CZ413199A3 - Process for preparing adenovirus vectors that do not pertain to group C - Google Patents
Process for preparing adenovirus vectors that do not pertain to group C Download PDFInfo
- Publication number
- CZ413199A3 CZ413199A3 CZ19994131A CZ413199A CZ413199A3 CZ 413199 A3 CZ413199 A3 CZ 413199A3 CZ 19994131 A CZ19994131 A CZ 19994131A CZ 413199 A CZ413199 A CZ 413199A CZ 413199 A3 CZ413199 A3 CZ 413199A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- cell
- adenovirus
- gene
- adenoviral genome
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Způsob produkce replikačně nedostatečného adenoviru, který obsahuje cizorodý gen aje nedostatečný v podstatné genové funkci oblasti El adenoviru. Tento způsob zahrnuje produkci adenoviru v buňce, která poskytuje in trans genové funkce oblastí El a E4 jednoho nebo více adenovirů, které nepatří do stejné séroskupiny, jako replikačně nedostatečný adenovirusA method for producing a replication deficient adenovirus contains a foreign gene and is insufficient in essential gene the function of the E1 region of the adenovirus. This method involves production adenovirus in a cell that provides in trans gene functions the E1 and E4 regions of one or more non-adenoviruses the same serogroup as the replication-deficient adenovirus
Description
✓ • ·· • · 1 • · • · ··· ·· • · • · · • · • · • · «Μ • · • ·
Způsob produkce vektorů adenovirů nepatřících do skupiny f
Oblast techniky
Vynález se vztahuje k produkci vektorů, které jsou vhodné k přenosu adenovirových genů, které za účelem exprese v buňkách obsahují cizorodý gen.
Dosavadní stav techniky Během zimy a jara 1952 až 1953 Rowe a jeho spolupracovníci z instituce National Institutes of Health (NIH) získali a převedli na tkáňovou kulturu adenoidy, které se chirurgicky odstranily malým dětem v oblasti Washington D.C. (Rowe et al., Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570-573 (1953)). Po několika týdnech řada kultur začala vykazovat progresivní degeneraci charakterizovanou destrukcí epiteliálních buněk. Tento cytopatický účinek se mohl sériově přenášet tekutinou filtrované kultury na stabilní tkáňové kultury lidských buněčných linií. Cytopatické činidlo bylo nazváno „adenoidní degenerační činidlo" (Ad). Nakonec se pro toto činidlo stal běžným také název „adenovirus". Po těchto počátečních zjištěních následovaly objevy řady prototypových kmenů adenovirů, z nichž některé způsobují respírační onemocnění (Rowe et al., Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570-573 (1953), Dinglě et al., Am. Rev. Respir. Dis., 97, 1-65 (1968); Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication", in: Fundamental Virology (ed. Fields et al., Raven Press Ltd. , New York, NY, 2. vyd., 1991), pp. 771-813). Všechny adenoviry si jsou podobné jak strukturou tak morfologií. Tyto viry nemají obal, tvoří pravidelné ikosaedry o průměru 65 až 80 nm, obsahující externí kapsid a vnitřní jádro. Kapsid se skládá z dvaceti trojúhelníkových stěn nebo plošek a dvanácti vrcholů (Horné et al., J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)). Plošky jsou tvořeny hexony a vrcholy pentony. Z každého vrcholu vyčnívá vlákno. Vedle hexonů, pentonů a vláken zde existuje osm menších stavebních polypeptidů, přičemž přesná poloha jejich velké části není jasná.
Virové jádro obsahuje lineární, dvouřetězcovou molekulu DNA s obrácenými koncovými repeticemi (ITR), jejichž délka u různých izolátů kolísá od 103 bp do 163 bp (Garon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394 (1972); Wolfson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057 (1972); Arrand et al., J. Mol. Biol., 128, 577-594 (1973); Steenberg et al., Nucleic Acids Res., 4, 4371-4389 (1977); Tooze, DNA Tumor Viruses (2nd ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), pp. 943-1054). ITR nesou počátky replikace DNA (Garon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394 (1972); Wolfson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057 (1972); Arrand et al., J. Mol. Biol., 128, 577-594 (1973); Steenberg et al., Nucleic Acids Res., 4, 4371-4389 (1977)).
Virová DNA je spojena se čtyřmi polypeptidy. Jsou to polypeptid V, VII, m a terminální polypeptid (TP). TP o molekulové hmotnosti 55 000 je kovalentnš spojen s 5' koncem DNA prostřednictvím dCMP (Rekosh et al., Cell, 11, 283-295 (1977); Robinson et al., Virology, 56, 54-69 (1973)). Další tři polypeptidy jsou nekovalentně vázány k DNA a balí se takovým způsobem, že se vejdou do malého objemu kapsidu. DNA se balí do struktury, která je podobná buněčnému nukleozómu, což je patrné z paternů štěpení nukleázou (Corden et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 73, 401-404 (1976); Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785 (1979); Mirza et al., Biochim. Biophys. Acta, 696, 76-86 (1982)) .
Vedle různých fyzikálních podobností, které charakterizují adenoviry, se tyto viry rozdělují do sub-divizí s ohledem na určitá kritéria, které zahrnují imunologickou reaktivitu, onkogenicitu a obsah GC v genomu daného kmene (Horwitz, 3 3 • ·
·· «· • · · · • · · · • · · · · • · · · „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), str 777). Mezi izoláty lidských adenovirů se například izolovalo přes 40 sérotypů a čtyři hemoglutinační skupiny. Následuje tabulka shrnující klasifikaci lidských adenovirů, jak se popisuje v publikaci (Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), str 777).
Onkogenní potenciál Podskupina Hemaglutina ční skupina Sérotyp Nádory u zvířat Transform ace v tkáňový ch kulturách Procento G . + C v DNA A IV(málo nebo neaglutinuj e) 12, 18, 31 Vysoký + 48 - 49 B I(úplná aglutinace opičích erytrocytů) 3, 7, 11, 14, 16 21, 34, 35 Střední + 50 - 52 C III(částečn á aglutinace krysích erytocytů) 1, 2, 5, 6 Nízký nebo žádný + 57 - 59 D II(úplná aglutinace krysích erytrocytů) 8, 9, 19 37, 10 13, 15 17, 19 20, 22-30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42 Nízký nebo žádný + 57 - .61 E III 4 Nízký nebo žádný + 57 - 59 F III 40, 41 Není znám 4
«· · ·· Μ • · · · · * · · • · I · ♦ · · «· #····· • · · · · · · «· · · · · · · · V minulosti se nejvíce pozornosti věnovalo studiu adenovirových sérotypů Ad2 a Ad5, které se zcela sekvenovaly. Zjistilo se, že celá organizace adenovirového genomu je konzervativní mezi sérotypy tak, že specifické funkce mají podobné pozice. Sekvenovaly se také části jiných sérotypů, přičemž se dospělo k výsledku, který odpovídá hypotéze konzervativní genetické organizaci mezi adenoviry. Adenoviry vykazují na genetické úrovni podstatnou rozdílnost. Virové izoláty z různých skupin adenovirů vykazují v genomech různé . obsahy GC.Studie hybridizace DNA-DNA ukazují, že zde existuje méně než 20 % homologie . mezi DNA různých skupin, ačkoli podrobnější analýza ukázala, že ve srovnání se segmenty sub-genomu, se detekovaly konzervativní sekvence. Například při studiu až 30 mapovacích jednotek délky DNA se zjistilo, že alespoň 20 až 50 % sekvence DNA se mezi skupinami liší (Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), str 777). Při jiné studii sekvence počátku replikace subtypů spojených s každou ze šesti skupin adenovirů se zjistilo, že tyto adenoviry jsou příbuzný ale odlišují se.
Je důležité poznamenat, ačkoli to zůstává nevysvětleno, že mezi adenoviry různých skupin nedochází k ' rekombinaci v případě, že se objeví v hostiteli ko-infekce. Naopak adenoviry ve skupině se účinně rekombinují (Sambrook et al., J. Mol. Biol. 97, 369-390, (1975)). Neschopnost adenovirů rekombinovat se mezi séroskupinami ukazuje na genetické rozdílnosti adenovirových skupin. Základní fyziologie adenovirové infekce se studovala ohledem na Ad2 a Ad5. Z této studie vyplynulo, že adenoviry začínají infikovat buňku zachycením vlákna na specifickém receptoru na buněčné membráně (Londberg-Holm et al., J. Virol., 4, 323-338 (1969); Morgan et al., J. Virol., 4, 777-796 (1969); Pastan et al., „Adenovirus entry into cells: some new obsarvations on an old problém" in Concepts in Viral Pathogenesis, Notkins et al., eds7 Springer-Verlag, New York, NY, pp. 141-146 (1987)). Pentonová báze se pak váže na buněčný receptor integrinu. Virus vázaný na receptoru pak migruje z plazmatické membrány do klatrinem potažených jamek, které tvoři endocytické vesikuly nebo receptozómy, kde hodnota pH klesne na 5,5. Pří poklesu hodnoty pH se pravděpodobně změní povrchová konfigurace viru, což vede k ruptuře receptozómů a k uvolnění viru do cytoplazmy buňky.
Když virus dosáhne jaderných pórů, virová DNA vstupuje do jádra, přičemž většina zbývajících proteinů zůstává v cytoplazmě (Philipson et al., J. Virol., 2, 1064-1075 (1968)). Virová DNA však není zcela bez proteinu, protože alespoň část virové DNA je spojena s alespoň čtyřmi virovými polypeptidy, jmenovitě s polypeptidy V, VII, TP a m, a přeměňuje se na komplex DNA-buněčný histon (Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785 (1979)).
Cyklus od infekce buňky do produkce virových částic trvá 1 až 2 dny a výsledkem je produkce až 10 000 infekčních částic na jednu buňku (Green et al., Virology, 13, 169-176 (1961)).
Proces infekce adenovirů se rozděluje na časnou (E) a pozdní (L) fázi, které jsou odděleny replikací DNA, ačkoli některé pochody, které probíhají během časné fáze také probíhají v pozdní fázi a naopak. Za účelem úplného popsání dočasné exprese virových genů se provedlo další dělení adenovirových genetických oblastí do subdivizí. Během časné fáze se virová mediátorová (mRNA), která zahrnuje minoritní část celkové RNA přítomné v buňce, syntetizuje z obou řetězců adenovirové DNA přítomné v jádru buňky. Popisuje se alespoň pět oblastí označených El, E2, E3, E4 a MLP-L1 (Lewis et al., Cell, 7, 141-151 (1976); Sharp et al., Virology, 75, 442-456 (1976); Sharp, „Adenovirus transcription," in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenům Press, New York, NY, pp. 173-204 (1984)). Každá oblast má alespoň jeden odlišný promotor a zpracovává se za vzniku více specie mRNA.
Produkty časných oblasti (E) : (1) slouží jako regulátory exprese jiných virových komponentů, (2) obecně se podílí na ukončení replikace buněčné DNA a syntéze proteinů a (3) jsou nutné při replikaci virové DNA. Složité série jevů regulující časnou transkripci mRNA začínají expresí jistých bezprostředně časných oblastí, které zahrnují AlA, Ll a gen o velikosti 13 500 (Sharp, „Adenovirus transcription," in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenům Press, New York, NY, pp. 173-204 (1984); Horwitz, „Adenovirídae and Their Replication," in Eundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813)).Exprese opožděných časných oblastí ElB, E2A, E2B, E3 a E4 závisí na produktech genu E1A. Tři promotory (promotor E2 tvoří 72 jednotek mapy („mu"), promotor proteinu IX a promotor IVa) jsou posíleny replikací DNA, ale nejsou na ní závislý (Wilson et al., Virology, 94, 175-184 (1979)). Jejich exprese charakterizuje střední fázi exprese virových genů. Výsledkem exprese kaskády exprese časných genů je počátek replikace virové DNA.
Replikace adenovirové DNA nahrazuje jeden rodičovský řetězec kontinuální syntézou ve směru od 5'-konce do 3'-konce od počátku replikace do konce genomu (popisuje se v publikaci Kelly et al., „Initiation of viral DNA replication," in Advances in Virus Research, Maramorosch et al., eds., Academie Press, lne., San Diego, CA, 34, 1-42 (1980); Horwitz et al., in Virology, Raven Press, New Yo_rk, 2, 1679-1721 (1990); van der Vliet, „Adenovirus DNA replication in vitro," in The Eukaryotic Nucleus, Straus et al., eds., Telford Press, Caldwell, NJ, 1, 1-29 (1990)). Tři virové proteiny kódované E2 jsou podstatné při syntéze adenovirové DNA: (1) protein vázající se na jednořetězcovou DNA (DBP), (2) adenovirové DNA polymeráza (Ad pol) a (3) pre-terminální protein (pTP) . Vedle těchto proteinů experimenty in vitro ukázaly, že existuje řada ·· · • ·
+ »· · · · « · · · ··· ·♦ ·· ··· ·♦ ♦· faktorů hostitelské buňky, které jsou nezbytné pro syntézu DNA.
Syntéza DNA se iniciuje kovalentním navázáním molekuly x.-- dCMP na serinový zbytek pTP. Komplex pTP-DCMP, pak funguje jako primer pro elongaci Ad pol. Rodičovský jeden řetězec může párováním baží obrácených terminálních repetic tvořit miskovitou strukturu. Tato terminální duplexová struktura je stejná s konci rodičovského genomu a může sloužit jako počátek pro iniciaci syntézy komplementárních řetězců. Počátek replikace virové DNA je zřejmě podstatný pro vstup do pozdní fáze. Pozdní fáze virové infekce se charakterizuje produkcí velkého množství virových strukturních polypeptidů a néstrukturních proteinů, které se podílejí na sestavení kapsidu. Hlavní pozdní promotor (MLP) se stává plně aktivní a produkuje transkripty, které začínají v 16,5 mu a končí blízko konce genomu. Post-transkripční zpracování uvedeného dlouhého transkriptu dává vzniku pěti rodinám pozdní mRNA označených jako LI až L5 (Shaw et al., Cell, 22, 905-916 (1980)). Mechanizmy, které řídí posun z časné fáze do pozdní, a výsledky takových dramatického posunu v transkripčnim využití nejsou jasné. Požadavek replikace DNA může být vlastnost cis templátové DNA, protože nedojde k pozdní transkripci z superinfekčního viru v době, kdy je aktivní pozdní transkripce primárně infekčního viru (Thomas et al., Cell, 22, 523-533 (1980)). Tvorba virionů je složitý proces. V prvním kroku dochází k uspořádání hlavních strukturních jednotek z jednotlivých polypeptidových řetězců (popisuje se v publikaci Philipson, „Adenovirus Assembly," in The
Adenoviruses, Ginsbrg, ed., Plenům Press, New York, NY (1984), pp. 309-337; Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991)) . Hexonová a pentonová báze a vlákno uspořádané do trimérového homopolyméru se tvoří po syntéze v cytoplazmě. Protein o velikosti 100 000 funguje jako 8 • ·· ·· ·· · · · · • · · · · • · · · · · • · · ♦ · ♦ ·♦ ·· ·· • ·· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ··» ·♦ ♦♦ lešení v případě hexonové trimerizace a výsledný hexonový trimér se nazývá hexonový kapsomér. Hexonové kapsoméry se mohou samostatně sestavit za vzniku skořápky prázdného kapsidu a pentonová báze a vláknité triméry se mohou kombinovat za vzniku pentonu, kdy komponenty jsou uvnitř jádra. |p//\&ka ikosaědrx^ se skládá ze tří hexonových. kapsomérů, které je možné spatřit na základě disociace kapsidu, ale střední krok tvorby skupiny devíti hexonů nebyl pozorován. V experimentech s mutanty citlivými na teplotu se pozorovalo několik
meziproduktů. Progrese uspořádání kapsidu se jeví závislá na proteinu, který slouží jako lešení pro balení. Tento protein má molekulovou hmotnost 50 000 až 30 000. Samotná DNA s největší pravděpodobností vstupuje do kapsidu tím, že se otevře v jednom vrcholu. Poslední krok postupu zahrnuje proteolytické trimování prekurzorových polypeptidů pVI, pVII, pVIII a pTP, které stabilizují strukturu kapsidu, což způsobuje, že DNA není citlivá k ošetření nukleázou a výsledkem je úplný virion.
Replikačně deficitní adenoviry jsou známy, že nacházejí různá využití. Replikačně deficitní adenovirus se může například použít při transferu genů a jiných · genetických elementů, jako jsou ribozómy, antimediátorová RNA a segmenty DNA, které se exprimují podobným způsobem, do buněk in vivo a in vitro. Použití in vivo také zahrnuje geneticky pozměněné buňky, které jsou vhodné pro diagnostické a léčebné účely a studium biologických jevů, jako jsou poločas rozpadu proteinů regulujících elementy, rychlost transkripce a funkce proteinu. Použití in vitro dále zahrnuje studii biologického jevu uvedeného shora v textu a může být také výhodné, protože umožňuje přesnější řízení experimentálních podmínek.
Jisté rekombinantní adenovirové vektory se mohou použít v genové terapii, zvláště Ad2 a Ad5, přičemž oba viry jsou členy skupiny C. Použití rekombinantního adenovirového vektoru k přenosu jednoho nebo více rekombinantních genů umožňuje cílené zavádění genu nebo genů do orgánu, tkáně nebo buněk v případě potřeby léčby, přičemž se obchází problém zavádění, ke kterému dochází při většině formách somatické genové terapii. Dále rekombinantní adenovirové vektory nevyžadují v případě exprese adenovirových proteinů proliferaci hostitelských buněk kmene (Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988)). Jestliže orgánem, který vyžaduje léčbu jsou plíce, pak použití adenoviru jako vektoru pro genetickou informaci je výhodné, protože adenovirus je v normálním případě trofický pro respirační epitel (Straus, in Adenoviruses, Penum Press, New York, pp. 451-496 (1984)).
Jiné výhody adenovirů jako vektorů v případě genové terapie u lidí jsou: (i) v řídkých případech dochází b k rekonfinaci; (li) adenovirový genom (kterým je lineární, dvouřetězcová DNA) může být současně manipulována, aby nesla cizorodé geny, jejichž velikost je v rozmezí alespoň 7,5 kb; (iii) adenovirový vektor nezačleňuje svou DNA do chromozómu buňky, to znamená, že jeho účinek je dočasný a není pravděpodobné, že interferuje s normální funkcí buňky; (iv) adenovirus může infikovat nedělící se nebo terminálně diferenciované buňky, jako jsou buňky mozku a plic a (v) živý adenovirus, jehož podstatnou charakteristikou je schopnost se replikovat, má bezpečné využití při použití v lidských vakcínách (Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), Berkner et al. , J. Virol., 61, 1213-1220 (1987); Straus et al., eds., Telford Press, Caldwell, NJ, 1, 1-29 (1990); Chanock et al., JAMA, 195, 151 (1966); Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57, 267 (1986);
Ballay et al., EMBO, 4, 3861 (1985)). m 0m ** »* « · · · · • · I · * • · ♦ t · · • · · · * ·»* ·· *· · 10
Cizorodé geny se začlenily do různých hlavních oblastí genomu adenovirů skupiny C za účelem použiti jako expresívnich vektorů. Nejběžněji se používají oblasti El, E3 a E4. Tímto způsobem vzniká jednoduše deficitní adenovirus a vektory z něho odvozené. Začlenění do oblasti El adenovirů vede ke vzniku defektivního progenu, který požaduje buď kultivaci v komplementárních buňkách nebo přítomnost pomocného viru, který poskytuje funkci in trans nebo nemá oblast El (Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988); Davidson et al., J. Virol., 61, 1226-1239 (1987); Mansour et al., Mol. Cell Biol., 6, 2684- 2694 (1986)). Příklady buněčných linií, které doplňují nedostatek podstatných adenovirových genových funkcí, zahrnují buňky ledvin lidského embrya, které jsou známy jako HEK-293 (Graham et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 39, 637-650 (1975))., buňky W162 (popisují v publikaci Weinberg et
al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 5383-5386 (1983)), gMDBP (Klessig et al., Mol. Cell. Biol., 4, 1354-1362 (1984); Brough et al., Virology, 190, 624-634 (1992)) a buňky 293/ORF6 (popisuje se v dokumentu WO 95/34671, Kovesdi et al.). V případě exprese cizorodé nukleové kyseliny se nej častěji používá oblast genomu El. Geny začleněné do oblasti El jsou řízeny různými promotory a geny v závislosti na expresívní kazetě produkují velké množství cizorodého produktu.
Oblast E3 není podstatná pro růst viru v tkáňové kultuře a nahrazení této oblasti expresívní kazetou obsahující cizorodou nukleovou kyselinu vede ke vzniku viru, který produktivně roste v nekomplementační buněčné linii. Například se popisuje začlenění a exprese povrchového antigenu hepatitidy B do oblasti E3 viru sérotypu Ad5, následná inokulace a tvorba protilátek u křečků (Morin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 4626-4630 (1987)). Také se popisuje analogová nedostatečnost E3 u sérotypů Ad4 a Ad7 (s ohledem na Ad4 se popisuje v publikaci Chengalvala et al., Vaccine, 9, 485-490 (1991); s ohledem na Ad7 se popisuje v publikaci Lindley et 11 • * ♦ 9 v al., Gene, 138, 165-170 (1994) a Chengalvala et al., J. Gen. Virol., 75, 125-131 (1994)). V oboru adenovirové genové terapie se v klinických studiích dodnes používaly pouze dva shora uvedené sérotypy skupiny C. Jsou to Ad2 a Ad5. Příklady takových studií se popisují v publikacích Davidson et al., Nátuře, 3, 219 (1993) a Mastrangeli et al., J. Clin. Invest., 91, 225-234 (1993).
Současné studie se zaměřují na sérotypy skupiny C s ohledem na skutečnost, že většina hlavních výzkumných projektů se soustředí na Ad2 a Ad5. (popisuje se v publikaci Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813)a také The Adenoviruses (Ginsberg, ed., Plenům Press,
New York, NY, 1984). Tyto studie ukazují, že adenoviry skupiny / C jsou výjimečně účinná jako nástroje pro zavádění do různých cílových tkání, které zahrnují například rešpirační epitel (popisuje se v publikaci Bajocchi et al., Nátuře Genetics, 3, 229-23# (1993)) .
Existují však omezení při použití vektorů při genové terapii adenoviry skupiny C. U hostitele může dojít k imunitní odezvě na určitý adenovirový vektor, který se používá při genové terapii, což je výsledkem přirozeného vystavení hostitele stejnému typu adenoviru dříve než došlo k započetí genové terapie nebo to může být výsledek vystavení hostitele působení adenovirového vektoru v průběhu samotné genové terapie. Buněčná imunitní odezva může zkrátit' dobu života buněk infikovaných adenovirovým vektorem a tím redukovat expresi cizorodé nukleové kyseliny a tak omezit účinnost genové terapie. Je nutné poznamenat, že hlavní omezení současně používaných systémů genové terapie adenovirů skupiny C je krátké trvání získané exprese genů (popisuje se v publikaci Crystal et al., Nátuře Genetics, 8, 42-51 (1994).
Humorální imunitní odpověď, jejímž výsledkem je produkce protilátek, může podstatně snížit účinnost genové terapie používající určitý adenovirový vektor. Je zřejmé, že tato 12
neutralizace adenoviru narušuje genovou terapii a in vivo použiti adenovirových vektorů při aplikacích při biologickém výzkumu. V řadě aplikací je možné použít replikačně deficitní adenovirus určitého sérotypu. Důvodů je více. Jeden sérotyp například adenoviru podle definice není reaktivní s adenovirem jiného sérotypu. Proto v případě, že savci, mezi něž patří lidé, se vystaví působení jednoho sérotypu adenoviru, dojde k imunitní reakci, která je specifická pro uvedený kmen adenoviru, ale nikoli pro odlišné kmeny. Pak se tyto odlišné kmeny mohou použít, aby se zabránilo humorálním a buněčným imunitním odezvám, které jsou specifické pro jiné adenoviry. Různé sérotypy adenovirů jsou trofické pro odlišné typy buněk. Tak replikačně deficitní adenovirus, který je vhodný pro přenos cizorodých genů do buňky jednoho typu je méně vhodný než druhý adenovirus, který se používá při přenosu uvedeného cizorodého genu do druhého typu buňky. Existuje proto požadavek na vytvoření replikačně deficitního adenoviru vhodného pro více kmenů. Avšak, jestliže každý adenovirový kmen požaduje své vlastní komplementární buňky nebo dokonce, zda se uvedená komplementační buňka zkonstruovala ko-infekcí s pomocným vírem, pak proces produkce nové komplementační buněčné linie pro každý adenovirový sérotyp bude velmi nákladný a náročný na čas. Tudíž se popisuje způsob produkce vektorů adenovirů, které nepatří do skupiny C, což je předmětem US patentu 5,837,511. Tento patent popisuje, že komplementární buněčné linie, jako je HEK-293, které se připravují nebo se mohou připravovat za účelem doplnění replikační nedostatečnosti u vektorů skupiny C, se mohou překvapivě použít pro komplementaci produkce vektorů adenovirů, které nespadají do skupiny C. Použití takových komplemenatčních buněčných linií vhodných pro komplementaci růstu vektorů, které nespadají do skupiny C, vede ke slabé komplementaci. Naneštěstí při této slabé komplementaci je • ·· ·· ι · · ·· ·· « · · ··· · ·· « ··· # · · ···« • t ♦ · · · · · · · ♦ · • · · · * · U · · · ··· ·· «· «·· ·· ·· 13 obtížné získat zásobní roztoky (to znamená nekontaminovaný virus divokého typu) El-deficitních vektorů adenovirů, které nespadají do sérotypu skupiny C. To platí, zvláště, když použití homologní rekombinace izolovaného ramene viru se používá při přípravě El-deficitních vektorů, které nespadají do skupiny C.
Navíc produkce adenovirových vektorů skupiny C v doplňujících buněčných liniích vyvinutých pro adenoviry nespadající do skupiny C je použitelná, protože rekombinace mezi genomem doplňující buněčné linie a adenovirem skupiny C je velmi nevýhodná.
Vzhledem k tomu je nutné zdokonalit způsob produkce El-deficitních adenovirových vektorů, zvláště, kde nedostatečnost El vede k replikační nedostatečnosti. Vynález hledá způsob konstrukce a produkce takových vektorů.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje způsob produkce replikačně deficitního adenovirů, který obsahuje cizorodý gen a nedostatečnost v podstatné genové funkci oblasti El. Uvedený způsob zahrnuje produkci adenovirů v buňce, která poskytuje in trans genové funkce oblastí El a E4 jednoho nebo více adenovirů, které nepatří do stejné séroskupiny jako replikačně deficitní adenovirus. Vynález dále popisuje adenoviry produkované v souladu s vynálezem.
Vynález popisuje způsob produkce replikačně deficitního adenovirů, který je deficitní v oblastí El adenovirového genomu, který obsahuje cizorodý gen odstraňující potřebu separace komplementačních buněk pro každý adenovirový kmen.
El deficitní adenoviry skupiny C účinně rostou v buňkách, které poskytují in trans deficitní důležitý genový produkt. Tento produkt se získal z adenovirů stejného nebo podobného sérotypu (např. El deficitní Ad2 a Ad5 rostou dobře v buňkách 293). Navíc buňky, které účinně doplňují podstatné genové 14 14
··· ·· · ♦ · · · ««t · · » · ··· «· · · funkční defekty, jednoho určitého sérotypu adenoviru nejsou nezbytně účinné při komplementaci růstu replikačně deficitních adenovirů jiných sérotypů. El deficitní Ad5 (séroskupiny C) se kultivuje podstatně lépe v buňkách 293, než v homologní E7 deficitní Ad7 (séroskupiny B) . Věří se, že protože El genové produkty v buňkách 293 se získaly z adenoviru skupiny C, buňky 293 jsou schopny více doplnit růst adenovirů skupiny C než jiných adenovirů. Při způsobu podle vynálezu replikačně deficitní virus, jehož genom je deficitní v podstatné genové funkci oblasti El adenovirového genomu (nebo segmentů DNA obsahujících genom replikačně deficitního adenoviru), se přenese do komplementační buňky. Jestliže genom nese více jak jeden segment DNA, . v buňce dochází k homologní rekombinaci nebo k ligaci DNA za účelem produkce replikačně deficitního adenovirového genomu. V jiném případě replikačně deficitní adenovirus se může vnést do buňky infekcí nebo jeho DNA se může začlenit do buňky libovolným vhodným transfekčním postupem, který je znám v oboru (například elektroporací). Komplementační buňka poskytuje in trans: jednu nebo více podstatných genových funkcí oblasti El adenovirového genomu a jednu nebo více genových funkcí oblasti E4 adenovirového genomu. Toto opatření in trans obou funkcí El a E4 v buňce překvapivě, spíše než pouze funkce El, umožňuje posílit produkci replikačně deficitního adenoviru, přičemž sérotyp adenoviru, ze kterého je podstatný El produkt poskytovaný in trans je odvozen, a sérotyp replikačně deficitního adenoviru spadají do různých séroskupin. Buňka obsahující genom replikačně deficitního adenoviru se pak udržuje v kultuře po dobu, která je dostatečně dlouhá, aby vznikl replikačně deficitní adenovirus. Replikačně deficitní adenovirus se může sklízet libovolným vhodným způsobem za vzniku zásobního roztoku replikačně deficitního adenoviru. 15 • ·
I • Μ » · β# " ·· * · • # • I · · * · i»· ·· * · ·· Věří se, že produkt genu E4 a podstatný produkt genu El funkčně interaguje s více doplněným adenovirem. Schopnost funkčně interagovat se jeví v sérotypech séroskupiny být absolutně konzervativní, ale méně konzervativní je mezi odlišnými sérotypy séroskupiny a není konzervativní mezi viry různých séroskupin. V některých provedeních vynálezu se preferuje, že důležité genové produkty oblastí El a E4 adenovirového genomu se odvodily ze séroskupiny a dokonce se více preferuje, že se získaly ze stejného sérotypu.
Oblast E4 obsahuje pouze jednu podstatnou genovou funkci , ale tato funkce je alespoň částečně redundantní v oblasti E4 adenovirového genomu. Zatímco genová funkce E4/ORF6 se často zmiňuje jako podstatná genová funkce oblasti E4 adenovirového genomu, tento pohled se může v některých ohledech příliš zjednodušovat. Genová funkce E4/ORF3 může částečně nahradit produkt genu E4/OR6. Navíc E4/ORF6/7 se může definovat jako podstatná funkce genu E4. Komplementace a jiné studie ukázaly, že funkce jednoho genu oblasti E4, která je nezbytná a optimálně doplňuje deleci celé oblasti E4 je 0RF6. Důležitá funkce genu oblasti E4 adenovirového genomu, který je ve formě in trans, je v řadě provedení vynálezu přednostně funkcí genu E4/ORF6. Věří se, že genový produkt 0RF6 interaguje s genovým produktem oblasti E1B adenovirového genomu. Podstatná genová funkce oblasti El adenovirového genomu, která je ve formě in trans, je v mnoha provedeních podle vynálezu přednostně genovou funkcí E1B.
Genový produkt E1B je také znám, že interaguje s nepodstatným genovým produktem E4/ORF4. Vynález také popisuje, že genový produkt E4 vyskytující se in trans v komplementační buňce je genový produkt E4/ORF4. Často je možné použít buněčnou linii, která poskytuje genové funkce oblastí El a E4 z DNA, která je stabilně začleněna do buňky, zvláště do genomu buňky. Takové buněčné 16 • · ··» ·♦ linie řeší potřebu vzniku komplementačni buněčné linie pokaždé, kdy se odborník rozhodne vytvořit replikačně deficitní adenovirus. V jiném případě libovolná genová funkce oblasti El nebo E4 se může stabilně začlenit do buňky, která pak bude vyžadovat dočasné opatření jiné genové funkce. To je možné nejjednodušeji ilustrovat v dobře známých buňkách buněčné linie HEK-293, která obsahuje podstatné genové funkce oblasti El. Pomocný virus exprimující E4/ORF6 v buňce 293 napomůže vzniku komplementární buňky. V jiném případě buněčná linie 293/ORF6 se může použít jako komplementačni buněčná linie použitelná podle vynálezu. V oboru jsou dobře známy technologie produkce buňky 293/ORF6 a jiných buněk, které mají stabilně začleněnou a exprimují DNA schopnou poskytovat El a E4 podstatné genové funkce. Tyto technologie se popisují například v dokumentu mezinárodní patentová přihláška WO 95/34671 (Kovesdi et al.).
Dokument WO 95/34671 popisuje, že komplementačni buněčné linie vhodné pro replikaci deficitních adenovirů, které nemají oblasti El a E4 adenovirového genomu, se mohou produkovat začleněním segmentů DNA kódujících podstatné genové produkty do genomu buněčné linie. Tyto segmenty DNA jsou operativně spojeny s promotory, které řídí expresi dostatečného množství genového produktu (ů), což umožňuje ' replikaci replikačně deficitního adenovirů (El(—), E4(-)).. Dokument WO 95/34671 také uvádí, že podstatné genové funkce oblasti E4 poškozují hostitelskou buňku. Proto je vhodné použít regulovatelný promotor tak, že genová funkce oblasti E4 může vzniknout pouze když replikačně nedostatečný adenovirus potřebuje toxický genový produkt pro svou replikaci. V podobném případě podstatné genové funkce oblasti El ovlivňují charakteristiky hostitelských buněk. Proto je také vhodné umístit El genové funkce tak, aby byly řízeny regulovatelným promotorem.
Zatímco existují zřejmé výhody stabilního začlenění genových funkcí El a E4 do komplementačních buněk, existují « «· <*· ♦ ·♦ · ♦ *·# ♦ · ··· * · · * ··· ·· · ·«·· ·· t t # Ψ Ψ » · ·· · »·· * · · · * · · «·· ·« ·· ··· ·* ·· 17 také důvody, že toto začlenění může být dočasné. Například alespoň jedna podstatná genová funkce oblasti El a jedna genová funkce oblasti E4 adenovirového genomu se může poskytnout pomocným virem ve formě in trans. Pomocný virus produkuje tyto genové funkce, když infikuje buňku. V podobném případě komplementační buňka se může vytvořit transfekcí hostitelské buňky plazmidy nebo jinými částmi DNA. V tomto nebo v jiném libovolném provedeni vynálezu se upřednostňuje, aby se použila transfekce nebo infekce. V jiném případě transfekované buňky se umístí pod selekční tlak, což znamená například použití antibiotik spolu s plazmidem, který nese gen rezistence na antibiotika. Podstatné výhody dočasně začleněné DNA kódující komplementační genové funkce zahrnují, ale nejsou omezeny na to, že se neudrží v buněčné linii a · dochází k relativně rychlému vývoji komplementační buňky. V souladu se shora uvedeným popisem DNA obsahující replikačně nedostatečný adenovirový genom se může přenést do komplementační buňky infekcí. Tento způsob zavedení DNA, která obsahuje adenovirový genom, do komplementační buňky je zvláště použitelný, jestliže určitý adenovirový zásobní roztok obsahuje oba požadované replikačně nedostatečné adenoviry a jiný typ adenoviru. V tomto případě požadovaný replikačně nedostatečný adenovirus prvního sérotypu se může jednodušeji čistit pomocí plaků, protože komplementační buňka poskytuje jak podstatnou oblast El a podstatné genové produkty oblasti E4 druhého (nebo druhého a třetího) sérotypu. Poměr částice ku počtu jednotek tvořících plaky podstatně klesá. Pokles je přibližně 3 až 5-ti násobný. Pokles uvedeného poměru (v případě replikačně deficitního adenoviru) znamená, že kontaminující virus (to znamená požadovaný replikačně nedostatečný adenovirus) je s nižší pravděpodobností přítomen v daném plaku. Pokles uvedeného poměru dále ukazuje, že se zvýšil stupeň komplementace nedostatečnosti replikačně nedostatečného adenoviru. Vynález dále popisuje zdokonalený 18 způsob čištěni plaky replikačně nedostatečného adenoviru produkovaného v komplementační buněčné linii exprimujíci komplementační podstatnou genovou funkci adenoviru patřícího k odlišné séroskupině.
Jiný způsob přenosu DNA, která obsahuje replikačně deficitní adenovirový genom, do komplementační buňky je transfekce. Provedení vynálezu uvedeného způsobu Ž&b^ňuje transfekci, kde adenovirový genom je dostupný alespoň ve formě dvou oddělených segmentů DNA. V tomto provedení vynálezu se může v jednom kroku replikačně deficitní adenovirový genom připravit, pomnožit a zabalit. Dříve se vyvinulo několik buněčných linií, které doplňují nedostatečnost podstatných genových funkcí Ad2 nebo Ad5, které patří mezi adenoviry skupiny C. Tyto buněčné linie zvláště zahrnují ty linie, které doplňují nedostatečnost podstatných El genových funkcí. Jsou to například buňky HEK-293 a 293/ORF6. V souladu s vynálezem tyto buněčné linie, zvláště pak ty, které doplňují podstatnou funkci genu E1A, umožňují vytvořit v buněčné linii vhodné pro pomnožení -adenovirů skupiny C replikačně nedostatečný adenovirus, který reaguje s protilátkami specifickými pro adenoviry skupiny. A, D, E nebo F. Není však nutné, aby reagovaly s protilátkami, které jsou schopné neutralizovat infekci adenoviru skupiny C. Termín „neutralizace" znamená schopnost protilátek, které jsou schopny se vázat ve stechiometrickém množství na virus (to znamená 1 protilátka na 1 částici viru), aby došlo k prevenci infekce vhodné hostitelské buňky, jenž je vhodná pro tento virus. Tento replikačně nedostatečný adenovirus se charakterizuje začleněním segmentu adenovirové DNA izolované z adenoviru nebo segmentu, který je podstatně homologní se segmentem DNA získaným z adenoviru. Adenovirus může také ovšem nést cizorodý gen.
Zatímco segment adenovirové DNA, která tvoří část adenovirového vektoru se přednostně izoluje z adenoviru, 19 4 #· • # · segment adenovirové DNA může být také podstatně homologni k segmentu DNA, jenž je obsažen v takovém adenoviru. Termín „podstatně homologni" znamená schopnost dvou nukleových kyselin hybridizovat za alespoň středně přísných hybridizačních podmínek. Přísnost hybridizace je odborný termín, který značí podmínky používané při hybridizační reakci. Komplementární jednoduché řetězce nukleové kyseliny se spojují jeden s druhým za vzniku dvouřetězcové nukleové kyseliny s určitým stupněm chybného párování. Stupeň chybného párování je funkcí používané přísnosti. Přísnost bude zvláště záviset na velikosti a složení řetězců nukleové kyseliny, které spolu reagují, na možném stupni chybného párování, na požadované zkřížené reaktivitě a podobně. Stupeň přísnosti se může ovlivnit mezi jinými použitými iontovými podmínkami a teplotou (popisuje se v publikaci Sambrook ét al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yo rk). V souladu s vynálezem specifikovaná přísnost hybridizace částečně definuje segment DNA. Proto · je vhodné, aby hybridizační podmínky byly alespoň středně přísné nebo přísné. V dosavadních případech se vhodné podmínky, to znamená obsah solí, teplota, složení reakční směsi a velikosti nukleové kyseliny, stanovují na základě znalostí tak, aby došlo přibližně 45 % až 80 % nesprávného párování sekvence nukleotidů nukleové kyseliny. Upřednostňuje se, aby sé použily takové hybridizační podmínky, při kterých dochází přibližně k 55 % až 75 % chybného párování. Více se upřednostňují takové podmínky, kdy dochází přibližně k 60 % až 70 % chybného párování. V pozdějším případě vhodné podmínky pro hybridizaci jsou stanoveny na základě běžných znalostí tak, aby došlo ke vzniku přibližně 10 % až 40 % nesprávného párování. Upřednostňuje se, aby se použily přísné hybridizační podmínky, které poskytují přibližně 20 % až 40 % chybného párování. Více se upřednostňují takové podmínky, kdy dochází přibližně k 30 % 20 * · • · · · • · ψ
až 40 % chybného párování. Termín „chybné párování" znamená stupeň přiřazení nekomplementárních baží jedna k druhé v jinak duplexní DNA, čímž vznikají bublinové struktury a teplota denaturace duplexu je nižší ve srovnání s duplexem stejné délky a složení baží, který je 100 % párován.
Adenovirový vektor přednostně dále obsahuje cizorodý gen, který se v typickém případě exprimuje v hostitelské buňce a kóduje produkt, který je možný využít ve výzkumu (jako geny markérů), terapii a/nebo profylaxi. Takový cizorodý gen kóduje RNA, antimediátorovou RNA, syntetický oligonukleotid a/nebo polypeptid. Cizorodé geny, které se využívají při terapii, zahrnují geny kódující chybějící nebo porušenou funkci genu, jako je gen transmembránového regulátoru cystické fibrózy (CFTR) spojený s cystickou fibrózou (CF) . Cizorodé nukleové kyseliny, které mají profylaktické využití, zahrnují geny, které kódují genový produkt, jenž má schopnost přímo nebo nepřímo předcházet onemocnění tak, že poskytuje zdroj polypeptidu nebo jiného antigenu, aby - došlo k vyvolání imunitní odezvy. Příklady provedení vynálezu Příklad 1: V tomto příkladu se popisuje delece oblasti E1A z adenovirové DNA viru Ad7 a skupiny B, přičemž vznikají velké virové fragmenty.
Virus Ad7a se použil při inokulaci buněk HEK-293 v modifikovaném kultivačním Eagle médiu, které obsahuje 5 % koňské sérum, při 100 násobné infekci. Ze shromážděného viru Ad7a se izolovala DNA za použití způsobů popsaných v publikaci Falck-Pedersen, in Cell Biology: A Laboratory Manual (Spector et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Wew York, 1994). DNA Ad7a se pak podrobilo štěpení restrikční endonukleázou Aat II podle publikace Dijkema et al., Gene, 12, 287 (1980), 21
přičemž vzniká na levé straně malý fragment o velikosti 1,483 kb (fragment 1) a velký fragment přibližně o velikosti 30 kb, který se nachází ve středu genomu (fragment 2) a na pravé straně vzniká druhý velký fragment o velikosti 5 kb (fragment 3) . Malý fragment zahrnuje počátek replikace a balící sekvence, stejně jako oblast E1A, která je nezbytná při replikaci DNA. Velké fragmenty obsahují ostatní časné geny, stejně jako pozdní geny, které jsou nutné při produkci viríonů.
Velké fragmenty 2 a 3 se společně čistily a izolovaly se od malého fragmentu za použití centrifugace hustotním gradientem sacharózy. Gradient sacharózy 10 % až 20 % s polštářem 40 % sacharózy se přelil přes vrstvu DNA Ad7a štěpenou restrikčním enzymem AatlI. Následovala centrifugace a gradient se rozdělil do . frakcí. Frakce obsahující čištěné velké fragmenty se analyzovaly na agarózovém gelu elektroforézo-u a zviditelnily se barvením ethidium bromidem.
Frakce obsahující velké fragmenty, které neobsahovaly malé fragmenty se sloučily a jejich koncentrace se zvýšila srážením, a následnou rekonstitucí v menším objemu. Sloučené segmenty DNA se použily v následujících krocích při přípravě replikačně nedostatečného viru Ad7a, vzhledem k přítomnosti velkých fragmentů (2 a 3) a nepřítomnosti malého fragmentu (1), který je znám, že zahrnuje oblast E1A. Příklad 2:
Tento příklad popisuje vznik plazmidu pAd7aCMV-CATgD. Plazmid pAd7aCMV-CATgD se připravil přímým klonováním ve třech postupných krocích.
Nejdříve se za použití polymerázové řetězové reakce (PCR) amplifikovalo a izolovalo až 475 párů baží levého konce genomu Ad7a (lokalizovaných mezi 0 a 1,3 jednotek mapy (mu) na genomu Ad7a) . Primery používané při amplifikaci obsahují restrikční místo Sací (na levém konci primeru) a restrikční místo Not I (na pravém konci primeru). Amplifikovaná DNA obsahovala důležitý počátek (ori) balicí sekvence (pkg). Časné oblasti E1A část E1B, které se nacházejí mezi 1,3 a 7,7 mu se neamplifikovaly. Klónovací vektor pBS (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) se pak otevřel enzymy Sacl-Notl a do tohoto místa se začlenil PCR fragment SacI-ori/pkg-Notl.
Za druhé, za použití standardních metod se otevřel vektor pBS pomocí enzymů Notl-Sall a do elementů ori a. pkg se ligoval promotor cytomegaloviru (CMV), následovaný sekvencí bakteriální chloramfenikolacetyltransferázy (CAT) a myšího póly(A) místa B-maj globinu.
Za třetí se za účelem rekombinace s genomem Ad7a vytvořila za použití prvního a druhého primeru PCR oblast o velikosti 2,8 až 4,0 kb. První primer obsahoval restrikční. místo Nhel, které se dotýká restrikčního místa Sáli, jenž je bezprostředně vedle sekvence Ad7a od pozice 2 880 včetně do pozice 2816 včetně. Druhý primer obsahoval restrikční místo Aspal, které se dotýká restrikčního místa KpnI, jenž je bezprostředně vedle sekvence Ad7a od pozice 4 000 včetně do pozice 3 986 včetně.
Tento překrývající se rekombinační fragment se nachází na genomu Ad7a v poloze 7,7 až 11,1 mu. Vektor pBS se pak otevřel réíjsrikčními enzymy Sall-KpnI a do tohoto místa se začlenil PCR fragment SalI~Ad7 překrývající DNA 2,8-4,0 kb-Kpnl. To znamená, že se ligoval do dříve popsané konstrukce za místo póly(A), čímž vznikl plazmid pAd7aCMV-CATgD. Příklad 3: -,h
Tento příklad popisuje vytvoření rekombinajtního adenoviru Ad7-CAT a demonstruje schopnost rekombinantního adenoviru Ad7a replikovat se v buňkách HEK-293, které ho doplňují. Různé poměry mikroorganizmů virových velkých fragmentů připravených podle příkladu 1 a plazmid pAd7aCMV-CATgD připraveného podle příkladu 2 se přenesly na monovrstvu buněk HEK-293 (106 buněk na disku o průměru 60 mm) srážením « t· ·* • · » I · * • » M * f « · t · · • · · · ♦ ·♦* *♦ ·* • · t · · ψ • « t · · ·»· *♦ 23 fosforečnanem vápenatým. Po jednom týdnu se buňky shromáždily a opakovaným zmražováním a táním se připravil virový lyzát. 10 % část výsledného lyzátu (0,5 ml) se použila při infekci monovrstvy buněk HEK-293. Po 24 hodinách se tyto buňky shromáždily a připravily se lyzáty. V lyzátech se testovala aktivita reportního genu. To znamená acetyltransferáza chloramfenikolu (CAT) za použití způsobu popsaného v publikaci Gorman et al., Mol. Cell Biol., 2, 1044-1051 (1982) a Gorman, et al., PNAS, 79, 6777-6781 (1982). U výsledných virových konstrukcí se testovala jejich schopnost indukovat aktivitu CAT. Za podmínek, při kterých se nepozorovala v testu podle publikace Gorman et al. žádná CAT aktivita (například transfekce, která nezahrnuje žádnou exogenní cDNA CAT), některé konstrukce ukázaly až 50 % acetylaci chloramfenikolu, což naznačuje, že se úspěšně vytvořila virová konstrukce. Příklad 4:
Tento přiklad dále potvrzuje vytvoření rekombinantního adenoviru Ad7-CAT a schopnost rekombinantního adenoviru Ad7 se replikovat a doplňovat v buňkách HEK-293. Tento příklad zvláště popisuje test sekundárního virového lyzátu exprese genu CAT.
Alikvot primárního lyzátu o objemu 1,0 ml vytvořeného podle příkladu 3 se použil pro infekci buněk HEK-293 na plotně o průměru 60 mm. Po inkubaci po dobu jednoho týdne se buňky sebraly a vytvořil se lyzát, jak se popisuje v příkladu 3. 10 % část každého lyzátu se pak použila pro infekci čerstvé monovrstvy bur.ěk HEK-293 a ve výsledném lyzátu se testovala aktivita CAT.
Výsledky uvedených testů ukázaly, že výsledkem transfekce 4,8 mg velkého fragmentu kombinovaného s přibližně stejnou hmotností kruhového plazmidu je silná aktivita CAT v sekundárním lyzátu, která je výsledkem virové aktivity 9 24 • # ΦΦ9 ♦· ·· #·♦ progenu na začátku shromážděných rekombinantnich virových partikul!.
Vybrané buněčné lyzáty se dále charakterizovaly infekci buněk HEK-292 a přípravou virové DNA za použití upraveného způsobu podle Hirta, který se popisuje v publikaci Falck-Pedersen, in Cell Biology: A Laboratory Manual (Spector et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, new York, 1994). Čištěná virová DNA se štěpila restrikčním enzymem Aat II za účelem charakterizace rekombinantní DNA. Kontrolní DNA se izolovala z adenovirů Ad7a a Ad5 divokého typu. Vizuální analýza velikosti restrikčních fragmentů (separovaných elektroforézou na agarózovém gelu) potvrdila, že se získaly správné konstrukce DNA. Příklad 5:
Za účelem charakterizace Ad?-CAT produkovaného podle shora v textu uvedených příkladů se provedly experimenty výtěžku upraveného viru v buňkách 293 a A549. Aktivita CAT ad7-CAT se porovnala s homologním Ad5-CAT (odvozeným z Ad5 a stejným způsobem) v buňkách 293 a A549. Když se buňky 293 infikovaly jednou částicí Ad5-CAT, v buněčném lyzátu shromážděném 18 hodin po infekci se zjistila podstatná aktivita CAT. Dále, jak se očekávalo se zvyšuje aktivita CAT v Ad5-CAT v závislosti na dávce. Naopak Ad7-CAT nevykazuje v buňkách 293 žádnou detekovatelnou aktivitu CAT pokud se poměr virových partikul! ku buňkám zvyšoval na hodnotu přibližně 10:1. Při hodnotě poměru virové partikule ku buňkám 10:1 je Ad5-CAT přibližně 35 krát účinnější při řízení produkce CAT než Ad7-CAT. Navíc aktivita CAT produkovaná v Ad7-CAT při hodnotě poměru virové partikule ku množství buněk 1 000:1 je přibližně stejná jako aktivita získaná z Ad5-CAT při hodnotě poměru virové částice ku buňkám 10:1. Ad5-CAT a Ad7-CAT vykazují pouze malé množství aktivity CAT v buňkách A549 (dvakrát menší množství ve srovnání s Ad7-CAT v buňkách 293). Tento příklad ukazuje, že • *· lf · I» ·· «· 9 · · ♦ #* * · · · • t t · I · 9 9 9 9 9 9 9 9· 9 · · 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99· 99 99 999 «· 99 25
Ad7-CAT se neúčinně doplňuje buňkami 293 a je nedostatečný ve funkci genu oblasti El adenovirového genomu. Přiklad 6:
Tento přiklad ukazuje, že došlo ke zvýšeni účinnosti komplementace El deficitního adenoviru, který nespadá do skupiny C v buňkách 293/ORF6, ve srovnání s účinností ' komplementace v buňkách 293.
Za použití standardních protokolů tvoření plaků se stanovila schopnost viru Ad7a divokého typu tvořit plaky v různých buněčných linií. Cytopatický účinek virů odvozených od Ad7 a Ad5 je během infekce buněk A549 nebo 293 odlišný. Navíc tvoření plaků trvá o trochu déle v případě Ad7a ve srovnání s Ad5. Také poměr množství virových částic ku jednotkám tvořící plaky (pfu) v případě virů Ad7a (přibližně 2 000 částic/pfu nebo více) infikující buňky ' 293 je podstatně vyšší, než poměry množství částic ku pfu pro Ad5 infikující buňky 293 (přibližně 40 až 50 částic/pfu).
Směs Ad7-CAT a Ad7a divokého typu se nanesla na buňky 293, aby došlo k·tvorbě plaků. Při několika pokusech se neidentifikovaly žádné plaky obsahující El nedostatečný Ad7 a kontaminační virus divokého typu. Opakovaná tvorba plaků snadno zvyšuje poměr viru divokého typu ku El nedostatečnému viru.
Za použití upravených buněk 293 (které doplňují E1A a E1B) se uskutečnil stejný postup tvoření plaků. V· těchto plácích se exprimuje produkt genu ORE6 oblasti E4 adenovirového genomu (to znamená buňky 293/ORF6). Tento postup vede k podstatnému zvýšení počtu plaků ve srovnání s tvorbou plaků na normálních buňkách 293. Navíc se pozorovalo zjevné zlepšení morfologie plaků, což naznačuje vyšší stupeň komplementace v buňkách 293/ORF6, než v 293. Navíc v zásobních roztocích viru se pomocí PCR nedetekovala žádná DNA El (to znamená, že se v zásobních roztocích čištěných pomocí plaků nenašel žádný virus divokého typu). Některé tyto zásobní roztoky Ad7-CAT, které neobsahují replikačně kompetentní adenovirus (bez RCA) , zprostředkovaly produkci velkého množství CAT v infikovaných buňkách A549. Navíc se záskala koncentrace viru 1012 partikulí/ml, aniž došlo ke zvýšení titru viru. Výtěžek virů, který je přibližně 2 x 1012 virových částic z konfluentní kultury buněk 293/ORF6 na plotně o průměru 35 mm byl podstatně stejný, jak se očekávalo při infekci Ad5.
Tento příklad ukazuje, že stanovení genové funkce oblasti E4 adenovirového genomu vedle podstatných genových funkcí oblasti El adenovirového genomu překvapivě zvyšuje účinnost komplementace El nedostatečných adenovirů, kde se produkty genů El poskytované ve formě in trans získaly z adenovirů séroskupiny odlišné od séroskupiny replikačně nedostatečného adenovirů. Příklad 7: V tomto příkladu se popisuje zvýšená komplementace nedostatečnosti El tím, že se zajistí ín trans forma produktu genu E4 jiného než 0RF6. Produkce a stupeň komplementace El nedostatečného Ad7 se porovnává mezi buňkami 293 a 293/E4-ORF4 .
Buňky 293/ORF4 se produkují začleněním expresivní kazety 0RF4 do genomu buněk 293. Expresivní kazeta 0RF4 obsahuje buď promotor ovčího metalothioneinu nebo promotor LTR MMTV, které jsou operativně spojené se segmentem DNA, jenž kóduje produkt genu 0RF4 Ad5. Jestliže se použije promotor MMTV, pak se do buňky, která konstitutivně produkuje vysoké množství glukokortikoidního receptoru, také začlení druhá expresivní kazeta. V jiném případě se expresivní kazeta vhodná pro podstatné genové funkce oblasti El Ad5 a shora popsaná expresivní kazeta pro 0RF4 začlení do druhé buněčné linie, jako jsou buňky COS-1, A549, HeLa nebo 293. Výsledná buněčná linie se nazývá 293/ORF4. 27 ♦ ♦« ♦« • ·« ·· «· · ♦ · · ·· * · · · • · · · ♦ • • · · * « * · ♦ · ♦ • · • » « t ♦ ♦ t · · • • · · · ♦ ♦♦ ·· ♦ ♦♦ ·« »·
Směs Ad7-CAT a Ad7 divokého typu se nanesou na buňky 293/ORF4 za účelem vzniku plaků, aby se získaly jednotlivé plaky obsahující pouze El nedostatečný Ad7. Příklad 8:
Tento příklad hodnotí podobnost mezi adenoviry, které nespadají do skupiny C s ohledem na adenoviry skupiny C.
Podobnosti a odlišnosti mezi různými skupinami adenovirů se testovaly porovnáním podobnosti aminokyselin a shodnosti mezi produkty genů E1A a E1B Ad2 (skupiny C), Ad5 (skupiny C), Ad7 (skupiny B), Adl2 (skupiny A) a Ad40 (skupiny F). S ohledy na viry ve stejné skupině, zvláště mezi Ad2 a Ad5 ve skupině C, existuje 99 % podobnost a 98 % shoda mezi produkty genů E1A a E1B Ad2 a Ad5. Naopak porovnání virů různých skupin ukázalo značně omezenou podobnost a menší shodu. Mezi produkty genů E1A a E1B Ad7, Adl2 a Ad40 existuje například 63 až 75 % podobnost a 40. až 53 % shoda ve srovnání s produkty genů E1A a E1B Ad2 a Ad5.
Zjistilo se, že určité domény jsou mezi viry různých skupin konzervativní, například je tomu u produktů genů E1A a E1B adenovirů skupiny C a adenovirů, které nespadají do skupiny C. Tak se zjistilo, že rozdíly mezi určitými viry, kteří nepatří do skupiny C, v porovnání s viry patřící do skupiny C, jsou podobné tak, že demonstrace schopností adenovirů skupiny B ukazuje stejné schopnosti, jako vykazují jiné adenoviry, který nespadají do skupiny C. Zvláště demonstrace schopnosti El defektních adenovirů skupiny B, například Ad7, být komplementováni buňkami HEK-293 (jak se popisuje v příkladu 3) dokazuje schopnost jiných adenovirů, které nespadají do skupiny C, být komplementován buňkami HEK-293.
Odborník je schopen získat a pomnožit libovolný známý sérotyp adenovirů. Jestliže odborník získá zásobní roztok pomnoženého viru může z viru izolovat DNA a sekvenovat ji 28 • ·· 99 9 99 9 9 9 · 9 · * · * · · · • · ff * · 9 9*9 • « 9 9 · ♦ t f I «9 9 9· 9 9 9 »·· 999 9# #9 999 99 9 libovolnou rutinní metodou, to znamená, že nemusí dělat nic neobvyklého. Pak je také jednoduché identifikovat standardní oblasti adenovirového genomu rutinním porovnáním sekvencí. Tak se mohou také navrhnout oligonukleotidy a identifikovat se místa, která rozeznávají restrikční enzymy. Tak zatímco způsoby použití v příkladech ukazují použití Ad7, tyto metody je možné jednoduše aplikovat na jiné sérotypy adenovirů.
✓ · 1 1 1 1 1 · · · · ·
A method of producing adenovirus vectors not belonging to group f
Technical field
The invention relates to the production of vectors which are suitable for the transfer of adenoviral genes which contain a foreign gene for expression in cells.
BACKGROUND OF THE INVENTION During the winter and spring of 1952 to 1953, Rowe and his staff at the National Institutes of Health (NIH) acquired and transferred to tissue culture adenoids that were surgically removed from small children in the Washington DC area (Rowe et al., Proc. Soc. Exp. Biol Med., 84, 570-573 (1953). After a few weeks, a number of cultures began to show progressive degeneration characterized by the destruction of epithelial cells. This cytopathic effect could be serially transferred by fluid-filtered culture to stable tissue cultures of human cell lines. The cytopathic agent has been termed "adenoid degenerative agent"; (Ad). Finally, the term "adenovirus" has become commonplace for this agent. These initial findings were followed by discoveries of a number of prototype strains of adenoviruses, some of which cause respiratory diseases (Rowe et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570-573 (1953), Dingla et al., Am. Rev. Respir., Dis., 97, 1-65 (1968); Horwitz, " Adenoviridae and Their Replication ", in Fundamental Virology (ed. Fields et al., Raven Press Ltd., New York, NY, 2nd Ed. (1991), pp. 771-813). All adenoviruses are similar in structure and morphology. These viruses do not have packaging, they form regular icosahedras with a diameter of 65 to 80 nm, containing an external capsid and an inner core. The capsule consists of twenty triangular walls or patches and twelve peaks (Horne et al., J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)). Plates consist of hexons and pentons. The thread protrudes from each peak. In addition to hexons, pentons, and fibers, there are eight smaller building polypeptides, with the exact position of their large portion not clear.
The viral nucleus contains a linear, double-stranded, reverse-stranded repeat (ITR) DNA molecule whose length varies from 103 bp to 163 bp in different isolates (Garon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394 ( 1972; Wolfson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057 (1972); Arrand et al., J. Mol Biol., 128, 577-594 (1973); al., Nucleic Acids Res., 4, 4371-4389 (1977); Tooze, DNA Tumor Viruses (2nd ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), pp. 943-1054). ITRs carry the origins of DNA replication (Garon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394 (1972); Wolfson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057 (1972); Arrand et al., J. Mol Biol., 128, 577-594 (1973); Steenberg et al., Nucleic Acids Res., 4, 4371-4389 (1977).
The viral DNA is linked to four polypeptides. They are the V, VII polypeptide and the terminal polypeptide (TP). 55,000 TP is covalently linked to the 5 'end of DNA by dCMP (Rekosh et al., Cell, 11, 283-295 (1977); Robinson et al., Virology, 56, 54-69 (1973)). The other three polypeptides are non-covalently bound to DNA and packaged in such a way that they fit into a small volume of the capsid. The DNA is packaged in a structure similar to the cellular nucleosome, as shown by the nuclease cleavage patterns (Corden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 401-404 (1976); Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785 (1979), Mirza et al., Biochim, Biophys, Acta, 696, 76-86 (1982).
In addition to the different physical similarities that characterize adenoviruses, these viruses divide into sub-divisions with respect to certain criteria that include immunological reactivity, oncogenicity, and GC content in the genome of the strain (Horwitz, 3 3 • ·
Adenoviridae and Their Replication, " in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed., 1991), pp. 613-8. 771-813), p 777). For example, over 40 serotypes and four hemoglutination groups have been isolated among human adenovirus isolates. The following is a table summarizing the classification of human adenoviruses (Horwitz, "Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., Eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), p777).
Oncogenic potential Subgroup Hemagglutination group Serotype Tumors in animals Transformation in tissue cultures Percentage G. + C in DNA A IV (low or non-agglutinating) 12, 18, 31 High + 48 - 49 BI (full agglutination of monkey erythrocytes) 3, 7, 11, 14, 16 21, 34, 35 Medium + 50 - 52 C III (partial agglutination of rat erythocytes) 1, 2, 5, 6 Low or none + 57 - 59 D II (complete agglutination of rat erythrocytes) 8, 9, 19 37, 10 13, 15 17, 19 20, 22-30, 32 , 33, 36, 37, 38, 39, 42 Low or None + 57 - .61 E III 4 Low or None + 57 - 59 F III 40, 41 Not known 4
Minulosti se · nosti · minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti minulosti devoted to the study of adenovirus serotypes Ad2 and Ad5, which were completely sequenced. It has been found that the entire adenoviral genome organization is conserved among serotypes such that specific functions have similar positions. Parts of other serotypes were also sequenced, with a result that corresponds to the conservative genetic organization hypothesis among adenoviruses. Adenoviruses exhibit substantial genetic variation at the genetic level. Viral isolates from different groups of adenoviruses have different genomes. DNA-DNA hybridization studies show that there is less than 20% homology. between DNAs of different groups, although more detailed analysis showed that conservative sequences were detected compared to sub-genome segments. For example, when studying up to 30 DNA length mapping units, it has been found that at least 20 to 50% of the DNA sequence differs between groups (Horwitz, "Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., Eds. Raven Press Ltd.). , New York, NY, 2d ed., 1991), pp. 771-813), p777). In another study, the sequence of replication origin of the subtypes associated with each of the six groups of adenoviruses was found to be related but different.
It is important to note, although it remains unexplained that there is no recombination between adenoviruses of different groups when co-infection occurs in the host. In contrast, adenoviruses in the group are effectively recombined (Sambrook et al., J. Mol. Biol. 97, 369-390, (1975)). The inability of adenoviruses to recombine among serogroups indicates the genetic differences of adenovirus groups. The basic physiology of adenovirus infection has been studied with respect to Ad2 and Ad5. This study showed that adenoviruses begin to infect the cell by entrapping the fiber at a specific receptor on the cell membrane (Londberg-Holm et al., J. Virol., 4, 323-338 (1969); Morgan et al., J. Virol. 4, 777-796 (1969), Pastan et al., "Adenovirus entry into cells: some new obsolescence on an old problem" in Concepts in Viral Pathogenesis, Notkins et al., Eds7 Springer-Verlag, New York, NY, pp. 141-146 (1987)). The pentone base then binds to the cellular receptor integrin. The receptor-bound virus then migrates from the plasma membrane to clathrin-coated wells that form endocytic vesicles or receptosomes where the pH drops to 5.5. When the pH drops, the surface configuration of the virus is likely to change, leading to rupture of the receptosomes and release of the virus into the cytoplasm of the cell.
When the virus reaches the nuclear pores, viral DNA enters the nucleus, with the majority of the remaining proteins remaining in the cytoplasm (Philipson et al., J. Virol., 2, 1064-1075 (1968)). However, viral DNA is not completely protein-free, since at least a portion of the viral DNA is linked to at least four viral polypeptides, namely, V, VII, TP, and am, and is converted to a DNA-cell histone complex (Tate et al., Nucleic Acids Res. , 6, 2769-2785 (1979)).
The cycle from cell infection to viral particle production takes 1-2 days to produce up to 10,000 infectious particles per cell (Green et al., Virology, 13, 169-176 (1961)).
The adenovirus infection process is divided into early (E) and late (L) phases, which are separated by DNA replication, although some processes that occur during the early phase also take place in the late phase and vice versa. In order to fully describe the temporal expression of the viral genes, a further division of the adenoviral genetic regions into subdivisions was performed. During the early phase, viral mediator (mRNA), which includes a minor portion of total RNA present in the cell, is synthesized from both strands of adenoviral DNA present in the cell nucleus. At least five regions designated E1, E2, E3, E4 and MLP-L1 are described (Lewis et al., Cell, 7, 141-151 (1976); Sharp et al., Virology, 75, 442-456 (1976); Sharp, "Adenovirus transcription," in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, NY, pp. 173-204 (1984). Each region has at least one different promoter and is processed to produce more mRNA species.
Early region (E) products: (1) serve as regulators of expression of other viral components, (2) generally participate in termination of cellular DNA replication and protein synthesis, and (3) are required in viral DNA replication. Complex series of phenomena regulating early transcription of mRNA begin with the expression of certain immediate early regions that include AlA, L1 and a 13,500 gene (Sharp, "Adenovirus transcription," in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, NY) , pp. 173-204 (1984); Horwitz, "Adenoviruses and Their Replication," in Virundy (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771 Expression of delayed early regions of ElB, E2A, E2B, E3 and E4 depends on the E1A gene products. The three promoters (E2 promoter are 72 map units ("mu"), protein IX promoter, and IVa promoter are enhanced but not dependent on DNA replication (Wilson et al., Virology, 94, 175-184 (1979)). Their expression characterizes the middle phase of viral gene expression. The expression of the cascade of early gene expression results in viral DNA replication origin.
Adenovirus DNA replication replaces one parent strand with continuous synthesis from the 5'-end to the 3'-end of the origin of replication to the end of the genome (Kelly et al., "Initiation of Viral DNA Replication," in Advances in Virus) Research, Maramorosch et al., Eds., Academic Press, Inc., San Diego, CA, 34, 1-42 (1980); Horwitz et al., In Virology, Raven Press, New Yo_rk, 2, 1679-1721 ( 1990), van der Vliet, " Adenovirus DNA replication in vitro, " in Eukaryotic Nucleus, Straus et al., Eds., Telford Press, Caldwell, NJ, 1, 1-29 (1990). The three viral proteins encoded by E2 are essential in the synthesis of adenoviral DNA: (1) single-stranded DNA binding protein (DBP), (2) adenoviral DNA polymerase (Ad pol), and (3) pre-terminal protein (pTP). In addition to these proteins, in vitro experiments have shown that there are a number of
The host cell factors that are necessary for DNA synthesis.
DNA synthesis is initiated by covalently linking the x-dCMP molecule to the serine residue of pTP. The pTP-DCMP complex then acts as a primer for elongation of the Ad pol. The parent single strand may form a cup-shaped structure by pairing the craving of the inverted terminal repeats. This terminal duplex structure is the same as that of the parent genome and can serve as a starting point for initiating the synthesis of complementary strands. The origin of viral DNA replication appears to be essential for entering the late phase. The late phase of viral infection is characterized by the production of a large number of viral structural polypeptides and non-structural proteins involved in the assembly of the capsid. The major late promoter (MLP) becomes fully active and produces transcripts that begin at 16.5 mu and end near the end of the genome. The post-transcriptional processing of said long transcript gives rise to five late mRNA families designated L1 to L5 (Shaw et al., Cell, 22, 905-916 (1980)). The mechanisms that drive the shift from the early phase to the late and the results of such dramatic shift in transcriptional use are unclear. The requirement for DNA replication may be the cis template DNA property since late transcription from the superinfection virus will not occur at a time when late transcription of the primarily infectious virus is active (Thomas et al., Cell, 22, 523-533 (1980)). Virion formation is a complex process. In a first step, the major structural units are assembled from the individual polypeptide chains (Philipson, "Adenovirus Assembly," in The
Adenoviruses, Ginsbrg, ed., Plenum Press, New York, NY (1984) pp. 309-337; Horwitz, "Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991)). Hexone and penton bases and filaments arranged in the trimeric homopolymer are formed after synthesis in the cytoplasm. 100,000 protein works as 8 • ·· ·· ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · The scaffolding for hexon trimerization and the resulting hexon trimer is called the hexon capsomer. Hexone capsomers can be assembled separately to form an empty capsid shell, and the penton base and fibrous trimers can be combined to form pentone, where the components are inside the core. | p // & ka ikosaědrx ^ consists of three hexons. capsomeres that can be seen due to dissociation of the capsid, but no intermediate step of forming a group of nine hexons was observed. Several were observed in temperature sensitive mutants
intermediates. The progression of the capsid configuration appears to be protein dependent, serving as a scaffold for packaging. This protein has a molecular weight of 50,000 to 30,000. DNA itself most likely enters the capsid by opening at one peak. The final step of the process involves the proteolytic trimming of the precursor polypeptides pVI, pVII, pVIII and pTP, which stabilize the capsid structure, causing the DNA not to be sensitive to nuclease treatment and resulting in a complete virion.
Replication deficient adenoviruses are known to find various uses. For example, replication deficient adenovirus can be used to transfer genes and other genetic elements, such as ribosomes, antisense RNA, and DNA segments that are expressed in a similar manner to cells in vivo and in vitro. In vivo use also includes genetically engineered cells that are useful for diagnostic and therapeutic purposes, and the study of biological phenomena such as the half-life of the element-regulating proteins, the rate of transcription, and the function of the protein. In vitro use further comprises a study of the biological phenomenon mentioned above and may also be advantageous because it allows more precise control of the experimental conditions.
Certain recombinant adenoviral vectors may be used in gene therapy, in particular Ad2 and Ad5, both of which are members of group C. The use of a recombinant adenoviral vector to transfer one or more recombinant genes allows targeted introduction of the gene or genes into an organ, tissue or cell if desired treatment, bypassing the introduction problem that occurs in most forms of somatic gene therapy. Furthermore, in the case of expression of adenovirus proteins, recombinant adenoviral vectors do not require the proliferation of host cell strains (Horwitz, "Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., Eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991) ), pp. 771-813), Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988). If the lung is the organ requiring treatment, then the use of adenovirus as a vector for genetic information is advantageous because the adenovirus is normally trophic for respiratory epithelium (Straus, in Adenoviruses, Penum Press, New York, pp. 451-496 (1984)) ).
Other advantages of adenoviruses as vectors for gene therapy in humans are: (i) in rare cases, bk is reconstructed; (li) the adenoviral genome (which is linear, double-stranded DNA) can be manipulated simultaneously to carry foreign genes that are at least 7.5 kb in size; (iii) the adenoviral vector does not incorporate its DNA into the cell's chromosome, ie its effect is temporary and unlikely to interfere with normal cell function; (iv) the adenovirus can infect non-dividing or terminally differentiated cells such as brain and lung cells; and (v) a live adenovirus whose essential characteristic is its ability to replicate is safe for use in human vaccines (Horwitz, Adenoviridae and Their Replication) in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), Berkner et al. J. Virol., 61, 1213-1220 (1987); Straus et al., Eds., Telford Press, Caldwell, NJ, 1, 1-29 (1990); Chanock et al., JAMA, 195, 151 (1966); Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57, 267 (1986);
Ballay et al., EMBO, 4, 3861 (1985)). m 0m ** »*« · · · · · · · · · · · · · ·
The foreign genes have been introduced into different major regions of the genome of the adenoviruses of group C for use as expression vectors. The most commonly used regions are E1, E3 and E4. In this way, a simply deficient adenovirus and vectors derived therefrom are produced. Incorporation into the E1 region of adenoviruses results in a defective progene that requires either culturing in complementary cells or the presence of a helper virus that provides function in trans or lacking an E1 region (Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988); Davidson et al., J). Virol., 61, 1226-1239 (1987), Mansour et al., Mol Cell Biol., 6, 2684-2694 (1986). Examples of cell lines that complement the lack of substantial adenoviral gene functions include human embryonic kidney cells known as HEK-293 (Graham et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 39, 637-650 (1975)) , W162 cells (Weinberg et
al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 5383-5386 (1983), gMDBP (Klessig et al., Mol. Cell. Biol., 4, 1354-1362 (1984); Brough et al., Virology, 190, 624-634 (1992)) ) and 293 / ORF6 cells (WO 95/34671, Kovesdi et al.). In the case of foreign nucleic acid expression, the E1 genome region is more commonly used. The genes incorporated into the E1 region are driven by different promoters and the genes, depending on the expression cassette, produce a large amount of foreign product.
The E3 region is not essential for the growth of the virus in tissue culture and the replacement of this region with the expression cassette containing the foreign nucleic acid results in a virus that is productively growing in the non-complementing cell line. For example, the inclusion and expression of hepatitis B surface antigen into the E3 region of the Ad5 serotype virus, subsequent inoculation and antibody formation in hamsters, is described (Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4626-4630 (1987)). Analogic E3 deficiency in the Ad4 and Ad7 serotypes is also described (Chengalvala et al., Vaccine, 9, 485-490 (1991) for Ad4) and Lindley et al. 9 in al., Gene, 138, 165-170 (1994) and Chengalvala et al., J. Gen. Virol., 75, 125-131 (1994). In the field of adenoviral gene therapy, only two of the above group C serotypes have been used in clinical trials to date. These are Ad2 and Ad5. Examples of such studies are described in Davidson et al., Nature, 3, 219 (1993) and Mastrangeli et al., J. Clin. Invest., 91, 225-234 (1993).
Current studies focus on group C serotypes, considering that most major research projects focus on Ad2 and Ad5. (see Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed., 1991), pp. 613-8. 771-813) and also The Adenoviruses (Ginsberg, ed., Plenum Press,
New York, NY, 1984). These studies show that adenoviruses of the / C family are exceptionally effective as tools for introduction into various target tissues, including, for example, the respiratory epithelium (Bajocchi et al., Nature Genetics, 3, 229-23 # (1993)).
However, there are limitations on the use of vectors in the gene therapy of adenoviruses of the C group. The host may have an immune response to a particular adenoviral vector that is used in gene therapy, resulting in natural exposure of the host to the same type of adenovirus before or after gene therapy has begun. it may be the result of exposure of the host to the action of the adenoviral vector during gene therapy alone. The cellular immune response may shorten the lifespan of cells infected with the adenoviral vector, thereby reducing the expression of the foreign nucleic acid and thus reducing the efficacy of gene therapy. It should be noted that the major limitations of the currently used C-gene gene therapy systems are the short duration of gene expression obtained (Crystal et al., Nature Genetics, 8, 42-51 (1994)).
A humoral immune response resulting in antibody production can significantly reduce the efficacy of gene therapy using a particular adenoviral vector. Obviously, this 12
adenovirus neutralization disrupts gene therapy and in vivo use of adenoviral vectors in biological research applications. In many applications, a replication deficient adenovirus of a particular serotype may be used. The reasons are more. For example, one serotype of, for example, an adenovirus is not reactive with the adenovirus of another serotype. Therefore, when mammals, including humans, are exposed to one adenovirus serotype, an immune response occurs that is specific for said adenovirus strain but not for different strains. Then, these different strains can be used to prevent humoral and cellular immune responses that are specific for other adenoviruses. The different adenovirus serotypes are trophic for different cell types. Thus, a replication deficient adenovirus that is suitable for transferring foreign genes into a cell of one type is less suitable than a second adenovirus used in transferring said foreign gene into a second cell type. Therefore, there is a need for the generation of a replication deficient adenovirus suitable for multiple strains. However, if each adenovirus strain requires its own complementary cells or even whether said complementing cell is constructed by co-infection with helper, then the process of producing a new complementation cell line for each adenovirus serotype will be very costly and time consuming. Thus, a method for producing adenovirus vectors not belonging to Group C, which is the subject of US Patent 5,837,511, is described. This patent discloses that complementary cell lines, such as HEK-293, that are prepared or can be prepared to replicate deficiency in group C vectors, can surprisingly be used to complement the production of adenovirus vectors not belonging to group C. Use of such cells. complementary cell lines suitable for complementing the growth of vectors not belonging to group C result in poor complementation. Unfortunately, this weak complementation is • ·· ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · It is difficult to obtain stock solutions (i.e., uncontaminated wild-type virus) of E1-deficient adenovirus vectors that do not belong to the C-group serotype. • · · · · · · · · · · · · · This is especially true when the use of homologous recombination of an isolated virus arm is used in the preparation of E1-deficient vectors that do not fall into Group C.
In addition, the production of group C adenoviral vectors in complementary cell lines developed for adenoviruses not belonging to group C is useful because recombination between the complementary cell line genome and the C group adenovirus is very disadvantageous.
Accordingly, it is necessary to improve the method of producing E1-deficient adenoviral vectors, particularly where E1 deficiency results in replication deficiency. The invention seeks to design and produce such vectors.
SUMMARY OF THE INVENTION
The present invention provides a method of producing a replication deficient adenovirus comprising a foreign gene and a deficiency in the substantial gene function of the E1 region. Said method comprises the production of adenoviruses in a cell which provides in trans gene functions of the E1 and E4 regions of one or more adenoviruses which do not belong to the same serogroup as the replication deficient adenovirus. The invention further provides adenoviruses produced in accordance with the invention.
The present invention provides a method of producing a replication deficient adenovirus that is deficient in the E1 region of an adenoviral genome that contains a foreign gene eliminating the need for separation of complementing cells for each adenoviral strain.
E1 deficient adenoviruses of Group C grow efficiently in cells that provide an in trans deficient important gene product. This product was obtained from adenoviruses of the same or similar serotype (eg, El deficient Ad2 and Ad5 grow well in 293 cells). In addition, cells that effectively complement essential gene 14 14
Functional defects, one particular adenovirus serotype, are not necessarily effective in complementing the growth of replication-deficient adenoviruses of other serotypes. E1 deficient Ad5 (serogroup C) is cultured significantly better in 293 cells than in homologous E7 deficient Ad7 (serogroup B). It is believed that since the E1 gene products in 293 cells were obtained from the adenovirus of group C, the 293 cells are more able to supplement the growth of group C adenoviruses than other adenoviruses. In the method of the invention, a replication deficient virus whose genome is deficient in the essential gene function of the E1 region of the adenoviral genome (or DNA segments containing the replication deficient adenovirus genome) is transferred to a complementing cell. If the genome carries more than one DNA segment,. in the cell, homologous recombination or DNA ligation occurs to produce a replication deficient adenoviral genome. Alternatively, the replication deficient adenovirus may be introduced into the cell by infection or its DNA may be incorporated into the cell by any suitable transfection method known in the art (e.g., electroporation). The complementing cell provides in trans: one or more essential gene functions of the E1 region of the adenoviral genome and one or more gene functions of the E4 region of the adenoviral genome. This measure in trans of both the E1 and E4 functions in the cell surprisingly, rather than merely the E1 function, allows the production of replication deficient adenovirus, wherein the serotype of the adenovirus from which the E1 product is provided is derived, and the serotype of the replication deficient adenovirus falls into different serogroups. The cell containing the replication deficient adenovirus genome is then maintained in culture for a period of time sufficient to produce a replication deficient adenovirus. The replication-deficient adenovirus can be harvested by any suitable means to produce a replication-deficient adenovirus stock solution. 15 • ·
I • · · β # " It is believed that the E4 gene product and the substantial E1 gene product interacts interactively with more adenovirus. The ability to functionally interact appears to be absolutely conservative in serogroup serotypes, but is less conserved between different serogroup serotypes and is not conserved among viruses of different serogroups. In some embodiments of the invention, it is preferred that the important gene products of the E1 and E4 regions of the adenoviral genome are derived from serogroups and even more preferred to be obtained from the same serotype.
The E4 region contains only one essential gene function, but this function is at least partially redundant in the E4 region of the adenoviral genome. While the E4 / ORF6 gene function is often referred to as an essential gene function of the E4 region of the adenoviral genome, this view may be simplified in some respects. The E4 / ORF3 gene function can partially replace the E4 / OR6 gene product. In addition, E4 / ORF6 / 7 can be defined as a substantial function of the E4 gene. Complementations and other studies have shown that the function of one gene of the E4 region, which is necessary and optimally complementing the deletion of the entire E4 region, is 0RF6. An important function of the gene of the E4 region of the adenoviral genome, which is in the trans form, is in many embodiments of the invention preferably a function of the E4 / ORF6 gene. The 0RF6 gene product is believed to interact with the gene product of the E1B region of the adenoviral genome. The substantial gene function of the E1 region of the adenoviral genome, which is in trans form, is in many embodiments of the invention preferably the E1B gene function.
The E1B gene product is also known to interact with a non-essential E4 / ORF4 gene product. The invention also discloses that the E4 gene product occurring in trans in the complementing cell is the E4 / ORF4 gene product. It is often possible to use a cell line that provides the gene functions of the E1 and E4 regions of DNA that is stably incorporated into the cell, especially into the cell genome. Such a cell line addresses the need for the formation of a complementing cell line whenever a person skilled in the art decides to create a replication deficient adenovirus. Alternatively, any gene function of the E1 or E4 region may be stably incorporated into a cell, which will then require temporary action of another gene function. This is most easily illustrated in well-known cells of the HEK-293 cell line, which contains essential gene functions of the E1 region. Helper virus expressing E4 / ORF6 in cell 293 will assist in the formation of a complementary cell. Alternatively, the 293 / ORF6 cell line can be used as a complementing cell line useful in the invention. Techniques for producing 293 / ORF6 cells and other cells that are stably incorporated and express DNA capable of providing E1 and E4 essential gene functions are well known in the art. Such technologies are described, for example, in International Patent Application WO 95/34671 (Kovesdi et al.).
WO 95/34671 discloses that complementation cell lines suitable for replication of deficient adenoviruses that do not have the E1 and E4 regions of the adenoviral genome can be produced by incorporating DNA segments encoding essential gene products into the cell line genome. These DNA segments are operably linked to promoters that direct the expression of a sufficient amount of gene product (s), allowing replication-deficient adenoviruses (E1 (-), E4 (-)) to be replicated. WO 95/34671 also discloses that substantial the gene functions of the E4 region damage the host cell. Therefore, it is desirable to use a controllable promoter such that the gene function of the E4 region can only arise when the replication deficient adenovirus needs a toxic gene product for its replication. In a similar case, the substantial gene function of the E1 region affects the characteristics of the host cells. Therefore, it is also appropriate to place E1 gene functions such that they are controlled by a controllable promoter.
While there are clear benefits of stable incorporation of E1 and E4 gene functions into complementing cells, there is a «& · · · ♦ · ♦ * · # ♦ · ··· * · · * ··· ·· · · ··· Also, the reasons that this inclusion may be temporary. · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · \ T For example, at least one substantial gene function of the E1 region and one gene function of the E4 region of the adenoviral genome may be provided by a helper virus in the in trans form. The helper virus produces these gene functions when it infects a cell. In a similar case, the complementing cell may be generated by transfection of a host cell with plasmids or other portions of DNA. In this or any other embodiment, transfection or infection is preferred. Alternatively, the transfected cells are placed under selection pressure, which means, for example, the use of antibiotics together with a plasmid that carries the antibiotic resistance gene. Substantial advantages of temporarily incorporated DNA encoding complementation gene functions include, but are not limited to, non-maintenance in the cell line and the relatively rapid development of the complementation cell. In accordance with the above description, a DNA containing a replication deficient adenoviral genome may be transferred to a complementing cell of infection. This method of introducing DNA containing the adenovirus genome into the complementing cell is particularly useful when a particular adenovirus stock contains both the desired replication deficient adenoviruses and another type of adenovirus. In this case, the desired replication deficient adenovirus of the first serotype can be more easily purified by plaques because the complementing cell provides both a substantial E1 region and essential gene products of the E4 region of the second (or second and third) serotype. The particle ratio decreases significantly to the number of plaque forming units. The decrease is approximately 3 to 5 times. A decrease in said ratio (in the case of replication deficient adenovirus) means that the contaminating virus (i.e., the desired replication deficient adenovirus) is less likely to be present in the plaque. Further, the decrease in this ratio indicates that the degree of complementation of the replication deficient adenovirus deficiency has increased. The invention further provides an improved method for purifying plaque replication deficient adenovirus produced in a complementing cell line expressing the complementary essential gene function of an adenovirus belonging to a different serogroup.
Another method of transferring DNA that contains a replication deficient adenoviral genome to a complementing cell is transfection. An embodiment of the method of the present invention comprises transfection wherein the adenoviral genome is available in at least two separate DNA segments. In this embodiment of the invention, the replication-deficient adenoviral genome can be prepared, propagated and packaged in one step. Previously, several cell lines have developed that complement the deficiency of essential Ad2 or Ad5 gene functions that belong to the C group. These cell lines in particular include those lines that complement the deficiency of essential E1 gene functions. These are, for example, HEK-293 and 293 / ORF6 cells. In accordance with the invention, these cell lines, in particular those that complement the essential function of the E1A gene, make it possible to create a replication deficient adenovirus in a cell line suitable for the propagation of the group C adenoviruses, which reacts with antibodies specific for the adenoviruses of the group. A, D, E, or F. However, it is not necessary to react with antibodies that are capable of neutralizing infection of the adenovirus of Group C. The term "neutralization"; means the ability of antibodies that are capable of binding in stoichiometric amounts to a virus (i.e., 1 antibody per 1 virus particle) to prevent infection of a suitable host cell suitable for the virus. This replication deficient adenovirus is characterized by the inclusion of an adenoviral DNA segment isolated from an adenovirus or segment that is substantially homologous to the adenovirus DNA segment. However, the adenovirus may also carry a foreign gene.
While the adenoviral DNA segment that forms part of the adenoviral vector is preferably isolated from the adenovirus, the adenovirus DNA segment may also be substantially homologous to the DNA segment contained in such adenovirus. The term " substantially homologous " means the ability of two nucleic acids to hybridize under at least moderately stringent hybridization conditions. Hybridization stringency is a technical term that refers to the conditions used in a hybridization reaction. Complementary single nucleic acid strands associate with each other to form a double-stranded nucleic acid with some degree of mismatch. The degree of mismatch is a function of the stringency used. In particular, stringency will depend on the size and composition of the nucleic acid chains that interact with each other, the possible degree of mismatch, the desired cross-reactivity, and the like. The degree of stringency may be influenced by other ionic conditions and temperatures used (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York). In accordance with the invention, the stringency specified by hybridization partially defines the DNA segment. Therefore, it is desirable that the hybridization conditions be at least moderately stringent or stringent. In the prior art, suitable conditions, i.e., salt content, temperature, composition of the reaction mixture, and nucleic acid size are determined based on knowledge so that about 45% to 80% of the nucleic acid sequence is mismatched incorrectly. It is preferred that hybridization conditions be used in which about 55% to 75% of the mismatch occurs. More preferred are conditions where about 60% to 70% of the mismatches occur. Later, suitable conditions for hybridization are determined based on common knowledge to produce about 10% to 40% of mismatches. It is preferred that stringent hybridization conditions be used that provide about 20% to 40% mismatch. More preference is given to conditions where there is approximately 30% 20 * · • · · · · ·
up to 40% mismatch. The term "mismatching" means the degree of assignment of non-complementary cravings to each other in the otherwise duplex DNA, thereby forming bubble structures, and the denaturation temperature of the duplex is lower compared to the duplex of the same length and composition of cravings that is 100% paired.
The adenoviral vector preferably further comprises a foreign gene, which is typically expressed in a host cell and encodes a product that can be used in research (such as marker genes), therapy, and / or prophylaxis. Such a foreign gene encodes an RNA, an antisense RNA, a synthetic oligonucleotide and / or a polypeptide. Foreign genes that are used in therapy include genes encoding missing or impaired gene function, such as the cystic fibrosis (CF) associated cystic fibrosis transmembrane regulator gene (CFTR). Foreign nucleic acids that have prophylactic uses include genes that encode a gene product that has the ability to directly or indirectly prevent the disease by providing a source of polypeptide or other antigen to induce an immune response. EXAMPLE 1 This example describes the deletion of the E1A region from Ad7 and Group B adenovirus DNA, generating large viral fragments.
Ad7a virus was used to inoculate HEK-293 cells in a modified Eagle culture medium containing 5% horse serum at a 100-fold infection. DNA was collected from the collected Ad7a virus using the methods described in Falck-Pedersen, in Cell Biology: A Laboratory Manual (Spector et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Wew York, 1994). Ad7a DNA was then digested with restriction endonuclease Aat II according to Dijkema et al., Gene, 12, 287 (1980), 21
with a small 1,483 kb fragment (fragment 1) on the left and a 30 kb large fragment located on the center of the genome (fragment 2) and a second large 5 kb fragment (fragment 3) on the right side . The small fragment includes the origin of replication and the packaging sequence, as well as the E1A region that is necessary for DNA replication. Large fragments contain other early genes as well as late genes that are required for virion production.
Large fragments 2 and 3 were co-purified and isolated from a small fragment using sucrose density gradient centrifugation. A sucrose gradient of 10% to 20% with a 40% sucrose cushion was poured over the Adat DNA layer digested with the AatI restriction enzyme. This was followed by centrifugation and the gradient was divided into. fractions. Fractions containing purified large fragments were analyzed by agarose gel electrophoresis and visualized with ethidium bromide staining.
Fractions containing large fragments that did not contain small fragments were pooled and their concentration increased by precipitation, followed by smaller volume reconstitution. The pooled DNA segments were used in subsequent steps to prepare the replication-deficient Ad7a virus due to the presence of large fragments (2 and 3) and the absence of a small fragment (1) known to include the E1A region. Example 2:
This example describes the generation of plasmid pAd7aCMV-CATgD. Plasmid pAd7aCMV-CATgD was prepared by direct cloning in three sequential steps.
First, up to 475 pairs of the left end of the Ad7a genome (located between 0 and 1.3 units of map (mu) on the Ad7a genome) were amplified and isolated using polymerase chain reaction (PCR). The primers used in the amplification include a SacI restriction site (at the left end of the primer) and a Not I restriction site (at the right end of the primer). The amplified DNA contained an important start (ori) of the packaging sequence (pkg). The early E1A regions of the E1B portion, located between 1.3 and 7.7 µm, were not amplified. The pBS cloning vector (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) was then opened with SacI-NotI and a SacI-ori / pkg-NotI PCR fragment was inserted into this site.
Second, using standard methods, the pBS vector was opened with NotI-SalI and the cytomegalovirus (CMV) promoter was ligated into the ori and pkg elements, followed by the bacterial chloramphenicol acetyltransferase (CAT) and the B-maj globin mouse poles (A).
Third, a PCR region of 2.8 to 4.0 kb was generated using the first and second PCR primers for recombination with the Ad7a genome. The first primer contained restriction. the NheI site that touches the SalI restriction site that is immediately adjacent to the Ad7a sequence from position 2,880 inclusive to position 2816 inclusive. The second primer contained an Aspal restriction site that touches the KpnI restriction site, which is immediately adjacent to the Ad7a sequence from position 4,000 inclusive to position 3,986 inclusive.
This overlapping recombination fragment is located on the Ad7a genome at 7.7 to 11.1 µm. The pBS vector was then opened with SalI-KpnI restriction enzymes and a SalI-Ad7 PCR fragment overlapping 2.8-4.0 kb-KpnI DNA was inserted into this site. That is, it was ligated to the previously described construct by the poles (A) to give plasmid pAd7aCMV-CATgD. Example 3: -, h
This example describes the generation of a recombinant Ad7-CAT adenovirus and demonstrates the ability of the recombinant Ad7a adenovirus to replicate in HEK-293 cells that complement it. The different ratios of the microorganisms of the viral large fragments prepared according to Example 1 and the plasmid pAd7aCMV-CATgD prepared according to Example 2 were transferred to a HEK-293 cell monolayer (10 6 cells per 60 mm disc) by precipitation of the EK · · · · · · · · · · · ·. Calcium phosphate is used as a base for M * f «t · t · calcium phosphate. After one week, cells were harvested and viral lysate was prepared by repeated freezing and thawing. A 10% portion of the resulting lysate (0.5 mL) was used to infect a monolayer of HEK-293 cells. After 24 hours, these cells were collected and lysates were prepared. Reporter gene activity was tested in the lysates. That is, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) using the method described by Gorman et al., Mol. Cell Biol., 2, 1044-1051 (1982) and Gorman, et al., PNAS, 79, 6777-6781 (1982). The resulting viral constructs were tested for their ability to induce CAT activity. Under conditions not observed in the assay of Gorman et al. no CAT activity (e.g., transfection that does not include any exogenous CAT cDNA), some constructs showed up to 50% acetylation of chloramphenicol, suggesting that a viral construct was successfully established. Example 4:
This example further confirms the formation of the recombinant Ad7-CAT adenovirus and the ability of the recombinant Ad7 adenovirus to replicate and replenish in HEK-293 cells. In particular, this example describes a secondary viral lysate assay for CAT gene expression.
An aliquot of the 1.0 mL primary lysate formed in Example 3 was used to infect HEK-293 cells on a 60 mm plate. After incubation for one week, the cells were collected and a lysate was formed as described in Example 3. A 10% portion of each lysate was then used to infect fresh monolayers of HEK-293 and the resulting lysate was tested for CAT activity.
The results of these tests have shown that transfection of 4.8 mg of a large fragment combined with approximately the same mass of a circular plasmid results in a strong CAT activity in the secondary lysate resulting from viral activity of the progeny collected at the beginning. recombinant viral particles.
The selected cell lysates were further characterized by infection of HEK-292 cells and preparation of viral DNA using the modified Hert method described in Falck-Pedersen, Cell Biology: A Laboratory Manual (Spector et al., Eds., Cold Spring Harbor) Laboratory, New York, 1994). Purified viral DNA was digested with restriction enzyme Aat II to characterize recombinant DNA. Control DNA was isolated from Ad7a and Ad5 wild type adenoviruses. Visual analysis of restriction fragment size (separated by agarose gel electrophoresis) confirmed that correct DNA constructs were obtained. Example 5:
In order to characterize Ad? -CAT produced according to the above examples, experiments were carried out on the recovery of the treated virus in 293 and A549 cells. CAT ad7-CAT activity was compared to homologous Ad5-CAT (derived from Ad5 and in the same manner) in 293 and A549 cells. When 293 cells were infected with one Ad5-CAT particle, substantial CAT activity was found in the cell lysate collected 18 hours after infection. Further, as expected, CAT activity in Ad5-CAT increases in a dose-dependent manner. In contrast, Ad7-CAT shows no detectable CAT activity in 293 cells when the viral particle ratio is! to cells increased to about 10: 1. At a viral particle to cell ratio of 10: 1, Ad5-CAT is approximately 35 times more effective in controlling CAT production than Ad7-CAT. In addition, CAT activity produced in Ad7-CAT at a viral particle to cell ratio of 1,000: 1 is approximately the same as that obtained from Ad5-CAT at a 10: 1 viral particle to cell ratio. Ad5-CAT and Ad7-CAT show only a small amount of CAT activity in A549 cells (twice as small as Ad7-CAT in 293 cells). This example shows that • * · lf · I · ·· · 9 · 9 · 9 * 9 · 9 · 9 · 9 9 9 9 9 9 9 · 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99 99 999 «99 25
Ad7-CAT is inefficiently supplemented with 293 cells and is deficient in the function of the E1 region of the adenoviral genome. Example 6:
This example demonstrates that the complementation efficiency of the E1 deficient adenovirus that does not belong to Group C in 293 / ORF6 cells has been increased compared to the complementation in 293 cells.
Using standard plaque formation protocols, the ability of wild-type Ad7a to form plaques in various cell lines was determined. The cytopathic effect of viruses derived from Ad7 and Ad5 is different during infection of A549 or 293 cells. In addition, plaque formation takes a little longer for Ad7a compared to Ad5. Also, the proportion of viral particles to plaque forming units (pfu) in the case of Ad7a viruses (approximately 2,000 particles / pfu or more) of the infecting '293 cell is significantly higher than the ratio of the particle to pfu particle size of Ad5 infecting 293 cells (approximately 40 to 50 particles / pfu).
Wild-type Ad7-CAT and Ad7a were plated on 293 cells to create plaques. In several experiments, no plaques containing E1 deficient Ad7 and wild type contamination virus were identified. Repeated plaque formation easily increases the ratio of wild-type virus to E1 deficient virus.
Using modified 293 cells (which supplement E1A and E1B), the same plaque formation procedure was performed. In these plaques, the ORE6 gene product of the E4 region of the adenoviral genome (i.e., 293 / ORF6 cells) is expressed. This procedure leads to a substantial increase in plaque counts compared to plaque formation on normal 293 cells. In addition, an apparent improvement in plaque morphology was observed, suggesting a higher degree of complementation in 293 / ORF6 cells than in 293. Moreover, no PCR was detected in the virus stock solutions no E1 DNA (i.e., no wild-type virus was found in the plaque-purified stock solutions). Some of these Ad7-CAT stock solutions lacking replication competent adenovirus (without RCA) mediated the production of a large number of CATs in infected A549 cells. In addition, the virus concentration of 1012 particles / ml was detected without increasing the virus titer. The virus yield, which is approximately 2 x 10 12 viral particles from a confluent culture of 293 / ORF6 cells on a 35 mm plate, was substantially the same as expected for Ad5 infection.
This example shows that determining the gene function of the E4 region of the adenoviral genome, surprisingly, enhances the complementarity of E1 deficient adenoviruses in addition to the substantial E1 gene functions of the adenoviral genome region, where the E1 gene products provided in the trans form are derived from serogroup adenoviruses different from the serogroup of replication deficient adenoviruses. Example 7: In this example, the enhanced complementation of E1 deficiency is described by providing an in trans form of the E4 gene product other than 0RF6. The production and degree of complementation of E1 deficient Ad7 is compared between 293 and 293 / E4-ORF4 cells.
293 / ORF4 cells are produced by incorporating the 0RF4 expression cassette into the 293 genome. The 0RF4 expression cassette contains either the sheep metallothionein promoter or the MMTV LTR promoter operably linked to a DNA segment that encodes the 0RF4 Ad5 gene product. If an MMTV promoter is used, then a second expression cassette is also incorporated into a cell that constitutively produces a high amount of glucocorticoid receptor. Alternatively, the expression cassette suitable for the substantial gene functions of the E1 Ad5 region and the above-described ORF4 expression cassette are incorporated into a second cell line, such as COS-1, A549, HeLa, or 293 cells. The resulting cell line is called 293 / ORF4. 27 ♦ ♦ • • · · · · · · · t t * * · · «« «· · · • • · · · · · · · · · ·
Wild-type Ad7-CAT and Ad7 mixtures are plated on 293 / ORF4 cells to produce plaques to obtain single plaques containing only E1 deficient Ad7. Example 8:
This example evaluates the similarity between adenoviruses not belonging to group C with respect to group C adenoviruses.
The similarities and differences between the different groups of adenoviruses were tested by comparing the amino acid similarity and identity between the E1A and E1B Ad2 (Group C), Ad5 (Group C), Ad7 (Group B), Ad12 (Group A) and Ad40 (Group F) products. With respect to viruses in the same group, especially between Ad2 and Ad5 in Group C, there is a 99% similarity and 98% agreement between the E2A and E1B Ad2 and Ad5 gene products. In contrast, the comparison of viruses of different groups showed considerably reduced similarity and less consensus. Among the products of the E1A and E1B genes Ad7, Ad12 and Ad40, for example, there are 63 to 75% similarity and 40 to 53% agreement compared to the products of the E1A and E1B genes Ad2 and Ad5.
Certain domains have been found to be conserved among viruses in different groups, such as those of the E1A and E1B genes of adenoviruses of group C and adenoviruses that do not belong to group C. Thus, differences between certain viruses not belonging to group C were found to in comparison with viruses belonging to group C, they are similar in that the demonstration of the ability of adenoviruses of group B shows the same abilities as other adenoviruses not belonging to group C. Especially demonstrating the ability of E1 defective adenoviruses of group B, for example Ad7, to be complemented by HEK cells -293 (as described in Example 3) demonstrates the ability of other non-C group adenoviruses to be complemented by HEK-293 cells.
One of ordinary skill in the art will be able to obtain and propagate any known adenovirus serotype. If an expert obtains a replenished virus stock solution, he can isolate the DNA from the virus and sequencing it. 28 9 · 9 9 9 9 9 · 9 · * · · · · ff * 9 9 * 9 • «9 9 · ♦ tf I «9 9 9 · 9 9 9» ··· 999 9 # # 9 999 99 9 routine method, that is, it does not have to do anything unusual. It is then also easy to identify the standard regions of the adenoviral genome by routine sequence comparison. Thus, oligonucleotides can also be designed to identify sites that recognize restriction enzymes. Thus, while the methods of use in the examples show the use of Ad7, these methods can be easily applied to other adenovirus serotypes.
Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19994131A CZ413199A3 (en) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | Process for preparing adenovirus vectors that do not pertain to group C |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19994131A CZ413199A3 (en) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | Process for preparing adenovirus vectors that do not pertain to group C |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ413199A3 true CZ413199A3 (en) | 2000-04-12 |
Family
ID=5467722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19994131A CZ413199A3 (en) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | Process for preparing adenovirus vectors that do not pertain to group C |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ413199A3 (en) |
-
1998
- 1998-05-20 CZ CZ19994131A patent/CZ413199A3/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0988389B1 (en) | Method for the production of non-group c adenoviral vectors | |
| EP0866873B1 (en) | Non-group c adenoviral vectors | |
| CA2192442C (en) | Complementary adenoviral vector systems and cell lines | |
| AU711366B2 (en) | Complementary adenoviral vector systems and cell lines | |
| US5922576A (en) | Simplified system for generating recombinant adenoviruses | |
| JP3672494B2 (en) | Advanced throughput screening methods for gene function using libraries for functional genome applications | |
| WO1997012986A9 (en) | Non-group c adenoviral vectors | |
| JPH10508491A (en) | Novel adenovirus vectors, packaging cell lines, recombinant adenoviruses and methods | |
| WO1999053089A1 (en) | Recombinant adenovirus gene transfer vector | |
| CN112011570B (en) | Oncolytic virus system for specifically killing tumor cells and application thereof | |
| CZ413199A3 (en) | Process for preparing adenovirus vectors that do not pertain to group C | |
| CZ20021215A3 (en) | Process for preparing recombinant adenoviruses and adenovirus libraries | |
| AU730278B2 (en) | Complementary adenoviral vector systems and cell lines | |
| AU703768C (en) | Complementary adenoviral vector systems and cell lines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |