CZ9901946A3

CZ9901946A3 - Polymerní nosič pro kultivaci keratinocytů s aktivními sacharidy

Info

Publication number: CZ9901946A3
Application number: CZ19991946A
Authority: CZ
Inventors: Jiří Ing. Csc. Labský; Jiří Ing. Csc. Vacík; Karel Mudr. Doc. Smetana; Barbora Rndr. Dvořánková
Original assignee: Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr; Univerzita Karlova
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 1999-06-02
Publication date: 2001-01-17
Also published as: CZ292491B6

Description

Oblast techniky

Vynález se týká polymerního nosiče pro kultivaci keratinocytů na biologicky aktivních polymemích podložkách

Dosavadní stav techniky

Kultivované keratinocyty jsou běžně využívány pro krytí rozsáhlých kožních defektů jako jsou popáleniny, bércové vředy a proleženiny. Adherence keratinocytů v tkáňové kultuře představuje nutnou podmínku jejich kultivace a následného terapeutického využití. Je známo, že keratinocyty adherují k molekulám mezibuněčné hmoty (laminin, fibronektin, kolagen typu IV) prostřednictvím receptorů integrinového typu (Adams a Watt, Development, 117, 1183-1198, 1993). Kromě toho je známo, že adhezivní protein laminin je bohatě glykosylován (Goldstein a Liotta, Arch. Biochem.Biophys. 227, 118-124, 1983). Možný vliv těchto sacharidů na adherenci epithelálních buněk je předpokládán (TrinkausRanďall et al., Cell Tissue Res. 251, 315-323, 1988). V praxi vypadá využití kultivovaných keratinocytů následujícím způsobem: pacientovi je odebrán malý kousek kůže (asi 3 cm²), z něhož jsou enzymaticky izolovány keratinocyty. Ty jsou pak kultivovány v podmínkách tkáňových kultur spolu s myšími 3-T-3 fibroblasty (tzv. pomocné buňky), u nichž byla ozářením či chemicky zastavena proliferace. Jsou však schopné produkovat mezibuněčnou hmotu a růstové faktory. Bez těchto podpůrných buněk lidské keratinocyty nemohou adherovat ke kultivační nádobě. Po odumření podpůrných buněk a pomnožení keratinocytů jsou keratinocyty enzymaticky uvolněny ode dna kultivační nádoby, uchyceny na mastný tyl a přeneseny na kožní defekty (Green et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76, 5665-5668, 1979). Při tomto postupu je možno z relativně malého odběru pokrýt rozsáhlé plochy poškozené kůže. Vlastní přenos buněk na mastný tyl je však technicky náročný a bývá příčinou neúspěchů. Byla proto připravena technologie vycházející zGreenovy metody, která umožňuje kultivovat keratinocyty přímo na polymemích nosičích a přímo s těmito nosiči je transplantovat na rannou plochu (Vacík et al., Patent č.281 269, 1996; Dvořánková et al., Folia Biol., Praha, 42, 83-86, 1996; Smetana et al., J. Mater. Sci. Mater. Med. 8, 587590, 1997; Dvořánková et al., Biomaterials, 19, 141-146, 1998).

Polymerní nosiče se připravují radikálovou polymerizací za podmínek běžných pro tyto typy polymerizací. Připravené nosiče se dodatečně čistí dokonalým vypráním od zbytků nezreagovaných monomerů resp. použitého rozpouštědla. Dosud se používají polymerní nosiče z materiálu poly(HEMA), připravené radikálovou polymerizací z 2-hydroxyethyl methakrylátu (HEMA). Před nasazením buněk je nutno nosiče preinkubovat 1-24 hod v mediu, které obsahuje 25% bovinního séra. Kultivace keratinocytů pak probíhá za přítomnosti podpůrných buněk v podmínkách tkáňových kultur, tedy spolu s myšími 3-T-3 fibroblasty, u nichž byla ozářením či chemicky zastavena proliferace. I tento postup však komplikuje celý proces transplantace, neboť je nadále spojen s nutnou preinkubací a přítomností podpůrných buněk. Významnou nevýhodou je i skutečnost, že přítomnost pomocných buněk v kultivačním systému potencionálně zatěžuje imunologický systém pacienta.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu, který odstraňuje výše uvedené nevýhody, je polymerní nosič pro kultivaci keratinocytů připravený radikálovou polymerací z polymerizační směsi, která obsahuje 1 až 95 % hmot. radikálově polymerizovatelného monomeru, 0,0 až 10 hmot. % síťóvadla, 0,1 až 10 hmot.% iniciátoru, 0,0 až 60 hmot. % rozpouštědla, 0,0 až 60 hmot. % polymerizovatelného derivátu sacharidů resp. disacharidů a 0,0 až 30 hmot. % polymerizovatelného reaktivního derivátu ω-aminokyselin.

Předmět vynálezu je dále rozvinut poukazem na vhodné sloučeniny a jejich kombinace a postupy jejichž přípravy a účinky jsou demonstrovány v příkladech provedení.

Monomer obsahuje jednotlivě nebo v kombinaci látky vybrané ze skupiny kyselina akrylová a methakrylová, alkylakryláty a methakryláty, hydroxyalkylakiyláty a methakryláty, alkyloxyalkylakryláty a methakryláty, acyloxyalkylakryláty a methakryláty, akryl- a methakrylamidy, substituované alkylakryl- a methakrylamidy, hydroxyalkylakryl- a methakrylamidy, 1-vinyllaktamy, diacetonakrylamid [(l,l-dimethyl-3-oxobutyl) akrylamid].

Síťovadlo obsahuje jednotlivě nebo v kombinaci látky vybrané ze skupiny l,r-divinyl-3,3'-(ethan-l,l-diyl)di(pyrrolidin-2-on), ethylenglykol diakiylát, ethylenglykol dimethakrylát, oc,co-poly(oxyethylen) diakrylát, a,o-poly(oxyethylen) dimethakrylát, kde počet opakujících se jednotek je 2 až 20.

Iniciátor obsahuje jednotlivě nebo v kombinaci látky vybrané ze skupiny látek, které podléhají tepelnému rozkladu jako jsou azonitrily, azoestery, azoamidy, azoamidiny, alkyl-, acylperoxidy, systémy schopné vyvolat polymerizací po ozáření světlem jako jsou deriváty benzoinu, α-diketony (kafrchinon) s terciální aminy.

9 4 4 e e e e

Rozpouštědlo obsahuje jednotlivě nebo v kombinaci vodu, glykol, di-a polyethylenglykoly (mol.hmotnost až 1200), glycerin, mono- a diethery glykolu a diglykolu, l-methylpyrrolidin-2-on, dimethylformamid, dimethylacetamid, dimethylsulfoxid.

Další možností je polymerní nosič, připravený bez přítomnosti chemicky vázaných sacharidů, který je kondicionován adsorpcí biologicky aktivních sacharidů vybraných ze skupiny polysacharidů heparinu (A), heparan sulfátu (B), kyseliny hyaluronové (C) dále monosacharidů konjugovaných s albuminem či polymerním nosičem kyseliny glukuronové (D), β-D-galaktózy (E), P(a)-D-N-acetyl galaktosaminu (F), P(a)-D-N-acetyl glukosaminu (G), α-D-mannosy (H), kde adsorpce probíhá při koncentraci 10-500 pg/ml PBS za teploty 4° C - 37° C po dobu 1 -12 hodin.

Vynález je založen na novém zjištění, že při určitých vlastnostech polymerního nosiče je možno kultivovat keratinocyty bez přítomnosti pomocných buněk na polymerech s biologicky aktivními polysacharidy, neoglykoproteiny a neoglykoligandy adsorbovanými na nosič z hydrofilního polymeru.

Při adsorpci polysacharidů jsou polysacharidy použity v nativní formě či s navázaným biotinem, což usnadňuje jejich adsorpci. Monosacharidy jsou použity v podobě neoglykoproteinů o obecné struktuře: monosacharid-bovinní sérový albumin s biotinem či bez (Lee a Lee, vLectins and Glycobiology, H.-J. Gabius a S. Gabius (Eds.), Springer Laboratory, Berlin, 1993 pp 9-22; Gabius et al., Histol. Histopath. 8, 369-383, 1993) či v podobě neoglykoligandů: monosacharid-poly[7V-(2-hydroxyethyl) akrylamid] s biotinem či bez (Bovin, v Lectins and Glycobiology, H.-J. Gabius a S. Gabius (eds), Springer Laboratory, Berlin, 1993, pp 23-28; Bovin et al., Chem.Soc.Rev. 24, 413-321, 1995). Uvedené polysacharidy či monosacharidové konjugáty se imobilizují na povrch polymerních nosičů adsorpcí jednotlivých molekul či jejich kombinací (např. B:F = 1:1, B:F:H = 2:1:1).

Při práci se postupuje tak, že polymerní nosič se za sterilních podmínek inkubuje s polysacharidem (A-C), neoglykoproteinem či neoglykoligandem (D-H) nebo jejich směsí v koncentraci 10-500 pg/lml PBS (fosfáty pufrovaného fyziologického roztoku) po dobu 112 hodin. Přebytečný roztok se odstraní, polymerní nosič se šetrně opláchne kultivačním mediem a jsou nasazeny keratinocyty v hustotě 1-5 x 10⁶ na 50 cm² plochy. Buňky se kultivují při·37° C v atmosféře 3,3 % CO2.

Tímto způsobem lze kultivovat keratinocyty z enzymaticky rozvolněného jemného dermo-epidermálmho štěpu odebraného pacientovi i z buněk, které byly zmrazené.

Namnožené keratinocyty mohou být na polymerním nosiči přeneseny na kožní defekt a e ^e Í i i V * · · · tt ···· · ·· ···· • · 9 9 9 999 9 9 9 9 • · · · · · · to · 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 · * ·· 9999 99 99 99 99 použity k jeho krytí. Nosič s buňkami je přitom orientován tak, že buňky jsou aplikovány na plochu rány a polymemí nosič tvoří optimální kryt transplantovaných buněk. Tímto způsobem lze aplikovat jak buňky autologní (pacientovy vlastní buňky), které mohou vytvořit trvalý kryt, tak buňky alogenní (buňky druhého člověka), které výrazně stimulují hojení.

Je li polymemí nosič připraven za pomoci polymerizovatelných derivátů sacharidů, odpadá preinkubace vlastního nosiče s polysacharidy, neoglykoproteiny či neoglykoligandy. Kromě toho při použití polymerisovatelných derivátů mono-a disacharidů na polymemí nosič je přesněji určena jejich koncentrace. Další postup kultivace je zachován. Vyloučením pomocných buněk z kultivačního systému se sníží imunologická zátěž pacienta, zjednoduší se a zefektivní proces transplantace keratinocytů.

Příklady provedení

Příklad 1

100 g 2-hydroxyethyl methakrylátu, 0,4 g ethylenglykol dimethakrylátu, 1,4 g 2-hydroxy-2methylpropiophenonu bylo polymerizováno na polypropylenové folii 10 min. řadou UV lamp 175 W ze vzdálenosti 18 cm. Vznikla folie silná 1 mm, která byla extrahována směsí ethanol- voda (1:1) po dobu 48 hod. Folii lze nabobtnat ve vodě na obsah vody 36 %.

Příklad 2

Směs 80 g 2-hydroxyethyl methakrylátu, 0,6 g ethylenglykol dimethakrylátu, 0,5 g 2,2’azobis(2-methylpropionitrilu) se po probublání argonem (10 min.) nadávkuje v inertní atmosféře do forem vhodných pro přípravu folií (síla 1,3 mm), kde se polymerizuje při 70 ⁰C po dobu 12 hod. Po nabobtnání ve vodě obsahuje folie 36 % vody.

Příklad 3

Směs 40 g l-vinylpyrrolidin-2-onu, 40 g 2-acetyloxyethyl methakrylátu, 0,75 g l,l'-divinyl3,3'-(ethan-l,l-diyl)di(pyrrolidin-2-onu), , 15 ml glycerinu, 2 g 2-deoxy-2-methakryloylamino-D-galaktopyranosy, a 0,50 g 2,2'-dimethyl azobis(2-methylpropionátu) byla probublána argonem (10 min) a naplněna do forem pro přípravu folií (síla folie 1,1 mm) a polymerizována 12 hod. při teplotě 71° C. Folie byly vyprány v 30% ethanolu a nakonec nabotnány v destilované vodě.

• · · · • · · « ίϊ

Příklad 4

Směs 60 g 2-hydroxyethyl methakrylátu, 20 g 2-(2-hydroxyethoxy)ethyl methakrylátu, 3 g , 0,5 g ethylenglykol dimethakrylátu, 3,5 g 2-deoxy-2-({[5-(methakryloylamino) pentyl]karbonyl}-amino)-D-glukopyranosy, 0,5 g 2,2'-azobis(propionitrilu), 20 ml polyethylen glykolu 300 (Makrogolum 300) se po probublání argonem (12 min) nadávkuje v inertní atmosféře do forem pro přípravu folií (síla 1,6 mm) a polymerizuje se při 72° C po dobu 11 hod. Kopolymer byl extrahován při 25° C směsí 30 % ethanolu 72 hod. Výsledné folie byly nabobtnány v destilované vodě.

Příklad 5

Směs 40 g l-vinylpyrrolidin-2-onu, 30 g 2-acetyloxyethyl methakrylátu, 0,75 g l,l'.-divinyl3,3'-(ethan-l,l-diyl)di(pyrrolidin-2-onu), 3,5 g 4-nitrofenyl (10-methakryloylamino)dekanoátu, 0,2 g 2,2'-dimethyl azobis(2-methylpropionátu). Po probublání argonem (10 min) byla polymerizační směs naplněna do forem pro přípravu folií (1,6 mm) a polymerizována 12 hod. při teplotě 71° C. Polymeranalogická reakce s 25 mol násobkem D-glukosaminu byla provedena po nabobtnání folie v dimethylsulfoxidu (2 dny, lab. teplota). Folie byla po provedení reakce nabotnána v 3% roztoku amoniaku a nakonec v destilované vodě.

Příklad 6

Směs 40 g l-vinylpyrrolidin-2-onu, 40 g 2-acetoxyethyl methakrylátu, 0,75 g l,l'-divinyl3,3'-(ethan- l,l-diyl)di(pyrrolidin-2-onu), 3,5 g 4-nitrofenyl (10-methakryloylamino)dekanoátu, 2,2'-dimethyl azobis(2-methyl propionátu) byla probublána argonem (10 min) a naplněna do forem pro přípravu folií (síla 1,5 mm) a polymerizována 12 hod. při teplotě 71° C. Folie byly vyprány v 30% ethanolu a nakonec nabobtnány v destilované vodě.

Příklad 7

Nosič připravený podle příkladů 1 resp. 2 ve formě disku, čtverce či sítě o průměru 25-100 mm byl položen na dno kultivační nádoby a preinkubován s molekulami polysacharidů či neoglykoligandů (A-H) samotnými či v kombinaci (např. B;F = 1:1, B:F:H = 2:1:1) v koncentraci 10-500 g/ml fosfátového pufru íysiologického roztoku (PBS) po dobu 1-12 hodin, přičemž A-H značí A-heparin, B- heparin sulfát, C- kyselina hyaluronová, D-

kyselina glukuronová, E- β-D-galaktosa, F- 0(a)-D-N-acetyl galaktosamin, G- β(α)-ϋ-Νacetyl glukosamin, H- a-D-mannosa.

Na nosič byly nasazeny lidské keratinocyty v hustotě 4 χ 10⁴/ cm². Buňky byly kultivovány při 37° C v atmosféře 3,3 % CO2. Keratinocyty pro kultivaci se získají tak, že pacientovi je odebrán jemný dermo-epidermální štěp o tloušťce 0,2-0,3 mm, z něhož jsou keratinocyty získány působením trypsinu.

Kultivační medium obsahovalo:

1) Eaglovo-H MEM s neesenciálními aminokyselinami a pyruvátem sodným (ÚMG, AV ČR, Praha)

2) Glutamin (ÚSOL, Praha; 0,3 mg/ml

3) 10% bovinní sérum (Bioveta, Opava)

4) Hydrocortison (HydrocortisoN-Spofa, Praha; 0,5 μΜ/ml

5) Penicilín (200 jednotek/ml)

6) Streptomycin (10 pg/ml)

7) Insulin (Actrapid MC NOVO, Dánsko; 5 pg/ml)

8) Choleratoxin (Sigma, Praha; 10'^1θΜ)

9) epidermální růstový faktor (Sigma, Praha; 10 ng/ml).

Příklad 8

Hodnocení polymemích nosičů:

Byly provedeny orientační pokusy s pěstováním keratinocytů na různých polymemích nosičích, složení je uvedeno v následující tabulce. Nosiče byly připraveny radikálovou polymerizací za použití tepelných resp. světelných iniciátorů,

Polymerizace za použití tepelného iniciátoru byla provedena po smíchání a probublání polymerizační směsi (argon, 10 min.) mezi deskami z polypropylenu při teplotě 70° C po dobu 12 hod. (Síla folie 1,2 mm). Folie byly extrahovány 3 dny v 30% ethanolu a 3 dny v destilované vodě.

Polymerizace provedená iniciací UV iniciátorem byla provedena tak, že po smíchání polymerizační směsi byl roztok nalit na polyesterovou podložku, kde byl ozařován UV lampami výkonu 175 W ze vzdálenosti 15 cm po dobu 12 min. Folie byly vyprány v 30 % ethanolu (2 dny) a v destilované vodě (3 dny).

Složení polymerizačních násad pro přípravu různých polymemích nosičů je uvedeno v následující tabulce.

• «

a. Použité hydrofilní monomery - označení v tabulce:

1. 2-hydroxyethyl methakrylát

2. (2-hydroxyethoxy)ethyl methakrylát

3. l-vinylpyrrolidin-2-on

4. 2-acetoxyethyl methakrylát

5. kys. methakrylová

b. Síťovadla:

11. ethylenglykol dimethakrylát

12. 1,1 '-dívinyl-(ethan-l,l '-diyl)di(pyrrolidin-2-on)

c. Polymerizovatelné cukry:

A. 2-deoxy-2-({[5-(methakryloylamino)pentyl]karbonyl}amino)-D-glukopyranosa

B. 2-deoxy-2-methakryloylamino-D-galaktopyranosa

C. 2-methakryloyloxyethyl 2-acetamino-2-deoxy-D-glukopyranosid

D. 6-deoxy-6-methakryloylamino-D-glukopyranosa

e. Typ polymerizace - použitý iniciátor - tepelná polymerizace: iniciátor 2,2'-dimethyl azobis(2-methylpropionát)

UV polymerizace: iniciátor 2-hydroxy-2-methyl-propiophenon

Rozpouštědlo: glycerin označeno G a množství v hmot.% polyethylen glykol 300 (Macrogolum 300) označeno M a množství v hmot.%

v c.p.	Monomer	sífovadlo.	Cukr	jolymerace
	1	2	3	4	5	11	12	A	B	C	D	tep.	svět	rozp.
1	98, 5					0,3							1,2
2	69, 5	30				0,3						0,2
3	99, 5					0,3						0,2
4	68,	30				0,3	*						1,1

ee β»

δ

	6
5			50	39,5			0,3					0,2	G10
6	96, 5				3	0,3						0,2
7	87, 5					0,3		2				0,2	G10
8			50	46,5			0,3		3			0,2
9	61, 5	25				0,3				3		0,2	G10
10	96, 5					0,3					3	0,2
11	86, 5					0,3					3	0,2	M10
12	87, 5					0,3		2				0,2	G10

Poznámka: uvedená čísla v tabulce jsou hmotnostní procenta uvedených polymerizačních směsí.

Hodnocení:

Polymerní podložky připravené pod čísly pokusů 1 až 6 jsou standardní polymerní nosiče, které sloužily jako referenční polymerní podložky. Na těchto nosičích rostou lidské keratinocyty po preinkubaci sbovinním sérem za přítomnosti myších fibroblastů či po adsorpci bioaktivních sacharidů bez přítomnosti myších fibroblastů. Je nutná aktivace -podložky za použití cukrů (viz příklad 7).

Výsledky kultivace lidských keratinocytů na polymerních podložkách číslo 7. až 12. jsou velmi dobré. Keratinocyty adherujf a úspěšně rostou bez předchozí preinkubace s bioaktivními polysacharidy.

Průmyslová využitelnost

Polymerní nosič pro kultivaci keratinocytů na biologicky aktivních polymerních podložkách lze využít především při krytí a současném léčení rozsáhlých kožních defektů jako jsou popáleniny, bércové vředy a proleženiny.

Claims

Patentové nároky

1. Polymerní nosič pro kultivaci keratinocytů připravený radikálovou polymeraci z polymerizační směsi, která obsahuje 1 až 95 % hmot. radikálově polymerizovatelného monomeru, 0,0 až 10 hmot. % síťovadla, 0,1 až 10 hmot. % iniciátoru, rozpouštědlo 0,0 až 60 hmot. %, 0,0 až 60 hmot. % polymerizovatelného derivátu sacharidů resp. disacharidů a 0,0 až 30 hmot. % polymerizovatelného reaktivního derivátů ωaminokyselin.
2. Polymerní nosič pro kultivaci keratinocytů podle nároku 1 vyznačený tím, že polymerizační směs obsahuje jednotlivě nebo v kombinaci v rozsahu 1 až 95 hmot. % monomery vybrané ze skupiny kyselina akrylová a methakrylová, alkylakryláty a methakryláty, hydroxyalkylakryláty a methakryláty, alkyloxyalkylakryláty a methakryláty, acyloxyalkylakryláty a methakryláty, akryl- a methakrylamidy, substituované alkylakryl- a methakrylamidy, hydroxyalkylakryl- a methakrylamidy, 1 -vinylalktamy, diacetonakrylamid (1,1 -dimethyl-3 -oxobutyl) acrylamid.
3. Polymerní nosič pro kultivaci keratinocytů připravený podle nároku 1 až 2 vyznačený tím, že polymerizační směs obsahuje jako síťovadlo 0,0 až 10 hmot. % jednotlivě nebo v kombinaci látky vybrané ze skupiny:

1,1 '-divinyl-3,3 '-(ethan-1,1 -diyl)di(pyrrolidin-2-on) ch=ch₂ ch=ch₂

I I ^z 'CO

OC'

CH, ethylenglykol diakrylát, ethylenglykol dimethakrylát * T

H₂C=C-CO O-CH₂CH_rO-CO-C=CH₂ R = H, CH₃ i

r ' 'v? a » u * • · · 4 «•«'O

Ť « a,o>-poly(oxyethylen) diakrylát, ot,(o-poly(oxyethylen) dimethakrylát

R R

Ir 1 I h₂c=c-co-)-o-ch₂ch_í-[^-o-co-c=ch₂ r = h, ch₃ kdemje2až20.
4. Polymerní nosič pro kultivaci keratinocytů připravený podle nároku 1 až 3 vyznačený tím, že obsahuje jako iniciátor 0,1 až 10 hmot. % jednotlivě nebo v kombinaci látky vybrané ze skupiny látek, které podléhají tepelnému rozkladu a tím umožňují polymerisační reakci, jako jsou azonitrily, azoestery, alkyl-, acylperoxidy, nebo systémy, schopné vyvolat polymerizaci po ozáření UV nebo denním světlem jako jsou deriváty benzoinu, adiketony (kafrchinon) ve směsi s terciální aminy.
5. Polymerní nosič pro přípravu keratinocytů podle nároku 1 až 4 vyznačený tím,že obsahuje jako rozpouštědlo jednotlivě nebo v kombinaci látky ze skupiny zahrnující glykol, di-a polyethylen glykoly, glycerin, mono- a diethery glykolů a diglykolu, l-methylpyrrolidin-2on, dimethylformamid, dimethylacetamid, dimethylsulfoxid v rozsahu 0,0 až 60 hmot. %.
6. Polymerní nosič podle nároků 1 až 5 vyznačený tím, že polymerizační směs obsahuje 0,0 az 30 hmot. % polymerizovatelných reaktivních derivátů ω-aminokyselin, které se mohou modifikovat v připraveném hydrofilním polymeru reakcí s vhodným aminoderivátem * sacharidu resp. disacharidu, přičemž polymerizovatelné deriváty ω-aminokyselin jsou vyhrané ze skupiny zahrnující

a) Aktivované estery ω-akryloylaminoalkankarbonových a ω-methakryloylaminoalkankarbonových kyselin obecného vzorce

R

H₂C=C CO_r{-CH₂-^CO-R1 r = h, ch₃R

H₂C=C-CO₂-|-NHCH₂CO^-O—R1 kde η = 1 až 12, m - 2, 3, Rl jsou estery 4-nitrofenolu, pentachlorfenolu, N11 hydroxysukcinimidu, TV-hydroxyftalimidu

b) Polymerisovatelné deriváty ω-aminokyselin, které se aktivují pro reakci s aminocukry dicyklohexylkarbodiimidem.

R

H₂C=C CO^CH_r^CO_rR1 R = H, CH₃R

H₂C=C-CO^NHCH₂CO-(^-O—R1 kde Rlje H přičemž vhodné deriváty aminocukrů jsou :

2-{[cd-(aminoalkyl)karbonyl]amino}-2-deoxy-glukopyranosa, pro η - 1 až 12

2-{[o-(aminoalkyl)karbonyl]amino}-2-deoxy-galaktopyranosa, pro n = 1 až 12

2-{[ců-(aminoalkyl)karbonyl]amino}-2-deoxy-mannopyranosa, pro n = 1 až 12

HO

CH₂OH

-NH, fe

9 9 ¢6 ·« n-aminoalkyl 2-acetamido-2-deoxy-P-D-glukopyranosid η 2-10 n-aminoalkyl (P-D-galaktopyranosyl)(1^4) 2-acetamido-2-deoxy-P-D-
7. Polymerní nosič pro přípravu keratinocytů podle nároku 1 až 5 vyznačený tím, že polymerizovatelné deriváty sacharidů v rozsahu 0,0 až 60 hmot.% obsahují jednotlivě nebo v kombinaci deriváty sacharidů a disacharidů vybraných ze skupiny: 2-deoxy-2-({[n-(methakryloylamino)alkyl]karbonyl}amino)-D-glukopyranosa 2-deoxy-2-({[5-(methakryloylamino)pentyl]karbonyl}amino)-D-glukopyranosapro n=5

R?je

H₂C=C-CONH-|-CH^-CO- R = H,

CH, nje 1 až 10

2-({[n-(methakrylóylamino)alkyl]karbonyl}amino)-D-galaktopyranosapro 2-({[5-(methakryloylamino)pentyl]karbonyl}amino)-D-galaktopyranosa pro n = 5 nje 1 až 10

R?je

H₂C=C-CO-NH-^CH^k-CO- r = h, ch.

2-deoxy-2- [({[n-(methakryloylamino)alkyl]karbonyl} amino)-D-mannopyranosa

9 9 «* *w ·* «« • · · · · « « « · * « • · · · · β < · · « « » • · · · · · · · · ·· ···< ·· ·· ♦· 99

2-deoxy-2-[({[5-(methakryloylamino)pentyl]karbonyl}amino)-D-mannopyranosa pro nje 5

OH ^Rz^NH

Ό

OH

R7 je h₂c=c-conh^ch^h-co- R = H, CH, nje 1 až 10

2-methakryloyloxyethyl 2-acetylamino-2-deoxy-D-glukopyranosid (pro n je 1) n může být 1 až 3

6-deoxy-6-methakryloylamino-D-glukopyranosa

4-O-(P-D-galaktopyranosyl)-7V-(4-vinylbenzyl))(l~>4)-P-D-glukopyranosylamin

2-acetamido-4-O-(2-acetamido-2-deoxy-P-D-glukopyranosyl))(l—»4)-2-deoxy7V-4-vinylbenzoyl-3-D-gukopyranosylamin

« *0' ·* ··' ·· • '· · · - '· · :'· » 0 0 0 • · · 0 0 0·· 0 β 0 « • · 0 0 · 0 0 0 · ·· ···· ·· 00 ·· 0· n-(7V-akryloylamino)alkyl O-(P-D-galaktopyranosyl)(l—>4)-2-acetamido-2-deoxy-P-Dglukopyranosid, η = 2 - 10 n-(jV-methakryloylamino)alkyl O-(P-D-galaktopyranosyl)( 1 -»4)-2-acetamido-2-deoxy-PD-glukopyranosid, n = 2 - 10

3-(ýV-akryloylamino)ethyl O-(P-D-galaktopyranosyl))(l-»4)-2-acetamido-2-deoxy-P-Dglukopyranosid pro n = 2, R = H

R = H, CH₃
8. Polymerní nosič pro kultivaci keratinocytů podle nároku 1 až 5, vyznačený tím, že je připraven kondicionováním polymerního nosiče adsorpci biologicky aktivních sacharidů vybraných ze skupiny polysacharidů heparinu, heparan sulfátu, kyseliny hyaluronové, dále monosacharidů konjugovaných s albuminem i polymemím nosičem kyseliny glukuronové, β-D-galaktózy, P(a)-D-N-acetyl galaktozaminu, P(a)-D-N-acetyl glukozaminu, α-D-manózy, kde adsorpce probíhá při koncentraci 10-500 pg/ml fosfátového pufru fysiologického roztoku (PBS) za teploty 4° C - 37° C po dobu 1-12 hodin.