CZ399A3 - Polypeptide analogs of cation-active polypeptides - Google Patents
Polypeptide analogs of cation-active polypeptides Download PDFInfo
- Publication number
- CZ399A3 CZ399A3 CZ993A CZ399A CZ399A3 CZ 399 A3 CZ399 A3 CZ 399A3 CZ 993 A CZ993 A CZ 993A CZ 399 A CZ399 A CZ 399A CZ 399 A3 CZ399 A3 CZ 399A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- analog
- seq
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 134
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 132
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 130
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 claims abstract description 97
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 66
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 8
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 6
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 claims description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 16
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 abstract description 98
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 87
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 72
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 abstract description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 69
- 102220552473 Platelet-activating factor acetylhydrolase_K64D_mutation Human genes 0.000 description 40
- 102220473986 Meiosis inhibitor protein 1_R61F_mutation Human genes 0.000 description 37
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 18
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 13
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 102220500028 Interferon-induced GTP-binding protein Mx2_K95A_mutation Human genes 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 241000282322 Panthera Species 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N Cys-Arg Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 7
- 101000634196 Homo sapiens Neurotrophin-3 Proteins 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 102000057714 human NTF3 Human genes 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- -1 for example Proteins 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- GCACQYDBDHRVGE-LKXGYXEUSA-N Asp-Thr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O GCACQYDBDHRVGE-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 102220465647 Lymphocyte activation gene 3 protein_R97E_mutation Human genes 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 102100034195 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108010064892 trkC Receptor Proteins 0.000 description 4
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N Asp-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- QBUWQRKEHJXTOP-DCAQKATOSA-N Ser-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QBUWQRKEHJXTOP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- YJVJPJPHHFOVMG-VEVYYDQMSA-N Thr-Met-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O YJVJPJPHHFOVMG-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 102000047459 trkC Receptor Human genes 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YKBHOXLMMPZPHQ-GMOBBJLQSA-N Arg-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKBHOXLMMPZPHQ-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 2
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- JGDBHIVECJGXJA-FXQIFTODSA-N Asp-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JGDBHIVECJGXJA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N Cys-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N)O BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N Cys-Asp Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- YZFCGHIBLBDZDA-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YZFCGHIBLBDZDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- SGZVZUCRAVSPKQ-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N SGZVZUCRAVSPKQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- NBIIPOKZPUGATB-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O NBIIPOKZPUGATB-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 2
- XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N Thr-Ser-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N)O XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWARNRIBWGHMIS-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[2-(4,5-dimethyl-1,3-thiazol-2-yl)-3-(4-sulfophenyl)-1h-tetrazol-5-yl]phenoxy]acetic acid Chemical class S1C(C)=C(C)N=C1N1N(C=2C=CC(=CC=2)S(O)(=O)=O)N=C(C=2C=C(OCC(O)=O)C=CC=2)N1 YWARNRIBWGHMIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SDMAQFGBPOJFOM-GUBZILKMSA-N Ala-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SDMAQFGBPOJFOM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BVSGPHDECMJBDE-HGNGGELXSA-N Ala-Glu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N BVSGPHDECMJBDE-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- OSASDIVHOSJVII-WDSKDSINSA-N Arg-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OSASDIVHOSJVII-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N Arg-Gly-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N Arg-His Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZPWMEWYQBWSGAO-ZJDVBMNYSA-N Arg-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZPWMEWYQBWSGAO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- POZKLUIXMHIULG-FDARSICLSA-N Arg-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N POZKLUIXMHIULG-FDARSICLSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- PLVAAIPKSGUXDV-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)N PLVAAIPKSGUXDV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Asp-Ile Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 101100228200 Caenorhabditis elegans gly-5 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 235000000509 Chenopodium ambrosioides Nutrition 0.000 description 1
- 244000098897 Chenopodium botrys Species 0.000 description 1
- 235000005490 Chenopodium botrys Nutrition 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- MQQLYEHXSBJTRK-FXQIFTODSA-N Cys-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N MQQLYEHXSBJTRK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101100127166 Escherichia coli (strain K12) kefB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- TWYSSILQABLLME-HJGDQZAQSA-N Glu-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWYSSILQABLLME-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FXTUGWXZTFMTIV-GJZGRUSLSA-N Gly-Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)CN FXTUGWXZTFMTIV-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ZIMTWPHIKZEHSE-UWVGGRQHSA-N His-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O ZIMTWPHIKZEHSE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- CKRJBQJIGOEKMC-SRVKXCTJSA-N His-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CKRJBQJIGOEKMC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000739876 Homo sapiens Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- NHJKZMDIMMTVCK-QXEWZRGKSA-N Ile-Gly-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NHJKZMDIMMTVCK-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- IVFUVMSKSFSFBT-NHCYSSNCSA-N Lys-Ile-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IVFUVMSKSFSFBT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- LKDXINHHSWFFJC-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)N LKDXINHHSWFFJC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000542855 Megathura crenulata Species 0.000 description 1
- BKIFWLQFOOKUCA-DCAQKATOSA-N Met-His-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N BKIFWLQFOOKUCA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 206010028116 Mucosal inflammation Diseases 0.000 description 1
- 101000931108 Mus musculus DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 101500000014 Ricinus communis Allergen Ric c 3 small chain Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GHPQVUYZQQGEDA-BIIVOSGPSA-N Ser-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O GHPQVUYZQQGEDA-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- JMQUAZXYFAEOIH-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O JMQUAZXYFAEOIH-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- YBXMGKCLOPDEKA-NUMRIWBASA-N Thr-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YBXMGKCLOPDEKA-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- XFTYVCHLARBHBQ-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XFTYVCHLARBHBQ-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- ZMYCLHFLHRVOEA-HEIBUPTGSA-N Thr-Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZMYCLHFLHRVOEA-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- KVEWWQRTAVMOFT-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KVEWWQRTAVMOFT-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Chemical group CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Chemical group 0.000 description 1
- UKINEYBQXPMOJO-UBHSHLNASA-N Trp-Asn-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N UKINEYBQXPMOJO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- RWTFCAMQLFNPTK-UMPQAUOISA-N Trp-Val-Thr Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)=CNC2=C1 RWTFCAMQLFNPTK-UMPQAUOISA-N 0.000 description 1
- IELISNUVHBKYBX-XDTLVQLUSA-N Tyr-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 IELISNUVHBKYBX-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- PHKQVWWHRYUCJL-HJOGWXRNSA-N Tyr-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O PHKQVWWHRYUCJL-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- TYFLVOUZHQUBGM-IHRRRGAJSA-N Tyr-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 TYFLVOUZHQUBGM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BWVHQINTNLVWGZ-ZKWXMUAHSA-N Val-Cys-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BWVHQINTNLVWGZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- JVYIGCARISMLMV-HOCLYGCPSA-N Val-Gly-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N JVYIGCARISMLMV-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N aluminum;silicic acid;hydrate Chemical compound O.[Al].[Al].O[Si](O)(O)O INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001483 arginine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 101150023807 copB gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000051542 human BDNF Human genes 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000191 poly(N-vinyl pyrrolidone) Polymers 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 101150055347 repA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů z Polypeptide analogues of cationic polypeptides from
Oblast technikyField of technology
Vynález se obecně týká polypeptidových analog terapeuticky aktivních kationaktivních proteinů, včetně (ale nejenom) analog neurotrofických faktorů známých jako neurotro-fi-n-33—(-N-T--3-)—a—neurotrofickýfaktor pocházející z-mozku(BDNF-faktor; brain derived neurotrophic factor). Přesněji řečeno, tento vynález popisuje kationaktivní polypeptidy, jejichž nativní sekvence byla pozměněna tak, že vzniklá analoga mají nižší izoelektrické body a/nebo vykazují po parenterální aplikaci zvýšenou absorpci in vivo. Vynález rovněž popisuje materiály a způsoby pro produkci zmíněných polypeptidových analog, protilátek namířených proti těmto analogům a farmaceutické přípravky obsahující tato analoga, kde zmíněné farmaceutické přípravky mohou být použity k léčbě nej různějších onemocnění a patologických stavů.The invention generally relates to polypeptide analogs of therapeutically active cationic proteins, including (but not limited to) analogs of neurotrophic factors known as neurotrophin-n-33-(-N-T--3-)-a-brain-derived neurotrophic factor (BDNF-factor; brain derived neurotrophic factor). More specifically, the present invention describes cationic polypeptides whose native sequence has been altered such that the resulting analogs have lower isoelectric points and/or exhibit increased in vivo absorption after parenteral administration. The invention also describes materials and methods for the production of said polypeptide analogues, antibodies directed against these analogues and pharmaceutical preparations containing these analogues, where said pharmaceutical preparations can be used to treat a wide variety of diseases and pathological conditions.
Dosavadní stav technikyCurrent state of the art
Po parenterální aplikaci (jako například subkutánní, intravenózní nebo intramuskulární injekcí) nějakého terapeutického proteinu se ú jednotlivých takto aplikovaných proteinů mohou podstatně lišit jejich farmakokínetické vlastnosti jako například biologická dostupnost, doba setrvání v cirkulaci nebo rychlost clearence (vymizení z organizmu). Ačkoliv jsou ve mnoha laboratořích uskutečňovány pokusy o vyvinutí alternativních způsobů aplikace proteinových produktů, v současnosti je velmi málo známo o faktorech, které řídí farmakokinetiku terapeutických proteinů po parenterální • « ··· · ·« ··· ·· ·· « « · • t · · · « · · · · v · * · · · · » ·«··· ·· ♦ · · · · » * «»·* V» ·· · ·· aplikaci. Bylo prokázáno, že zvýšení molekulové hmotnosti proteinu má za následek přednostní příjem takového proteinu lymfatickým systémem (raději něž krevními kapilárami); viz. Supersaxo a další, Pharmaceutical Res., svazek 7, strana 167 a následující, 1990. Velikost molekuly terapeutického proteinu hraje rovněž klíčovou úlohu u příjmu insulinu, kde bylo prokázáno, že limitujícím krokem při příjmu insulinu je disociace hexamerů insulinu spojených prostřednictvím iontů zinku na monomerní formu; viz. Kang a další,—Diabetes Gare^— svazek 14, strany 942 až 948, 1991. Klinické testy analog monomerního insulinu, u kterých bylo odstraněno místo odpovědné za asociaci molekul, prováděné na pacientech postižených diabetem prokázaly u těchto pacientů rychlejší příjem zmíněných analog vedoucí k podstatnému zlepšení v řízení hladiny glukózy; viz,. Brange a další, Nátuře, svazek 33, strana 679 a následující, 1988.After parenteral application (such as by subcutaneous, intravenous or intramuscular injection) of a therapeutic protein, the individual proteins applied in this way may differ substantially in their pharmacokinetic properties, such as bioavailability, retention time in the circulation or clearance rate (disappearance from the body). Although attempts are being made in many laboratories to develop alternative routes of administration of protein products, very little is currently known about the factors that control the pharmacokinetics of therapeutic proteins after parenteral • « ··· · ·« ··· ·· ·· « « · • t · · · « · · · · v · * · · · · » ·«··· ·· ♦ · · · · » * «»·* V» ·· · ·· application. An increase in the molecular weight of a protein has been shown to result in preferential uptake of such protein by the lymphatic system (rather than blood capillaries); see Supersaxo et al., Pharmaceutical Res., Vol. 7, pp. 167 et seq., 1990. The molecular size of the therapeutic protein also plays a key role in insulin uptake, where the rate-limiting step in insulin uptake has been shown to be the dissociation of zinc-linked insulin hexamers into monomeric form; see Kang et al.,—Diabetes Gare^—Volume 14, pages 942-948, 1991. Clinical trials of monomeric insulin analogs in which the site responsible for molecular association has been removed in diabetic patients have shown a faster uptake of said analogs in these patients leading to substantial improvement in glucose control; see,. Brange et al., Nature, Volume 33, Page 679ff, 1988.
Popis obrázků na výkresechDescription of the images on the drawings
Obrázek 1 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci lidského NT-3 divokého typu (tj. nativní sekvenci). Tento polypeptid byl produkován rekombinantně v bakteriální buňkách E. coli a exprimován s methioninem na N-konci, tj. jde o r-metHuNT-3 (SEK. ID. Č: 1). Číslování aminokyselinových zbytků začíná na obrázku 1 u prvního aminokyselinového zbytku následujícího po startovním methioninu (Met-1) a to proto, že přirozeně se vyskytující protein je v savčích buňkách normálně exprimován bez tohoto methioninu. (Povšimněte si, že v Seznamu sekvencí je Met počítán jako +1).Figure 1 shows the amino acid sequence of wild-type human NT-3 (ie, the native sequence). This polypeptide was produced recombinantly in E. coli bacterial cells and expressed with methionine at the N-terminus, i.e. r-metHuNT-3 (SEQ ID NO: 1). Amino acid residue numbering begins in Figure 1 at the first amino acid residue following the starter methionine (Met-1) because the naturally occurring protein is normally expressed in mammalian cells without this methionine. (Note that in the Sequence List Met is counted as +1).
Na obrázku 2 je znázorněna nukleotidová sekvence (SEK. ID. Č: 2 a obrázek 2A) a aminokyselinová sekvence .(SEK. ID..Figure 2 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2 and Figure 2A) and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2
99999999
ΦΦ 9999ΦΦΦ 9999
9999
9 9 9 9 · Φ Φ Φ Φ • Φ Φ ·9 9 9 Φ φφφφ φ φ Φφφφ Φ Φ ΦφΦ ΦΦΦ *Φ ΦΦΦΦΦ Φ Φ φφ ΦΦΦ ΦΦ * ·* ·♦9 9 9 9 · Φ Φ Φ Φ • Φ Φ ·9 9 9 Φ φφφφ φ φ Φφφφ Φ Φ ΦφφΦ ΦΦΦ *Φ ΦΦΦΦΦ Φ Φ φφ ΦΦΦ ΦΦ * ·* ·♦
Č: 3 a obrázek 2Β) polypeptidového analoga r-metHuNT-3 podle vynálezu, jmenovitě NT-3a-n9)R61A, K64D (s číslováním aminokyselin začínajícím u prvního aminokyselinového zbytku následujícího po startovním methioninu).No: 3 and Figure 2B) of the r-metHuNT-3 polypeptide analog of the invention, namely NT-3a-n9)R61A, K64D (with amino acid numbering starting at the first amino acid residue following the starting methionine).
Na obrázku 3 je znázorněna nukleotidová sekvence (SEK.Figure 3 shows the nucleotide sequence (SEQ.
ID. Č: 4 a obrázek 3A) a aminokyselinová sekvence (SEK. ID. Č: 5a obrázek 3B) jiného polypeptidového analoga r-metHuNT3 podle vynálezu, jmenovitě NT-3 (i.n7)R61A, K64D (s číslováním aminokyselin začínajícím u prvního aminokyselinového zbytku následujícího po startovním methioninu).id. NO: 4 and Figure 3A) and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5 and Figure 3B) of another r-metHuNT3 polypeptide analog of the invention, namely NT-3 (in 7 )R61A, K64D (with amino acid numbering starting at the first amino acid residue following the starting methionine).
Na obrázku 4 jsou znázorněny kalibrační (standardní) křivky u stanovení ELISA pro NT-3 divokého typu (tj. o sekvenci SEK. ID. Č: 1; kroužky) a pro analoga NT-3 o sekvencích SEK. ID. Č: 3 (NT-3(1.119)R61A,K64D; trojúhelníky) a SEK. ID. Č: 5 (N.T-3(1-H7JR61A,K64D; čtverečky). V grafu je vynesena optická hustota v závislosti na koncentraci vzorku vyjádřené v nanogramech na mililitr (ng/ml). Při stanoveních ELISA je křížová reaktivita k analogům NT-3 přibližně deset procent. Vzorky sér z farmakokinetických studií byly analyzovány metodou ELISA a koncentrace NT-3 divokého typu a analog NT-3 byly stanovovaný na zaklade srovnáni s odpovídajícími kalibračními křivkami.Figure 4 shows calibration (standard) curves for ELISA assays for wild-type NT-3 (i.e. with SEQ ID NO: 1; circles) and for NT-3 analogs with SEQ sequences. id. No: 3 (NT-3 (1 . 119) R61A,K64D; triangles) and SEC. id. No: 5 (NT-3(1-H7JR61A,K64D; squares). The graph shows optical density as a function of sample concentration expressed in nanograms per milliliter (ng/ml). Cross-reactivity with NT-3 analogues in ELISA assays approximately ten percent.Sera samples from pharmacokinetic studies were analyzed by ELISA, and concentrations of wild-type NT-3 and the NT-3 analog determined at baseline were compared to the corresponding calibration curves.
Obrázek 5 znázorňuje chromatogram z vysokoúčinné kapalinové chromatografie na nosiči pro gelovou chromatografii (SEC-HPLC; size exclusion high performance liquid chromatogram) , kde je NT-3 divokého typu srovnáván s analogy NT-3 o sekvencích znázorněných na obrázcích 2 a 3. Na ose y jsou vyneseny jednotky absorbance (AU) a na ose x je znázorněn eluční čas (v minutách). Z obrázku je vidět, že zmíněná analoga jsou eluována ve stejném čase jako molekula divokého typu což ukazuje, že nekovalentní dimerní struktura NT-3 divokého typu nebyla rozrušena ani u jednoho z analog.Figure 5 shows a size exclusion high performance liquid chromatogram (SEC-HPLC) chromatogram comparing wild-type NT-3 with NT-3 analogs having the sequences shown in Figures 2 and 3. On the axis y are plotted in absorbance units (AU) and the x-axis shows elution time (in minutes). It can be seen from the figure that the mentioned analogs are eluted at the same time as the wild-type molecule, which indicates that the non-covalent dimeric structure of wild-type NT-3 was not disrupted in either of the analogs.
V žádném z těchto preparátů hebyly detekovány agregované_ *4 44«4 4» »4«· 4« 44 ββ» 44 · · · · * • 4 4 4 4 *4 4 444 4 « 4 444 4 4« *44444 *4 44444 4 4In none of these preparations were detected aggregates_ *4 44«4 4» »4«· 4« 44 ββ» 44 · · · · * • 4 4 4 4 *4 4 444 4 « 4 444 4 4« *44444 *4 44444 4 4
44444 44 44 44 4 · molekuly proteinů. Legenda: ( _ ) NT-3 divokého typu; ( --- ) NT-3 (i-117)R61A, K64D; a ( ) NT-3 (1-119)R61A, K64D.44444 44 44 44 4 · protein molecules. Legend: ( _ ) wild-type NT-3; ( --- ) NT-3 ( i- 117 )R61A, K64D; and ( ) NT-3 (1 - 119) R61A, K64D.
Obrázek 6 znázorňuje chromatogram z vysokoúčinné kapalinové chromatografie na katexu (CEX-HPLC; cation exchance high performance liquid chromatogram), kde je NT-3 divokého typu srovnáván s analogy NT-3 o sekvencích znázorněných na obrázcích 2 a 3. Na svislé ose jsou vyneseny jednotky absorbance (AU). Na vodorovné ose je znázorněn eluční čas (v minutách). Na tomto obrázku je vidět,—že—zm-íněná-analogajsou eluována dříve než NT-3 divokého typu, což je v souladu s nižší hodnotou izoelektrických bodů těchto analog. Legenda: ( _ ) NT-3 divokého typu; (----) NT-3 d-117)R61A, K64D;Figure 6 shows a cation exchange high performance liquid chromatography (CEX-HPLC) chromatogram comparing wild-type NT-3 to NT-3 analogs with the sequences shown in Figures 2 and 3. Plotted on the vertical axis are absorbance units (AU). The horizontal axis shows the elution time (in minutes). In this figure, it can be seen that these analogs are eluted earlier than wild-type NT-3, which is consistent with the lower isoelectric points of these analogs. Legend: ( _ ) wild-type NT-3; (----) NT-3 d- 117 )R61A, K64D;
a ( ) NT-3I1-i19,R61A,K64D.and ( ) NT-3 I1 -i 19 ,R61A,K64D.
Na obrázku 7 je znázorněn elektroforetický chromatogram SDS polyakrylamidového gelu barveného stříbrem. Zde je NT-3 divokého typu (viz. obrázek 1) srovnáván s analogy NT-3 o sekvencích znázorněných na obrázcích 2 a 3. Všechny tři vzorky putovaly při elektrofořeze jako jeden proužek o přibližně stejných molekulových hmotnostech odpovídajících monomerním formám. V žádném ze vzorků není pozorována pří- « « a n » η μ λ w Vh X -! λ ť λ wt v* λ íí w » ď λ Ί ! Λ ΊΊ-ι λ ν»β» Λ TVÍ r-1 *t nVn Ί .Figure 7 shows an electrophoretic chromatogram of a silver-stained SDS polyacrylamide gel. Here, wild-type NT-3 (see Figure 1) is compared to NT-3 analogs with the sequences shown in Figures 2 and 3. All three samples migrated as a single band on electrophoresis of approximately equal molecular weights corresponding to the monomeric forms. In none of the samples is observed a pre- « « an » η μ λ w Vh X -! λ ť λ wt v* λ íí w » ď λ Ί ! Λ ΊΊ-ι λ ν» β » Λ TVÍ r-1 *t nVn Ί .
UULLlllkJD U V _ý ώ J Ο J-HO |Ι U ΑΟ Ο L· V J. S-/ X X LLIC X ΙΛ η ι vi-l vých hmotnostech nebo fragmentů o nižších molekulových hmotnostech. Dráha 1: NT-3 (1.117)R61A, K64D, 2,5 μg; dráha 2: NT3 (1-119)R61A,K64D, 2,5 μg; dráha 3: NT-3 divokého typu, 2,5 μg; dráha 4: NT-3 divokého typu, 12,5 μg; dráha 5: standardy o známých molekulových hmotnostech.UULLlllkJD UV _ý ώ J Ο J-HO |Ι U ΑΟ Ο L· V J. S-/ XX LLIC X ΙΛ η ι vi-l weights or fragments with lower molecular weights. Lane 1: NT-3 (1 . 117 )R61A, K64D, 2.5 μg; lane 2: NT3 (1-119)R61A,K64D, 2.5 μg; lane 3: wild-type NT-3, 2.5 μg; lane 4: wild-type NT-3, 12.5 μg; lane 5: standards of known molecular weights.
Na obrázku 8 jsou znázorněny profily sérových koncentrací (v nanogramech na mililitr) proteinů o sekvencích SEK.Figure 8 shows serum concentration profiles (in nanograms per milliliter) of proteins with SEQ sequences.
ID. Č: 1 (plná kolečka), SEK. ID. Č: 3 (prázdné kroužky) a SEK. ID. Č: 5 (plné obdélníčky) v závislosti na čase (v hodinách) po intravenózní aplikaci (IV) do organizmu pokusných potkanů. Podávaná dávka obsahovala 1 miligram proteinu na kilogram,(mg/kg) tělesné,hmotnosti. Profily koncentracíid. No: 1 (solid circles), SEC. id. No: 3 (empty circles) and SEC. id. No: 5 (filled rectangles) depending on the time (in hours) after intravenous application (IV) into the body of experimental rats. The administered dose contained 1 milligram of protein per kilogram (mg/kg) of body weight. Concentration profiles
44444444
44444444
4 444 *4 4 444« · 444 4 44 4 4 4 4 4 44 444 *4 4 444« · 444 4 44 4 4 4 4 4 4
44444 4 4 «4 444 «4 44 44 4« jsou dvoufázové. Počáteční distribuční fáze byla následována pomalejší eliminační fází. Každý bod grafu reprezentuje průměrnou hodnotu ze tří pokusných zvířat.44444 4 4 «4 444 «4 44 44 4« are two-phase. An initial distribution phase was followed by a slower elimination phase. Each point of the graph represents the average value from three experimental animals.
Na obrázku 9 jsou znázorněny křivky sérových koncentrací (v nanogramech na mililitr) proteinů o sekvencích SEK. ID.Figure 9 shows serum concentration curves (in nanograms per milliliter) of proteins with SEQ sequences. id.
Č: 1 (plná kolečka), SEK. ID. Č: 3 (prázdné kroužky) a SEK, ID. Č: 5 (plné obdélníčky) v závislosti na čase (v hodinách) po subkutánním podání (SC) proteinu v množství 1 mg/kg do organizmu pokusných potkanů. Každý bod grafu reprezentujeprůměrnou hodnotu ze tří pokusných zvířat. Absorpční fáze je charakterizována zvyšováním sérové koncentrace proteinu. NT3 divokého typu (SEK. ID. Č: l) vykazuje, po dosažení maximální koncentrace, nej rychlejší snížení sérové koncentrace.No: 1 (solid circles), SEC. id. No: 3 (open circles) and SEK, ID. No: 5 (filled rectangles) depending on the time (in hours) after subcutaneous administration (SC) of protein in the amount of 1 mg/kg into the body of experimental rats. Each point of the graph represents the average value from three experimental animals. The absorption phase is characterized by an increase in serum protein concentration. Wild-type NT3 (SEQ ID NO: 1) shows, after reaching the maximum concentration, the fastest decrease in the serum concentration.
Podstata vynálezuThe essence of the invention
2a účelem stanovení vlivu hodnoty izoelektrického bodu (pí) na farmakokinetické vlastnosti proteinů, byla vytvořena analoga NT-3 a BDNF-faktoru s relativně nižšími hodnotami pi, priceruz u uccnto analog byla zachovana struktura a biologická aktivita proteinů v „nativním stavu (tj. proteinů s přirozeně se vyskytující aminokyselinovou sekvencí, jakož i jejich verzí Met'1 (s methioninem na první pozici); obě tyto verze jsou v přihlášce označovány jako proteiny divokého typu)). Na základě těchto studií bylo zjištěno, žé vytvořená proteinová analoga s nižší hodnotou pí a/nebo nižším nábojem za fyziologických podmínek (vzhledem k molekule divokého typu) setrvávají po injekční aplikaci in vivo v krevním oběhu déle (tj. jejich poločas života je delší) a vykazují zvýšenou absorpci. Ačkoliv je tento vynález ilustrován na příkladech lidského NT-3 a BDNF-faktoru, je jeho použitelnost samozřejmě širší a tento vynález může být vyu5 ·»··2a in order to determine the effect of the value of the isoelectric point (pi) on the pharmacokinetic properties of proteins, analogs of NT-3 and BDNF-factor with relatively lower pi values were created, while the structure and biological activity of the proteins in the "native state" (i.e. proteins with the naturally occurring amino acid sequence as well as their Met' 1 version (with methionine in the first position); both of these versions are referred to in the application as wild-type proteins)). Based on these studies, it was found that the protein analogs created with a lower pi value and/or a lower charge under physiological conditions (relative to the wild-type molecule) persist longer in the bloodstream after in vivo injection (i.e., their half-life is longer) and show increased absorption. Although this invention is illustrated by the examples of human NT-3 and BDNF-factor, its applicability is of course wider and this invention can be vyu5 ·»··
I * · ··«· «4 44 » 4 » « žit u jakéhokoliv kationaktivního proteinu, a zvláště pak u bazických proteinů s hodnotou pí vyšší než 7,0.I * · ··«· «4 44 » 4 » « live in any cation-active protein, and especially in basic proteins with a pi value higher than 7.0.
Melo by být zřejmé, že termíny „protein a „polypeptid používané v této přihlášce jsou navzájem zaměnitelné a označují jednu a tutéž věc.It should be understood that the terms "protein" and "polypeptide" as used herein are interchangeable and refer to one and the same thing.
Stručně řečeno, tento vynález popisuje substituční, inzerční a deleční analoga kationaktivních terapeutických proteinů a/nebo chemicky modifikované verze zmíněných terapeutických proteinů. 'Tafeo-anaioga—nebo-chemicky-modifiko_vané_ verze zmíněných terapeutických proteinů jsou charakterizovány nižší hodnotou pí a rovněž vykazují, vzhledem k nemodifikovaným proteinům (tj. proteinům s nativní sekvencí) , zvýšenou absorpci a/nebo delší setrvání v krevním oběhu. Proteinová analoga podle vynálezu jsou obvykle lidské terapeutické proteiny, které jsou obyčejně,, ale ne nezbytně, bazické proteiny. Ve výhodném provedení mají tyto proteiny, ve srovnání s nemodifikovanými bazickými proteiny, za fyziologických podmínek nižší náboj.Briefly, this invention describes substitution, insertion and deletion analogs of cationically active therapeutic proteins and/or chemically modified versions of said therapeutic proteins. The 'tafeo-anaioga' or 'chemically modified' versions of said therapeutic proteins are characterized by a lower pI value and also show, with respect to unmodified proteins (i.e. proteins with native sequence), increased absorption and/or longer retention in the bloodstream. Protein analogs of the invention are usually human therapeutic proteins which are usually, but not necessarily, basic proteins. In a preferred embodiment, these proteins, compared to unmodified basic proteins, have a lower charge under physiological conditions.
Vynález popisuje materiály a způsoby pro produkci zmíněných analog rekombinantními technikami (výhodné způsoby pro vtip? nnr!Ί 3 <=> nrnh ί 1 átlí-v nrnti ť ť *· “ J — —-------J C---prdKuicke využiti)· Vynalez ro7 těmto analogům a farmaceutické, přípravky pro použití při léčbě onemocnění nebo patologických stavů, obsahující zmíněná analoga jako biologicky aktivní látky.The invention describes materials and methods for the production of said analogues by recombinant techniques (excellent methods for wit? nnr!Ί 3 <=> nrnh ί 1 átlí-v nrnti ť ť *· “ J — —-------J C -- -prdKuicke ružiteti)· Invention ro 7 these analogs and pharmaceutical preparations for use in the treatment of diseases or pathological conditions, containing the mentioned analogs as biologically active substances.
Principy popsané ve vynálezu mohou být aplikovány na jakýkoliv kationaktivní protein, u kterého bude mít snížení hodnoty pí (a v některých případech náboje proteinu) za následek posílení biologických vlastností důležitých pro terapeutickou funkci. Takovými vlastnostmi jsou například doba setrvání v krevním oběhu a/nebo absorpce po parenterální aplikaci. Příkladem takových proteinů jsou (výčet není limitující) bazické proteiny jako.například NT-3, BDNF6The principles described in the invention can be applied to any cationically active protein for which a reduction in the pi value (and in some cases the charge of the protein) will result in enhanced biological properties important for therapeutic function. Such properties are, for example, the residence time in the bloodstream and/or absorption after parenteral administration. Examples of such proteins are (the list is not limiting) basic proteins such as, for example, NT-3, BDNF6
9« 999« 99
I «9 «I «9 «
I 9 999 9 *9 * · 99»» 9 9 999 999 & · 999·· 9 9 >99 99 99 99 99 faktor, růstový a diferenciační faktor makrofágů, jehož nejrůznější známé izoformy vykazují v podstatě stejnou schopnost stimulovat in vivo a ex vivo produkci krevních destiček (v této přihlášce jsou izoformy zmíněného faktoru společně označovány jako „MGDF,) a růstový faktor keratinocytů (KGF). Detailní popisy těchto- faktorů, jejich biologických vlastností a způsobů jejich přípravy a testování jsou popsány v patentových přihláškách: NT-3 je popsán v—přihlášce—PG-T-W0Ri/-0J56-9-;—BDNF^faktor_v_pahentových_přiz:_ hláškách US 5180820, 5229500, 5438121 a 5453361 a v publikované přihlášce PCT WO95/26745; MGDF v publikovaných přihláškách PCT WO95/26745, WO95/21919 a WO95/21920; a KGF v publikované přihlášce PCT W090/08771.I 9 999 9 *9 * · 99»» 9 9 999 999 & · 999·· 9 9 >99 99 99 99 99 factor, growth and differentiation factor of macrophages, the various known isoforms of which show basically the same ability to stimulate in vivo and ex in vivo production of platelets (in this application the isoforms of said factor are collectively referred to as "MGDF") and keratinocyte growth factor (KGF). Detailed descriptions of these factors, their biological properties and methods of their preparation and testing are described in patent applications: NT-3 is described in—application—PG-T-W0Ri/-0J56-9-;—BDNF^faktor_v_pahentových_prize:_ US notices 5180820, 5229500, 5438121 and 5453361 and in published PCT application WO95/26745; MGDF in published PCT applications WO95/26745, WO95/21919 and WO95/21920; and KGF in published PCT application WO90/08771.
Cílem vynálezu je v podstatě vytvořit jednu nebo více modifikací primární struktury proteinu divokého typu tak, aby byla zachována struktura a biologická aktivita, zmíněného proteinu, ale aby současně došlo ke snížení hodnoty izoelektrického bodu a snížení náboje při fyziologickém pH. Přesný způsob, jehož prostřednictvím jsou tyto modifikace prováděny není podstatný, a k dosažení popisovaných vylepšených vlasti ·* & v 1 I y, Γ1, o Ί rnrr 1The objective of the invention is essentially to create one or more modifications of the primary structure of the wild-type protein in such a way that the structure and biological activity of said protein are preserved, but that at the same time there is a decrease in the value of the isoelectric point and a decrease in the charge at physiological pH. The exact method through which these modifications are carried out is not essential, and to achieve the described improved homeland ·* & v 1 I y, Γ 1 , o Ί rnrr 1
111M. ÍJ 'v žit 1 akvkolΊ'J' vpdnnní k vvše uvedeU _k. v w — —£- — J.111M. ÍJ 'v žit 1 akvkolΊ'J' vpdnnni k vvse udedU _k. in w — —£- — J .
ným změnám. Toliko jako ilustrace je zmíněn postup, který k dosažení požadovaných modifikací využívá cílené mutageneze zahrnující přidání kyselých aminokyselinových zbytků do dané sekvence, a to vložením kyselých aminokyselinových zbytků a/nebo substitucí jiných aminokyselin kyselými aminokyselinovými zbytky a/nebo odstraněním bazických aminokyselin delecí a/nebo jejich nahrazením. Jinou možností, vedoucí k dosažení stejného cíle (tj. snížení hodnoty pí a náboje při zachování struktury a biologické aktivity), je přidání chemických skupin nebo částí molekul na vybraná místa (tj. na aminokyselinové zbytky) v peptidovém řetězci molekuly divokého typu. Specifickým případem je připojení kyseliny φφ φφφφ • v ··· Φ φφ φφ • φ · · · φφφφ • · ··« · · · φ φ · φ • · φ φ φ φ φφφφφ φφφ φφ ΦΦΦ·· φ φ φφφφφ φφ φφ ·· ·· jantarové na vybrané aminokyselinové zbytky v řetězci proteinu.changes. By way of illustration, a method is mentioned that uses targeted mutagenesis to achieve the desired modifications, including the addition of acidic amino acid residues to a given sequence, by inserting acidic amino acid residues and/or substituting other amino acids with acidic amino acid residues and/or removing basic amino acids by deletion and/or their by replacing Another possibility, leading to the achievement of the same goal (i.e. reducing the value of pi and charge while preserving the structure and biological activity), is the addition of chemical groups or parts of the molecules at selected places (i.e. at amino acid residues) in the peptide chain of the wild-type molecule. A specific case is the addition of acid φφ φφφφ • v ··· Φ φφ φφ • φ · · · φφφφ • · ··« · · · φ φ · φ • · φ φ φ φφφφφ φφφ φφ ΦΦΦ·· φ φ φφφφφ φφ φφ ·· ·· amber to selected amino acid residues in the protein chain.
Nukleové kyseliny kódující analoga proteinů podle vynálezu (tj. polypeptidy lišící se od polypeptidu divokého typu v jednom nebo více aminokyselinových zbytcích) mohou být vytvořeny s využitím cílené mutageneze nebo amplifikací metodou PCR, při níž obsahuje primer (primery) požadovanou bodovou mutaci. Detailní popisy vhodných postupů mutageneze _j.s ou u ve de nyi_vi_publ ikacíchS ambro o k a da1 š í, Mo1 ecu 1 ar— Cl o -ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989; nebo Ausubel a další,Nucleic acids encoding protein analogs according to the invention (i.e., polypeptides differing from the wild-type polypeptide in one or more amino acid residues) can be created using site-directed mutagenesis or PCR amplification in which the primer(s) contain the desired point mutation. Detailed descriptions of appropriate mutagenesis procedures are available in the published publications of Ambrosia, Mo1ecu1ar— Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989; or Ausubel and others,
Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers lne. and Wiley and Sons, NY, 1994. K přípravě zmíněných nukleových kyselin mohou být rovněž využity postupy chemické syntézy popsané v publikaci Engels a další, Angew. Chem.Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers lne. and Wiley and Sons, NY, 1994. The chemical synthesis procedures described in Engels et al., Angew. Chem.
Intl. Ed., svazek 28, strany -716 až-734, 1989.Intl. Ed., Volume 28, Pages -716 to -734, 1989.
Zmíněné molekuly DNA mohou být použity k expresi analog polypeptidu podle vynálezu v rekombinantních systémech odborníkům dobře známých. Mezi takové způsoby produkce patří (nejenom) způsoby popsané ve výše zmíněných patentových přihláškách pro NT-3,- BDNF-faktor, KGF a MGDF, Jako ilustrace může být zmíněn postup, kdy je nukleotidová sekvence kódující nějaký analog polypeptidu podle vynálezu vložena do * vhodného biologicky funkčního vektoru (například do cirkulárního plazmidu nebo virové DNA) pro expresi ve vhodné hostitelské buňce. Zmíněný-vektor zahrnuje regulační sekvence pro expresi vložené nukleotidové sekvence a je zvolen tak, aby byl funkční v použité hostitelské buňce (tj. tento vektor je kompatibilní s mašinérií hostitelské buňky tak, že může dojít k amplifikaci a/nebo expresi daného genu). Zmíněný polypeptid může být amplifikován/exprimován v kvasinkách, prokaryotické, hmyzí (bakulovirový systém) a/nebo eukaryotické hostitelské buňce. Výběr hostitelské buňky bude, ales8Said DNA molecules can be used to express polypeptide analogs according to the invention in recombinant systems well known to those skilled in the art. Such production methods include (but not limited to) the methods described in the above-mentioned patent applications for NT-3, BDNF-factor, KGF and MGDF. As an illustration, a procedure may be mentioned where a nucleotide sequence encoding a polypeptide analog according to the invention is inserted into * a suitable of a biologically functional vector (for example, into a circular plasmid or viral DNA) for expression in a suitable host cell. Said vector includes regulatory sequences for the expression of the inserted nucleotide sequence and is chosen to be functional in the host cell used (ie this vector is compatible with the host cell machinery so that amplification and/or expression of the given gene can occur). Said polypeptide may be amplified/expressed in a yeast, prokaryotic, insect (baculovirus system) and/or eukaryotic host cell. The host cell selection will, ales8
4944 · · 0 9 · 44 · 4 4 • ♦ »99« ·· 4 4« ·44 *9 «4*Α4944 · · 0 9 · 44 · 4 4 • ♦ »99« ·· 4 4« ·44 *9 «4*Α
4444
4 4 44 4 4
4 4 4 44 4 4 4
449 494 * 4 9449 494 * 4 9
99 44 poň z části, záviset na tom, má-li být exprimovaný polypeptidový produkt glykosylován. Je-li glykosylace žádoucí, jsou ve výhodném provedení použity kvasinky, hmyzí nebo savčí hostitelské buňky.99 44 depends, in part, on whether the expressed polypeptide product is to be glycosylated. If glycosylation is desired, yeast, insect or mammalian host cells are preferably used.
Obvykle budou dané vektory, obsahovat sekvenci (tato sekvence je rovněž označována jako „promotor) přiléhající k 5' konci vložené sekvence a další regulační elementy, a rovněž posilovač(-e) transkripce (enhancery), počátek replikace, _terminátor_transkripce_,_kompletní_intronovoLLsekvenci obsahující donorové a akceptorové místo sestřihu, sekvenci signálního peptidu, místo odpovědné za vazbu na ribozomy (RBS), polyadenylační signál, selekční markér a oblast polylinkeru sloužící ke vložení nukleotidové sekvence kódující polypeptid, který má být exprimován.Typically, the vectors will contain a sequence (this sequence is also referred to as a "promoter) adjacent to the 5' end of the inserted sequence and other regulatory elements, as well as enhancer(s) of transcription, an origin of replication, a _transcription_terminator_, a_complete_intronovoLL sequence containing the donor and an acceptor splice site, a signal peptide sequence, a ribosome binding site (RBS), a polyadenylation signal, a selectable marker, and a polylinker region used to insert the nucleotide sequence encoding the polypeptide to be expressed.
Sekvence přiléhající k 5' konci vloženého genu může být přirozená sekvence vyskytující se na 5' konci tohoto genu divokého typu nebo:to může být sekvence homologní (tj. ze stejného druhu a/nebo kmene jako hostitelská buňka), heterologní (tj. z druhu a/nebo kmene odlišného od hostitelské buňky), hybridní (tj. kombinace sekvencí z více než jednoho zdroje) nebo synteticky připravená.Z-drojem sekvence přiléhající k 5' konci vloženého genu může být jednobuněčný prokaryotický nebo eukaryotický organizmus, jakýkoliv obratlovec nebo bezobratlý nebo jakákoliv rostlina a to za předpokladu, že tato 5' sekvence je funkční v hostitelské buňce a může být v této hostitelské buňce aktivována.The sequence adjacent to the 5' end of the inserted gene may be the natural sequence occurring at the 5' end of the wild-type gene or : it may be a sequence homologous (i.e. from the same species and/or strain as the host cell), heterologous (i.e. from a species and/or a strain different from the host cell), hybrid (i.e., a combination of sequences from more than one source) or synthetically prepared. The Z-terminal sequence adjacent to the 5' end of the inserted gene may be a unicellular prokaryotic or eukaryotic organism, any vertebrate or invertebrate, or any plant, provided that this 5' sequence is functional in the host cell and can be activated in that host cell.
Počátek replikace je obvykle součástí prokaryotických expresívních vektorů zakoupených komerčně a je nezbytný pro amplifikaci daného vektoru v hostitelské buňce. Amplifikace vektoru na určitý počet kopií může být v některých případech důležitá pro optimální expresi daného polypeptidu. Jestliže zvolený vektor neobsahuje místo počátku replikace, může být ·» 444»·.The origin of replication is usually included in prokaryotic expression vectors purchased commercially and is necessary for amplification of the vector in the host cell. Amplification of a vector to a certain number of copies may in some cases be important for optimal expression of a given polypeptide. If the selected vector does not contain the origin of replication, it can be ·» 444»·.
• 4 * ·4 • a «a • 4 4 4 • 4 4 4• 4 * ·4 • a «a • 4 4 4 • 4 4 4
4*4 4444*4 444
4 • 4 44 tento element syntetizován chemicky na základě známé sekvence a následně zaligován do daného vektoru.4 • 4 44 this element chemically synthesized on the basis of a known sequence and subsequently ligated into the given vector.
Terminátor transkripce je obvykle umístěn v oblasti přilehlé ke 3' konci sekvence kódující požadovaný polypeptid a slouží k. ukončení (terminaci) transkripce tohoto polypeptidu. V prokaryotických buňkách je terminátor transkripce obvykle fragment s vysokým obsahem párů C-G následovaný sekvencí poly-T. I když tento element může být snadno nakloňován— z—něgaké kn i hovny ne bo-komerč ně_zakoupen jako součást vektoru, může být rovněž snadno syntetizován s využitím postupů pro syntézu nukleových kyselin popsaných výše.The transcription terminator is usually located in the region adjacent to the 3' end of the sequence encoding the desired polypeptide and serves to end (terminate) the transcription of this polypeptide. In prokaryotic cells, the transcription terminator is usually a fragment with a high content of C-G pairs followed by a poly-T sequence. Although this element can be easily cloned from any library or purchased commercially as part of a vector, it can also be easily synthesized using the nucleic acid synthesis procedures described above.
Selekční markér kóduje protein nezbytný k přežití a růstu hostitelských buněk kultivovaných v selekčním kultivačním médiu. Obvykle využívané geny selekčních markérů kódují proteiny, které (a) propůjčují nositeli rezistenci vůči antibiotikům nebo jiným toxinům, například vůči ampicilinu, tetracyklinu nebo kanamycinu u prokaryotických hostitelských buněk; (b) komplementují auxotrofní deficience buněk; nebo (c) dodávají životně důležité látky, které nejsou dostupné z komplexních médií. Ve výhodných provedeních jsou jako selekční markéry používány gen pro rezistenci vůči kanamycinu, gen pro rezistenci vůči ampicilinu a gen pro rezistenci vůči tetracyklinu.The selectable marker encodes a protein necessary for the survival and growth of host cells cultured in the selective culture medium. Commonly used selectable marker genes encode proteins that (a) confer resistance to the carrier to antibiotics or other toxins, such as ampicillin, tetracycline, or kanamycin in prokaryotic host cells; (b) complement the auxotrophic deficiencies of the cells; or (c) supply vital substances not available from complex media. In preferred embodiments, the kanamycin resistance gene, the ampicillin resistance gene and the tetracycline resistance gene are used as selection markers.
Místo odpovědné za vazbu na ribozomy, obvykle nazývané Shine-Dalgarnova sekvence (pro prokaryonty) nebo Kozákova sekvence (pro eukaryonty), je nezbytné pro iniciaci translace mRNA. Tento element je obvykle umístěn v oblasti přiléhající ke 3' konci promotoru a 5' konci kódující sekvence polypeptidu, který má být exprimován, Shine-Dalgarnova sekvence je různorodá, ale obvykle má velké zastoupení purinových bází (tj. má vysoký obsah A-G). Dosud bylo identifikováno množství Shine-Dalgarnových sekvencí a každá z těchto *♦ ·»4* »» »»44 • 4 4 • · 444 · 4The site responsible for binding to ribosomes, usually called the Shine-Dalgarn sequence (for prokaryotes) or the Kozak sequence (for eukaryotes), is essential for initiation of mRNA translation. This element is usually located in the region adjacent to the 3' end of the promoter and the 5' end of the coding sequence of the polypeptide to be expressed, the Shine-Dalgarn sequence is diverse, but usually has a high proportion of purine bases (ie, it has a high A-G content). A number of Shine-Dalgarn sequences have been identified so far, and each of these *♦ ·»4* »» »»44 • 4 4 • · 444 · 4
4 44 4
44«44«
I 4 . ·· ·· ’ · · *44· ί J * * 4 4 4 [ · * * ·44 44« ř · · * 4 4 ·· 4» «I sekvencí může být snadno syntetizována s využitím postupů popsaných výše a následně použita v prokaryotickém vektoru.And 4. ·· ·· ' · · *44· ί J * * 4 4 4 [ · * * ·44 44« ø · · * 4 4 ·· 4» «I sequence can be easily synthesized using the procedures described above and subsequently used in a prokaryotic vector.
V případech kdy je žádoucí, aby byl daný polypeptid sekretován z hostitelské buňky, může být ke směrování tohoto polypeptidu ven z hostitelské buňky v níž je syntetizován využita signální sekvence. Obvykle je signální sekvence umístěna v kódující oblasti nukleotidové sekvence nebo přímo na 5' konci kódující oblasti. Dosud bylo identifikováno Tnnořství—si-gná-l-ních—sekvencí—a-jj-akákol-iv— z—těch to-sek věnci_ může být využita (v této přihlášce) v hostitelských buňkách za předpokladu, že je v těchto hostitelských buňkách funkční. Vzhledem k danému polypeptidu může být signální sekvence homologní nebo heterologní. Signální sekvence může být navíc syntetizována chemickou cestou s využitím postupů uvedených v předchozím textu.In cases where it is desired that a given polypeptide be secreted from a host cell, a signal sequence can be used to direct the polypeptide out of the host cell in which it is synthesized. Usually, the signal sequence is located in the coding region of the nucleotide sequence or directly at the 5' end of the coding region. Signaling sequences have been identified so far, and any of them can be used (in this application) in host cells, provided that in those host cells functional. With respect to a given polypeptide, the signal sequence may be homologous or heterologous. In addition, the signal sequence can be chemically synthesized using the procedures described above.
Hostitelskými buňkami mohou být prokaryotické hostitelské buňky (jako'například E. coli) nebo eukaryotické'hostitelské buňky (jako například kvasinky, hmyzí buňky nebo buňky obratlovců). Jsou-li hostitelské buňky kultivovány za vhodných nutričních podmínek, mohou tyto buňky syntetizovat požadovaný polypeptid, který může být následně shromažďován z kultivačního média (jestliže je tento protein sekretován do média) nebo přímo z produkujících hostitelských buněk (není-li sekretován). Následně může být tento polypeptid purifikován s využitím metod zahrnujících například gelovou chromatografii, afinitní chromatografii a podobně. Obecně lze říci, že jestliže je daný polypeptid exprimován v E. coli., bude tento protein po izolaci obsahovat na Nkonci methioninový zbytek (tj. Met’1). Výjimkou je situace, kde je polypeptid exprimován v takovém kmenu E. coli, ve kterém je N-koncový methionin hostitelskou buňkou enzymaticky odštěpen.The host cells can be prokaryotic host cells (such as E. coli) or eukaryotic host cells (such as yeast, insect or vertebrate cells). When the host cells are cultured under suitable nutritional conditions, these cells can synthesize the desired polypeptide, which can then be collected from the culture medium (if this protein is secreted into the medium) or directly from the producing host cells (if it is not secreted). Subsequently, this polypeptide can be purified using methods including, for example, gel chromatography, affinity chromatography, and the like. In general, it can be said that if a given polypeptide is expressed in E. coli, this protein will contain a methionine residue at the N-end (ie Met' 1 ) after isolation. An exception is the situation where the polypeptide is expressed in a strain of E. coli in which the N-terminal methionine is enzymatically cleaved by the host cell.
•4 «444•4 «444
Vhodnými hostitelskými buňkami nebo buněčnými liniemi jsou rovněžsavčí buňky, jako například buňky křečcích ovarií (CHO) nebo buňky 3T3. V současnosti jsou dobře známe způsoby transformace, kultivace, amplifikace, screeningu (testování) a produkce a purifikace požadovaného produktu, jakož i výběr vhodných savčích hostitelských buněk. Jinými vhodnými savčími buněčnými liniemi jsou opičí buněčné linie COS-1 a COS-7 a buněčná linie CV-1. Dalšími příklady savčích hostitelských buněk jsou buněčné linie odvozené z primátů a buněčné linie z hlodavců, včetně transformovaných buněčných linií. Rovněž jsou vhodné normální diploidní buňky, buňky odvozené z primárních tkání kultivovaných in vitro a rovněž primární explantáty. Vhodné buňky mohou být genotypově deficientní a tato deficience může být využita jako selekční markér. Jako selekční markér může být rovněž- využit dominantní gen. Mezi další vhodné hostitelské savčí buňky patří (výčet není limitující) 'buňky HéLa, myší buňky L-929, linie 3T3 odvozené z myší Swiss, Balb-c nebo ΝΊΗ a křeččí buněčné linie BHK nebo HaK.Suitable host cells or cell lines are also mammalian cells, such as hamster ovary (CHO) cells or 3T3 cells. Methods of transformation, cultivation, amplification, screening (testing) and production and purification of the desired product, as well as the selection of suitable mammalian host cells, are now well known. Other suitable mammalian cell lines are the monkey cell lines COS-1 and COS-7 and the CV-1 cell line. Other examples of mammalian host cells are cell lines derived from primates and cell lines from rodents, including transformed cell lines. Also suitable are normal diploid cells, cells derived from primary tissues cultured in vitro, as well as primary explants. Suitable cells can be genotypically deficient and this deficiency can be used as a selection marker. A dominant gene can also be used as a selection marker. Other suitable mammalian host cells include (but are not limited to) HéLa cells, mouse L-929 cells, Swiss, Balb-c, or ΝΊΗ mouse-derived 3T3 lines, and BHK or HaK hamster cell lines.
Inzerce (rovněž označována termínem „transformace nebo „transfekce) příslušného vektoru do zvolené hostitelské buňky může být provedena s využitím chloridu vápenatého, elektroporací, mikróinjekcí, lipofekcí nebo metodou využívající DEAE-dextran. Zvolený Způsob inzerce vektoru bude z části záviset na typu použité hostitelské buňky. Zmíněné metody a rovněž jiné vhodné metody transformace jsou odborníkům dobře známé a jsou popsány například v publikaci Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989.Insertion (also referred to as "transformation or "transfection) of the appropriate vector into the chosen host cell can be performed using calcium chloride, electroporation, microinjection, lipofection, or a method using DEAE-dextran. The method of vector insertion chosen will depend in part on the type of host cell used. The aforementioned methods, as well as other suitable methods of transformation, are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989.
Hostitelské buňky nesoucí příslušný vektor můžou být kultivovány ve standardních médiích odborníkům dobře známých. Tato média budou obvykle obsahovat všechny nutriční složky nezbytné k růstu a přežívání buněk. Vhodnými médii ··» pro kultivaci buněk E. coli jsou například Luria Broth (LB) a/nebo Terrific Broth (TB). Vhodnými médii pro kultivaci eukaryotických buněk jsou RPMI 1640, MEM a DMEM; v závislosti na druhu kultivované buněčné linie mohou být všechna tato média doplněna sérem a/nebo růstovými faktory.. Vhodným médiem pro kultivaci hmyzích buněk je Graceho médium doplněné (je-li to nezbytné) Yeastolatem, hydrolyzátem laktalbuminu a/nebo fetálním telecím sérem.Host cells carrying the appropriate vector can be cultured in standard media well known to those skilled in the art. These media will usually contain all the nutritional components necessary for cell growth and survival. Suitable media ··» for culturing E. coli cells are, for example, Luria Broth (LB) and/or Terrific Broth (TB). Suitable media for eukaryotic cell culture are RPMI 1640, MEM and DMEM; depending on the type of cultured cell line, all these media can be supplemented with serum and/or growth factors.. A suitable medium for culturing insect cells is Grace's medium supplemented (if necessary) with Yeastolate, lactalbumin hydrolyzate and/or fetal calf serum.
-Gbvyklej-e—;j ako—š up le ment—při- dáváno-do-mé di a—rovn ěŽ-nĚU— jaké antibiotikum nebo jiná sloučenina použitelná pro selektivní růst transformovaných buněk. Použití zmíněné sloučeniny bude záviset na povaze selekčního markéru přítomného na plazmidu, kterým byla příslušná hostitelská buňka transformována, Je-li například jako selekční markér použit gen kódující rezistenci vůči kanamycinu, bude takovou sloučeninou přidanou do média právě kanamycin.-Gbvyklej-e—;j as—šup element—added-to-me di a—also ěŽ-nÚU— what antibiotic or other compound usable for selective growth of transformed cells. The use of said compound will depend on the nature of the selection marker present on the plasmid with which the respective host cell has been transformed. If, for example, a gene encoding resistance to kanamycin is used as a selection marker, kanamycin will be the compound added to the medium.
Množství pólypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou může být stanoveno pomocí standardních metod v současnosti známých. Takovými metodami jsou například (výčet není limitující) analýza metodou Western blot, elektroforéza na SDSpclyakrylamidovém gelu, dělení s využitím HPLC, imunoprecipitace a/nebo stanovení aktivity jako například „DNA-binding gel shíft assay (pozn. jedná se o stanovení založené na rozdílných pohyblivostech samotných molekul DNA a molekul DNA s navázanými proteiny, kde je toto stanovení prováděno elektroforézou v nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu).The amount of polypeptide produced by the host cell can be determined using standard methods currently known. Such methods are for example (the list is not limiting) Western blot analysis, electrophoresis on SDSpclyacrylamide gel, separation using HPLC, immunoprecipitation and/or activity determination such as "DNA-binding gel shift assay (note: this is a determination based on different mobilities DNA molecules alone and DNA molecules with bound proteins, where this determination is performed by electrophoresis in a non-denaturing polyacrylamide gel).
Je-li polypeptid navržen tak, aby byl sekretován ven z hostitelské buňky, bude se většina tohoto pólypeptidu pravděpodobně nacházet v kultivačním médiu. Nicméně, není-li daný polypeptid sekretován, bude tento přítomen v cytoplazmě (u eukaryotických hostitelských buněk, Gram-pozitivních baktérií a hmyzích hostitelských buněk) nebo v periplazme (u Gram-negativních.bakteriálních hostitelských buněk).If a polypeptide is designed to be secreted out of the host cell, most of the polypeptide is likely to be found in the culture medium. However, if a given polypeptide is not secreted, it will be present in the cytoplasm (in eukaryotic host cells, Gram-positive bacteria and insect host cells) or in the periplasm (in Gram-negative bacterial host cells).
·* ···· *· «·*· ·· ···· ·* · , s s . · · · ’ · ··* ···· *· «·*· ·· ···· ·* · , s s . · · · ' · ·
I ···· · · · · · · · · a » » · ·· ······ * *»·· · · · ··· ·· «· ·· ··I ···· · · · · · · · · a » » · ·· ······ * *»·· · · · ··· ·· «· ·· ··
Při produkci intracelulárních peptidů jsou hostitelské buňky obvykle nejprve rozrušeny mechanicky nebo osmotickým šokem, čímž je obsah cytoplazmy uvolněn do pufrovaného roztoku. Následně je polypeptid z tohoto roztoku izolován. Následná, purifikace polypeptidu z roztoku může být provedena různými způsoby. Jestliže byl polypeptid syntetizován tak, že má na svém C-konci nebo N-konci umístěnu nějakou kotvu, jako například hexahistidin nebo jiný malý polypeptid, může být^tento purifikován v jednom-kroku Tato jednokroková_ purifikace je provedena tak, že je roztok obsahující zmíněný polypeptid nanesen na afinitní kolonu naplněnou nosičem, který má vysokou afinitu vůči použité kotvě nebo přímo vůči polypeptidu (tj. monoklonální protilátka). Polyhistidin se například se specificky s velkou afinitou váže na nikl a pro purifikaci může být tedy využita afinitní kolona s ionty niklu (jako například afinitní kolony s navázanými ionty niklu od firmy Qiagen); viz.: například Ausubel. a další, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers lne. and Wiley and Sons, NY, 1994.For the production of intracellular peptides, host cells are usually first disrupted mechanically or by osmotic shock, releasing the cytoplasmic contents into a buffered solution. Subsequently, the polypeptide is isolated from this solution. The subsequent purification of the polypeptide from the solution can be carried out in various ways. If the polypeptide has been synthesized with an anchor such as hexahistidine or other small polypeptide at its C-terminus or N-terminus, it can be purified in one step. the polypeptide loaded onto an affinity column filled with a carrier that has a high affinity to the anchor used or directly to the polypeptide (ie, a monoclonal antibody). Polyhistidine, for example, specifically binds to nickel with high affinity, and therefore an affinity column with nickel ions can be used for purification (such as affinity columns with bound nickel ions from Qiagen); see : for example Ausubel. and others, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers lne. and Wiley and Sons, NY, 1994.
Na druhé straně, jestliže k danému polypeptidu není připojena Žádná kotva a rovněž nejsou dostupné žádné protilátky, mohou být pří purifikaci využity jiné dobře známé postupy. Mezí takové postupy patří (výčet není limitující) chromatografie na iontoměničích, gelová chromatografie, HPLC, gelová elektroforéza proteinů v nativním, stavu v kombinaci s následnou elucí z gelu a preparativní izoelektrická fokusace (přístroj/metoda Isoprime, Hoefer Scientific).On the other hand, if there is no anchor attached to a given polypeptide and no antibodies are also available, other well-known methods can be used for purification. Such procedures include (but are not limited to) ion exchange chromatography, gel chromatography, HPLC, gel electrophoresis of proteins in the native state combined with subsequent elution from the gel, and preparative isoelectric focusing (Isoprime apparatus/method, Hoefer Scientific).
V některých případech mohou být za účelem dosažení vyšší čistoty použity dvě nebo více z výše uvedených purifikačních technik.In some cases, two or more of the above purification techniques may be used to achieve higher purity.
Předpokládá-li se, že daný polypeptid se bude primárně nalézat v periplazmatickém prostoru baktérií nebo cytoplazme eukaryotických buněk, múze být obsah periplazmy nebo cyto14If a given polypeptide is predicted to be primarily found in the periplasmic space of bacteria or the cytoplasm of eukaryotic cells, the contents of the periplasm or cyto14
»»« • « ·· · · plazmy, včetně inkluzních tělísek (například u Gramnegativních baktérii, vytváří-li zmíněný polypeptid takové komplexy) hostitelských buněk extrahován s využitím jakéhokoliv standardního postupu odborníkům známého. Hostitelské buňky mohou být například lyžovány (aby došlo k uvolnění obsahu periplazmy) s využitím French pressu, homogenizací a/nebo sonikací. Získaný homogenát je následně centrifugován.»»« • « ·· · · plasma, including inclusion bodies (for example, in Gram-negative bacteria, if said polypeptide forms such complexes) of host cells extracted using any standard procedure known to those skilled in the art. For example, host cells can be lysed (to release periplasmic contents) using a French press, homogenization, and/or sonication. The obtained homogenate is then centrifuged.
-Mimo—přípravy—polypeptidových analog podlevynálezure-^kombinantními technikami mohou být tyto polypeptidy připraveny s využitím metod chemické syntézy v současnosti známých (jako například syntéza peptidů na pevné fázi), včetně postupů popsaných v publikacích Merrifield a další, J. Am.In addition to the preparation of polypeptide analogs of the invention by combinatorial techniques, these polypeptides may be prepared using methods of chemical synthesis currently known (such as solid phase peptide synthesis), including procedures described in Merrifield et al., J. Am.
Chem. Soc., svazek 85, strana 2149, 1964; Houghten a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA, svazek 82, strana 5132, 1985; a Stewart a Young v Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984. Aby došlo k vytvoření disulfidických můstků, mohou být polypeptidy připravené chemickou syntézou oxidovány s využitím postupů popsaných ve výše uvedených publikacích.Chem. Soc., vol. 85, page 2149, 1964; Houghten and others, Why. Nati. Acad. Sci, USA, Volume 82, Page 5132, 1985; and Stewart and Young in Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984. To form disulfide bridges, polypeptides prepared by chemical synthesis can be oxidized using the procedures described in the above publications.
Hodnoty pí a náboj proteinových analog připravených jakoukoliv z výše uvedených metod mohou být měřeny pomocí standardních technik jako například pomocí technik popsaných v dalším textu ve spojení s příklady provedení vynálezu.The pi values and charge of protein analogs prepared by any of the above methods can be measured using standard techniques such as those described below in connection with the examples of the invention.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají polypeptidy chemicky modifikované (tj . deriváty) tak, že zmíněný polypeptid je· připojen k nějakému polymeru, čímž dojde k ovlivnění vlastností tohoto polypeptidu. Použitý polymer je obvykle rozpustný ve vodě, aby protein, ke kterému je tento polymer připojen, neprecipitoval ve vodném prostředí, jako například ve fyziologickém prostředí. Aby mohl být řízen stupeň polymerizace, může mít zmíněný polymer jednu reaktivní skupinu, jako například aktivní_es,ter (pro acylační reakci) nebo • · « · · « ♦ · · • » · > fl · · · · · · · * aldehyd {pro alkylaci). Výhodně používaným reaktivním aldehydem je polyethylenglykolpropionaldehyd, který je stabilní ve vodném prostředí, nebo jeho mono Cl až CIO alkyloxy- nebo aryloxy-deriváty (viz. patentová přihláška US 5252714). Zmíněný polymer může být rozvětvený nebo nerozvětvený. Ve výhodném provedení bude, kvůli terapeutickému využití připraveného koncového produktu, zmíněný polymer farmaceuticky přijatelný. Polymer rozpustný ve vodě nebo, je-li to Žádou-eír-smě s—t akovýc h po1ymerů, mů ž e bý t vyb r án z e—s kup i ny_z shrnující například polyethylenglykol (PEG), monomethoxypolyethylenglykol, dextran, celulózu nebo jiné polymery na bázi cukrů, póly(N-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, homopolymery propylenglykolu, kopolymer polypropylenoxid/ethylénoxid, polyoxyethylované polyoly (například glycerol) a polyvinylalkohol.The scope of the invention also includes chemically modified polypeptides (i.e. derivatives) in such a way that said polypeptide is attached to a polymer, thereby affecting the properties of this polypeptide. The polymer used is usually water soluble so that the protein to which the polymer is attached does not precipitate in an aqueous environment such as a physiological environment. In order to control the degree of polymerization, said polymer may have one reactive group, such as an active_ester (for acylation reaction) or • · « · · « ♦ · · • » · > fl · · · · · · · * aldehyde { for alkylation). A preferably used reactive aldehyde is polyethylene glycol propionaldehyde, which is stable in an aqueous environment, or its mono Cl to C10 alkyloxy- or aryloxy-derivatives (see patent application US 5252714). Said polymer may be branched or unbranched. In a preferred embodiment, due to the therapeutic use of the prepared end product, said polymer will be pharmaceutically acceptable. A water-soluble polymer or, if desired, a mixture of such polymers, may be selected from the group consisting of, for example, polyethylene glycol (PEG), monomethoxy polyethylene glycol, dextran, cellulose or other sugar-based polymers, poly(N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, polypropylene oxide/ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyols (eg glycerol) and polyvinyl alcohol.
Obecně lze říci, že polypeptidová analoga podle vynálezu budou použitelná pro stejné účely jako proteiny divokého' typu, ze kterých jsou tato analoga odvozena. U NT-3 například probíhá klinická studie mapující jeho využitelnost při léčbě neuropatií periferních nervů (včetně diabetické neuropatis) a u 2DNF-faktoru je prováděna klinická studie posuzující možnosti léčby amyotrofické laterální sklerózy (ALS). 0 KGF-faktoru je známo, že je aktivní při růstu tkání a obnově poškozených tkání, a v současné době probíhá v klinické praxi snaha vyvinout způsob využití zmíněného faktoru při léčbě zánětů sliznice navozených chemoterapií nebo působením ionizujícího záření. U MGDF (ve formě s navázaným polyethylenglykolem) probíhají klinické studie týkající se stimulace tvorby krevních destiček při trombocytopenii (nedostatku krevních destiček) vyvolané působením chemoterapeutických látek. Předpokládá se nicméně, že analoga podle vynálezu budou, vzhledem k nemodifikovaným formám, výhodnější, a to • 44 · · 4 4 * * · ·«·«« · · · 4 · · · »4 444» ·· ··· ··· • 4 ««444 4 4In general, the polypeptide analogs of the invention will be useful for the same purposes as the wild-type proteins from which the analogs are derived. NT-3, for example, is undergoing a clinical study mapping its usefulness in the treatment of peripheral nerve neuropathies (including diabetic neuropathy), and 2DNF-factor is undergoing a clinical study assessing the treatment options for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). 0 KGF-factor is known to be active in tissue growth and regeneration of damaged tissues, and there is currently an effort in clinical practice to develop a method of using the mentioned factor in the treatment of mucosal inflammation induced by chemotherapy or ionizing radiation. MGDF (in the form with bound polyethylene glycol) is undergoing clinical studies regarding the stimulation of platelet formation in thrombocytopenia (lack of platelets) induced by the action of chemotherapeutic agents. It is assumed, however, that the analogs according to the invention will be more advantageous, compared to the unmodified forms, namely • 44 · · 4 4 * * · ·«·«« · · · 4 · · · »4 444» ·· ··· · ·· • 4 ««444 4 4
444 4 4 *4 4 · * · v důsledku jejich delšího terapeutického poločasu života a vyšší absorpce.444 4 4 *4 4 · * · due to their longer therapeutic half-life and higher absorption.
Pro terapeutické účely budou analoga podle vynálezu formulována do formy vhodných farmaceutických přípravků upravených pro terapeutickou aplikaci. Tato skutečnost rovněž spadá do rozsahu vynálezu. Zmíněné farmaceutické přípravky budou obvykle obsahovat terapeuticky účinné množství polypeptidového analoga a to buď samostatně nebo spolu s jednou-nebo—více pornocnými_látkami, nosiči nebo jinými_ přídavky používanými standardně při formulaci farmaceutických přípravků. Jako vehikulum (nosič) může být použita voda pro injekce, která je ve výhodném provedení doplněna jinými látkami obvykle používanými při aplikaci do organizmu savců. Analog polypeptidu bude obvykle podáván ve formě přípravku obsahujícího purifikovanou formu zmíněného polypeptidu (která může být chemicky modifikována) spolu s jedním nebo více fyziologicky přijatelnými vehikuly, pomocnými látkami nebo rozpouštědly. Příkladem vhodných vehikul jsou fyziologický roztok o neutrálním pH nebo fyziologický roztok se sérovým albuminem. Je-li to žádoucí, mohou být použita jiná standardní vehikula, pomocné látky nebo rozpouštěd.la,For therapeutic purposes, the analogs according to the invention will be formulated in the form of suitable pharmaceutical preparations adapted for therapeutic application. This fact also falls within the scope of the invention. Said pharmaceutical preparations will usually contain a therapeutically effective amount of the polypeptide analog either alone or together with one or more excipients, carriers or other additives used standardly in the formulation of pharmaceutical preparations. Water for injection can be used as a vehicle (carrier), which is preferably supplemented with other substances usually used in the application to the organism of mammals. A polypeptide analog will usually be administered in the form of a preparation containing a purified form of said polypeptide (which may be chemically modified) together with one or more physiologically acceptable vehicles, excipients or solvents. Examples of suitable vehicles are saline of neutral pH or saline with serum albumin. If desired, other standard vehicles, excipients or solvents may be used,
Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být připraveny pro uskladnění smícháním vybrané látky (směsi látek) o požadovaném stupni čistoty s fyziologicky přijatelnými vehikuly, pomocnými, látkami nebo stabilizátory (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Company, editor A. R. Gennaro, 1990) ve formě lyofilizátu nebo vodného roztoku. Vhodná vehikula, pomocné látky a stabilizátory jsou pro organizmus příjemce netoxické a ve výhodném provedení jsou v použitých dávkách a koncentracích inertní a zahrnují: tlumivé roztoky jako například soli fosforečnanu, citrátu, acetátu, sukcinátu a jiných organických kyselin; antioxidanty jako například kyselinu askorbovou; polypeptidy • 4 «4 4 4 · 4 4Pharmaceutical preparations according to the invention can be prepared for storage by mixing the selected substance (mixture of substances) of the desired degree of purity with physiologically acceptable vehicles, excipients, substances or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, editor A.R. Gennaro, 1990) in in the form of a lyophilisate or an aqueous solution. Suitable vehicles, excipients and stabilizers are non-toxic to the recipient's body and are preferably inert in the doses and concentrations used and include: buffer solutions such as phosphate, citrate, acetate, succinate and other organic acid salts; antioxidants such as ascorbic acid; polypeptides • 4 «4 4 4 · 4 4
4 4 4 4 4 · » 4 · · 44 4 4 4 4 · » 4 · · 4
4 444 · ·· 4444444444 · ·· 444444
44444 · 444444 · 4
444 44 «4 44 44 o nízké molekulové hmotnosti; proteiny jako například sérový albumin, želatinu nebo imunoglobuliny; hydrofilní polymery jako například polyvinylpyrrolídon; aminokyseliny jako například glycin, glutamin, asparagin, arginin a lysin,· monosacharidy, disacharidy a jiné karbohydráty včetně glukózy, manózy nebo dextrinů; alkoholické cukry jako například manitol nebo sorbitol; opačně nabité ionty tvořící soli jako například ionty sodné; a/nebo neionogenní povrchově aktivní Játkyij.akO-napříkladurween.f—Bluroiiie.-nebo—polyethyJLenglykoL(PEG).444 44 «4 44 44 of low molecular weight; proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine, · monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrins; alcoholic sugars such as mannitol or sorbitol; oppositely charged salt-forming ions such as sodium ions; and/or non-ionic surfactants such as urween or polyethylenglycol(PEG).
Jakýkoliv přípravek podle vynálezu pro aplikaci in vivo musí být sterilní. Sterilizace je snadno prováděna filtrací přes sterilní filtrační membrány. Jestliže je přípravek lyofilizován, je sterilizace prováděná výše zmíněnými postupy uskutečňována před nebo až po lyofilizaci a rekonstituci. Přípravek pro parenterální aplikaci bude obvykle uskladněn v lyofilizované formě nebo ve formě roztoku.Any preparation according to the invention for application in vivo must be sterile. Sterilization is easily performed by filtration through sterile filter membranes. If the preparation is lyophilized, the sterilization performed by the aforementioned procedures is carried out before or after lyophilization and reconstitution. A preparation for parenteral administration will usually be stored in lyophilized form or in solution form.
Množství polypeptidu, které bude účinné při léčbě daného onemocnění nebo patologického stavu, bude záviset na chemické podstatě tohoto polypeptidu a rovněž na věku a celkovém zdravotním stavu příjemce. Toto množství může být stanoveno standardními klinickými metodami. Je-li to možné, bude, před vlastním testováním na lidech, žádoucí stanovit křivku odpovědi na podanou dávku farmaceutického přípravku nejprve in vitro a následně na vhodném živočišném modelu in vivo. Obecně lze říci, že vhodná množství používaná in vivo mohou být odvozena ze známých terapeuticky účinných dávek proteinů divokého typu, ze kterých jsou příslušná analoga odvozena. Zkušený lékař bude schopen, vezme-li do úvahy kontext léčby, druh léčeného onemocnění atp., stanovit vhodné dávkování bez vynaložení nepřiměřeného úsilí.The amount of a polypeptide that will be effective in treating a given disease or pathological condition will depend on the chemical nature of the polypeptide as well as the age and general health of the recipient. This amount can be determined by standard clinical methods. If possible, before the actual testing on humans, it will be desirable to determine the response curve to the administered dose of the pharmaceutical preparation first in vitro and then on a suitable animal model in vivo. In general, appropriate amounts used in vivo can be derived from known therapeutically effective doses of the wild-type proteins from which the respective analogs are derived. An experienced physician will be able, taking into account the context of the treatment, the type of disease being treated, etc., to determine the appropriate dosage without undue effort.
Způsoby aplikace přípravku zahrnuji aplikaci intradermální, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní a • ♦ * ·' · « · · · « • * * • · « *« • « · «· ·» • · ♦ · * · * · « v · · · · • · • · · · subkutánní. Do rozsahu vynálezu navíc spadají polypeptidová analoga aplikovaná prostřednictvím lipozomů, mikročástic nebo mikrotobolek; tento druh aplikace je zvláště výhodný pro dosažení prodlouženého uvolňování.Methods of application of the product include intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous and • ♦ * ·' · « · · · « • * * • · « *« • « · «· ·» • · ♦ · * · * · « v · · · · • · • · · · subcutaneous. In addition, the scope of the invention includes polypeptide analogs administered via liposomes, microparticles or microcapsules; this kind of application is particularly advantageous for achieving sustained release.
V případech použití některých polypeptidových analog jako například analog NT-3, BDNF-faktoru a jiných neurotrofických faktorů určených k léčbě neurologických stavů spojených s mozkem nebo jinými oblastmi centrálního nervového systému, může—být—nezbybné-použ-i-fe-í— speciálních aplikačních 2ařízer.í— Mezi taková zařízení například patří implantáty a osmotické pumpy pro intrathekální a intrakraniální podávání:In cases of use of certain polypeptide analogues such as NT-3 analogues, BDNF-factor and other neurotrophic factors intended for the treatment of neurological conditions associated with the brain or other areas of the central nervous system, it may be necessary to use special application devices— Examples of such devices include implants and osmotic pumps for intrathecal and intracranial administration:
Analoga podle vynálezu mohou být využita při standardních postupech sloužících k produkci protilátek použitelných pro lékařské účely jako například sledování hladiny odpovídajícího analoga v krvi pacienta podstupujícího léčbu.The analogs according to the invention can be used in standard procedures for the production of antibodies useful for medical purposes, such as monitoring the level of the corresponding analog in the blood of a patient undergoing treatment.
K produkci polyklonálních protilátek rozpoznávajících epitopy daných polypeptidů mohou být využity nejrůznější postupy v současnosti známé. Za účelem produkce protilátky mohou být imunizováni (injekcí polypeptidového analoga nebo jeho fragmentu nebo derivátu) různí živočišní hostitelé včetně (nejenom) králíků, myší, potkanů atd. V závislosti na druhu hostitele mohou být, za účelem zvýšení imunologické reakce hostitele, použita nej různější adjuvans včetně (nejenom) Freundova adjuvans, minerálních gelů jako například hydroxidu hlinitého (alum), povrchově aktivních látek jako například lysolecithinu, polyolů Pluronic, polyaniontů, peptidů, emulzí olejů, hemocyaninů z druhu Megathura crenulata, dinitrofenolu a adjuvans používaných v humánní medicíně jako například Calmetteho-Guerinova bacilu a Corynebacterium parvum.A variety of currently known methods can be used to produce polyclonal antibodies recognizing the epitopes of given polypeptides. Various animal hosts including (but not limited to) rabbits, mice, rats, etc. can be immunized (by injection of a polypeptide analog or a fragment or derivative thereof) for antibody production. Depending on the host species, a wide variety of adjuvants can be used to enhance the host's immunological response including (but not limited to) Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide (alum), surfactants such as lysolecithin, Pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, hemocyanins from the species Megathura crenulata, dinitrophenol and adjuvants used in human medicine such as Calmette - Guerin's bacillus and Corynebacterium parvum.
K přípravě monoklonálních protilátek namířených proti polypeptidovým analogům mohou být použity jakékoliv postupy vedoucí k molekulám protilátek produkovaných kontinuálnímiAny procedure leading to antibody molecules produced by continuous
» · · • · ·» · · • · ·
buněčnými liniemi v buněčných kulturách. Vhodnými postupy pro produkci monoklonálních protilátek jsou například příprava hybridomú původně vyvinutá Kohlerem a Milsteinem a popsaná v článku Nátuře, svazek 256, strany 495 až 497,cell lines in cell cultures. Suitable procedures for the production of monoclonal antibodies include, for example, the hybridoma preparation originally developed by Kohler and Milstein and described in Nature, Volume 256, pages 495 to 497,
1975; příprava triomů, příprava hybridomú lidských B-buněk popsaná v publikaci Kozbor a další, Immunology Today, svazek 4, strana 72, 1983; příprava EBV-hybridomů produkujících monoklonální protilátky popsaná v publikaci Cole a další,1975; preparation of triomas, preparation of human B-cell hybridomas described in Kozbor et al., Immunology Today, Volume 4, Page 72, 1983; preparation of EBV-hybridomas producing monoclonal antibodies as described in Cole et al.,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,.Alan R.—L-iss-,lne., strany 77 až 96, 1985.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, .Alan R.—L-iss-,lne., pages 77 to 96, 1985.
Klon protilátky namířené proti epitopu nebo epitopům daného polypeptidu může být připraven s využitím známých postupů. K vytvoření nukleotidových sekvencí kódujících molekulu monoklonální protilátky nebo její oblasti vážící antigen je zvláště výhodné využití rekombinantní ch technik; viz;, například Maniatis a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982.A clone of an antibody directed against an epitope or epitopes of a given polypeptide can be prepared using known procedures. To create nucleotide sequences encoding a monoclonal antibody molecule or its antigen-binding region, the use of recombinant techniques is particularly advantageous; see, for example, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982.
Protilátky jsou užitečné pro diagnózu prováděnou jak in vivo tak in vitro, zvláště pak jsou-li tyto protilátky znaJí A Λ w Λ R I X í* -r -r—t ^-1 Á 1* J Λ ! & 4 ΛΙΎ1Υ1 O +Antibodies are useful for both in vivo and in vitro diagnosis, especially if these antibodies are known A Λ w Λ R I X í* -r -r—t ^-1 Á 1* J Λ ! & 4 ΛΙΎ1Υ1 O +
L.C11C CL pUUó X V CU.J.C n. «uXCÍ J. i o ti <7Vn νχι'Άΐ irr^dZiTťl- π ζ*1ιοι άγο vzorcích tekutin a tkání.L.C11C CL pUUó XV CU.JC n. «uXCÍ J. io ti <7Vn νχι'Άΐ irr^dZiTťl - π ζ*1ι ο ι άγο samples of fluids and tissues.
Příklady provedení vynálezuExamples of embodiments of the invention
Vynález je dále detailně popsán s odkazem na následující materiál, metody, postupy a výsledky experimentů. Aminokyselinové zbytky proteinů jsou v textu označovány obvyklým způsobem za použití třípísmenných zkratek (například „met zastupuje methionin, „val valin atp.) nebo v některých případech za použití zavedených jednopísmenných zkratek (například „M zastupuje methionin, „R arginin atp.)._____ «»» 4 · * 4 · · ·The invention is further described in detail with reference to the following material, methods, procedures and experimental results. Amino acid residues of proteins are indicated in the text in the usual way using three-letter abbreviations (for example, "met stands for methionine, "val for valine, etc.) or in some cases using established one-letter abbreviations (for example, "M stands for methionine, "R for arginine, etc.)._____ «»» 4 · * 4 · · ·
4 ·«· 4 4 4 · 4 4 4 •4 4444 4» 444 ·444 ·«· 4 4 4 · 4 4 4 •4 4444 4» 444 ·44
44444 · 444444 · 4
4 44 4 4· ·4 · · 444 44 4 4· ·4 · · 44
Materiál a metody:Material and methods:
Příprava analog NT-3Preparation of NT-3 analogues
Substituované aminokyselinové zbytky z nativní sekvence lidského NT-3 byly vybrány s cílem zachovat základní strukturu, a biologickou/terapeutickou aktivitu (viz. Holland a další, J. Mol. Biol., svazek 239, strany 385 až 400, 1994; Ibanez a další, Cell, svazek 69, strany 329 až 341, 1992; -Tbane-2^a-da-l-š-ÍT—EMBO-Journa-l-^svazok—T2-,—strany—2281_až2293, 1993). Skutečně provedené substituce v nativní sekvenci lidského NT-3 jsou znázorněny na obrázcích 2 a 3.Substituted amino acid residues from the native sequence of human NT-3 were chosen in order to preserve the basic structure, and biological/therapeutic activity (see Holland et al., J. Mol. Biol., vol. 239, pages 385-400, 1994; Ibanez et al. , Cell, vol. 69, pages 329 to 341, 1992; EMBO Journal Vol. The substitutions actually made in the native sequence of human NT-3 are shown in Figures 2 and 3.
U. analoga znázorněného na obrázku 2 byly provedeny následující dvě substituce: arginin v poloze 61 (arg61) byl nahrazen alaninem (ala) a lysin v pozici 64 (lyse4) byl nahrazen kyselinou asparágovou. Tento analog byl označen „NT-3(ih9)R61A,K64D. U druhého analoga znázorněného na obrázku 3 byly provedeny stejné substituce aminokyselin jako u analoga prvního a navíc byl polypeptidový řetězec ukončen za aminokyselinovým zbytkem 117 (tudíž došlo k odstranění aminokyselin argn8 a thr119) . Tento analog byl označen „NT-3(i117)RS1A, K64D. Za účelem vytvoření zmíněných analog byly do sekvence lidského NT-3 zavedeny pomocí polymerázové řetězcové reakce (PCR) odpovídající mutace. U analoga NT-3(in9)R61A,K64D byly použity páry chemicky syntetizovaných oligonukleotidů a s jejich využitím byly vytvořeny fragmenty genu NT-3 zahrnující (1) počáteční oblast až do místa mutací v kodonech odpovídajících pozicím aminokyselin 61 a 64 a (2) koncovou oblast zmíněného genu od místa mutací aŽ do konce sekvence. K vytvoření celé molekuly nukleové kyseliny kódující obě mutace v pozicích 61 a 64 byla provedena druhá reakce PCR, která sloučila počáteční a koncovou oblast připravené dříve. U analoga NT-3d-u7)R61A,K64D byl zopakován výše zmíněný.postup s výjimkou toho, že z koncové oblasti «φφφφ φφ φ φ · · φ φφ φφφφ φφ φφφ ··« φφ φφφφφ φ φ φφ φφφ φφ φφ φφ ·* byly vypuštěny kodony pro arginin a threonin v pozicích 118 a 119.In the analog shown in Figure 2, the following two substitutions were made: arginine at position 61 (arg 61 ) was replaced by alanine (ala) and lysine at position 64 (lys e4 ) was replaced by aspartic acid. This analog was designated “NT-3(ih9)R61A,K64D. In the second analog shown in Figure 3, the same amino acid substitutions were made as in the first analog, and in addition, the polypeptide chain was terminated after amino acid residue 117 (therefore amino acids argn 8 and thr 119 were removed). This analog was designated “NT-3(i 117 )RS1A, K64D. In order to create the mentioned analogs, corresponding mutations were introduced into the sequence of human NT-3 by polymerase chain reaction (PCR). For the analogue NT-3(i n9 )R61A,K64D, pairs of chemically synthesized oligonucleotides were used, and using them, fragments of the NT-3 gene were created including (1) the initial region up to the site of mutations in codons corresponding to amino acid positions 61 and 64 and (2) the terminal region of the mentioned gene from the site of mutations to the end of the sequence. To generate the entire nucleic acid molecule encoding both mutations at positions 61 and 64, a second PCR reaction was performed that merged the start and end regions prepared earlier. For the NT-3d analogue 7 )R61A,K64D, the above-mentioned procedure was repeated, except that from the end region ·* the codons for arginine and threonine at positions 118 and 119 have been omitted.
Exprese v E. coliExpression in E. coli
Z účelem exprese zmíněných analog v E. coli byla na 5 konec DNA molekul připravených postupem popsaným výše zavedena sekvence kódující methionin a na 3' konec pak stop kodon. Navíc byla ve vhodné vzdálenosti proti směru transkripce od místa startovního methioninu umístěna sekvence_ odpovědná za vazbu na ribozom a na 5' a 3' konce byla genu zavedena místa rozpoznávaná restrikčními enzymy Xbal (5' konec) a HindlII (3' konec). Vzniklé synteticky připravené fragmenty genů byly na 5' konci hraničeny restrikčním místem Xbal a na 3' konci restrikčním místem HindlII, obsahovaly místo odpovědné za vazbu na ribozomy, startovní kodon ATG (kódující methionin), sekvenci kódující příslušný analog a stop kodon. Fragmenty byly štěpeny restrikčními endonukleázami Ndel a BamHI a zaligovány do vektoru pAMG12.In order to express the mentioned analogues in E. coli, a sequence coding for methionine was introduced to the 5' end of the DNA molecules prepared by the procedure described above, and then a stop codon was introduced to the 3' end. In addition, the sequence responsible for binding to the ribosome was placed at a suitable distance upstream of the transcriptional starting methionine site, and sites recognized by the restriction enzymes XbaI (5' end) and HindII (3' end) were introduced to the 5' and 3' ends of the gene. The resulting synthetically prepared gene fragments were bordered at the 5' end by an XbaI restriction site and at the 3' end by a HindII restriction site, they contained a site responsible for binding to ribosomes, an ATG start codon (encoding methionine), a sequence encoding the relevant analogue and a stop codon. The fragments were digested with restriction endonucleases NdeI and BamHI and ligated into the pAMG12 vector.
Expresívní plazmid pAMG12 může být odvozen z plazmidu pCFMl656 (přístupové číslo ATCC 69576, uložený 24. únoraThe expression plasmid pAMG12 can be derived from plasmid pCFMl656 (ATCC accession number 69576, deposited 24 February
Ί O O 71 τολΙ τ* τη γππγ\γ7Ο+-ιτί mí ·Ρ Ί 7^ Virgin *7 3 ΓΠΖ&ΤΊΊ O O 71 τολΙ τ* τη γππγ\γ7Ο+-ιτί mí ·Ρ Ί 7^ Virgin *7 3 ΓΠΖ&ΤΊ
V iiluvíj »— V í -J v i ~ Ci 4, JL uskutečněných substitucí sekvence DNA a mutagenezí metodou PCR s využitím překrývajících se oligonukleotidů. Od restrikčního místa BglII (pár baží ě. 180), nacházejícího se na 5' konci počátku replikace PcopB plazmidu pCFM1656, byly, ve směru k replikačním genům plazmidu, provedeny následující záměny párů baží (bp):V iiluvíj »— V í -J vi ~ Ci 4, JL carried out by DNA sequence substitution and mutagenesis by the PCR method using overlapping oligonucleotides. From the BglII restriction site (bp 180), located at the 5' end of the P copB replication origin of plasmid pCFM1656, the following base pair (bp) swaps were made in the direction of the replication genes of the plasmid:
4*4 · · 4 4 · · · • 4 4 4 · * · · »4444*4 · · 4 4 · · · • 4 4 4 · * · · »444
4 44» · · 4 444 44 44 44» · · 4 444 44 4
4 4 «*· * ·4 4 «*· * ·
4* 444 4* 44 *4 *44* 444 4* 44 *4 *4
Navíc sekvence DNA nacházející se mezi jedinečnými restrikčními místy AatlI (pozice 4364 v plazmidů pCFM1656) a • · • ··· * · «In addition, the DNA sequence located between the unique AatI restriction sites (position 4364 in plasmids pCFM1656) and • · • ··· * · «
• ·• ·
····
Sadí (pozice 4585 v plazmidu pCFM1656) byla nahrazena následující sekvencí DNA:Sadí (position 4585 in plasmid pCFM1656) was replaced by the following DNA sequence:
[kohézní konec AatlI] ‘ CGTAACGTATGCATGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA3 ' GCACGCATTGCATACGTACCAGAGGGGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTT- TAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTG -ATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGACCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCAC-ACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGG- TGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCGGCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCC -CCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAG-GGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCGGTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTC-CCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAAT-CGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTAAatlI[cohesion end AatlI] ' CGTAACGTATGCATGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA3 ' GCACGCATTGCATACGTACCAGGGGTACGCTCTCCATCCCTTGACGGTCCAGTCGAAAGACTGGGCTTTCGTTTATCTGTTGTTTGTCGGTG -ATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTCTGACCGGAAAGCAAAATAGACAAACAGCCAC-ACGCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGG - TGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCGGCCCTGCCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCC -CCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAG-GGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCGTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTC-CCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTGTTTATTTTTCTAAAT-CGGTAGGACTGCCTACCGGAAAACGCAAAGATGTTTGAGAAAAACAAATAAAAAGATTTAAatlI
- AC ATTC ÁAAT AT.GG ACGTCTC AT AATTTTT AAAAAATTC ATTTGACAAATGCT AAAATTC - tgtaagtttátacctgcagagtattaaaaattttttaac-taaactGtttacgattttaag -TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGAGT- AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGATCTAAACTCA -TTTAACTTTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGAGCTCACTAGT-AAATTGAAAATCTTCCTCCTTAŤTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCASacII-GTCGACCTGCAGGGTACCATGGÁAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAG-CAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTTCTTCTTCTTC-AAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA-TTCTTTCGGGCŤTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATT-CCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTT- GGGG AAC C CCGGAGATTTGC CCAGAACTCCC C AAA AAACG ACTTTC GTCCTTGGCGAGAA-CACGCTCTTCACGC 3'- AC ATTC ÁAAT AT.GG ACGTCTC AT AATTTTT AAAAAATTC ATTTGACAAATGCT AAAATTC - tgtaagtttátacctgcagagtattaaaaatttttaac-taaactGtttacgattttaag -TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGAGT- AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGTCTAAACTCA -TTTAACTTTTAGAAGGGAATAACATATGTTAACGGTTGGAATTCGAGCTCACTAGT GAAAATCTTCCTCCTTAŤTGTATCCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCASAcII-GTCGACCTGCAGGGTACCATGGÁAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAG-CAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTTCTTCTTCTTTC-AAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA-TTCTTTCGGGCŤTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATT-CCCCTTGGGGCCTCTAAAC GGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTT- GGGG AAC C CCGGAGATTTGC CCAGAACTCCC C AAA AAACG ACTTTC GTCCTTGGCGAGAA-CACGCTCTTCACGC 3'
-GTGCGAGAAGTG 5' [kohézní konec SacII]-GTGCGAGAAGTG 5' [SacII cohesive end]
Produktem ligační reakce byly transformovány kompetentní buňky E. coli kmene FM15. U narostlých kolonií byla testová24Competent cells of E. coli strain FM15 were transformed with the product of the ligation reaction. For grown colonies, it was test24
4444 ·4 ·♦·♦ »· ·♦4444 ·4 ·♦·♦ »· ·♦
4* 4* 4 4 4 4 4 ····· · 4 4 4 · · 44* 4* 4 4 4 4 4 ····· · 4 4 4 · · 4
444* 4 4 44· ··*444* 4 4 44· ··*
44444 4 444444 4 4
444 44 44 44 44 na produkce rekombinantního proteinu a u kolonií produkujících protein o správné velikosti byla stanovena sekvence DNA vloženého genu. Kmen nesoucí „správný gen byla zaočkován do kultivačního média Luria Broth (10 g/1 Trypticase-Pepton, 10 g/1 kvasničný autolyzát, 5 g/1 chlorid sodný) a kultivace probíhala 16 hodin při 37°C za stálého míchání o intenzitě 250 otáček za minutu. Takto získaná kultura byla přenesena do sterilního média (sterilizováno přímo ve fermentoru) a za stálého—pří sunu-glukózy^a-organického-dusíku—byly—buňkynamnoženy a následně indukovány prostřednictvím laktózy. Po indukci byla fermentace zastavena, buňky byly centrifugovány, supernatant po centrifugací odstraněn a zbylá buněčná pasta zamražena.444 44 44 44 44 to produce the recombinant protein, and for colonies producing protein of the correct size, the DNA sequence of the inserted gene was determined. The strain carrying the "correct gene" was inoculated into Luria Broth culture medium (10 g/1 Trypticase-Peptone, 10 g/1 yeast autolysate, 5 g/1 sodium chloride) and cultured for 16 hours at 37°C with constant stirring at an intensity of 250 rotations per minute. The culture obtained in this way was transferred to a sterile medium (sterilized directly in the fermenter) and with a constant supply of glucose and organic nitrogen, the cells were multiplied and subsequently induced through lactose. After induction, the fermentation was stopped, the cells were centrifuged, the supernatant after centrifugation was removed and the remaining cell paste was frozen.
Purifikace proteinuProtein purification
Buňky z buněčné pasty byly rozbity homogenizací při vysokém tlaku a inkluzní tělíska byla izolována centrifugací. Takto získaná inkluzní tělíska byla rozpuštěna v roztoku guanidin-HCl a následně zředěna do roztoku močoviny. Po několikadenním stání bylo pH roztoku upraveno na hodnotu 3, hvl ron i- -rí -Fi ΐΛτΓλΤ7·£·η a τη i v *i f *i Ir ran no*inrve chromatografii na katexové koloně a poté chromatografii na hydrofobní koloně. Frakce obsahující požadovaný protein byly spojeny a sterilovány filtrací.Cells from the cell paste were disrupted by high pressure homogenization and inclusion bodies were isolated by centrifugation. The inclusion bodies thus obtained were dissolved in a guanidine-HCl solution and then diluted into a urea solution. After standing for a few days, the pH of the solution was adjusted to 3, followed by chromatography on a cathexis column and then chromatography on a hydrophobic column. Fractions containing the desired protein were pooled and sterilized by filtration.
Izoelektrický bod.a náboj proteinu .Isoelectric point.and charge of the protein.
Hodnoty izoelektrických bodů lidského NT-3 divokého typu (r-metHuNT-3, SEK. ID. Č: 1) a jeho analog (tj. SEK. ID. Č:Isoelectric point values of wild-type human NT-3 (r-metHuNT-3, SEQ ID NO: 1) and its analog (i.e. SEQ ID NO:
a SEK. ID. Č: 5) byly spočítány s využitím softwarového balíku pro sekvenční analýzu proteinů/DNA označovaného „CGC od společnosti Genetics Computer Group, lne., Madison, Wisconsin. Náboj zmíněných molekul při fyziologickém pH (předpokládá se hodnota pH .,7,4) byl odhadnut, s využitím stejnéhoand SEC. id. No: 5) were calculated using the protein/DNA sequence analysis software package designated “CGC from Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wis. The charge of the mentioned molecules at physiological pH (presumed pH .,7,4) was estimated, using the same
9444 44 ·*·» ·* 4» • 9 · «4 4 444«9444 44 ·*·» ·* 4» • 9 · «4 4 444«
44444 44 4 444444444 44 4 4444
4* 449* 49444 9444* 449* 49444 944
44444 4 4 • 4 44« 4» «4 44 44 programového balíku. Hodnota pí prvního analoga (NT-3(1. 119)R61A, K64D, SEK. ID. Č: 3) byla spočítána na hodnotu o přibližně 0,9 jednotek pH nižší než je tomu u NT-3 divokého typu (8,5 ve srovnání s 9,4). Náboj pro tento analog při fyziologickém pH (7,4) byl snížen o přibližně 2,5 jednotky pH vzhledem k NT-3 divokého typu (tj . přibližně z hodnoty +7 na hodnotu +4,5). Vypočítaná hodnota pí druhého analoga (NT3 (1-117)R61A, K64D, SEK. ID. Č: 5) byla 8,2, což bylo o při-bl-ižně—1-,-2—jednotek—pH—méně—než-je—hodnota—pI-NT^3—divokéhotypu (9,4). Náboj pro tento (druhý) analog pří fyziologickém pH (7,4) byl snížen o přibližně 3,5 jednotky pH (na hodnotu přibližně +3,5) vzhledem k hodnotě pro NT-3 divokého typu (+7) .44444 4 4 • 4 44« 4» «4 44 44 of the program package. The pI value of the first analog (NT-3 (1 . 119 )R61A, K64D, SEQ ID NO: 3) was calculated to be approximately 0.9 pH units lower than that of wild-type NT-3 (8.5 compared to 9.4). The charge for this analog at physiological pH (7.4) was reduced by approximately 2.5 pH units relative to wild-type NT-3 (ie, from approximately +7 to +4.5). The calculated pi value of the second analog (NT3 (1-117)R61A, K64D, SEQ. ID. NO: 5) was 8.2, which was about—1-.-2—unit—pH—less— than-is-the-value-of-pI-NT^3-wild-type (9.4). The charge for this (second) analog at physiological pH (7.4) was reduced by approximately 3.5 pH units (to a value of approximately +3.5) relative to that for wild-type NT-3 (+7).
Stanovení metodou ELISADetermination by ELISA method
Stanovení metodou ELISA bylo prováděna na 96-ti jamkových destičkách pokrytých monoklonální protilátkou proti .. lidskému NT-3. Jako sekundární protilátka byla použita králičí polyklonální protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou. Před vlastním stanovením byly vzorky séra, kalibrační standardy a vzorky pro ověření kvality zředěny fosfátovým pufrem a před stanovením obsahovaly přibližně 50% séra.Determination by the ELISA method was performed on 96-well plates covered with a monoclonal antibody against .. human NT-3. A rabbit polyclonal antibody conjugated with horseradish peroxidase was used as a secondary antibody. Serum samples, calibration standards, and quality control samples were diluted with phosphate buffer prior to the assay and contained approximately 50% serum prior to assay.
Objem použitých vzorků byl 100 mikrolitrů (μ1) na jednu jamku. Každý vzorek byl analyzován ve dvou paralelních stanoveních. Mezní limity pro kvantifikaci byly 0,65 ng/ml (NT.3 divokého typu), 4,00 ng/ml (NT-3(i-n9)R61A,K64D) a 4,05 ng/ml (NT-3 (1.117)R61A,K64D) .The volume of samples used was 100 microliters (μ1) per well. Each sample was analyzed in two parallel determinations. The cutoff limits for quantification were 0.65 ng/ml (NT.3 wild type), 4.00 ng/ml (NT-3(in 9 )R61A,K64D) and 4.05 ng/ml (NT-3 (1 .117) R61A,K64D) .
Gelová chromatografie (SEC-HPLC)Gel Chromatography (SEC-HPLC)
Gelová chromatografie každého vzorku byla provedena s využitím systému Waters 600 spolu s. kolonou G2000SWXL (TosoHaas). Vzorky byly eluovány při průtoku 0,7 mililitrů za minutu (ml/min) pufrem o složení 100 mM fosforečnan sod26 ««4 44 4 ι*44Gel chromatography of each sample was performed using a Waters 600 system with a G2000SWXL column (TosoHaas). The samples were eluted at a flow rate of 0.7 milliliters per minute (ml/min) with a buffer containing 100 mM sodium phosphate26 ««4 44 4 ι*44
44444 44 4 »44444444 44 4 »444
4 444 4 « « *144444,444 4 « « *14444
44444 4 444444 4 4
4*4 44 44 14 1» ný, 0,5 M NaCl, pH 6,09. Píky byly detekovány při vlnové délce 230 nanometrů (nm).4*4 44 44 14 1» new, 0.5 M NaCl, pH 6.09. Peaks were detected at a wavelength of 230 nanometers (nm).
Chromatografie na katexu (CEX-HPLC)Cathexis chromatography (CEX-HPLC)
Chromatografie na katexu byla provedena s využitím systému Waters 625 spolu s kolonou Resource S (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Vzorky byly eluovány při průtoku 1 mililitr za minutu gradientem chloridu sodného od 0 do 1 M v pufru obsahujícím 20 mM Tris-HCl, pH 8,5.—Píky—byly—detekovány—při vlnové délce 220 nanometrů (nm).Cathexis chromatography was performed using a Waters 625 system with a Resource S column (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Samples were eluted at a flow rate of 1 milliliter per minute through a 0 to 1 M sodium chloride gradient in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.5.—Peaks—were—detected—at a wavelength of 220 nanometers (nm).
SDS-PAGE barvená stříbremSilver-stained SDS-PAGE
Proteiny byly naředěny roztokem 2% SDS, smíchány se vzorkovým pufrem a po dobu pěti minut zahřívány ve vroucí vodě. Vlastní elektroforetické dělení bylo prováděno postupem doporučeným výrobcem za použití prefabrikovaných gradientových gelů TRIS-Tricin, 10 až 20%, zakoupených od společnosti ISS (Integrated Separation Systems, Natick, MA). Barvení stříbrem bylo prováděno postupem popsaným v publikaci Blum a další, Electrophoresis, svazek 8, strany 93 až 99,Proteins were diluted with 2% SDS solution, mixed with sample buffer and heated in boiling water for five minutes. Custom electrophoretic separation was performed according to the manufacturer's recommended procedure using precast TRIS-Tricin gradient gels, 10 to 20%, purchased from ISS (Integrated Separation Systems, Natick, MA). Silver staining was performed according to the procedure described in Blum et al., Electrophoresis, Volume 8, pages 93-99,
Biologické stanovení mitogenní aktivity s využitím buněk 3T3trkCBiological determination of mitogenic activity using 3T3trkC cells
Biologická aktivita r-metHuNT-3 jako referenčního standardu je stanovována prostřednictvím biostanovení mitogenní aktivity s využitím buněk 3T3trkC. Tyto buňky jsou získány transfekcí buněk 3T3 (ATCC), které normálně na svém povrchu neexprimují receptor trkC, plazmidem pcDNAl/neo (Invitrogen, San Diego, CA) modifikovaným tak, že obsahuje sekvenci kódující lidský receptorový protein trkC. Sekvence genu trkC je popsána v publikaci Shelton a další, Journal of Neuroscience, svazek 15, strany 477 až 491, 1995; a příklad φφφ Φ φ ΦΦΦΦ· • * φ φφ φ · » · φ · φ • φ φφφ· · φ φφφ φφφ φφ «φφφφ φ φ φφ φφφ φφ φφ φ» φφ provedení transfekce je popsán v publikaci Valenzuela a další, Neuron, svazek 10, strany 963 až 974, 1993. Transfekované buňky jsou kultivovány při teplotě 37 + 2°C v inkubátoru s vysokou vlhkostí v atmosféře obsahující 5,5 + 1,0% CO2 v Dulbeccově minimálním médiu doplněném fetálním bovinním sérem a G-418 se síranovým aniontem. Při každém stanovení byly buňky rozděleny na 96-ti jamkové destičky. Po přibližně 24 hodinové inkubaci za stejných podmínek bylo -k-u-itřvační— médium-nahrazeno-médienuRPMI—leAO-a-k-buňkánubyXypřidány testované vzorky. V médiu RPMI 1640 byly v různých koncentracích připraveny standardní a testované vzorky rmetHuNT-3 a získaná směs byla přidána do příslušných jamek. Destičky pro tkáňové kultury byly umístěny zpět do inkubátoru a přibližně po 24 hodinách byl počet živých buněk stanoven barvením solí 3 -(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3karboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)2H tetrazolu, sloučeninou tétrážolu (MTS). Následně byly-destičky pro tkáňové, kultury umístěny zpět do inkubátoru a po uplynutí přibližně 5 hodin byla v každé jamce měřena optická hustota při vlnové délce 490 nm. Byla vytvořena standardní křivka závislosti optické hustoty na dávce přidaného pólypeptidu a lineární úsek této standardní křivky byl podroben lineární regresní analýze. Poté byly stanoveny koncentrace testovaných vzorků u ředění, jejichž naměřená optická hustota spadá do lineárního úseku standardní křivky.The biological activity of r-metHuNT-3 as a reference standard is determined by a mitogenic activity bioassay using 3T3trkC cells. These cells are obtained by transfecting 3T3 cells (ATCC), which do not normally express the trkC receptor on their surface, with the plasmid pcDNAl/neo (Invitrogen, San Diego, CA) modified to contain the sequence encoding the human trkC receptor protein. The sequence of the trkC gene is described in Shelton et al., Journal of Neuroscience, Volume 15, Pages 477-491, 1995; and an example φφφ Φ φ ΦΦΦΦ· • * φ φφ φ · » · φ · φ • φ φφφ· · φ φφφ φφφ φφ «φφφφ φ φ φφ φφφ φφ φφ φ» φφ is described in Valenzuela et al., Neuron. volume 10, pages 963 to 974, 1993. Transfected cells are cultured at 37 + 2°C in a high humidity incubator in an atmosphere containing 5.5 + 1.0% CO 2 in Dulbecco's minimal medium supplemented with fetal bovine serum and G- 418 with sulfate anion. For each determination, cells were divided into 96-well plates. After approximately 24 hours of incubation under the same conditions, the tested samples were added to the medium-replaced-medium RPMI-leAO-ak-cellnubyXy. Standard and tested samples of rmetHuNT-3 were prepared at different concentrations in RPMI 1640 medium, and the obtained mixture was added to the respective wells. The tissue culture plates were placed back into the incubator and after approximately 24 hours the number of viable cells was determined by staining with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)2H tetrazole salts , the compound tetrazole (MTS). Subsequently, the tissue culture plates were placed back into the incubator and after approximately 5 hours the optical density was measured in each well at a wavelength of 490 nm. A standard curve of dependence of optical density on the dose of added polypeptide was created and the linear section of this standard curve was subjected to linear regression analysis. After that, the concentrations of the tested samples were determined at dilutions whose measured optical density falls within the linear section of the standard curve.
Biologické testování in vivoIn vivo biological testing
Vliv aminokyselinových záměn na biologické vlastnosti molekul byl stanovován in vivo na samcích potkanů Sprague Dawley v křížovém experimentu. Přesněji řečeno, devět pokusných zvířat bylo rozděleno do tří skupin po třech a každému potkanu ze skupiny byla aplikována dávka 1 miligram na kilogram tělesné hmotnosti (mg/kg) bud' pólypeptidu NT-3 divokého • * ··· * * * · · · · • « · · · u· «· *···♦· » « · · · · · · ·· 999 *· ·» ·· ·· typu (3 potkani), NT-3 (1.lig)R61A, K64D (jiní 3 potkani) nebo NT-3(i.h7)R61A,K64D (zbylí 3 potkani). Testovaný materiál byl aplikován buď (1) intravenózně (IV) jako první dávka a následně subkutánně (SC) 24 hodin po první dávce; nebo (2) v obráceném pořadí. Vzorky krve byly odebírány před podáním a v časech 1, 5, 15 a 30 minut a 1, 2, 4 a .8 hodin po intravenózní aplikaci. Koncentrace NT-3 v krevním séru byly stanovovány metodou ELISA (viz. výše). Protilátky použité při .s.t a nove n í ch_s 1 ou ž i ly^k e_k va ntifikaci NT-3 divokého typu._The effect of amino acid substitutions on the biological properties of molecules was determined in vivo on male Sprague Dawley rats in a crossover experiment. More specifically, nine experimental animals were divided into three groups of three, and each rat in the group was administered a dose of 1 milligram per kilogram of body weight (mg/kg) of wild-type NT-3 polypeptide • * ··· * * * · · · · • « · · · u· «· *···♦· » « · · · · · · ·· 999 *· ·» ·· ·· type (3 rats), NT-3 (1 . lig )R61A , K64D (other 3 rats) or NT-3(i.h7)R61A,K64D (remaining 3 rats). The test material was administered either (1) intravenously (IV) as the first dose and then subcutaneously (SC) 24 hours after the first dose; or (2) in the reverse order. Blood samples were collected before administration and at 1, 5, 15, and 30 minutes and 1, 2, 4, and .8 hours after intravenous administration. NT-3 concentrations in blood serum were determined by the ELISA method (see above). Antibodies used for quantification of wild-type NT-3.
Ačkoliv nebyly podmínky experimentu plně optimalizovány, vykazovaly zmíněné protilátky dostatečnou křížovou reaktivitu s NT-3 {1.119)R61A, K64D a NT-3 (1-1i7)R61A, K64D, čímž byla umožněna rovněž kvantifikace těchto analog. Pro jednotlivé proteiny byly vytvořeny standardní křivky (viz. obrázek 4).Although the conditions of the experiment were not fully optimized, the mentioned antibodies showed sufficient cross-reactivity with NT-3 {1 . 11 9)R61A, K64D and NT-3 (1 - 1 i 7 )R61A, K64D, which also enabled the quantification of these analogs. Standard curves were created for individual proteins (see Figure 4).
Výsledky testů:Test results:
Charakterizace analog polypeptidu NT-3Characterization of NT-3 polypeptide analogs
Při biostanovení prováděném in vitro na buňkách PC-12 bylo pozorováno, že si obě analoga (jak s NT-3 (i-n9)R61A, K64D tak NT-3(1.117!R61A,K64D) zachovávají aktivitu proteinu NT-3 divokého typu (r-metHuNT-3) (tabulka 1). Ve skutečnosti se zdá, že biologická aktivita zmíněných analog (jak byla naměřena při tomto stanovení) je poněkud vyšší než aktivita NT-3 divokého typu, což snad naznačuje jejich zvýšenou afinitu vůči.receptoru trkC (receptor pro NT-3).In the bioassay performed in vitro on PC-12 cells, it was observed that both analogs (both with NT-3 (in 9 )R61A, K64D and NT-3 (1 . 117! R61A,K64D) retain the activity of the wild-type NT-3 protein type (r-metHuNT-3) (Table 1).In fact, the biological activity of said analogs (as measured in this assay) appears to be somewhat higher than that of wild-type NT-3, perhaps indicating their increased affinity for. of the trkC receptor (NT-3 receptor).
• ·• ·
Tabulka 1. Biologická aktivita proteinů NT-3 stanovovaná in vitroTable 1. Biological activity of NT-3 proteins determined in vitro
Obě analoga byla při gelové vylučovací chromatografii v provedení HPLC eluována jako nekovalentně spojené dimery, stejně jako NT-3 divokého typu (viz. obrázek 5). Jak se předpokládalo, v molekulových hmotnostech jednotlivých proteinů nebyl pozorován žádný podstatný rozdíl. U žádného' z analog nebyla detekována významná agregace molekul proteinů. Výsledky HPLG na koloně katexu (viz. obrázek 6) byly v souladu se sníženou hodnotou pí obou analog. Nepatrný posun při SDS-PAGE (viz; obrázek 7) 'je patrně důsledkem.....Both analogs were eluted as non-covalently linked dimers by HPLC gel exclusion chromatography, as well as wild-type NT-3 (see Figure 5). As expected, no significant difference was observed in the molecular weights of the individual proteins. No significant aggregation of protein molecules was detected for any of the analogs. HPLG results on the cathexis column (see Figure 6) were consistent with the reduced pi value of both analogs. The slight shift in SDS-PAGE (see; Figure 7) is probably the result of...
změny v náboji analog vzhledem k NT-3 divokého typu. Obě analoga si zachovávají biologickou aktivitu a strukturu nekovalentně spojených dimerů polypeptidu NT-3 divokého typu.changes in analog charge relative to wild-type NT-3. Both analogs retain the biological activity and structure of non-covalently linked dimers of the wild-type NT-3 polypeptide.
Farmakokinetické chováníPharmacokinetic behavior
Bylo pozorováno, že křivky sérové koncentrace po intravenózní aplikaci jsou dvojfázové (viz. obrázek 8). Mezi jednotlivými typy NT-3 byly podstatné rozdíly v počáteční distribuční fázi. Poločasy (ocTi/2) byly 3,3 minuty pro NT-3 divokého typu, 5,4 minut pro NT-3 (1.i19)R61A,K64D a 7,6 minut * « 9 · 9 · *The serum concentration curves after intravenous administration were observed to be biphasic (see Figure 8). There were substantial differences in the initial distribution phase between individual NT-3 types. The half-lives (ocTi/ 2 ) were 3.3 minutes for wild-type NT-3, 5.4 minutes for NT-3 (1 .i 19 )R61A,K64D, and 7.6 minutes * « 9 · 9 · *
9 9 4 4 ·9 9 4 4 ·
9 * · · 4 «'* 9·· 4 9 · «>9 * · · 4 «'* 9·· 4 9 · «>
4 9 •99 4·94 9 •99 4·9
99
94 pro NT-3 (i-i17)R61A, K64D (viz. tabulka 2). Pozorované snížení clearence po intravenózni aplikaci může být zapříčiněno toliko pomalejší distribucí analog NT-3. Nejvýraznější snížení koncentrace v průběhu této fáze bylo pozorováno u NT-3 divokého typu. Poločasy koncové fáze (βΤι/2) byly podobné pro všechny tři zmíněné typy a pohybovaly se v rozmezí 0,9 až 1,0 hodina což naznačuje, že mechanizmus odstraňování může být pro všechny zmíněné typy totožný. Plochy pod křivkami znázorňujícími čásóvóu závislostkoncentrací (tTAUCinf)“Byly pro analoga NT-3(i-n7)R61A,K64D a NT-3(1.119)R61A,K64D přibližně 1,2 až 2-krát větší než tomu bylo u NT-3 divokého typu.94 for NT-3 (ii 17 )R61A, K64D (see table 2). The observed decrease in clearance after intravenous administration can only be caused by the slower distribution of NT-3 analogues. The most pronounced decrease in concentration during this phase was observed for wild-type NT-3. The half-lives of the terminal phase (βΤι/ 2 ) were similar for all three mentioned types and ranged from 0.9 to 1.0 hour, indicating that the elimination mechanism may be identical for all mentioned types. The areas under the time-concentration curves (tTAUCinf)" were approximately 1.2 to 2 times greater for NT-3 ( in 7 )R61A,K64D and NT-3 (1 . 119) R61A,K64D analogs than for NT- 3 wild type.
Tabulka 2. Farmakokinetické parametry získané u potkanů, kterým byla intravenózně aplikována jedna dávka proteinů NT3 v koncentracích 1 mg/kg.Table 2. Pharmacokinetic parameters obtained in rats administered a single dose of NT3 proteins in concentrations of 1 mg/kg intravenously.
1 Plocha pod křivkou časové závislosti sérové koncentrace v časech nula až nekonečno. Plocha je vypočítána lichoběžníkovou metodou. 1 Area under the curve of time dependence of serum concentration at times zero to infinity. The area is calculated using the trapezoidal method.
2 Rychlost clearence vypočítána jako: dávka : AUC 3 Poločas distribuční fáze (αΤι/2) 4 Poločas koncové fáze (βΤι/2) 2 Clearance rate calculated as: dose : AUC 3 Half-life of the distribution phase (αΤι/ 2 ) 4 Half-life of the terminal phase (βΤι/ 2 )
Po subkutánní injekci NT-3 divokého typu došlo k rychlému zvýšení sérové koncentrace tohoto peptidu (viz.After subcutaneous injection of wild-type NT-3, there was a rapid increase in the serum concentration of this peptide (see Fig.
» v « - v - - . I i • · » · · · · · ·· ··· .· ·· ·· ·· obrázek 9) . Maximální koncentrace bylo dosaženo v čase (Tmax) přibližně 0,17 hodin (viz. Tabulka 3). U modifikovaných polypeptidů byl pozorován pozvolnější profil absorpce. Přesněji řečeno, hodnoty Tmax- byly 0,67 hodin pro NT-3(i119)R61A, K64D a 1,33 hodin pro NT-3 (1.117)R61A, K64D. Maximální pozorované sérové koncentrace polypeptidů NT-3 (1.119)R61A, K64D a NT-3(i-h7)R61A,K64D byly ve srovnání s NT-3 divokého typu 6-ti až 10-ti násobně vyšší, což naznačuje, že. zmíněná ana-loga~vykazuj-í—vyšá-í-stupeň-absorpce-z-mí sta..in j.ekční.aplikace. Stupeň nebo rozsah absorpce (biologická dostupnost) je obvyklej i stanovován z poměru ploch pod křivkami časových závislostí sérových koncentrací pro subkutánní a intravenózní aplikaci (Tabulka 3). Biologické dostupnosti byly 2,2% pro NT-3 divokého typu, 28,2% pro NT-3(1.ii9)R61A,K64D a 43,22% pro NT-3d-uvjRGlA, K64D. Poločasy koncových fází pro zmíněná analoga se jevily delší ve srovnání s polypeptidem divokého typu.» in « - in - - . I i • · » · · · · · ·· ··· .· ·· ·· ·· figure 9) . The maximum concentration was reached in a time (Tmax) of approximately 0.17 hours (see Table 3). A slower absorption profile was observed for the modified polypeptides. More specifically, the Tmax values were 0.67 hours for NT-3(i 119) R61A, K64D and 1.33 hours for NT-3 (1 117) R61A, K64D. The maximum observed serum concentrations of NT-3 (1 . 119) R61A, K64D and NT-3(i-h7)R61A,K64D polypeptides were 6- to 10-fold higher compared to wild-type NT-3, suggesting that that. the mentioned analogue shows a higher degree of absorption in the functional application. The degree or extent of absorption (bioavailability) is usually determined from the ratio of areas under the curves of time dependences of serum concentrations for subcutaneous and intravenous administration (Table 3). Bioavailabilities were 2.2% for wild-type NT-3, 28.2% for NT-3 (1 .ii 9 )R61A,K64D and 43.22% for NT-3d-uvjRG1A,K64D. The terminal half-lives for said analogs appeared longer compared to the wild-type polypeptide.
Tabulka 3 Farmakokinetické parametry získané u potkanů, kterým byla subkutánně aplikována jedna dávka proteinů NT-3 v koncentracích l mg/kg= ‘4Table 3 Pharmacokinetic parameters obtained in rats that received a single dose of NT-3 proteins in concentrations of 1 mg/kg = '4 subcutaneously
• 44 4 4 * · · · · « 444 4 · · 4 · 4 *• 44 4 4 * · · · · « 444 4 · · 4 · 4 *
4 444 · · 4 ·»♦*·♦4,444 · · 4 ·»♦*·♦
4 4 ··· · *4 4 ··· · *
444 44 «· *· * · 1 Plocha pod křivkou časové závislosti sérové koncentrace v časech nula až nekonečno. Plocha je vypočítána lichoběžníkovou metodou.444 44 «· *· * · 1 Area under the curve of time dependence of serum concentration at times zero to infinity. The area is calculated using the trapezoidal method.
2 Biologická dostupnost (P) je vypočítána jako: (t-AUCsc / t-AUCiv) x 100%, kde byly obě plochy získány ze stejného živočicha. 2 Bioavailability (P) is calculated as: (t-AUCsc / t-AUCiv) x 100% where both areas were obtained from the same animal.
3 Ckax je maximální koncentrace 4 Tmax je poločas pro dosažení maximální koncentrace 3 Ckax is the maximum concentration 4 Tmax is the half-time to reach the maximum concentration
-Po-ločas—koncové-fáze—í-pTr/ž*)-Výsledky z těchto experimentů ukazují, že snížením hodnoty pí polypeptidu NT-3 může být dosaženo snížení rychlosti clearence po intravenózní aplikaci (alespoň na počátku) a rovněž může být dosaženo zvýšení absorpce po subkutánním podání. Získané výsledky rovněž ukazují, že náboj daného proteinu hraje důležitou úlohu při stanovování farmakokinetických vlastností. V případe bazických proteinů jako například NT-3 a rovněž jiných kationaktivních proteinů může mít snížení izoelektrického bodu (nebo náboje při fyziologické hodnotě pH) za následek podstatné zlepšení absorpce a biologické dostupnosti dané molěkuly po súbkutánní aplikaci. Tato znalost a popis uvedený v této přihlášce umožňují navrhnout nové molekuly se zlepšenými terapeutickými vlastnostmi.-Half-time—end-phase—í-pTr/ž*)-Results from these experiments show that by reducing the pi value of the NT-3 polypeptide, a decrease in the clearance rate after intravenous administration (at least initially) can be achieved and also increased absorption after subcutaneous administration. The obtained results also show that the charge of the given protein plays an important role in determining the pharmacokinetic properties. In the case of basic proteins such as NT-3 as well as other cationic proteins, a reduction in the isoelectric point (or charge at physiological pH) can result in a substantial improvement in the absorption and bioavailability of the given molecule after subcutaneous administration. This knowledge and the description provided in this application allow the design of new molecules with improved therapeutic properties.
Mělo by být zřejmé, že analoga popsaná v předchozím textu jsou uvedena pouze jako příklady, .a že je možné, s využitím popisu uvedeného v této přihlášce, vytvořit jiná analoga NT-3, jakož i analoga jiných proteinů, vyznačující se nižší hodnotou izoelektrického bodu a delším setrváním v krevním oběhu a/nebo vyšší absorpcí. V jedné variantě mohou být například vytvořena analoga proteinů SEK. ID. Č: 3 a 5 tak, že je provedena exprese v savčích buňkách nebo sekretujících bakteriálních buňkách takovým způsobem, že je získán produkt „Meť (tj . methioninový zbytek na. N-konci je » M« »It should be understood that the analogs described in the preceding text are given as examples only, and that it is possible, using the description provided in this application, to make other analogs of NT-3, as well as analogs of other proteins, characterized by a lower value of the isoelectric point and longer retention in the bloodstream and/or higher absorption. In one variant, for example, analogs of SEK proteins can be created. id. No: 3 and 5 by expressing in mammalian cells or secreting bacterial cells in such a way that the product "Met" (ie the methionine residue at the N-terminus is "M" is obtained)
odstraněn a výsledkem jsou polypeptidy o sekvencích SEK. ID. Č: 6 a 7). Totéž bude platit v případě analog BDNF-faktoru popsaných v dalším textu.removed and result in polypeptides with SEQ sequences. id. No: 6 and 7). The same will apply in the case of the BDNF-factor analogs described in the following text.
Analoga BDNF-faktoruBDNF-factor analogue
S využitím postupů popsaných výše (pro polypeptid NT-3) byla připravena analoga BDNF-faktoru, která byla purifikována z E. coli. U každého z těchto analog byla stanovena hodnota-izoelektrického-bodu-{pl)—a—(-př-i-b-l-i-ž-ný·}—výsledný-riáboj— při fyziologickém pH (7,4). Pro srovnání jsou rovněž uvedeny hodnoty izoelektrického bodu a náboje při fyziologickém pH pro BDNF-faktor divokého typu (tj. BDNF-faktor o přirozeně se vyskytující sekvenci; viz. Patentová přihláška US 5180820, obrázek 5; SEK. ID. Č: 8). Místa substitucí jsou číslována s počátkem na prvním aminokyselinovém zbytku následujícím po methioninu v maturované formě proteinu exprimovaného v E. coli (tj . počáteční methioninový zbytek není započítán).Using the procedures described above (for the NT-3 polypeptide), a BDNF-factor analog was prepared and purified from E. coli. For each of these analogs, the value of the isoelectric point was determined at physiological pH (7.4). The values are also given for comparison isoelectric point and charge at physiological pH for wild-type BDNF-factor (ie, BDNF-factor of naturally occurring sequence; see US Patent Application 5180820, Figure 5; SEQ ID NO: 8).Substitution sites are numbered beginning at the first amino acid residue following methionine in the mature form of the protein expressed in E. coli (ie, the initial methionine residue is not counted).
BDNF-faktor K65D,K73D,K95A,R97ABDNF-factor K65D,K73D,K95A,R97A
Px^veudiyíllj. Su.t>stj-tu.Ccuij_ j sou ΖαΠΐβΠα iysirm asparágovou v pozicích 65 a 73, záměna lysinu za alanin v pozici 95 a záměna argininu za alanin v pozici 97. (SEK. ID. Č: 9)Px^veudiyíllj. Su.t>stj-tu.Ccuij_ j sou ΖαΠΐβΠα iysirm asparagus in positions 65 and 73, substitution of lysine for alanine in position 95 and substitution of arginine for alanine in position 97. (SEQ ID NO: 9)
Vypočtená hodnota pí: 8,46Calculated value of pi: 8.46
Náboj: +4,0Charge: +4.0
BDNF-faktor P60E,K65D,K73D,K95ABDNF-factor P60E,K65D,K73D,K95A
Provedenými substitucemi jsou záměna prolinu za kyselinu glutamovou v pozici 60, záměna lysinu za kyselinu asparágovou v pozicích 65 a 73 a záměna lysinu za alanin v pozici 95. (SEK. ID. Č: 10) • φφφφ φ φ Β φφφ φ φ φφφ φ · ΦΦΦ φ φ φ Φφφ « φ φ φThe substitutions made are the exchange of proline for glutamic acid in position 60, the exchange of lysine for aspartic acid in positions 65 and 73, and the exchange of lysine for alanine in position 95. (SEQ ID NO: 10) • φφφφ φ Β φφφ φ φ φφφ φ · ΦΦΦ φ φ φ Φφφ « φ φ φ
Φ «4Φ «4
Vypočtená hodnota pí: 8,45Calculated value of pi: 8.45
Náboj : +4,0Charge : +4.0
BDNF-faktor divokého typu Vypočtená hodnota pí: 10,23BDNF-wild-type factor Calculated pi: 10.23
Náboj: +9,5Charge: +9.5
Popis- 3“ν-γ3-1θ€ΐλ-γ·“^ίθ-1-©5Ϊθ^γθ1ΐ-”&β8&ύ--”Description- 3“ν-γ3-1θ€ΐλ-γ·“^ίθ-1-©5Ϊθ^γθ1ΐ-”&β8&ύ--”
1) Stanovení biologické aktivity in vitro; biologické stanovení mitogenní aktivity s využitím buněk 3T3trkC1) Determination of biological activity in vitro; biological determination of mitogenic activity using 3T3trkC cells
V tomto experimentu je biologická aktivita BDNF-faktoru divokého typu a biologická aktivita analog BDNF-faktoru stanovována kvantitativně měřením inkorporace (MTS) do buněk PC-12 (ATCCj, které byly transformovány tak, aby exprimovaly receptor trkB (vysokoafinitní receptor pro BDNF-faktor).In this experiment, the biological activity of wild-type BDNF-factor and the biological activity of BDNF-factor analogues is determined quantitatively by measuring the incorporation (MTS) into PC-12 cells (ATCCj that have been transformed to express the receptor trkB (high-affinity receptor for BDNF-factor) .
Tyto transformované buňky byly kultivovány, v Dulbeccově minimálním médiu obsahujícím fetální bovinní a koňské sérum a 1% L-glutaminu. Kultivace probíhala při teplotě 37°C + 2°C v inkubátoru s vysokou vlhkostí vzduch a obsahem oxidu uhličitého 7,5 ± 1%. Pro vlastní experiment byly buňky přeneseny do destiček pro tkáňové kultury a dále kultivovány. Po uplynutí přibližně 48 hodin bylo kultivační médium nahrazeno médiem RPMI 1640, k buňkách byly přidány testované vzorky a inkubace probíhala za stejných podmínek dalších 48 hodin. Následně byly buňky obarveny pomocí MTS, inkubovány dalších pět hodin za stejných podmínek a s využitím čtečky destiček byla v každé jamce změřena optická hustota při vlnové délce 490 nm. Získané výsledky biologické aktivity zmíněných dvou analog BDNF-faktoru (vzhledem k BDNF-faktoru divokého typu) jsou znázorněny v Tabulce 4.These transformed cells were cultured in Dulbecco's minimal medium containing fetal bovine and horse serum and 1% L-glutamine. Cultivation took place at a temperature of 37°C + 2°C in an incubator with high air humidity and a carbon dioxide content of 7.5 ± 1%. For the actual experiment, the cells were transferred to tissue culture plates and further cultured. After approximately 48 hours, the culture medium was replaced with RPMI 1640 medium, test samples were added to the cells, and incubation was continued under the same conditions for another 48 hours. Subsequently, the cells were stained with MTS, incubated for another five hours under the same conditions, and the optical density at a wavelength of 490 nm was measured in each well using a plate reader. The obtained results of the biological activity of the mentioned two BDNF-factor analogues (compared to the wild-type BDNF-factor) are shown in Table 4.
• 4 44• 4 44
4 4 4 * 4 444 4 4 * 4 44
Tabulka 4. Biologická aktivita BDNF-faktorů stanovovaná in vitroTable 4. Biological activity of BDNF-factors determined in vitro
2) Biologické testování in vivo a získané výsledky Biologické vlastnosti zmíněných analog byly hodnoceny in vivo na samcích potkanů Sprague Dawley a to v dávkách 3,0 miligramy na kilogram tělesné hmotnosti pro BDNF-faktor K65D,K73D, K95A, R97A a 1,7 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti pro BDNF-faktor P60E, K65D, K73D, K95A. Testované látky byly podávány intravenózně a subkutánně a poté následovaly odběry vzorků séra a měření koncentrací zmíněných analog v krevním séru (byl uplatněn stejný postup jako u NT3 a analog NT-3). Pro každou formu podání jsou níže uvedeny farmakokínetické vlastnosti jednotlivých proteinů.2) In vivo biological testing and obtained results The biological properties of the mentioned analogs were evaluated in vivo on male Sprague Dawley rats at doses of 3.0 milligrams per kilogram of body weight for the BDNF factor K65D, K73D, K95A, R97A and 1.7 milligrams per kilogram of body weight for BDNF-factor P60E, K65D, K73D, K95A. Test substances were administered intravenously and subcutaneously, followed by serum sampling and measurement of concentrations of said analogs in blood serum (the same procedure as for NT3 and NT-3 analogs was applied). The pharmacokinetic properties of the individual proteins are listed below for each form of administration.
Tabulka 5. Farmakokínetické vlastnosti měřené na potkanech; jedna intravenózní dávka BDNF-faktorů . - .Table 5. Pharmacokinetic properties measured in rats; one intravenous dose of BDNF-factors. - .
»«·«· 9 9 · »999 * t ··«* · « ··· 999»«·«· 9 9 · »999 * t ··«* · « ··· 999
9« » · · 9 » * * •9 9·« *> 9·' 9« 9·9« » · · 9 » * * •9 9·« *> 9·' 9« 9·
Tabulka_6. Farmakokinetické vlastnosti měřené na potkanech; jedna subkutánní dávka BDNF-faktorůTable_6. Pharmacokinetic properties measured in rats; one subcutaneous dose of BDNF-factors
Získané výsledky ukazují, že zavedení mutací do BDNFfaktoru divokého typu má měřitelný vliv na farmakokinetickévlastnosti. Jedná se zvláště o dosažení větší biologické dostupnosti zmíněných dvou analog BDNF-faktoru (ve srovnání s BDNF-faktorem) in vivo, což se odráží ve vyšších hodnotách t-AUC(inf) po intravenózním podání těchto analog a vyšších hodnotách t-AUC(inf) a F% po subkutánní aplikaci.The obtained results show that the introduction of mutations into the wild-type BDNF factor has a measurable effect on the pharmacokinetic properties. This is particularly the achievement of greater bioavailability of the mentioned two BDNF-factor analogs (compared to BDNF-factor) in vivo, which is reflected in higher values of t-AUC(inf) after intravenous administration of these analogs and higher values of t-AUC(inf ) and F% after subcutaneous administration.
Tento vynález je definován připojenými patentovými nároky.This invention is defined by the appended claims.
··· · · * ♦ · * · * » « · · * ·*·· • » · 9 « · »» ·»·»« «· · · » · » * « »t ··« · · « · ·· · *··· · · * ♦ · * · * » « · · * ·*·· • » · 9 « · »» ·»·»« «· · · » · » * « »t ··« · · « · ·· · *
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:LIST OF SEQUENCES (1) GENERAL INFORMATION:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Boone, Thomas C.(i) APPLICANT: Boone, Thomas C.
Cheung, Ellen N.Cheung, Ellen N.
Hershenson, Susan I.Hershenson, Susan I.
Young, John D.Young, John D.
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů (iii) POČET SEKVENCÍ: 10 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:(ii) NAME OF THE INVENTION: Polypeptide analogues of cation-active polypeptides (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 10 (iv) ADDRESS FOR CORRESPONDENCE:
(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:(v) MACHINE READABLE FORM:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní . .. .. (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PCr.DOS./MS-DOS. .. . .....(A) MEDIA TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible . .. .. (C) OPERATING SYSTEM: PCr.DOS./MS-DOS. .. . .....
(D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.25 (vi) DATA O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:(D) SOFTWARE: Patentln Release No. 1.0, Version No. 1.25 (vi) DATA ON CURRENT APPLICATION:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:(A) APPLICATION NUMBER:
(B) DATUM PODÁNÍ:(B) FILING DATE:
(C) ZATŘÍDĚNÍ:(C) CLASSIFICATION:
(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:(viii) REPRESENTATIVE INFORMATION:
(A) JMÉNO: Mazza, Richard J.(A) NAME: Mazza, Richard J.
(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO:(B) REGISTRATION NUMBER:
(C> ČÍSLO SPISU: A-411 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:(C> FILE NUMBER: A-411 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:
« 4« 4
444 · 4 « 4444 · 4 « 4
4 · 4 «4 ·<<4 · 4 «4 ·<<
4 4 4 * · 4 «4 · 44 4 (A) TELEFON:4 4 4 * · 4 «4 · 44 4 (A) TELEPHONE:
(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:
(2) INFORMACE 0 SEK. ID. Č.:l:(2) INFORMATION 0 SEC. id. No.:l:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselinových zbytků(A) LENGTH: 120 amino acid residues
'.....“(B')“TYPT“po*lýpeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:l:'....."(B')"TYPE"polypeptide (C) NUMBER OF CHAINS: one (D) TOPOLOGY: unknown (ii) TYPE OF MOLECULE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEC. id. No.:l:
* »»»· ·· 4*44 4* 4« • 4 4 44 . 4 «4*4* »»»· ·· 4*44 4* 4« • 4 4 44 . 4 «4*4
444· 4 · « 4 · 4 4 44 4 4 « 4 44 *44 444444· 4 · « 4 · 4 4 44 4 4 « 4 44 *44 444
4 44444 4 44 44444 4 4
444 44 44 4· 44 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:444 44 44 4· 44 (2) INFORMATION ABOUT SEC. id. No.: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ij) TYP MOLEKULY: cDNA_ ______________ (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. C.:2:(A) LENGTH: 360 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (D) TOPOLOGY: linear (ij) TYPE OF MOLECULE: cDNA_ ______________ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEC. id. C.:2:
aegtacgcfcg aacacaaatc tcaccgtgge gaatactctg. tttgcgactc tgaatctctg 60 :tgggttaccg acaaatcttc tgctatcgac atccgtggtc accaggctac cgttctgggt 120 .gaaaccaaaa ccggtaactc tecggttaaa cagtacttct acgaaacccg ttgcaaagaa .180 gctgcáccgg ttgacaacgg ttgccgtggt atcgacgaca aacactggaa ctctcagtgc 240 !naaacctctc agacctacgt tcgtgctctg acctctgaaa acaacaagct tgttggttgg 300 cgttggattc gtatcgacac ctcttgcgtt tgcgctctgt ctcgtaaaat cggtegtacc 360 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:3:aegtacgcfcg aacacaaatc tcaccgtgge gaatactctg. tttgcgactc tgaatctctg 60 :tgggttaccg acaaatcttc tgctatcgac atccgtggtc accaggctac cgttctgggt 120 .gaaaccaaaa ccggtaactc tecggttaaa footacttct acgaaacccg ttgcaaagaa .180 gctgcácgg ttgacaacgg ttgccgtggt atcgacgaca aacactggaa ctctcagtgc 240 ! naaacctctc agacctacgt tcgtgctctg acctctgaaa acaacaagct tgttggttgg 300 cgttggattc gtatcgacac ctcttgcgtt tgcgctctgt ctcgtaaaat cggtegtacc 360 (2) INFORMATION ABOUT SEC. id. No.:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein « 4 4 44 4 · · 4 4 4 4(A) LENGTH: 120 amino acid residues (B) TYPE: polypeptide (C) NUMBER OF CHAINS: one (D) TOPOLOGY: unknown (ii) TYPE OF MOLECULE: protein « 4 4 44 4 · · 4 4 4 4
V 4444 44 444 444In 4444 44 444 444
4444 4 4 44444 4 4 4
4 444 44 44 44 ··4 444 44 44 44 ··
115 120 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:4:115 120 (2) INFORMATION ABOUT SEC. id. No.: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
f Ti \ πτ?τ ΤΛΤΙ . -Λ f“ A — £. -A-·. V. A. ~ f i O3*± U. Ud2,_L (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:4:f Ti \ πτ?τ ΤΛΤΙ . -Λ f“ A — £. -AND-·. V. A. ~ f i O3*± U. Ud2,_L (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF CHAINS: one (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEC. id. No.: 4:
atgtacgctg aacacaaatc tcaccgtggt gaatactctg tttgcgactc tgaatetctg 60 tgggttaccg acaaatcttc tgctatcgac atccgtggtc accaggttac cgttctgggt 120 gaaatcaaaa ccggtaactc tccggttaaa cagtacttct acgaaacccg ttgcaaagaa 160 gctgcadcgg ttgacaacgg ttgccgtggt atcgacgaca aacactggaa ctctcagtgc 240 aaaacctctc agacctacgt tcgtgctctg acctctgaaa acaacaagct tgttggttgg 300 : cgttggattc gtatcgacac ctcttgcgtt tgcgctctgt ctcgtaaaat cggt 354.atgtacgctg aacacaaatc tcaccgtggt gaatactctg tttgcgactc tgaatecttg 60 tgggttaccg acaaatcttc tgctatcgac atccgtggtc accaggttac cgttctgggt 120 gaaatcaaaa ccggtaactc tccggttaaa ctctct acgaaacccg ttgcaaagaa 160 gctgcadcgg ttgacaacgg ttgccgtggt atcgacgaa aacactggaa ctc tcagtgc 240 aaaacctctc agacctacgt tcgtgctctg acctctgaaa acaacaagct tgttggttgg 300 : cgttggattc gtatcgacac ctcttgcgtt tgcgctctgt ctcgtaaaat cggt 354.
i · B B « · B B Bi · B B « · B B B
B 4 4 4 4 * · ♦ ··· ··· • > B * · · B · B «Β ♦♦· ·♦ ·♦ ·« ·· (2) INFORMACE O SEK. ID. C*:5:B 4 4 4 4 * · ♦ ··· ··· • > B * · · B · B «Β ♦♦· ·♦ ·♦ ·« ·· (2) INFORMATION ABOUT SEC. id. C*:5:
(i). CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(and). CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) DÉLKA: 118 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden(A) LENGTH: 118 amino acid residues (B) TYPE: polypeptide (C) NUMBER OF CHAINS: one
-CD )“TOPOLOGTE-:—neznámá---(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:5:-CD )“TOPOLOGTE-:—unknown---(ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEC. id. No.:5:
Leu Ser Arg Lys Ile Gly 115Leu Ser Arg Lys Ile Gly 115
9, • · ι • ·Μ » 9 · • · · »9 · ··· (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:6:9, • · ι • ·Μ » 9 · • · · »9 · ··· (2) INFORMATION ABOUT SEC. id. No.:6:
(i). CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(and). CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) DÉLKA: 119 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden(A) LENGTH: 119 amino acid residues (B) TYPE: polypeptide (C) NUMBER OF CHAINS: one
-(-D)—T0POLOOíE-:—neznámá(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:6:-(-D)—T0POLOOíE-:—unknown (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEC. id. No.:6:
4 4 4 * 4 · 44 4 · « 4, 4 • » *44 4 4 * 4 · 44 4 · « 4, 4 • » *4
444 ··· 44 4 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:7:444 ··· 44 4 (2) INFORMATION ABOUT SEC. id. No.:7:
(i). CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(and). CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) DÉLKA: 117 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden ' (ό·)““ΤΟΡΟΕΟΟιετ~ neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:7:(A) LENGTH: 117 amino acid residues (B) TYPE: polypeptide (C) NUMBER OF CHAINS: one ' (ό·)““ΤΟΡΟΕΟΟιετ~ unknown (ii) TYPE OF MOLECULE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEC. id. No.:7:
φ · φ Φ φ a > > * φ φ φφφ φφφ • φφφ φ φ φφ ·· · · φ« (2) INFORMACE Ο SEK. ID. Č.:8:φ · φ Φ φ a > > * φ φ φφφ φφφ • φφφ φ φ φφ ·· · · φ« (2) INFORMATION Ο SEC. id. No.: 8:
(ί)· CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(ί)· CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (‘Εί^ΤΟΡΟΕΟΘΤΕΊ—ηε známá----(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:8:(A) LENGTH: 120 amino acid residues (B) TYPE: polypeptide (C) NUMBER OF CHAINS: one ('Εί^ΤΟΡΟΕΟΘΤΕΊ—ηε known-----(ii) TYPE OF MOLECULE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO. No.: 8:
*« «»· • · · · • · 4 «* * · * · · · » · a a a a ·· a·· »· a« aaaa » ♦ **« «»· • · · · • · 4 «* * · * · · · » · a a a a ·· a·· »· a« aaaa » ♦ *
aa ·· 99 • 9 9 9 a a a 9aa ·· 99 • 9 9 9 a a a 9
999 9 99 • · a· áa (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:9:999 9 99 • · a· áa (2) INFORMATION ABOUT SEC. id. No.: 9:
(i). CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(and). CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
. (A) DÉLKA:. 120 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden. (A) LENGTH:. 120 amino acid residues (B) TYPE: polypeptide (C) NUMBER OF CHAINS: one
--(-£) )—TOPOLOGIE-:—ne známá--(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. C.:9:--(-£) )—TOPOLOGY-:—not known--(ii) TYPE OF MOLECULE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEC. id. C.:9:
• · • ♦·· « · · · · · « • v · · · · · ·· ··« »· · »· * »· · ♦ t« (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:10:• · • ♦·· « · · · · · « • v · · · · · ·· ··« »· · »· * »· · ♦ t« (2) INFORMATION ABOUT SEC. id. No.: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (DjTOPOL'OUIETliěžňaiňá (ii) TYP MOLEKULY: protein(A) LENGTH: 120 amino acid residues (B) TYPE: polypeptide (C) NUMBER OF CHAINS: one (DjTOPOL'OUIETližňaina) TYPE OF MOLECULE: protein
115 120115 120
Claims (44)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US68435396A | 1996-07-19 | 1996-07-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ399A3 true CZ399A3 (en) | 1999-06-16 |
Family
ID=24747700
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ993A CZ399A3 (en) | 1996-07-19 | 1997-07-17 | Polypeptide analogs of cation-active polypeptides |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US6211150B1 (en) |
EP (1) | EP0938499A1 (en) |
AU (1) | AU720232B2 (en) |
CA (1) | CA2259163C (en) |
CZ (1) | CZ399A3 (en) |
IL (1) | IL127872A0 (en) |
NO (1) | NO990059L (en) |
NZ (1) | NZ333650A (en) |
SK (1) | SK1499A3 (en) |
WO (1) | WO1998003546A1 (en) |
ZA (1) | ZA976326B (en) |
Families Citing this family (61)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1284143A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-02-19 | Sifi S.p.A | A process for the preparation of pharmaceutical formulations containing lactoferrin description |
JP5341311B2 (en) | 2003-03-19 | 2013-11-13 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | NOGO receptor binding protein |
US8597911B2 (en) | 2003-06-11 | 2013-12-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing antibodies |
WO2005035753A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Double specific antibodies substituting for functional protein |
EP1720564A1 (en) * | 2004-02-20 | 2006-11-15 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods of treating obesity or diabetes using nt-4/5 |
PL1776136T3 (en) | 2004-06-24 | 2013-03-29 | Biogen Ma Inc | Treatment of conditions involving demyelination |
US7476331B2 (en) * | 2005-02-09 | 2009-01-13 | E I Du Pont Nemours And Company | Compositions comprising 1,1,1,2,2,3,4,5,5,6,6,7,7,7-tetradecafluoroheptane and uses thereof |
AU2006232287B2 (en) | 2005-03-31 | 2011-10-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association |
JP2008545781A (en) | 2005-06-06 | 2008-12-18 | ワイス | Anti-TrkB monoclonal antibody and use thereof |
CN101495509B (en) | 2005-07-08 | 2015-04-22 | 比奥根艾迪克Ma公司 | SP35 antibodies and uses thereof |
WO2007058843A2 (en) * | 2005-11-15 | 2007-05-24 | Lentigen Corporation | Web based vector design |
IN2014DN10515A (en) * | 2006-03-31 | 2015-08-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | |
ES2654040T3 (en) | 2006-03-31 | 2018-02-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for the purification of bispecific antibodies |
RU2510400C9 (en) * | 2007-09-26 | 2014-07-20 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Modification method of isoelectric point of antibody by means of amino-acid replacements in cdr |
MX2010003450A (en) | 2007-09-26 | 2010-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modified antibody constant region. |
EP2617736A1 (en) * | 2007-09-28 | 2013-07-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-glypican 3 antibody having improved kinetics in plasma |
AU2008311251B9 (en) * | 2007-10-11 | 2014-04-17 | Biogen Ma Inc. | Methods for treating pressure induced optic neuropathy, preventing neuronal degeneration and promoting neuronal cell, survival via administration of lingo-1 antagonists and TrkB agonists |
EP2217697B1 (en) * | 2007-11-08 | 2015-06-10 | Biogen MA Inc. | Use of lingo-4 antagonists in the treatment of conditions involving demyelination |
ES2834741T3 (en) | 2007-12-05 | 2021-06-18 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-NR10 antibody and its use |
DK2708559T3 (en) | 2008-04-11 | 2018-06-14 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules |
JP2011527572A (en) | 2008-07-09 | 2011-11-04 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | Composition comprising a LINGO antibody or fragment |
TWI440469B (en) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
TWI682995B (en) | 2009-03-19 | 2020-01-21 | 日商中外製藥股份有限公司 | Antibody constant region alteration |
EP2409991B1 (en) | 2009-03-19 | 2017-05-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody constant region variant |
CA2761891A1 (en) | 2009-05-15 | 2010-11-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-axl antibody |
US10150808B2 (en) | 2009-09-24 | 2018-12-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Modified antibody constant regions |
US10435458B2 (en) | 2010-03-04 | 2019-10-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding |
NO2644698T3 (en) | 2010-11-17 | 2018-06-02 | ||
JP6030452B2 (en) | 2010-11-30 | 2016-11-24 | 中外製薬株式会社 | Antigen-binding molecules that repeatedly bind to multiple molecules of antigen |
CN103492565B (en) | 2011-02-25 | 2021-01-29 | 中外制药株式会社 | Fc gamma RIIb specific Fc antibodies |
EP3939996A1 (en) | 2011-09-30 | 2022-01-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities |
TW201326209A (en) | 2011-09-30 | 2013-07-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Therapeutic antigen-binding molecule with a FcRn-binding domain that promotes antigen clearance |
US9796780B2 (en) | 2012-05-14 | 2017-10-24 | Biogen Ma Inc. | LINGO-2 antagonists for treatment of conditions involving motor neurons |
UY35148A (en) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Amgen Inc | HETERODIMERIC IMMUNOGLOBULINS |
US9708375B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Amgen Inc. | Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors |
CA2923145A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-12 | Amgen Inc. | Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles |
MX2016003616A (en) | 2013-09-27 | 2016-07-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for producing polypeptide heteromultimer. |
MX2016014761A (en) | 2014-05-16 | 2017-05-25 | Amgen Inc | Assay for detecting th1 and th2 cell populations. |
MA40764A (en) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | THERAPEUTIC AGENT INDUCING CYTOTOXICITY |
US10000560B2 (en) | 2014-12-19 | 2018-06-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use |
TW201809008A (en) | 2014-12-19 | 2018-03-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | Anti-C5 antibodies and methods of use |
WO2016112270A1 (en) | 2015-01-08 | 2016-07-14 | Biogen Ma Inc. | Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders |
CN114773470A (en) | 2015-02-05 | 2022-07-22 | 中外制药株式会社 | Antibodies comprising an ion concentration-dependent antigen-binding domain, FC region variants, IL-8-binding antibodies and uses thereof |
KR20180095740A (en) | 2015-02-27 | 2018-08-27 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | Composition for treating il-6-related diseases |
WO2016159213A1 (en) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | 中外製薬株式会社 | Method for producing polypeptide hetero-oligomer |
EP3328440A4 (en) | 2015-07-28 | 2019-01-16 | Otonomy, Inc. | Treatment using truncated trk b and trk c antagonists |
EP3328898B8 (en) | 2015-07-28 | 2024-04-10 | 6452728 Canada Corp. | Trkb or trkc agonist compositions and methods for the treatment of otic conditions |
WO2017110981A1 (en) | 2015-12-25 | 2017-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-myostatin antibodies and methods of use |
JP7219005B2 (en) | 2015-12-28 | 2023-02-07 | 中外製薬株式会社 | Methods for Streamlining Purification of Fc Region-Containing Polypeptides |
RU2746754C2 (en) | 2016-03-14 | 2021-04-20 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Cell damage inducing therapeutic medicinal product for anticancer therapy |
EP3478269A4 (en) | 2016-06-29 | 2020-04-08 | Otonomy, Inc. | Triglyceride otic formulations and uses thereof |
CA3026050A1 (en) | 2016-08-05 | 2018-02-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composition for prophylaxis or treatment of il-8 related diseases |
AU2018235928B2 (en) | 2017-03-14 | 2023-09-21 | Amgen Inc. | Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture |
JP7185884B2 (en) | 2017-05-02 | 2022-12-08 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター | METHOD FOR PREDICTING AND DETERMINING THERAPEUTIC EFFECT OF IL-6 AND NEUTROPHIL-RELATED DISEASE |
KR20200135781A (en) | 2018-03-26 | 2020-12-03 | 암젠 인크 | Total non-fucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture |
KR20220069982A (en) | 2019-09-26 | 2022-05-27 | 암젠 인크 | Methods for producing antibody compositions |
US20230273126A1 (en) | 2020-06-04 | 2023-08-31 | Amgen Inc. | Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process |
AU2021360897A1 (en) | 2020-10-15 | 2023-05-25 | Amgen Inc. | Relative unpaired glycans in antibody production methods |
CA3222409A1 (en) | 2021-06-07 | 2022-12-15 | Amgen Inc. | Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins |
EP4413377A1 (en) | 2021-10-05 | 2024-08-14 | Amgen Inc. | Fc-gamma receptor ii binding and glycan content |
WO2023215725A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Fred Hutchinson Cancer Center | Compositions and methods for cellular immunotherapy |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5322678A (en) * | 1988-02-17 | 1994-06-21 | Neorx Corporation | Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification |
US6247647B1 (en) * | 1988-09-19 | 2001-06-19 | Symbol Technologies, Inc. | Scan pattern generator convertible between multiple and single line patterns |
US5229500A (en) * | 1989-08-30 | 1993-07-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Brain derived neurotrophic factor |
JPH0595786A (en) | 1991-10-07 | 1993-04-20 | Green Cross Corp:The | Mutant human prourokinase |
US5349055A (en) | 1992-03-06 | 1994-09-20 | Persson Hakan B | Nerve growth factor having altered receptor binding specificities |
EP0668352A1 (en) | 1994-02-14 | 1995-08-23 | Kirin Brewery Company, Ltd. | Protein having TPO activity |
ATE237634T1 (en) * | 1994-10-13 | 2003-05-15 | Amgen Inc | ANALOGUE OF KERATINOCYTE GROWTH FACTOR |
US5770577A (en) | 1994-11-14 | 1998-06-23 | Amgen Inc. | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
US5830857A (en) * | 1995-07-14 | 1998-11-03 | Amgen Inc. | Method of treating epilepsy |
-
1997
- 1997-07-17 AU AU36712/97A patent/AU720232B2/en not_active Ceased
- 1997-07-17 IL IL12787297A patent/IL127872A0/en unknown
- 1997-07-17 SK SK14-99A patent/SK1499A3/en unknown
- 1997-07-17 CZ CZ993A patent/CZ399A3/en unknown
- 1997-07-17 ZA ZA9706326A patent/ZA976326B/en unknown
- 1997-07-17 EP EP97933550A patent/EP0938499A1/en not_active Withdrawn
- 1997-07-17 US US09/214,214 patent/US6211150B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-17 CA CA002259163A patent/CA2259163C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-17 NZ NZ333650A patent/NZ333650A/en unknown
- 1997-07-17 WO PCT/US1997/012609 patent/WO1998003546A1/en not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-01-07 NO NO990059A patent/NO990059L/en unknown
-
2000
- 2000-12-19 US US09/745,032 patent/US6500429B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-19 US US09/742,600 patent/US6723701B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-07-11 US US10/618,283 patent/US20050143294A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL127872A0 (en) | 1999-10-28 |
NO990059D0 (en) | 1999-01-07 |
WO1998003546A1 (en) | 1998-01-29 |
US6500429B2 (en) | 2002-12-31 |
NO990059L (en) | 1999-03-19 |
US20050143294A1 (en) | 2005-06-30 |
NZ333650A (en) | 2000-02-28 |
AU720232B2 (en) | 2000-05-25 |
CA2259163A1 (en) | 1998-01-29 |
US6211150B1 (en) | 2001-04-03 |
CA2259163C (en) | 2004-07-06 |
ZA976326B (en) | 1998-02-03 |
US20020010135A1 (en) | 2002-01-24 |
US20010027179A1 (en) | 2001-10-04 |
EP0938499A1 (en) | 1999-09-01 |
US6723701B2 (en) | 2004-04-20 |
AU3671297A (en) | 1998-02-10 |
SK1499A3 (en) | 1999-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ399A3 (en) | Polypeptide analogs of cation-active polypeptides | |
JP6608799B2 (en) | Highly soluble leptin | |
US8673858B2 (en) | Method for treating wrinkles using a paralytic peptide from the shrew Blarina brevicauda | |
CN114671941B (en) | Nerve growth factor mutant | |
EP3060238A1 (en) | Mutated fibroblast growth factor (fgf) 1 and methods of use | |
EP3285798A2 (en) | Fibroblast growth factor (fgf) 1 with mutation in the heparin binding domain and methods of use to reduce blood glucose | |
EP3285793A2 (en) | Fibroblast growth factor (fgf) 1 mutants and methods of use to reduce blood glucose | |
CN109134664B (en) | Modified growth differentiation factor and preparation method and application thereof | |
CN113383012A (en) | Human hepatocyte growth factor mutant and application thereof | |
WO2015031316A1 (en) | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders | |
CN108727486A (en) | Long-acting nerve growth factor, preparation method and combinations thereof | |
US20240252660A1 (en) | Cargo molecule transduction domain rmmr1, variant thereof, recombinant cargo molecule, and method for transducing cargo molecule using same | |
RU2727715C2 (en) | Fused protein containing a version of ccl3, and use thereof | |
US6271364B1 (en) | Analogs of NT-3 | |
JP2001523113A (en) | Sodium channel receptor | |
US6387875B1 (en) | Method of use for murine leukaemia inhibitory factor-binding protein (mLBP) | |
KR20050065519A (en) | Albumin-fused ciliary neurotrophic factor | |
JP2004041175A (en) | Human lig-1 homolog (hlig-1) | |
MXPA99000372A (en) | Products analogues of proteins cationi | |
KR20220163872A (en) | Cargo molecule transport domain RMMR1, variant thereof, recombinant cargo molecule containing thereof and cargo molecule transport method using the same | |
EP0596034A1 (en) | Purification of recombinant ciliary neurotrophic factor and c-terminal truncated ciliary neurotrophic factor and methods for treating peripheral nerve damage | |
JP2002330793A (en) | Hnbc1a being member of sodium carbonate co-transporter family | |
CA2079291A1 (en) | Activities of heparin binding neurite-outgrowth promoting factor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |