinnungszeit mit und ohne Prothrombinkomplexkonzentrat (NAPTTR) angegeben werden·To characterize the amount of activated activated coagulation factors, the quotient of the coagulation time with and without prothrombin complex concentrate (NAPTTR) can be stated.

Von G. Sas et· al· (In vitro spontanaeous thrombin generation in human factor IX concentrates, British Journal of Haematology 21 (1975) 25) wird der zeitliche Verlauf der Thrombinentstehung aus Prothrombinkomplexkonzentraten bei Gegenwart von Kalziumchlorid zur Charakterisierung einer eventuellen thrombogenen Wirkung herangezogen·G. Sas et al. (In vitro spontaneous thrombin generation in human factor IX concentrates, British Journal of Haematology 21 (1975) 25) uses the time course of thrombin generation from prothrombin complex concentrates in the presence of calcium chloride to characterize a possible thrombogenic effect.

Die aus Humanzitratplasma durch Adsorption des Prothrombinkomplexes durch Adsorption an DEAE-Zellulose und DEAE-Sephadex hergestellten Prothrombinkomplexkonzentrate (Suomela, G,, Myllylä, G,, Raaska, E·: Preparation and properties of a therapeutic Factor IX concentrate, Vox. Sang. 22 (1977) 37-51 - Heystek, J·, Brummelhuis, H.G.J., Krijnen, H.W.: Contributions to the optimal use of human blood II· The large-scale preparation of prothrombin complex, Vox. Sang. 2£ (1973) 113-123) enthalten nur wenig oder kein Ant!thrombin III,The prothrombin complex concentrates prepared from human nitrate plasma by adsorption of the prothrombin complex by adsorption onto DEAE-cellulose and DEAE-Sephadex (Suomela, G ,, Myllyl, G ,, Raaska, Preparation and properties of a therapeutic factor IX concentrate, Vox. Sang. 22 (1977) 37-51 - Heystek, J ·, Brummelhuis, HGJ, Krijnen, HW: Contributions to the optimal use of human blood II · The large-scale preparation of prothrombin complex, Vox. Sang. £ 2 (1973) 113- 123) contain little or no antithrombin III,

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Von Suomela wird in den Prothrombinkomplexkonzentraten nach der Substratmethode eine vom Antithrombin III unabhängige Äntithrombin-Aktivität unklarer Herkunft nachgewiesen.Suomela detects an antithrombin activity of unknown origin in the prothrombin complex concentrates according to the substrate method.

Antithrombin III ist ein natürlicher Proteaseinhibitor, der die in Prothrombinkomplexkonzentraten möglicherweise vorhandenen aktivierten Gerinnungsfaktoren irreversibel neutralisiert, wobei di? Geschwindigkeit dieser Reaktion durch Heparin beträchtlich erhöht wird.Antithrombin III is a natural protease inhibitor that irreversibly neutralizes the activated coagulation factors that may be present in prothrombin complex concentrates. The rate of this reaction is considerably increased by heparin.

Der Zusammenhang zwischen dem Antithrombin III- und Heparingehalt der ProthrombinkoDiplexkonzentrate und einer thrombogenen Nebenwirkung wird nicht einheitlich beurteilt. Von G.C. White etо al. (Prothrombin Complex Concentrates: Potentially thrombogenic materials and clues to the mechanism of thrombosis in vivo, Blood 4£ (1977) 159) wird vermutet, daß die Menge des in einigen Prothrombinkomplexkonzentraten nachweisbaren Antithrombin III nicht zur Neutralisation der Gesamtmenge aktivierter Gerinnungsfaktoren ausreicht. Nach White führt Heparin allein ohne Antithrombin III nur zu einer partiellen Neutralisierung aktivierter Gerinnungsfaktoren.The relationship between the antithrombin III and heparin content of the prothrombin complex diplexes and a thrombogenic side effect is not assessed consistently. From G.C. White et al. (Prothrombin Complex Concentrates: Potentially thrombogenic materials and clues to the mechanism of thrombosis in vivo, Blood 4 £ (1977) 159) it is believed that the amount of antithrombin III detectable in some prothrombin complex concentrates is insufficient to neutralize the total amount of activated coagulation factors. According to White, heparin alone without antithrombin III only leads to a partial neutralization of activated coagulation factors.

In der Anmeldung WP-DDR "Verfahren zur Herstellung von Antithrombin III enthaltenden Produkten" (WP A 61 K/210 335) wird festgestellt, daß tri-Kalziumphosphat nicht nur bekanntermaßen die Gerinnungsfaktoren II, VII, ΓΧ und X adsorbiert, sondern in zitratfreiem Plasma ein ausreichendes Adsorptionsvermögen für Antithrombin III aufweist.In the application WP-DDR "Process for the preparation of products containing antithrombin III" (WP A 61 K / 210 335) it is found that tri-calcium phosphate is not only known to adsorb the coagulation factors II, VII, ΓΧ and X, but in citrate-free plasma has a sufficient adsorptive capacity for antithrombin III.

Dadurch ist es in Abhängigkeit von der Verfahrensgestaltung möglich, die Paktoren des Prothrombinkomplexes und Antithrombin III im gewünschten Umfang in einer Plasmafraktion anzureichern.This makes it possible, depending on the process design, to enrich the pactors of the prothrombin complex and antithrombin III to the desired extent in a plasma fraction.

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Wird diesen Konzentraten Heparin zugesetzt, erfolgt eine Neutralisation der vorhandenen aktivierten Gerinnungsfaktoren and eine Stabilisierung des Prothrombinkomplexes. Das Verfahren ist auf die Verwendung zitratfreier Ausgangsmaterialien beschränkt.If heparin is added to these concentrates, the activated coagulation factors present are neutralized and the prothrombin complex stabilized. The process is limited to the use of citrate-free starting materials.

Von S. Chandra und M. Wickerhauser (Large scale preparation of a nonthrombog^nic prothrombin complex, Thrombosis Research Λ2 (1978) 571-582) wird festgestellt, daß ein bereits in der ersten Stufe der Herstellung von Prothrombinkomplexkonzentraten aufgefundenes Fragment des Faktor XII durch die Aktivierung von Prekallikrein zu Kallikrein schließlich zur Entstehung des aktivierten Faktor IX führen kann. Von dem aktivierten Faktor IX ist eine thrombogene Wirkung bekannt. Deshalb entfernen die Autoren den Faktor XII teilweise durch Adsorption an Kaolin und eliminieren die im Plasmaüberstand verbleibenden thronibogen wirkenden Bestandteile durch eine Fällung bei einer Polyäthylenglykolkonzentration von 10 %. Der partielle Prothrombinkomplex (ohne den Faktor VII) wird an DEAE-Zellulose adsorbiert. Während der Elution werden 72 Plasmaäquivalente Antithroabin III pro Liter Puffer zugesetzt. Um in vitro Ergebnisse nicht zu verfälschen, erfolgt kein Zusatz von Heparin. Die so hergestellten Prothrombinkomplexkonzentrate ergeben in einer Verdünnung von 1:10 einen Quotienten NAPTTR von > 0,5· Durch in vivo Versuche wurde festgestellt, daß solche Konzentrate im Tierversuch nach Wessler keine thrombogene Wirkung zeigen. Das Verfahren erfordert auf Grund der erreichten Ausbeuten von z. B. nur 30 % für den Faktor IX die Gewinnung weiterer therapeutisch einsetzbarer Proteine, wobei das Fehlen des Faktor VII bei der Effektivität der Behandlung von hämorrhagischen Diathesen bei Lebererkrankungen ein Nachteil sein kann.It is stated by S. Chandra and M. Wickerhauser (Large Scale Preparation of a Non-thrombogenic Prothrombin Complex, Thrombosis Research Λ2 (1978) 571-582) that a fragment of the factor XII already found in the first stage of the production of prothrombin complex concentrates activation of prekallikrein to kallikrein may eventually lead to the formation of activated factor IX. Activated factor IX is known to have a thrombogenic effect. Therefore, the authors partially remove factor XII by adsorption on kaolin and eliminate the remaining in the plasma supernatant thronibogen-acting ingredients by precipitation at a Polyäthylenglykolkonzentration of 10%. The partial prothrombin complex (without factor VII) is adsorbed on DEAE cellulose. During elution, 72 plasma equivalents of antithroabin III are added per liter of buffer. In order not to falsify in vitro results, there is no addition of heparin. The prothrombin complex concentrates prepared in this way give a ratio of NAPTTR of> 0.5 at a dilution of 1:10. In vivo experiments have shown that such concentrates show no thrombogenic activity in animal experiments according to Wessler. The method requires due to the achieved yields of z. B. only 30 % for Factor IX, the recovery of other therapeutically useful proteins, the lack of factor VII in the effectiveness of the treatment of hemorrhagic diathesis in liver diseases may be a disadvantage.

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Bei dem gegenwärtigen Stand der Technik sind beim Hersteller produktionsbegleitende Prüfungen notwendig, die u. a, auch die Menge eventuell thrombogen wirkender Enzyme erfassen. Die Standardisierung und das Festlegen von Grenzwerten für den NAPCDT-Test nach Kingdon und die TG^Q-Zeit nach Sas ist auf Grund der Heterogenität der mit beiden Untersuchungsverfahren nachgewiesenen aktivierten Gerinnungsfaktoren und der unbekannten Bedeutung einzelner Paktoren, wie z· B. des Paktor VII a, außerordentlich schwierig·In the current state of the art production-accompanying tests are necessary at the manufacturer, the u. a, also detect the amount of possibly thrombogenic enzymes. The standardization and setting of limits for the NDCDCDT test according to Kingdon and the TG ^ Q time according to Sas is due to the heterogeneity of the activated coagulation factors detected with both examination methods and the unknown significance of individual factors, such as the factor VII a, extremely difficult ·

Außerdem ist bekannt, daß Prothrombinkomplexkonzentrate, in denen zunächst nur geringe Mengen thrombogen wirkender Enzyme nachgewiesen werden können, in einem unterschiedlichen Umfang thrombogen wirksam werden können, wenn die Präparate nach dem Auflösen kurze Zeit bei Raumtemperatur stehen. (S, Elödi, Varadi, K_#, Activation of clotting factors in prothrombin complex concentrates as demonstrated by clotting assays for factors IX a and X a, Brombos, Research 12 (1978) 597-807).In addition, it is known that prothrombin complex concentrates, in which initially only small amounts of thrombogenic enzymes can be detected, can become thrombogenically effective to a different extent if the preparations are after dissolution for a short time at room temperature. (S, Elödi, Varadi, K _# , Activation of clotting factors in prothrombin complex concentrates as demonstrated by clotting assays for factors IX a and X a, Brombos, Research 12 (1978) 597-807).

In der WP-DDR-Anmeldung WPA 61 K/199 396 wurde festgestellt, daß durch die Verkürzung der Prozeßzeit und den Wegfall der Verfahrensschritte Sterilfiltration und Entsalzung der Gehalt der Konzentrate an aktivierten Gerinnungsfaktoren verringert werden kann. In Abhängigkeit von der Beschaffenheit der zur Isolierung des Prothrombinkomplexes eingesetzten Ausgangsmaterialien und den Eigenschaften des eingesetzten Adsorptionsmittels sind aktivierte Gerinnungsfaktoren in einem bestimmten Umfang nachweisbar.In the WP-GDR application WPA 61 K / 199 396 it was found that the shortening of the process time and the elimination of the process steps sterile filtration and desalting the content of the concentrates of activated coagulation factors can be reduced. Depending on the nature of the starting materials used to isolate the prothrombin complex and the properties of the adsorbent used, activated coagulation factors are detectable to a certain extent.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist die Herstellung eines stabilisierten Prothrombinkomplexkonzentrates aus zitrathaltigem Plasma, beiThe aim of the invention is the preparation of a stabilized prothrombin complex concentrate from citrate-containing plasma

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dessen Anwendung auch bei sogenannten Risikopatienten_vdie Gefahr einer thromboembolischen Komplikation bzw· einer disseminierten intravasalen Gerinnung vermindert werden kann·may be its use also in so-called patients at risk of a thromboembolic complication the risk _v · or disseminated intravascular coagulation reduces ·

Gleichzeitig sollen für den Hersteller Schwierigkeiten bei der Bewertung der Ergebnisse der produktionsbegleitenden Überprüfung im TG^.CQ-Test nach Sas und im NAPTT-Test nach Kingdon dadurch beseitigt werden, daß die Notwendigkeit der Entscheidung über die therapeutische Verwendbarkeit nach mehr oder weniger willkürlich festgelegten Grenzwerten entfällt, da solche Grenzwerte mit den erfindungsgemäß hergestellten Präparaten auch nicht annähernd erreicht werden.At the same time, the manufacturer should be overcome difficulties in assessing the results of the production-accompanying review in the TG ^ .CQ test according to Sas and in the NDTTT test according to Kingdon, that the need for the decision on therapeutic usability for more or less arbitrarily set limits is omitted, since such limits are not even reached with the preparations prepared according to the invention.

Das bei Einsatz von Plasmaüberständen der Humanplasmafraktion Kryopräzipitat nach Abtrennung des Prothrombinkomplexes erhaltene Überstandsplasma soll ohne Einschränkung zur Herstellung von Humantrockenplasma 2· AB-DDR eingesetzt werden können·The supernatant plasma obtained by using plasma supernatants of the human plasma fraction cryoprecipitate after separation of the prothrombin complex should be usable without restriction for the production of human dry plasma 2 × AB-DDR.

Explanation of the essence of the invention

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß während der Isolierung des Prothrombinkomplexkonzentrates aus zitrathaltigen Ausgangsmaterialien durch Adsorption an DEAE-Sephadex oder DEAE-Zellulose Antithrombin III und Heparin diesen zugesetzt werden.According to the invention, this object is achieved in that during the isolation of Prothrombinkomplexkonzentrates from citrate-containing starting materials by adsorption to DEAE-Sephadex or DEAE-cellulose antithrombin III and heparin are added.

Es wurde gefunden, daß in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der zur Isolierung des Prothrombinkomplexes eingesetzten Humanzitratplasmen (z· B. Gehalt an Thrombozyten), den verfahrenstechnischen Parametern wie Temperatur, Zusammensetzung der Pufferlösungen, der Art und Dauer des Kontaktes mit dem Adsorptionsmittel, der Beschaffenheit des AdsorptionsmittelsIt has been found that, depending on the nature of the human nitrate plasmas used to isolate the prothrombin complex (eg content of platelets), the procedural parameters such as temperature, composition of the buffer solutions, the type and duration of contact with the adsorbent, the nature of the adsorbent

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selbst usw· die Konzentrate unterschiedliche Mengen in vitro nachweisbarer aktivierte Gerinnungsfaktoren enthalten, die zu ihrer irreversiblen Neutralisation den Zusatz unterschiedlicher Mengen Ant!thrombin III erfordern»itself, the concentrates contain different amounts of in vitro detectable activated coagulation factors which require the addition of different amounts of antithrombin III for their irreversible neutralization.

Es wurde festgestellt, daß es notwendig ist, Antithrombin III in einer solchen Menge zuzusetzen, die die aktuell zur Neutralisierung der vorhandenen aktivierten Gerinnungsfaktorexi benötigte Menge Antithrombin III übersteigt.It has been found necessary to add antithrombin III in an amount that exceeds the amount of antithrombin III currently required to neutralize the activated activated coagulation factor.

Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, das Antithrombin III im Verfahrensablauf bereits während der Freisetzung des Prothrombinkomplexes vom Adsorptionsmittel zuzusetzen.It has been found that it is expedient to add the antithrombin III in the course of the process already during the release of the prothrombin complex from the adsorbent.

Es wurde festgestellt, daß eine solche Verfahrensweise den Einsatz geeigneter, aber nicht sehr hoch gereinigter Antithrombin HI-Konzentrate ermöglicht, da eine teilweise Entfernung von in den Antithrombin III-Konzentraten vorhandenen Proteinen durch Adsorption am Adsorptionsmittel während der Freisetzung des Prothrombinkomplexes erfolgt. Ein Zusatz zu einem späteren Zeitpunkt, z. B. nach der Isolierung des Prothrombinkomplexkonzentrates oder nach dem Auflösen des lyophilisierten Präparates, erfordert vergleichsweise mehr Antithrombin III, da Antithrombin III nicht nur zu einer Heutralisierung bereits gebildeter aktivierter Faktoren führt, sondern offensichtlich den Prоthrombinkomplex vor einer Spontanaktivierung schützt.It has been found that such a procedure allows the use of suitable but not very highly purified antithrombin HI concentrates, since a partial removal of proteins present in the antithrombin III concentrates by adsorption on the adsorbent during the release of the prothrombin complex. An addition at a later date, eg. B. after isolation of the prothrombin complex or after dissolution of the lyophilized preparation, requires comparatively more antithrombin III, since antithrombin III not only leads to a neutralization of already formed activated factors, but obviously protects the Prоthrombinkomplex from spontaneous activation.

Es wurde gefunden, daß die vollständige Neutralisation der aktivierten Gerinnungsfaktoren und der gewünschte Schutz des Prothrombinkomplexes vor einer Spontanaktivierung einen Zusatz von Heparin erfordert.It has been found that complete neutralization of the activated coagulation factors and the desired protection of the prothrombin complex from spontaneous activation requires addition of heparin.

Es wurde festgestellt, daß die notwendige Menge Heparin vonIt was found that the necessary amount of heparin from

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der Zusammensetzung der Prothrombinkomplexkonzentrate abhängig ist. Es wurde gefunden, daß bei Verwendung von Adsorptionsmitteln, die unter Prozeßbedingungen Heparin adsorbieren, ein weiterer Heparinzusatz zum Endprodukt notwendig ist, wenn Heparin zeitlich bereits bei vor der Freisetzung des Prothrombinkomplexes liegenden Verfahrensstufen zugesetzt wird.the composition of the prothrombin complex concentrates. It has been found that when using adsorbents which adsorb heparin under process conditions, further addition of heparin to the final product is necessary if heparin is added in time even before the release of the prothrombin complex process steps.

Es wurde festgestellt, daß das gesamte Verfahren in geschlossener Anordnung unter aseptischen Bedingungen durchführbar ist, so daß eine Sterilfiltration durch die Untersuchung auf Sterilität ersetzt werden kann.It has been found that the entire process can be carried out in a closed configuration under aseptic conditions, so that sterile filtration can be replaced by sterility testing.

Es kann angenommen werden, daß durch die Beschränkung der Menge des pro Charge eingesetzten Ausgangsmaterials und bei Verwendung von aus Einzelplasma hergestellten Ant!thrombin III-Konzentraten eine Verringerung des Hepatitisrisikos erreicht wird.It can be assumed that a reduction in the risk of hepatitis is achieved by limiting the amount of starting material used per batch and using anti-thrombin III concentrates prepared from single plasma.

Es wurde festgestellt, daß ein Antithrombin HI-Überschuß und eine ausreichende bienge Heparin die lyophilisierten Präparate vor einer Bildung zusätzlicher Mengen aktivierter Gerinnungsfaktoren in dem Zeitraum zwischen dem Auflösen des Präparates und der therapeutischen Anwendung schützen.It has been found that an excess of antithrombin HI and a sufficient amount of heparin protect the lyophilized preparations from formation of additional amounts of activated coagulation factors in the period between dissolution of the preparation and therapeutic application.

Es wurde festgestellt, daß durch den Zusatz ausreichender Mengen Antithrombin III und Heparin Ausgangsplasma mit einem Gehalt > 15·000 Thrombozyten//Ul zur Isolierung des Prothrombinkomplexes eingesetzt werden kann, ohne daß in den Konzentraten in vitro aktivierte Gerinnungsfaktoren nachweisbar sind.It was found that the addition of sufficient amounts of antithrombin III and heparin starting plasma with a content> 15,000 platelets // Ul can be used to isolate the prothrombin complex, without in the concentrates in vitro activated coagulation factors are detectable.

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embodiment

Die Herstellung der Prothrombinkomplexkonzentrate erfolgt bis zum Verfahrensschritt der Freisetzung des Prothrombinkomplexes nach WP-DDEThe prothrombin complex concentrates are prepared until the process step of release of the prothrombin complex according to WP-DDE

1· Adsorption des Prothrombinkomplexes 24 AcD-AG-PIasmen mit einem Gehalt an Thrombocyten/ /Ul von 295OO + 10850 und einem mittleren Volumen von 444 + 21 ml werden nach Abtrennung der Humanplasmafraktion Kryopräzipitat maximal 16 Stunden bei + 2 ⁰C gelagert.1 x adsorption of the prothrombin 24 AcD-AG-PIasmen containing platelets / / Ul of 295OO + 10850 and an average volume of 444 + 21 mL are stored cryoprecipitate a maximum of 16 hours at + 2 ⁰ C after the separation of human plasma fraction.

Zur Adsorption des Prothrombinkomplexes werden in silikonisierte 5OO ml Blutkonservenflaschen 21,0 ml einer sterilisierten Suspension von DEAE-Sephadex A 50 (12,0 g/510 ml 0,075 ro Natriumchloridlösung Korngröße 40 bis 120 лі1) gebracht. Die Adsorptionsdauer beträgt 45 Minuten bei Temperaturen zwischen + 2 ⁰C und + 20 ⁰C. Die Stabilisierung der DEAE-Sephadex-Plasmasuspensionen erfolgt durch Eotation der Behältnisse mit 4 bis 12 U/min oder durch Schütteln auf geeigneten Schüttelgeräten, die ein schaumfreies Arbeiten ermöglichen.For the adsorption of the prothrombin complex, 21.0 ml of a DEAE-Sephadex A 50 sterilized suspension (12.0 g / 510 ml 0.075 ro sodium chloride solution of particle size 40 to 120 μl_1) are placed in siliconized 5OO ml blood bottles. The adsorption period is 45 minutes at temperatures between + 2 ⁰ C and + 20 ⁰ C. The stabilization of DEAE Sephadex plasma suspensions by eotation of the containers at 4 to 12 U / min or by shaking on suitable shakers, which allow a foam-free working ,

2» Abtrennen des Adsorptionsmittels DEAE-Sephadex A 50 und Entfernen von Inertprotein 2 » Separation of the adsorbent DEAE-Sephadex A 50 and removal of inert protein

Das nach der Zentrifugation (10 Minuten 1600 U/min) verbleibende DEAE-Sephadex A 50-Gel wird in der Waschflüssigkeit (0,2 m NaCl, 0,01 m Natriumzitrat pH 7,0) suspendiert und in eine geeignete Trennvorrichtung z. B. nach WP-DDR 1 D/197 З19 überführt und in dieser wird durch weitere kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe von Waschflüssigkeit die Entfernung des Inertproteins fortgesetzt.The DEAE-Sephadex A 50 gel remaining after centrifugation (10 minutes 1600 rpm) is suspended in the washing liquid (0.2 M NaCl, 0.01 M sodium citrate pH 7.0) and poured into a suitable separating device, e.g. B. to WP-DDR 1 D / 197 З19 transferred and in this is continued by further continuous or discontinuous addition of washing liquid, the removal of the inert protein.

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3· Freisetzung des Prothrombinkomplexes Nach Beendigung des Auswaschens wird überschüssige Waschflüssigkeit durch Überdruckfiltration entfernt» Die Freisetzung des Prothrombinkomplexes vom DEAE-Sephadex wird so gesteuert, daß eine Natriumchloridkonzentration von mindestens 0,5 m erreicht wird.3 · Release of the prothrombin complex After washing is complete, excess washing liquid is removed by overpressure filtration »The release of the prothrombin complex from the DEAE-Sephadex is controlled so that a sodium chloride concentration of at least 0.5 m is achieved.

20,0 ml Elutionsflüssigkeit (3,95 m Natriumchlorid, 0,1 m Natriumzitrat, pH 6,85 + 0,05) und 40,0 ml der Lösung einer lyophilisierten Antithrombin III angereicherten Humanplasmafraktion (hergestellt z. B. nach DDR-WP, Anmeldung WP A 61 K/210 335 "Verfahren zur Herstellung von Antithrombin III enthaltenden Produkten") mit 0,5 и Natriumchloridlösung werden in die Trenneinrichtung gebracht und diese zur Beschleunigung der Freisetzung des Prothrombinkomplexes 20 Minuten geschüttelt. Die zugesetzte Antithrombin III angereicherte Humanplasmafraktion enthält im Mittel 70,4 jf 1,4 mg Antithrombin III und 890 _+ 34 mg Gtesamtprotein.20.0 ml of elution liquid (3.95 M sodium chloride, 0.1 M sodium citrate, pH 6.85 + 0.05) and 40.0 ml of the solution of a lyophilized antithrombin III-enriched human plasma fraction (prepared, for example, according to DDR-WP , Application WP A 61 K / 210 335 "Process for Preparing Products Containing Antithrombin III") with 0.5 î sodium chloride solution are placed in the separator and shaken for 20 minutes to accelerate the release of the prothrombin complex. The added anti-thrombin III-enriched human plasma fraction contains on average 70.4 jf 1.4 mg antithrombin III and 890 _ + 34 mg total protein.

Das Prothrombinkomplexkonzentrat wird durch überdruckfiltration gefolgt von einer abschließenden Zentrifugalfiltration abgetrennt. Mit Beginn der Abtrennung des Konzentrates werden diesem 1200 bis 2500 IE Heparin zugesetzt.The prothrombin complex concentrate is separated by overpressure filtration followed by a final centrifugal filtration. With the beginning of the separation of the concentrate, heparin is added to this 1200 to 2500 IU.

Im Mittel werden pro Charge 111,6 + 5i7 S des stabilisierten Prothrombinkomplexkonzentrates mit einem Antithrombin III-Gehalt von 47,4 + 4,9 mg/100 ml erhalten.On average, 111.6 + 5i7 S of the stabilized prothrombin complex concentrate with an antithrombin III content of 47.4 + 4.9 mg / 100 ml are obtained per batch.

Pro Transfusionseinheit werden 7»4 ml des Konzentrates in 120 ml Blutkonservenflaschen portioniert, im Block eingefroren und bei Temperaturen von -10 ⁰C getrocknet.Per transfusion unit, 7 »4 ml of the concentrate are portioned into 120 ml blood bottles, frozen in a block and dried at -10 ⁰ C.

Bei der therapeutischen Anwendung des lyophilisierten Pro-In the therapeutic application of the lyophilized

- 11 - Berlin,d.5.12И979 О73О DD/18- 11 - Berlin, d.5.12И979 О73О DD / 18

thrombinkomplexkonzentrates wird dieses in 20,0 ml Wasser zur Injektion gelöst. Eine Transfusionseinheit enthält im Mittel 364 + 41,6 Einheiten Faktor II, 317 + 58 Einheiten Faktor X und 432 + 48 Einheiten Faktor IX, der Antithrombin III-Gehalt pro Transfusionseinheit beträgt im Mittel 3>51 + 0,36 mg·thrombin complex concentrate, this is dissolved in 20.0 ml of water for injection. A transfusion unit contains on average 364 + 41.6 units factor II, 317 + 58 units factor X and 432 + 48 units factor IX, the antithrombin III content per transfusion unit is on average 3> 51 + 0.36 mg ·

Die Charakterisierung eventuell thrombogen wirkender Beimengungen erfolgt durch die Bestimmung der nicht aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (NAPTT) nach Kingdon und durch die Bestimmung der Thrombinfreisetzung (TG^₁-Q nach Sas)·The characterization of possibly thrombogenic additions is carried out by the determination of the non-activated partial thromboplastin time (NAPTT) according to Kingdon and by the determination of the thrombin release (TG ^ ₁ -Q according to Sas).

Prothrombinkomplexkonzentrate, bei deren Isolierung Antithrombin III in der beschriebenen Weise während der Freisetzung des Prothrombinkomplexkonzentrates zugesetzt wurde, verkürzen in einer Verdünnung von 1:10 die nicht aktivierte partielle Thromboplastinzeit (NAPTT) nicht·Prothrombin complex concentrates in which isolation of antithrombin III was added in the manner described during the release of the prothrombin complex concentrate do not shorten the unactivated partial thromboplastin time (NAPTT) at a dilution of 1:10.

Bei Vergleichspräparaten ohne Antithrombin III-Zusatz beträgt der Quotient (NAPTTR) der NAPTT mit und ohne Prothrombinkomplexkonzentrat (Verdünnung 1:10) im Mittel 0,559 + 0,0379.In comparator drugs without antithrombin III addition, the ratio (NAPTTR) of NAPTT with and without prothrombin complex concentrate (dilution 1:10) averages 0.559 + 0.0379.

Die TG^Q-Zeiten nach Sas liegen zwischen 7 bis 8 Minuten für Prothrombinkomplexkonzentratѳ ohne Antithrombin III, für entsprechende Konzentrate mit Antithrombin III werden TG. ,-Q-Zeiten > 250 Minuten ermittelt.The TG ^ Q times after Sas are between 7 to 8 minutes for prothrombin complex concentrateѳ without antithrombin III, for corresponding concentrates with antithrombin III become TG. , -Q times> 250 minutes.

Claims

- 12 - Berlin, d.5.12.1979 О7ЗО DD / 18 Erfindu.ngsanspru.ch

1, A method for producing a prothrombin complex concentrate having reduced thrombogenicity preferably from human plasma, supernatants of the human plasma fraction cryoprecipitate or other suitable starting materials by adsorption to DEAE-Sephadex A 50 or other adsorbents which under the conditions of isolation of the prothrombin complex concentrate are not naturally present in the plasma or plasma fractions Protease inhibitor to a sufficient extent and characterized, characterized in that the naturally occurring in the plasma protease inhibitor antithrombin III and heparin are added to the prothrombin complex concentrate ·

Method according to item 1, characterized in that the amount of added antithrombin III depends on the nature of the starting material, the adsorbent used, the process conditions such as temperature, process time, contact with hydrophilic surfaces, etc. and the time of addition to the prothrombin complex concentrate.

3 · Method according to item 1 and 2, characterized in that the release of the prothrombin complex is carried out with an antithrombin III-containing eluent.

4 "process according to point 1 to 3i characterized in that the amount of total heparin used depends on the time of addition, the adsorbent used and the composition of the prothrombin complex concentrates ·

- 13 - Berlin, d.5.12.1979 0730 DD / 18

5. The method according to item 1 to 4, characterized in that the prothrombin complex concentrate is added immediately after separation from the adsorbent heparin.

6, method according to item 1 to 5ι characterized in that the amounts of added heparin and antithrombin III are such that during the period between the dissolution of the lyophilized prothrombin complex concentrate and its therapeutic application, activation of the existing coagulation factors either prevented or by entstan spontaneous activation entstan activated clotting factors can be irreversibly neutralized »

7th method according to item 1 to 6, characterized in that for the isolation of the prothrombin complex plasma or plasma fractions can be used, for example, with platelet counts of Ul.

8. The method according to item 1 to 3i, characterized in that the used antithrombin III-containing human plasma fractions are freed by the interaction with the adsorbent used for the isolation of the prothrombin complex of certain accompanying protein.

9 · Method according to items 1 to 3 »characterized in that the batch size is limited to reduce the risk of hepatitis and the antithrombin III concentrate used is produced from low-poled or single-donation plasma,

10 · Method according to item 1 and item 3 to 5 », characterized in that the entire method is carried out in a closed arrangement under aseptic conditions.