CZ76797A3 - Biosensor ke stanovení koncentrací látek inhibujících cholinesterázu - Google Patents
Biosensor ke stanovení koncentrací látek inhibujících cholinesterázu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ76797A3 CZ76797A3 CZ97767A CZ76797A CZ76797A3 CZ 76797 A3 CZ76797 A3 CZ 76797A3 CZ 97767 A CZ97767 A CZ 97767A CZ 76797 A CZ76797 A CZ 76797A CZ 76797 A3 CZ76797 A3 CZ 76797A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- parts
- electrode
- biosensor
- cholinesterase
- current
- Prior art date
Links
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 title abstract description 12
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 title abstract description 11
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 title abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 title description 15
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 239000010439 graphite Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- SMEGJBVQLJJKKX-HOTMZDKISA-N [(2R,3S,4S,5R,6R)-5-acetyloxy-3,4,6-trihydroxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O1)O)OC(=O)C)O)O SMEGJBVQLJJKKX-HOTMZDKISA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229940081735 acetylcellulose Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 claims abstract description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 102100032404 Cholinesterase Human genes 0.000 claims description 14
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 claims description 12
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims description 11
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 claims description 9
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 6
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 claims description 5
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N Sarin Chemical compound CC(C)OP(C)(F)=O DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N Soman Chemical compound CC(C)(C)C(C)OP(C)(F)=O GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010053652 Butyrylcholinesterase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 9
- MPMSMUBQXQALQI-UHFFFAOYSA-N cobalt phthalocyanine Chemical class [Co+2].C12=CC=CC=C2C(N=C2[N-]C(C3=CC=CC=C32)=N2)=NC1=NC([C]1C=CC=CC1=1)=NC=1N=C1[C]3C=CC=CC3=C2[N-]1 MPMSMUBQXQALQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WEQAAFZDJROSBF-UHFFFAOYSA-M 2-butanoylsulfanylethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CCCC(=O)SCC[N+](C)(C)C WEQAAFZDJROSBF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 4
- 101710083761 Cholinesterase Proteins 0.000 description 3
- 229940122041 Cholinesterase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- -1 platinum ester Chemical class 0.000 description 3
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- NTBLZMAMTZXLBP-UHFFFAOYSA-M 2-acetylsulfanylethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CC(=O)SCC[N+](C)(C)C NTBLZMAMTZXLBP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QEFGKSABIJCBSV-UHFFFAOYSA-M 2-butylsulfanylethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CCCCSCC[N+](C)(C)C QEFGKSABIJCBSV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 1
- 229940122601 Esterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- AWBGQVBMGBZGLS-UHFFFAOYSA-N butyrylthiocholine Chemical compound CCCC(=O)SCC[N+](C)(C)C AWBGQVBMGBZGLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000003891 environmental analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002329 esterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229960001697 physostigmine Drugs 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000003900 soil pollution Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- CTGNYPVJSIRPLG-UHFFFAOYSA-N trimethyl(2-sulfanylethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].C[N+](C)(C)CCS CTGNYPVJSIRPLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003911 water pollution Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky i’ 1 gisqg
Vynález se týká biosenzoru ke stanovení koncentraci látek j inhibdjicích j cholínesterázu, jako jsou sarín, soman nebo pesticidy na bázi organ^fCjsf^tQj a n karbamátů, obsahující pomocnou platinovou elektrodu, referentní argerÍtchloridovou j ,-· ' ‘ť'2 . i elektrodu a pracovní platinovou elektrodu; -——' i .
Dosavadní stav techniky
Sloučeniny inhibující cholínesterázu nacházej^ široké uplatnění jako bojové otravné látky ve vojenské praxi stejně jako pesticidy v zemědělství. Jedná se o látky na ' bázi organofósfátů a karbamátů. Vzhledem k tomu, že tojsou sloučeniny vyskytující se přímo v procesu produkce surovin pro výrobu potravin, stejně jako v procesu úpravy a ‘- '“ “ “Tučhóváňí^vodý^pró /spotřebu'obyvatelstvem;7předstayují-”tyto-jedno-z-největších nebezpečí, neboť, se vyznačují vysokou toxicitou již při nepatrných koncentracích. Ne‘ malý význam však mají tyto látky z ekologického hlediska, neboť se významnou měrou podílejí jak na znečištění vod, tak i půdy. . ¥ 'V oblastí vojenství se stanovení velmi nízkých koncentrací toxických organofos? fátu provádí pomocí'jednoduchých prostředků, například v armádě detekčními proužky ,š imóbílizovanými enzymy?Toto stanovení je však poměrně časově náročné, zejména u nízkých koncentrací a navíc je značně závislé na subjektivním vnímání kolorimetrické ·· - · -- , '>' ‘ ·.'' ·Λ ' · ' ....
reakce průzkumníkem, který v této době nemůže vykonávat'jinou činnost. Na druhé ' ' i * straně existují rychlé detektory těchto látek, například ionizační detektory, které jsou . však o 2 až 3 řády méně citlivé.
V oblasti analýzy pro potřeby životního'prostředí sé stanovení velmi nízkých koncentrací této skupiny pesticidů provádí ve speciálních laboratořích na speciálních přístrojích, většinou na plenových chromatografech. Zde je ale bezpodmínečné nutné l přesně určit fyzikálními metodami; zastoupení jednotlivých konkrétních pesticidů, '! .protože různé pesticidy mají velmi rozdílné toxícitní parametry. Jen tak je možno nako- j . , ’ . >
nec stanovit celkovou toxicitu vzorku./Tyto metody však vyžadují poměrně dlouhý proces úpravy vzorků před analýzou nesoucí s sebou nebezpečí značných změn koncentrací látek ve vzorcích během úprav těchto vzorků.
, .· >
Tento systém vyžaduje značné náklady na dopravu vzorků do laboratoři stejně, jako na vlastní provedení analýz. Dosud chybí přístroj, který by byl schopen podat prvotní informaci o přítomnosti pesticidů v konkrétních podmínkách, a který by mohl přispět ke zjištění znečišťujícího zdroje přímo v místě znečištění.
Vzhledem k tomu, že uvedené látky inhibují cholínesterázu, byly vyvinuty senzory využívající biochemického principu s použitím cholinesteráz.
K měření koncentrací organofosfátů byly použity skleněná elektroda s cholinesterázovou imobilizovanou membránou na preaktivované polyamidové membráně (TRAN-MINH, 1990), speciální elektroda s povrchem povlečeným vrstvou albuminu zesíťovaného glutaraldehydem a kovalentně vázanou cholinesterázou (TAGUCHI, 1990), potenciometrický biosenzor s platinovými elektrodami a cholinesterázou vpravenou pomocí škrobového mazu do polyuretanové pěny (BAUMAN, 1965), voltametrický senzor s měřením aktivity enzymu, kdy je vznikající produkt enzymového štěpení thiocholin oxidován na elektrodě s vrstvou stříbra a vrstvou rtuti (BUDNIKOV, 1983),. konduktometrický senzor s měřením změn vodivosti po preinkubaci cholinesterázy s inhibitorem (WALLACH, 1989), spektrofotometrický senzor, kdy se obdobným způsobem jako u dřívějších senzorů nechá vzniknout thiocholin a ten se následně reakcí s Ellmanovým činidlem převede na barevný produkt sledovaný spektrofotometrem (ELLMANN, 1961), fluorimetrický senzor, kde jako substrát slouží N-methylindoxylacetát, přičemž byla měřena fluorescence vzniklého produktu (GUILBAULT, 1970) nebo piezoelektrický senzor, kdy byla na krystal piezosenzoru nanesena cholinesteráza a v přítomnosti inhibitoru byla pozorována změna frekvence krystalu (GUILBAULT, 1989).
Nevýhodou metod používajících volnou cholínesterázu je značná spotřeba velmi drahého enzymu a nákladné přístrojové vybavení, například .spektrofotometr, nebo fluorimetr, Polarografické měření v inertní atmosféře elektrochemickými senzory s imobilizovanou cholinesterázou je náročné a odezvy senzorů nejsou lineárně závislé na koncentraci měřených látek.
Obecně jsou všechny tyto senzory finančně velmi náročné a poskytují výsledky až po poměrně dlouhém čase.
Je znám elektrodový systém se třemi elektrodami umístěnými na malém keramickém podkladu, přičemž systém tvoří pomocná platinová elektroda, referentní argentchoridová elektroda a pracovní platinová elektroda (KREJČÍ, 1989). Tento systém byl využíváni k amperometrickému stanovení glukózy.
Podstata vynálezu
Úkolem vynálezu je odstranit nedostatky a nevýhody stávajících řešeni a nalézt výhodný biosenzor ke stanovení koncentrací látek inhibujících cholínesterázu.
*
Tento úkol je vyřešen biosenzorem ke stanovení koncentrací látek inhibujících cholinesterázu, jako jsou sarin, soman nebo pesticidy ňa bázi organofosfátů a karbamatů, obsahujícím pomocnou platinovou elektrodou, referentní argentchloridovou elektrodou a pracovní platinovou elektrodou, podle vynálezu, jehož podstatou je, že pracovní platinová elektroda je opatřena základní grafitovou vrstvou tvořenou 2 až 8 hmotnostními díly acetylcelutózy, 86 až 94 hmotnostními díly grafitového prášku a 2 až hmotnostními díiy ftalocyanátu kobaltnatého, přičemž je na. tuto vrstvu nanesena směs sládající se z 5 až 10 objemových dílů roztoku, butyryfchoíinesterázy nebo acetylcholinesterázy o specifické aktivitě 1 až 100 nkat/μΙ, 5 až 10 objemových dílů glutar' r dialdehydu a:5 až 20 objemových dílů fosfátového pufru o pH 7 až 8,5, a koncentraci 20 až 30 mM. . .
' Výhodou biosenzoru podle vynálezu při stánóvení koncentrací Játek inhibujících cholinesterázu je, že umožňuje amperometncké stanovení a detekci těchto látek na základě anodické oxidace thiocholinu ‘pó .přídavků substrátu butyrylthiocholin. jodidu / nebo acetylthiocholin jodidu.· ‘ ' * Další výhodoů biosenzoru podlé vynálezů je použití grafitové elektrody modifikované ftalócyariátem kobaltnatým při nízkém'pracovním potenciálu pracovní elektrody, kdy lže jako substrát použít stabilnější butyrylthiocholin jodid, aniž by docházelo k , ; - /fa * ' j interferencím'zpusobenyproxidací jodidovýchaniontu ý r , . ' „ , ··*' ... .. á ' . o : * . · ‘ . ·. i . Ϊ r ’,Α' .'V ' ' ' 1 '' '··: ' > 1
Další výhodou,biosenzoru podle vynálezu jě, že umožňuje měření nebezpečných ( . ' f ·> Ěj . <’ . -i' 'i- ' * .· « ' ' y ' . ,· koncentrací látek inhibujících cholinesterázu a to jak ve vodě tak i ve vzduchu. Při stanoveni toxickýčh látek ve vzduchu jě biosenzor vetmi citlivý (mez detekovatelnosti například pro sarin 1.10'7 mg/l) a informaci přitom podává.velmi rychle (do 20 až 30 s).
Další výhodou biosenzoru je, že pří dlouhodobém 'používáni nedochází ke zrněnám vlastností pracovní grafitové elektrody,.
Další výhodou je možnost využití biosenzoru pro konstrukci automatického, malého, lehkého a přenosného přístroje pro stanovení výše uvedených toxických slour · ' čenin přímo v terénu a to jen. s minimální úpravou vzorku před stanoveními
Další výhodou je možnost citlivého’(například 1.10’7 mg/ml pro látku VX) a jed-.
noduchého stanovení organofosfátových a karbamátových sloučenin v roztoku a po zředění pufrovacím roztokem i na pevných matricích. Biosenzor rovněž umožňuje při měření nízkých koncentrací několikanásobné použití jednoho senzoru a umožňuje dlouhodobé kotinuální pozorování, například kvality vody ve vodohospodářství. .
Přehled obrázků
Obrázek 1: Popisuje průběh signálu biosenzoru během měření. Šipka S vyznačuje dobu, kdy je do systému přiveden substrát butyrylthiocholin jodid. Šipka I vyznačuje dobu, kdy je do systému přiveden inhibitor, to je látka inhibující butyrylcholínesterázu. Hodnota iss udává velikost proudu v ustáleném stavu a výraz di/dt udává směrnici poklesu proudu, která je úměrná koncentraci inhibitoru.
Obrázek 2: Ukazuje výsledky měření kalibračních křivek vybraných otravných organofosfátů při měření v roztoku. Jedná se o závislost poklesu proudu děleného proudem v ustáleném stavu na koncentraci inhibitoru v roztoku. Označení je následující: 1- látky VX, 2- sarin, 3-soman, 4-physostigmin.
Příklady provedeni vynálezu • Biosenzor, skládající se ze systému tři elektrod, kterými jsou pomocná platinová elektroda, referentni argentchloridová elektroda a pracovní platinová elektroda, která je opatřena základní grafitovou vrstvou modifikovanou ftalocyanátem kobaltnatým, přičemž na této vrstvě je nanesena reakční enzymová membrána obsahující mimo jiné butyrylcholínesterázu nebo acetylcholinesterázu, lze s výhodou použít.ke stanovení koncentrací látek inhibujících tyto enzymy.
Po sestavení biosenzoru a zaschnutí reakční enzymové membrány se biosenzor umístí do temperované nádobky se substrátem butyrylthiocholin jodidem nebo acetylthiocholin jodidem a sleduje se anodická oxidace thiocholinu v prostředí fosfátového nebo borátového pufarpH 7 až 8,5. Ťhiocholín.vzniká štěpením substrátu v.reakční en-... zymové membráně. Po dosažení ustáleného stavu v reakční cholinesterázové membráně je potom proud v tomto stavu úměrný enzymové aktivitě cholinesterázy. Pokud se v tomto okamžiku přidá do reakční směsi látka inhibující cholinesterázu, dochází postupně k irreverzibilnímu snižování enzymové aktivity, které je provázeno poklesem proudu, čehož lze využít k detekci inhibujících látek. Podíl velikosti tohoto poklesu a původní velikosti proudu v ustáleném stavu je přímo úměrný koncentraci inhibující látky v reakční směsi.
Příklad 1
Při sestavování biosenzoru se nejdříve vytvoří grafitová hmota modifikovaná ftalocyanátem kobaltnatým tak, že se ve třecí misce dokonale smísí 4 hmotnostní díly acetylcelulózy, 92 hmotnostních dílů grafitového prášku a 4 hmotnostní díly ftalocyanátu kobaltnatého na pastovitou hmotu a tato hmota se nanese na pracovní platinovou elektrodu, která je spolu s pomocnou platinovou a referentní argentchtořidovou elektrodou umístěna na malém keramickém podkladu orozměrech 10 x 25 mm a tloušce 2 mm , v takovém množství, aby se vytvořila základní grafitová vrstva modifikovaná ftalocyanátem kobaltnatým o tloušce 0,1 mm.
Poté se na tuto vrstvu nanese směs skládající se ze 7 objemových drhy? 5% roztoku hovězího sérového albuminu, 7 objemových dílů roztoku butyrylcholinestérázy o specifické aktivitě 50 nkat/μΙ, 7 objemových dílů 1 % roztoku glutardialdehydu a 12 objemových dílů fosfátového pufru o pH 7,4 a koncentraci 25 mM. Směs se nechá ve vodorovné poloze zaschnout za normální laboratorní teploty. Takto připravený biosensor se skladuje v lednici při teplotě-4 °C.
Příklady 2 až 4 - . .
' V následujících příkladech se při. sestavování, biošenzoru použije stejného postupu (viz přikladl). ./ ' ............—
Složení základní grafitové vrstvy modifikované ftalocyanátem kobaltnatým (ZGV) a enzymové membrány (EM) je ukázáno v tabulce 1.
Tabulka .1 · . . . \ '* . · .
| ZGV hmotnostní díly | EM objemové díly | |
| Příklad 2 | 6 acetylcelulózy 88 grafitového prášku , 6 ftalocyanátu kobaltna tého | 8 5% roztoku hovězího sérového albuminů . 8' butyrylcholinestérázy o specifické aktivitě 50 nkat/μΙ. 8 ,í% roztoku glutardialdehydu , 12 25 mM fosfátového pufru o pH 7,4 ' . |
| Příklad 3 | 4.acetylcelulózy 92 grafitového prášku 4 ftalocyanátu- kobaltna tého | 7 5% roztoku hovězího sérového albuminu 7 acetylcholinesterázy o specifickéaktivitě 50 nkat/μΙ 7 1% roztoku glutardialdehydu- 1 12 25 mM fosfátového pufru o pH 7,4 . . - |
| Příklad 4 | 6 acetylcelulózy 88 grafitového prášku 6 ftalocyanátu kobaltna tého | 8 5% roztoku hovězího sérového albuminu 8 acetylcholinesterázy o specifické aktivitě 50 nkat/μΙ 8 1% roztoku glutardialdehydu 12 25 mM fosfátového pufru o pH 7,4 |
Příklad 5
Sestavený biosenzor (viz příklad 1)se umístí do temperované nádobky se 3 ml 25 mM fosfátového pufru o pH 7,3· Po ustálení elektrodového proudu se přidá butyrylthiocholin jodid do výsledné koncentrace 0,5 mM. Odečte se hodnota proudu v ustáleném stavu (iss obr. 1) a poté se přidá vzorek s látkami inhibujícími cholinesterázu. Zaznamená se časová změna proudu (dr/dt, obr.1). Dochází-li k poklesu proudu, je zřejmé, že je ve vzorku přítomen inhibitor cholinesterázy, Koncentraci této látky lze určit -na základě podílu časové změny proudu po přídavku inhibující látky a velikosti proudu v ustáleném stavu, to je (di/dt)/iss dle obr. 1. Příklady kalibračních křivek pro některé inhibitory cholinesterázy ze skupiny organofosfátových sloučenin jsou uvedeny na obr. 2.
Příklad 6 .
Sestavený biosenzor (viz příklad 3 ) se umístí do temperované nádobky se 3 ml 25 mM fosfátového pufru o pH 7,3, Po ustálení elektrodového proudu se přidá acetyl· thiocholin jodid do výsledné koncentrace 0,5 mM. Odečte se hodnota proudu v ustáleném stavu (iss obr. 1) a poté se přidá vzorek s látkami inhibujícími cholinesterázu. Zaznamená se časová změna proudu (di/dt, obr.1). Dochází-li k poklesu proudu je žřejmé, že ve vzorku je přítomen inhibitor choninesterázy. Koncentraci této látky lze určit na základě podílu časové změny proudu popřídavku inhibující látky a velikosti proudu v ustáleném stavu, tj. (di/dt)/lss dle obr. 1. Příklady kalibračních křivek pro některé . inhibitory ..cholinesterázy=ze * skupiny fosforových organických 'Sloučenin“ jsou uvedeny na obr. 2. ,
Příklad 7
Biosenzor sestavený podle příkladu 1 se umístí do okruhu kapilárního okruhu kapilárního systému vedoucího ze zásobní nádoby s 50 ml 25mM fosfátového pufru o pH 7,3 s butylthiocholin jodidem o výsledné koncentraci 0,5 mM. Do tohoto okruhu je rovněž zařazen meandr s polopropustnou membránou, který uskutečňuje přechod látek inhibujících cholinesterázu, obsažených v analyzovaném vzduchu do fosfátového pufru v kapilárním systému. Po ustálení elektrodového proudu se odečte hodnčřía proudu v ' W'-;
ustáleném stavu ( iss obr.1) a poté se začne přes meandr prosávptř analyzovaná atmosféra. Zaznamená se časová změna proudu (di/dt, obr.1). Dochází^rk poklesu ’ 7 proudu je zřejmé, že ve vzorku je přítomen inhibitor cholinesterázy. Koncentraci této inhibující látky lze určit stejně jako v příkladu 5.
Průmyslová využitelnost
Biosenzor podle vynálezu lze využít v celé řadě oblastí, jako je například vojenství, zemědělství, vodohospodářství, potravinářství, ochrana životního prostředí ke stanovení koncentrací a detekci nebezpečných organofosfátů, dále pak pesticidů, které jsou na bázi organofosfátů nebo karbamátů a to nejen ve vodě a vzduchu, ale také v '' ř půdě a v potravinách. /> .·'·. ·»·-/··-
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKYBiosenzor ke stanovení koncentrací látek inhibující^cholinesterázu, jako jsou sarin, soman nebo pesticidy na bázi organofosfátů a karbamátů, obsahující pomocnou platinovou elektrodu, referentní argentchloridovou elektrodu a pracovní platinovou elektrodu, vyznačující se tím, že pracovní platinová elektroda je opatřena í‘ základní grafitovou vrstvou tvořenou 2 až 8 hmotnostními díly acetylcelulózy, 86 až 94 (v hmotnostními díly grafitového prášku a 2 až 8 hmotnostními díly ftalocyanátuV kobaltnatého, přičemž je na této vrstvě nanesena směs sládající se z 5 až 10 objemových dílů roztoku butyrylcholinesterázy nebo acetylcholinesterázy o specifické aktivitě-1- až; -100 nkat/μΙ, 5 ...až 10, objemových„dílů.-glutardialdehydu...a._5_ až_20.. objemových dílů fosfátového pufru o pH 7 až .8,5 a koncentraci 20 až 30 mM.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ97767A CZ284970B6 (cs) | 1997-03-13 | 1997-03-13 | Biosensor ke stanovení koncentrací látek inhibujících cholinesterázu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ97767A CZ284970B6 (cs) | 1997-03-13 | 1997-03-13 | Biosensor ke stanovení koncentrací látek inhibujících cholinesterázu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ76797A3 true CZ76797A3 (cs) | 1999-02-17 |
| CZ284970B6 CZ284970B6 (cs) | 1999-04-14 |
Family
ID=5462217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ97767A CZ284970B6 (cs) | 1997-03-13 | 1997-03-13 | Biosensor ke stanovení koncentrací látek inhibujících cholinesterázu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ284970B6 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3196315B1 (en) | 2016-01-19 | 2020-02-05 | ORITEST spol. s r.o. | Spherical pellets, manufacturing process of such pellets, use, and a detection tube comprising such pellets |
-
1997
- 1997-03-13 CZ CZ97767A patent/CZ284970B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ284970B6 (cs) | 1999-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Andreou et al. | A portable fiber-optic pesticide biosensor based on immobilized cholinesterase and sol–gel entrapped bromcresol purple for in-field use | |
| Diauudin et al. | A review of current advances in the detection of organophosphorus chemical warfare agents based biosensor approaches | |
| Bernabei et al. | Anticholinesterase activity measurement by a choline biosensor: application in water analysis | |
| Mulchandani et al. | Biosensor for direct determination of organophosphate nerve agents. 1. Potentiometric enzyme electrode | |
| Chouteau et al. | Development of novel conductometric biosensors based on immobilised whole cell Chlorella vulgaris microalgae | |
| Dzyadevych et al. | Early-warning electrochemical biosensor system for environmental monitoring based on enzyme inhibition | |
| Tortolini et al. | Inhibition-based biosensor for atrazine detection | |
| Palleschi et al. | Determination of organophosphorus insecticides with a choline electrochemical biosensor | |
| US5001048A (en) | Electrical biosensor containing a biological receptor immobilized and stabilized in a protein film | |
| Viveros et al. | A fluorescence-based biosensor for the detection of organophosphate pesticides and chemical warfare agents | |
| Zheng et al. | Detection of mixed organophosphorus pesticides in real samples using quantum dots/bi-enzyme assembly multilayers | |
| Arkhypova et al. | Multibiosensor based on enzyme inhibition analysis for determination of different toxic substances | |
| Nunes et al. | Acetylcholine enzyme sensor for determining methamidophos insecticide: evaluation of some genetically modified acetylcholinesterases from Drosophila melanogaster | |
| Chough et al. | Organophosphorus hydrolase‐based amperometric sensor: modulation of sensitivity and substrate selectivity | |
| Guerrieri et al. | A disposable amperometric biosensor for rapid screening of anticholinesterase activity in soil extracts | |
| Sahney et al. | A comparative study of immobilization techniques for urease on glass-pH-electrode and its application in urea detection in blood serum | |
| Schöning et al. | A capacitive field-effect sensor for the direct determination of organophosphorus pesticides | |
| EP1175509B1 (en) | Immobilized enzymes as biosensors for chemical toxins | |
| Noguer et al. | Biosensors based on enzyme inhibition: Detection of organophosphorus and carbamate insecticides and dithiocarbamate fungicides | |
| Timur et al. | Screen printed graphite biosensors based on bacterial cells | |
| Campanella et al. | Determination of triazine pesticides using a new enzyme inhibition tyrosinase OPEE operating in chloroform | |
| Pohanka et al. | Preparation and performance of a colorimetric biosensor using acetylcholinesterase and indoxylacetate for assay of nerve agents and drugs | |
| Botrè et al. | Inhibition‐based biosensors for the detection of environmental contaminants: Determination of 2, 4‐dichlorophenoxyacetic acid | |
| Campanella et al. | Analysis of several real matrices using new mono-, bi-enzymatic, or inhibition organic phase enzyme electrodes | |
| CZ76797A3 (cs) | Biosensor ke stanovení koncentrací látek inhibujících cholinesterázu |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20170313 |