CZ396199A3

CZ396199A3 - Kosmetický prostředek

Info

Publication number: CZ396199A3
Application number: CZ19993961A
Authority: CZ
Inventors: Angel Augusto Guerrero; Joseph Michael Corey
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1998-04-21
Filing date: 1998-04-21
Publication date: 2000-04-12

Abstract

Kosmetický prostředek k péči o kůži obsahující kyselinu salicyloxy-a-karboxylovou. Prostředky podle vynálezu poskytují možnost regulace vylučování mazu ze sebocytů, zlepšení regulace mastnosti a zlepšení pocitu na kůži, zabraňují lesku a lepkavosti kůže a poskytují také prospěšné účinky proti stárnutí, které umožňují omezení vrásčitosti a stárnutí kůže, zlepšení barvy kůže, péči o kůži zestárlou působením světla, zlepšeníjasnosti a hladkosti kůže a dosažení celkově zdravého a mladého vzhledu kůže.

Description

σ>

Kosmetický prostředek	··· ···· ···· ··· · · · · · · · ······· · · ·· ·· * • · ··· ···· _ j - ..... .........
Oblast techniky Poskytují se kosmetické stavu lidské pokožky místním	způsoby a prostředky pro zlepšení ~ podáváním kosmetických prostředků

s obsahem kyseliny salicyloxy-a-karboxylové na pokožku.

Dosavadní stav techniky

Kosmetické výrobky, které zlepšují vzhled pokožky, jsou mezi spotřebiteli stále populárnější. Spotřebitelé často žádají zmírnění nebo opoždění nástupu známek stárnutí nebo stárnutí pokožky působením světla, jako jsou drobné rýhy a vrásky, vysušená a ochablá pokožka. Spotřebitelé také často vyhledávají navíc k oddálení známek stárnutí další prospěšné vlastnosti. Častým nežádoucím stavem pokožky je „mastná pokožka“ (oily skin), tedy stav způsobený nadměrným množstvím mazu na pokožce. Maz (sebum) je kožní olej, který je vytvářen sebocyty (buňky mazových žláz v pokožce) a který je potom vylučován na povrch kůže. Mastná kůže je spojena s blýskavým, nežádoucím vzhledem a nepříjemným pocitem na dotek. Mastná pokožka postihuje různé věkové skupiny. Kosmeticky účinné látky, které mohou poskytnout jak účinky proti stárnutí, tak i omezit množství mazu, jsou velmi žádané jak z hlediska výrobců, tak i zákazníků.

US patent 2,116,347 (Grether a další) popisuje použití esterů kyseliny salicyloxykarboxylové pro vnější léčbu revmatismu. Sloučeniny popisované v tomto patentu se odlišují od kyselin salicyloxy-a-karboxylových používaných v předkládaném vynálezu alespoň v tom, že sloučeniny podle výše uvedeného US patentu obsahují namísto koncové karboxylové kyseliny esterovou skupinu. Sloučeniny podle uvedeného US patentu obsahují dvě esterové vazby, • · • · · · · · · · · · · • · · ·· · · · · · • ···· ·· · · · · · · · • · ··· ···· ···· · ·· ··· ·· ·· zatímco sloučeniny podle předkládaného vynálezu obsahují pouze jednu esterovou vazbu.

PCT přihláška WO 93/10755 uvádí kyselinu salicylovou jako účinný prostředek proti vráskám. Leveque a další, US patent 5,262,407 uvádí použití kyseliny salicylové s acylovaným kruhem pro léčení stárnutí kůže. Kyselina salicylová s alkylovaným kruhem byla uváděna v japonském patentu 4036238 (Takasago Perfumery KK) pro léčení acne vulgaris. Van Scott a Yu popisovali v řadě patentů (viz například US patent 5,091,171) prospěšné účinky a-hydroxykyselin proti stárnutí, včetně odstraňování jemných rýh a vrásek. Evropská patentová přihláška 0676194 (Roussel Uclaf) popisuje kosmetické prostředky pro léčení potíží spojených se stárnutím kůže, které obsahují α-hydroxykyseliny (například kyselinu mléčnou) nebo její estery a kyselinu salicylovou nebo její estery. Estery kyseliny salicylové popsané v EP 0676194 jsou alkylestery neesterifikované na kruhu, tj. kyselina salicylová je kovalentně navázána esterovou vazbou na alkylový řetězec.

Žádný z výše uvedených pramenů nepopisuje kyseliny salicyloxy-a-karboxylové popisované v předkládaném vynálezu. Kyselina salicyloxy-a-karboxylová je kyselina salicylová kovalentně navázaná esterovou vazbou na skupinu, která nese kyselou funkční skupinu. V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že kyselina ahydroxykarboxylová (například kyselina mléčná) nebo kyselina salicylová, pokud se použijí zvlášť, nesnižují významným způsobem vylučování mazu, zatímco kyselinou salicyloxy-a-karboxylovou použitou v předkládaném vynálezu se dosahuje výrazného snížení vylučování mazu. Navíc je použití kyseliny salicyloxy-a-karboxylové výhodné v porovnání s použitím fyzikální směsi kyseliny salicylové a kyseliny α-hydroxykarboxylové. S kyselinou salicyloxy-akarboxylovou je možno dosáhnout snadnější formulace farmaceutického prostředku, protože kyselina a-hydroxykarboxylová • · · ·

- 3 a kyselina salicylová nesou jako jednotlivé použité látky větší počet nekompatibilních skupin než jediná molekula kyseliny saficyloxy-akarboxylové.

Podstata vynálezu

Prvním předmětem předkládaného vynálezu je prostředek k péči o kůži, který obsahuje:

(a) od 0,0001 do 20 % hmotnostních salicyloxy-ct-karboxylové kyseliny vzorce I:

kde R je atom vodíku nebo alkylový radikál obsahující od 1 do atomů uhlíku, a M je atom vodíku nebo kovový kationt zvolený z alkalického kovu nebo kovů alkalických zemin; a (b) kosmeticky přijatelný nosič.

Předmětem předkládaného vynálezu je také kosmetický způsob omezení nebo prevence stavu mastné pokožky, zvláště v oblasti obličeje, nanesením prostředku obsahujícího kyselinu salicyloxy-akarboxylovou v kosmeticky přijatelném nosiči na kůži.

Vynález také zahrnuje kosmetický způsob omezení, prevence nebo potlačení sekrece mazu sebocyty použitím prostředku podle vynálezu na kůži.

- 4 • · · · • · · · • * · · • · · ·

Předmětem vynálezu je také kosmetický způsob stimulace syntézy kolagenu a glykosaminoglykanu fibroblasty v kůži nanesením prostředku podle vynálezu na kůži.

Předmětem vynálezu je také kosmetický způsob zesvětlení kůže odstraněním stařeckých skvrn nanesením prostředku podle vynálezu na kůži.

Předmětem vynálezu je také kosmetický způsob péče o pokožku nebo oddálení stárnutí kůže s časem, stárnutí působením světelného záření, suché, rýhované nebo vrásčité kůže, stínění kůže před škodlivým zářením UVA a UVB (stínění proti slunci), zvýšení pevnosti a pružnosti stratům corneum a obecně zvýšení kvality kůže nanesením prostředku podle vynálezu na kůži.

Způsoby a prostředky podle vynálezu poskytují možnost potlačení vylučování mazu ze sebocytů, zlepšení omezení množství oleje a zlepšený pocit na kůži, zabraňují lesku a lepkavosti, přičemž zároveň poskytují prospěšné účinky proti stárnutí, které vedou k omezení vrásek a vzhledu staré kůže, zlepšení barvy kůže, kosmeticky pečují o kůži zestárlou působením světla, vyjasňují a zjemňují kůži a dodávají kůži celkově zdravý a mladý vzhled.

Podrobný popis vynálezu

Salicyloxy-a-karboxylové kyseliny mají obecný vzorec I:

O

II

OH • ·

- 5 kde R je atom vodíku nebo alkylový radikál obsahující od 1 do 16 atomů uhlíku a M je atom vodíku nebo kovový kationt zvolený z alkalického kovu nebo kovu alkalických zemin. Sloučeniny vzorce I se zde souhrnně nazývají „kyseliny“, ačkoliv jsou zahrnuty také soli.

Výhodné sloučeniny obsahují jako skupinu R alkylový řetězec s 1 až 2 atomy uhlíku a skupina M = vodík, sodík nebo draslík.

U nejvýhodnějších sloučenin R = CH3 a M je vodík nebo sodík nebo draslík (sloučenina se také nazývá „kyselina salicyloxy-apropionová“).

Sloučeniny vzorce I mohou být vyrobeny způsobem zahrnujícím následující kroky:

(a) acyluje se sloučenina vzorce II

O

II

RCHC—O—R¹I x

kde X je atom halogenu a R¹ je jakákoliv ochranná skupina, kterou je možno odstranit hydrogenací (další krok procesu) solí kyseliny salicylové (sůl s alkalickým kovem nebo kovem alkalických zemin, s výhodou sodíkem pro komerční dostupnost salicylátu sodného) za získání sloučeniny vzorce III;

O

II

R-CH-C-O-Rl

OH

- 6 (b) hydrogenuje se sloučenina vzorce lil za získání sloučeniny vzorce I.

Sůl salicylové kyseliny má vzorec IV:

kde M¹ je alkalický kov nebo kov skupiny alkalických zemin.

Prvním krokem způsobu (krok (a)) je acylační reakce prováděná za podmínek běžných v oboru. Molární poměr sloučeniny vzorce II k salicylátu (vzorec IV) je typicky v rozmezí 1 : 1 až 1 : 2, s výhodou je poměr 1:1. Reakce se typicky provádí v aprotickém polárním rozpouštědle (jako je aceton, butanon, ethylacetát, nejvýhodněji butanon, protože má vyšší bod varu, což umožní urychlení reakce), Reakce se s výhodou provádí v přítomnosti katalyzátoru (jako je jodid kovů alkalických zemin, nejvýhodněji jodid draselný). Reakce se provádí při teplotě 50 až 100 °C, nejvýhodněji při teplotě 70 až 80 °C. Ve sloučenině vzorce II je X atom halogenu, s výhodou bromu, protože brom má elektrofilnější vlastnosti a a-bromkarboxylové kyseliny (jedny z výchozích sloučenin při výrobě sloučeniny vzorce II) jsou komerčně dostupnější. R¹ je jakákoli ochranná skupina odstranitelná hydrogenací, která se s výhodou volí ze skupiny benzyl, substituovaný benzyl jako je benzyl substituovaný skupinou methoxy, benzyloxymethyl, fenacyl a difenylmethan.

Ve druhém stupni způsobu se sloučenina vzorce III hydrogenuje za získání sloučeniny vzorce I podle vynálezu. Podmínky hydrogenace jsou běžně známé odborníkům s běžnou znaiostí v oboru. Reakce se s výhodou provádí při tlaku 345 až 1379 kPa, výhodněji při tlaku 345 až 689 kPa a při teplotě 40 až 80 °C, s výhodou 50 až 70 °C. Reakce

• ·

- 7 se provádí v přítomnosti katalyzátoru paladia na uhlí. Způsobem podle vynálezu se získá sloučenina vzorce I podle vynálezu. Vedlejší produkty (jejich složení závisí na ochranné skupině R¹) mohou být odstraněny odpařením za atmosférického nebo sníženého tlaku. Výtěžek sloučeniny vzorce I podle vynálezu je typicky v rozmezí od 25 do 65 % hmotnostních.

Sloučenina vzorce II může být připravena různými způsoby v závislosti na přítomné ochranné skupině R¹. Sloučenina vzorce II může být tedy připravena způsobem, při kterém se (i) esterifikuje α-halogenkarboxylová kyselina sloučeninou zvolenou ze skupiny benzylalkohol nebo benzylalkohol substituovaný skupinou methoxy za získání sloučeniny vzorce II, kde R¹ je benzyl nebo substituovaný benzyl, (ii) esterifikuje sůl α-halogenkarboxylové kyseliny benzylchlormethyletherem za získání sloučeniny vzorce II, kde R¹ je benzyloxymethyl;

(iii) esterifikuje sůl α-halogenkarboxylové kyseliny fenacylbromidem za získání sloučeniny vzorce II, kde R¹ je fenacyl; a (iv) esterifikuje α-halogenkarboxylová kyselina difenylmethanolem za získání sloučeniny vzorce II, kde R¹ je difenylmethan.

Výhodná sloučenina vzorce II má skupinu R = benzyl. ahalogenkarboxylová kyselina, s výhodou α-bromkarboxylová kyselina (protože brom je nejlepší odštěpitelná skupina) se esterifikuje benzylalkoholem v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu (DCC). Tato reakce se s výhodou provádí v inertní atmosféře (dusík nebo argon), v nepolárním aprotickém rozpouštědle (jako jsou halogenovaná rozpouštědla, uhlovodíková rozpouštědla, tj. chloroform, methylchlorid, chlorid uhličitý, ethery, např. diethylether, xylen, hexan, heptan). Molární poměr α-bromkarboxylové kyseliny k benzylalkoholu k DCC je • · • · · · • · · · · • ···· · · · • · · · · · · · · ···· · ·· ··· ·* ··

- 8 od 2:1:2 až 1:1:1, s výhodou 1:1:1. Reakce se s výhodou provádí v přítomnosti katalyzátoru (jako je dimethylaminopyridin). Reakce se s výhodou provádí při teplotě 10 až 25 °C, nejvýhodněji při 20 až 25 °C. Reakce se s výhodou provádí při tlaku okolí.

Kyselina salicyloxy-a-karboxylová se přidává do prostředků podle vynálezu v množství od 0,0001 do 20 % hmotnostních, s výhodou pro maximalizaci prospěšných účinků při minimálních nákladech v množství od 0,01 do 12 % hmotnostních, nejvýhodněji od 0,1 do 8 % hmotnostních.

Kosmeticky přijatelné vehikulum

Prostředek podle vynálezu obsahuje také kosmeticky přijatelné vehikulum, které působí jako ředivo, dispergační látka nebo nosič pro kyselinu salicyloxy-a-karboxylovou v prostředku a pro umožnění jejího rozptýlení při nanesení prostředku na kůži.

Mezi vehikula kromě vody nebo navíc k vodě mohou patřit kapalné nebo pevné zvláčňující látky, rozpouštědla, zvlhčovadla, zahušťovadla a prášky. Zvláště výhodným nevodným nosičem je polydimethylsiloxan a/nebo polydimethylfenylsiloxan. Silikony podle vynálezu mohou být silikony s viskozitami v rozmezí od přibližně 10 do 10 000 000 mm²/s (centistokes) při 25 °C. Zvláště vhodné jsou směsi silikonů s nízkou a vysokou viskozitou. Tyto silikony jsou dostupné u firmy General Electric Company pod obchodním názvem Vicasil, SE a SF a Dow Corning Company pod názvem 200 a 550. Množství silikonu, které je možno v prostředcích podle vynálezu použít, je v rozmezí od 5 % do 95 % hmotnostních, s výhodou od 25 % do 90 % hmotnostních z prostředku.

Kosmeticky přijatelné vehikulum bude obvykle tvořit od 5 % do

99,9 %, s výhodou od 25 % do 80 % hmotnostních prostředku a v nepřítomnosti jiných kosmetických pomocných látek může • 9

- 9 • 99 99 • 9 9 9 9

9 9 9 9 • 999999 9

9·· •999 9 99

9 9

9 9 množství prostředku doplňovat do 100 %. S výhodou obsahuje vehikulum alespoň 80 % hmotnostních vody, vztaženo na hmotnost vehikula. S výhodou je množství vody alespoň 50 % hmotnostních z prostředku podle vynálezu, nejvýhodněji od 60 do 80 % hmotnostních prostředku. Výhodné prostředky jsou ve formě emulzí typu olej ve vodě, které obsahují alespoň 60 % hmotnostních, s výhodou alespoň 80 % hmotnostních vody.

Popřípadě přítomné látky s prospěšným účinkem na kůži a kosmetické io pomocné látky

Ačkoliv má kyselina salicyloxy-a-karboxylová ochranné účinky proti slunečnímu záření (protože je derivátem kyseliny salicylové), prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují další látky s ochranným účinkem proti slunečnímu záření, aby bylo dosaženo další snížení . vystavení kůže škodlivému UV záření.

Látky s ochranným účinkem proti slunečnímu záření zahrnují materiály běžně používané k ochraně proti ultrafialovému záření. Pro ilustraci je možno uvést deriváty PABA, cinnamáty a deriváty salicylátů (jiné než kyselina salaicyloxy-a-karboxylová). Je možno například použít oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon (známý také jako oxybenzon). Oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4methoxybenzofenon jsou komerčně dostupné pod obchodními označeními Parsol MCX a Benzofenon-3. Přesné množství použité látky s ochrannými účinky proti slunečnímu záření v emulzích podle vynálezu může kolísat v závislosti na stupni požadované ochrany proti slunečnímu UV záření.

Navíc je možno přidávat další účinné látky pro zesvětlení kůže, jako je niacinamid, kyselina kojová, arbutin, vitamin C, množství od 0,0001 do 20 % hmotnostních.

• ·

Spolu se zvláčňující látkou může být přítomen olej nebo olejovitá látka, aby došlo k vytvoření buď emulze typu voda v oleji nebo emulze typu olej ve vodě, což ve velké míře závisí na průměrné hydrofilnělipofilní rovnováze (HLB) použitého zvláčňujícího prostředku. Obsah takových zvláčňujících prostředků může být v rozmezí od přibližně 0,5 % do přibližně 50 % hmotnostních, s výhodou mezi přibližně 5 % a 30 % hmotnostními z celkového prostředku. Zvláčňující prostředky je možno roztřídit do obecných skupin podle chemického složení, jako jsou estery, mastné kyseliny a alkoholy, polyoly a uhlovodíky.

Estery mohou být mono- nebo diestery. Mezi přijatelné příklady diesterů mastných kyselin patří dibutyladipát, diethylsebakát, diizopropyldimerát a dioktylsukcinát. Přijatelnými estery mastných kyselin s rozvětveným řetězcem jsou například 2-ethylhexylmyristát, izopropylstearát a izostearylpalmitát. Mezi přijatelné tribazické estery kyselin patří triizopropyltrilinoleát a trilaurylcitrát. Mezi přijatelné estery mastných kyselin s přímým řetězcem patří laurylpalmitát, myristyllaktát, oleyleurukát a stearyloleát. Mezi výhodné estery patří kokosový kapryiát/kaprát (směs kokosového kaprylátu a kokosového kaprátu), propylenglykolmyristyletheracetát, diizopropyladipát a cetyloktanoát.

Mezi vhodné mastné alkoholy a kyseliny patří sloučeniny s obsahem 10 až 20 atomů uhlíku. Zvláště výhodné jsou sloučeniny jako cetyl, myristyl, palmityl a stearylalkoholy a kyseliny.

Mezí polyoly, které mohou sloužit jako zvláčňovadla, patří alkylpolyhydroxylové sloučeniny s přímým a rozvětveným řetězcem. Výhodné jsou například propylenglykol, sorbitol a glycerol. Mohou být také použitelné polymerní polyoly jako je polypropylenglykol a polyethylenglykol. Zvláště výhodné jako látky zesilující penetraci jsou také butylen- a propylenglykol.

Jako příklady uhlovodíků, které mohou působit jako zvláčňovadla, jsou látky s uhlovodíkovými řetězci o délce 12 až 30

- 11 9 · · 9 9 • 99 *9

9 9 9 9 • 9999 9 9 9

9 · 9

9999 9 99

99

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 atomů uhlíku. Mezi konkrétní příklady patří minerální olej, ropná vazelína, skvalen a izoparafiny.

Další kategorií funkčních složek v kosmetických prostředcích podle předkládaného vynálezu jsou zahušťovadla. Zahušťovadlo bude obyčejně přítomno v množství v rozmezí od 0,1 do 20 % hmotnostních, s výhodou od přibližně 0,5 do 10 % hmotnostních z prostředku. Příklady zahušťovadel jsou zesítěné polyakryláty dostupné pod obchodním označením Carbopol firmy B. F. Goodrich Company. Je možno také použít gum jako je xanthanová guma, karagenan, želatin, io karaya, pektin a karubová guma. Za určitých okolností může být zahušťujícího účinku dosaženo látkou, která je ve funkci silikonu nebo zvláčňovadla. Například silikonové gumy s viskozitami více než 10 centistokes (10⁵m²s'¹) a estery jako je glycerolstearát mají tuto dvojí funkci.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu je možno přidávat prášky. Mezi tyto prášky patří křída, talek, kaolin, škrob, smektitové jíly, chemicky modifikovaný hlinitokřemičitan hořečnatý, organicky modifikovaný montmorillonitový jíl, hydratovaný křemičitan hlinitý, koloidní oxid křemičitý, hlinitá sůl oktenylsukcinátu škrobu a jejich směsi.

Do kosmetických prostředků je možno přidávat v menším množství také jiné pomocné látky. Mezi tyto látky mohou patřit barviva, zakalovadla a parfémy. Množství těchto dalších pomocných složek přítomných v menším množství může být v rozmezí od 0,001 % do

20 % hmotnostních z prostředku.

Použití produktu, jeho forma a balení

Při použití se z vhodného zásobníku nebo aplikátoru nanese na exponované oblasti kůže prostředek v množství například od 1 do

- 12 ·* · • · ···»

·· ·» • · · · • · · · • · · · • · · » • · · ·

100 ml a v případě potřeby se potom rozprostře a/nebo vetře do kůže rukou nebo prsty nebo vhodným zařízením.

Kosmetický prostředek pro péči o kůži podle vynálezu může být vytvořen jako lotion, krém nebo gel. Prostředek může být balen do vhodného zásobníku vyhovujícího jeho viskozitě a zamýšlenému použití zákazníkem. Například lotion nebo krém mohou být baleny v lahvičce nebo kuličkovém aplikátoru nebo aerosolovým zařízením s vhodným hnacím prostředkem nebo zásobníku opatřeném pumpičkou ovládanou prstem. Pokud je prostředek ve formě krému, může být jednoduše uchováván v nedeformovatelné lahvičce nebo vymačkávacím zásobníku, jako je tuba nebo nádobka opatřená víčkem. Prostředky mohou být také obsaženy v kapslích jako se například popisuje v US patentu 5,063,507 (bezvodý prostředek na bázi silikonu v želatinové kapsli), který se zařazuje.odkazem. Vynález tedy také poskytuje uzavřený zásobník s obsahem kosmeticky přijatelného prostředku definovaného výše.

Vynález budou dále ilustrovat následující konkrétní příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad ilustruje syntézu kyseliny salicyloxy-oc-propionové, která je složkou prostředků podle vynálezu.

Materiály a metody:

Spektra protonové magnetické rezonance byla zaznamenávána na spektrofotometru Bruker AC 200. Chemické posuny se uvádějí v dílech na milion, vztaženo na tetramethylsilan jako vnitřní standard. Rozštěpení způsobené spinem se uvádí následujícím způsobem: s (singlet), d (dublet), t (triplet), q (kvartet), m (multiplet) a br (široký).

- 13 44 4 44 · • · » 4 4 · · • 4 4 · * 4

4··4 444 4

4 4 4 4

4444 4 44 44» »4 44 «4 4

4 4

4 ·

Deuterovaná rozpouštědla NMR obsahují v příslušné poloze 99,0 až

99,8 % deuteria a byla získána od firmy Cambridge Isotopic Laboratories.

Infračervená spektra byla zaznamenávána na spektrometru Nicolet Impact model 410 s použitím NaCI cely. Data byla zpracována použitím softwaru Quick IR. Polohy vrcholů se uvádějí v cm¹ jako vs (velmi silný), s (silný), m (střední), w (slabý) nebo br (široký).

Plynová chromatografie (GC) byla prováděna na plynovém chromatografu Hewlett-Packard 5890 Series II s použitím injektoru HP 7673 řízeného softwarem Hewlett-Packard ChemStation. Byla použita kolona Hewlett-Packard HP-1 25 M x 0,22 mní s 0,33 pm povlakem zesítěného methylsilikonu. Parametry byly následující:

Teplota nástřiku = 250 °C, počáteční teplota pece = 50 °C, počáteční čas = 5 min, rychlost = 25 °C/min, konečná teplota pece = 250 °C. Vzorky byly analyzovány ve formě trimethylsilyletherů/esterů.

Plynová chromatografie/hmotnostní spektrometrie byla prováděna na plynovém chromatografu Hewlett-Packard 5890 Series II ve spojení s detektorem s iontovým záchytem Finnigan MAT ITD 800. Použitá kolona HP-5 25 M x 0,32 mm měla povlak 0,52 pm 5 % zesítěného fenylmethylsilikonu.

Experimenty s diferenciální skanovací kalorimetrií byly prováděny na přístroji Dupont DSC s cell base typu 2910 a termálním analyzátoremtypu 2100. Vzorky o hmotnosti přibližně 1 mg byly přesně naváženy do hliníkových pánviček, které byly potom hermeticky uzavřeny. Po ekvilibraci při 30 °C byly vzorky zahřívány rychlostí 5 °C/min.

Všechny rozpouštědla byla analytické čistoty a byla použita bez úpravy. Všechny chemikálie byly získány od firem Aldrich nebo Sigma Chemical Companies a byly použity bez úprav.

- 14 99 9 *9

9 9 · · • · · · 9 • 9999 9 9 ·

9 9 ·

9999 9 99

9« 9 9

9999

9 9 9 9 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9

999 «9 99

Krok 1: Syntéza benzyl-2-brompropionátu g (0,13 mol) kyseliny 2-brompropionové bylo mícháno se

14,1 g (0,13 mol) benzylalkohoiu v suchém methylenchloridu při 5 až 10 °C, před přidáním 0,16 g (1,3 3 mol) 4-dimethylaminopyridinu (DAMP). Teplota byla zvýšena na ~ 15 °C a potom byl po kapkách přidán roztok dicyklohexylkarbodiimidu (DCC (26,7 g, 0,13 mol) v suchém methylenchloridu. Roztok byl přidáván takovou rychlostí, aby se reakční teplota nezvýšila nad 35 °C. Po ukončení přidávání imidu pokračovala reakce při 25 °C několik hodin, dokud nebyla potvrzena analýzou infračervenou spektroskopií nepřítomnost karboxylové kyseliny při 1730 cm'¹. Po ukončení byla reakční směs zfiltrována ve vakuu pro odstranění dicyklohexylmočoviny (DCU) jako vedlejšího produktu a filtrát byl extrahován 1 x vodou, 1x5% roztokem kyseliny octové (pro odstranění DMAP) a opět vodou. Organická vrstva byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým, zfiltrována a koncentrována za sníženého tlaku. Výtěžek byl 25 g (72 %) směsi benzyl-2-brompropionátu a benzyl-2-chlorpropionátu.

IR (neředěno): 1746 cm'¹ (s) ¹H NMR (200 MHz, CdCI₃): d 7,3 (s, 5H), 5,2 (s, 2H), 4,4 (gt, 1H,

1,8 (d, 3H)

GC (retenční čas): 11,4 min

Krok 2: Syntéza benzylpropionylsalicylátu g (0,092 mol) výše uvedené směsi bylo rozpuštěno ve 100 ml

2-butanonu. Vysrážená dicyklohexylmočovina (vedlejší produkt) byla odfiltrována a k filtrátu bylo přidáno ještě 200 ml butanonu. Roztok byl převeden do reakční nádoby a potom bylo přidáno 0,15 g (9,2 e'⁴ mol) katalyzátoru jodidu draselného a 14,8 g (0,092 mol) salicylátu sodného. Reakční roztok byl zahříván pod zpětným chladičem a monitorován plynovou chromatografií na ukončení reakce. Další • · polovina ekvivalentu katalyzátoru byla nezbytná po několika hodinách pro přivedení reakce k ukončení. Po ukončení byla reakční směs ochlazena a zfiltrována ve vakuu pro odstranění vedlejšího produktu bromidu sodného. Butanon byl odstraněn za sníženého tlaku a produkt byl rozpuštěn v methylenchloridu a extrahován vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nakonec vodou. Organická vrstva byla izolována a sušena nad bezvodým síranem hořečnatým, zfiltrována a koncentrována za sníženého tlaku. Výtěžek 26 g (82 0 %) 90 % benzylpropionylsalicylátu.

io ¹H NMR (200 MHz, CdCI₃): d 10,4 (s, 1H), 7,9 (d, 1H), 7,4 (t,

1H), 7,3 (s, 5H), 6,9 (m, 2H), 5,4 (qt, 1H), 5,3 (s, 2H), 1,8 (d 3H).

GC (retenční čas): 16,6 min DSC: Teplota náběhu (°C): 164 m/z (GC/MS): 301 (M+H)⁺

Krok 3: Syntéza kyseliny salicyloxy-ct-propionové g (0,018 mol) 90 % benzylpropionylsalicylátu bylo rozpuštěno ve 400 ml suchého 2-propanolu. Roztok byl vložen do autoklávu a ochlazen na 10 až 15 °C a potom byl probublán dusíkem pro odstranění vzduchu/kyslíku. Potom byl pomalu přidán 1,0 g (9,0 e'⁴mol) 10 % paladia na aktivním uhlí. Je důležité minimalizovat množství dostupného kyslíku v reakční nádobě, aby se zabránilo vzplanutí 2propanolu. Po přidání katalyzátoru byla nádoba uzavřena a natlakována vodíkem na 276 až 345 kPa a potom byla zahřívána na

60 °C 5 hod. Reakční směs byla potom ochlazena na 20 °C, zfiltrována pro odstranění katalyzátoru a bylo přidáno 1,0 g 10 % paladiového katalyzátoru. Reakční směs byla znovu zahřívána na 60 °C 5 hod, ochlazena a zfiltrována. Filtrát byl potom koncentrován za sníženého tlaku pro odstranění 2-propanolu a toluenu jako « · · ·

- 16 vedlejších produktů. Výtěžek 2,6 g (65 %) 95 % kyseliny salicyloxy-apropionové.

¹H NMR (200 MHz, CdCI₃): d 10,4 (s, 1H), 7,9 (d, 1H), 7,4 (t, 1H), 6,9 (m, 2H), 5,4 (qt, 1H), 1,8 (d, 3H)

GC (retenční čas): 13,2 min DSC: Teplota náběhu (°C): 133 m/z (GC/MS): 210 (M)⁺

Příklad 2

Tento příklad se zabývá měřením produkce prokolagenu I s fibroblasty jako odpověď na působení různými testovanými sloučeninami.

Kolagen je převažujícím proteinem kůže. Jeho syntéza klesá s věkem nebo poškozením světlem. Degradace nebo destrukce kolagenu zvyšuje tahové namáhání kůže, což způsobuje vrásky a ochablost. Mnoho studií včetně studií na lidech ukázalo, že množství kolagenu I klesá se zvyšující se vážností poškození světlem (viz Kligman, A., JAMA (1969), 210, str. 2377 - 2380; Lavker, R., J. Inv. Derm. (1979), 73, 79 - 66; Smith, J. a další, J. Inv. Derm. (1962), 39, str. 347 - 350; a Shuster, S. a další, Br. J. Dermatol. (1975), 93, str. 639 - 643); a udává se rovněž určitá korelace při histologii vrásek a snížení hladin kolagenu v kůži vystavené slunečnímu záření (viz Chen, S.; Kiss, I., J. Inv. Derm. (1992), 98, str. 248 - 254). Voorhees a spolupracovníci podpořili tato zjištění tím, že prokázali obnovu kolagenu typu I v lidské kůži poškozené světlem místním ošetřením tretioninem (viz Christopher, E., a další, The New Eng. J. of Medicine (1993), 329, str. 530 - 535). Prokolagen I je prekurzor kolagenu. Zvýšená produkce prokolagenu I jako odpověď na aplikaci testované sloučeniny naznačuje zvýšenou hladinu kolagenu.

• · • · · · · · ···· • · · · · 4 ···· ······· · · ·« ·« «

Protokol barvení prokolagenu I pro metodu Slot Blot

Novorozenecké lidské kožní fibroblasty byly získány od firmy Clonetics Corp., San Diego, CA. Všechny materiály pro kultivaci buněk byly získány od firmy Life Technologies, NY a použity při pasážích 510. Buňky byly zaočkovány na hustotu přibližně 10 000/jamku do vnitřních 48 jamek 96-jamkové destičky v médiu obsahujícím DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle's Medium), doplněném vysokým obsahem glukózy s 2 mM L-glutaminem, 10 % fetálním bovinním sérem a roztoky antibiotik a antimykotických látek. Buňky byly potom ponechány růst do konfluence 2 dny. Při dosažení konfluence bylo médium odstraněno a buňky byly promyty bezsérovým DMEM a do každé jamky bylo nadávkováno 200 pl roztoku testované sloučeniny v bezsérovém DMEM. Každé dávkování bylo opakováno celkem u šesti jamek. Testované sloučeniny byly použity v koncentracích uvedených v tabulce 1 dále. Kontrola neobsahovala testovanou sloučeninu. Po 24 hodinách byl roztok testované sloučeniny nebo kontrolní roztok odstraněn a do jamek bylo nadávkováno 100 pl roztoku testované sloučeniny v bezsérovém DMEM. Sloučeniny byly použity v koncentracích uvedených v tabulce 1 níže. Po 24 hodinách byl roztok testované sloučeniny nebo kontrolní roztok odstraněn a přes víkend uchován při 4 °C s inhibitorem proteázy (Aprotitin firmy Sigma) při poměru aprotininu k vodě 1 : 200. Roztok testované sloučeniny byl potom zředěn v DMEM (přibližně 20 μΙ vzorku v 200 μΙ DMEM).

Nitrocelulózová membrána a tři listy filtračního papíru byly namočeny ve fyziologickém roztoku pufrovaném TRIS (TBS, pH 7,3). Do přístroje BioRad slot blot (BioRad Labs, CA) byl vložen filtrační papír na dno, membrána navrch a přístroj byl uzavřen. Do jamky bylo přidáno 100 ml TBS. Pro prosátí obsahu jamek přes membránu bylo použito vakua. Roztok testované sloučeniny nebo kontroly byl důkladně zamíchán, potom bylo 100 μΙ naneseno do jamky a sušeno

- 18 gravitačně. Prokolagen z testovacího roztoku byl v tomto místě postupu navázán na membránu. Membrána byla vyjmuta z přístroje, přebytečná plocha byla odříznuta a pravý dolní roh byl pro orientaci označen. Membrána byla vložena do blokovacího roztoku (5 % sušené mléko ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku Dulbecco) a přes noc při 4 °C byla třepána. Membrána byla potom inkubována 1,5 hod při pokojové teplotě s 1,5 ml krysí protilátky proti aminokonci prokolagenu (Chemicon MAB1912) v TBS s 0,1 % BSA (poměr protilátky k pufru/BSA byl 1 : 100) v uzavřeném sáčku za třepání. io Membrána byla potom odstraněna; promývána třikrát 5 min vTBS/0,1 % Tween. Membrána byla potom inkubována 1 hod při pokojové teplotě ve 2 ml biotinylované protikrysí protilátky konjugované s peroxidázou (Vector Labs) v TBS s 0,1 % BSA (poměr protilátky k pufru/BSA byl 1 : 1000) v uzavřeném sáčku za třepání.

Membrána byla potom třikrát promývána 5 min v roztoku

TBS/0,1 % Tween. 3 ml PBS bylo inkubováno s 30 pl každého z roztoků A a B soupravy Vectastain Kit 30 min. Membrána byla vložena do získaného roztoku na 30 min v uzavřeném sáčku za třepání. Membrána byla potom vyjmuta a 2 x 5 min promývána vTBS/0,1 % Tween. Membrána byla potom barvena následujícím roztokem:

12,5 mg 3-amino-9-ethylkarbazolu (Sigma), 3,125 (přibližně) ml DMF (Ν,Ν-dimethylformamidu firmy Sigma), 21,5 ml pufru 0,2 M NaOAc, pH 5,2, 12,5 ml H₂O₂.

Membrána byla barvena až do vyvinutí barvy a reakce byla zastavena dvojnásobným promytím 10 min ve vodovodní vodě. Průhledná kopie blotu byla připravena pomocí barevné kopírky. Barevná kopie byla skenována laserovým densitometrem (Ultroscan XL firmy Pharmacia KLB). Byl vypočten násobek přírůstku jako poměr hodnot zjištěných densitometrem pro buňky v přítpmnosti testované sloučeniny ve srovnání s kontrolou.

• ·

- 19 • · ♦ · ♦ * · · • · · » · · · ·· ······ • · · · · · · • · · · · ·· ··

Takto získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1

Testovaná sloučenina (koncentrace)	Hodnota zjištěná densitometrem	Standardní odchylka	Hodnota p (proti kontrole)	Násobek zvýšení proti kontrole
Experiment 1
Kontrola	0,00209	0,001526
SP (10 mM)	0,002587	0,001642	0,695335	1,2
SP (2 mM)	0,00434	0,001521	0,081808	2,1
Experiment 2
Kontrola	0,002387	0,000926
SP (5 mM)	0,00388	0,000306	0,027063	1,6
SP (1 mM)	0,00549	0,001875	0,04861	2,3

SP = kyselina salicyloxy-a-propionová

Jak kyselina salicylová, tak i kyselina mléčná zvyšovaly produkci prokolagenu I fibroblasty (data nejsou uvedena).

Z údajů v tabulce 1 je vidět, že přídavek kyseliny salicyloxy-apropionové v koncentraci 1, 2 a 5 mM ke kultuře fibroblastů vede ke ío zvýšení produkce prokolagenu I, jak ukazují vyšší hodnoty získané densitometrem ve srovnání s kontrolou. Předpokládá se, že kyselina salicyloxy-a-propionová v koncentracích 10 mM poškozovala kultury fibroblastů.

- 20 Příklad 3

V tomto příkladu se měří produkce glykosaminoglykanů fibroblasty jako odpověď na působení různých testovaných sloučenin. Glykosaminoglykany (GAG) jsou skupina polysacharidů, které (s výjimkou kyseliny hyaluronové (HA) mohou být navázány na proteinové jádro za vytvoření proteoglykanu. Hlavní GAG v dermis jsou HA a sulfát dermatanu, přičemž v malých množstvích jsou přítomny chondroitin-4-sulfát a chondroitin-6-sulfát. GAG jsou produkovány jak keratinocyty, tak i kožními fibroblasty a jsou základními složkami extracelulární matrix, ačkoliv tvoří až pouze 0,2 % suché hmotnosti kůže. Glykosaminoglykany v kůži hydratují (HA může zadržet až tisícinásobek vlastní hmotnosti vody) a udržují základní integritu membrány, řídí buněčné interakce a transport živin a účastní se tvorby kolagenu a možná i elastických vláken. Podíl GAG (zejména HA) v kůži se podle současných poznatků snižuje s věkem (viz Perlish a další, „The Role of Glycosaminoglycans in Aging of the Skin“). Kyselina retinová, jako představitel účinných látek proti stárnutí, má zvyšovat obsah GAG spinózní a granulární vrstvy epidermis a papilární dermis zestárlé kůže in vivo (viz Kligman a další, „Effects of topical tretinoin on non-sun-exposed protected skin of the elderly“, J. Am. Acad. Dermatol. 1993, 29: 25 - 33).

Protokol pro měření obsahu GAG

Neonatální lidské kožní fibroblasty byly získány u firmy Clonetics Corp., San Diego, CA. Veškeré materiály pro kultivaci buněk byly získány u firmy Life Technologies, NY a použity v pasážích 5-10. Buňky byly zaočkovány na hustotu přibližně 10 000/jamku do vnitřních 48 jamek 96-jamkové destičky v médiu obsahujícím DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), doplněném vysokým obsahem glukózy s 2 mM L-glutaminem, 10 % fetálním bovinním sérem a roztoky antibiotik a antimykotických látek. Buňky byly potom • · ponechány růst do konfluence 2 dny. Při dosažení konfluence bylo médium odstraněno a buňky byly promyty bezsérovým DMEM a do každé jamky bylo nadávkováno 750 μΙ roztoku testované sloučeniny v bezsérovém DMEM. Každé dávkování bylo opakováno celkem třikrát.

Testované sloučeniny byly použity v koncentracích uvedených v tabulce 2 dále. Kontrola neobsahovala testovanou sloučeninu. Po 24 hodinách byl roztok testované sloučeniny nebo kontrolní roztok odstraněn a byl opakován krok působení testovaných sloučenin. Po dalších 24 hodinách bylo toto médium s obsahem rozpustných GAG io shromážděno a zmraženo pro analýzu.

Kladně nabitá membrána Zeta Probe byla namočena do sterilní vody a vložena do přístroje Dot-Blot Apparatus (oba Bio-Rad Labs, Hercules, CA). Do každé jamky bylo přidáno 100 μΙ vody a obsah byl prosát pomocí vakua. Po roztátí bylo na membránu naneseno 100 μΙ vzorků testovaných roztoků nebo standardů (kyselina hyaluronová nebo chondroitinsulfát z bovinní trachey, Sigma, St. Louis, MO) a roztok byl ponechán gravitačně filtrovat (přibližně 1,5 až 2 hod). GAG byly nyní navázány na membránu. Membrána byla blokována v roztoku bovinního sérumalbuminu bez mastných kyselin (Sigma) s koncentrací 3 % hmotnost/objem ve vodě po dobu 1 hodiny. Byl připraven roztok barviva Alcian Blue (ICN Biochemicals, Cleveland, OH) v 3 % kyselině octové, pH 2,3 s koncentrací 0,5 % hmotnost/objem. Membrána byla třikrát promyta v destilované vodě a potom barvena v roztoku barviva na rotační třepačce 15 min. Barvivo bylo odlito a membrána byla dvakrát odbarvena 15 min vždy v 3 % kyselině octové. Membrána byla opláchnuta vodou a ponechána přes noc usušit. Pro kvantitativní stanovení intenzity zbarvení v každé testované oblasti bylo použito přístroje Bio Rad Image Analysis Densitometer. Násobek zvýšení proti kontrole byl vypočten jako poměr hodnot zjištěných densitometrem u buněk v přítomnosti testované sloučeninyu ve srovnání s kontrolou.

• · • 9

- 22 • 9 9

9 9

99 99

9

99 9 9

9 9

Získané výsledky jsou zahrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2

Testovaná sloučenina (koncentrace)	Hodnota zjištěná densitometrem	Standardní odchylka	Hodnota p (proti kontrole)	Násobek zvýšení proti kontrole
Experiment 1
Kontrola	0,36325	0,025158
SP (5 mM)	0,38875	0,036582	0,294402	1,1
SP (1 mM)	0,41925	0,05818	0,127663	1,2
Experiment 2
Kontrola	0,357	0,039556
SP (5 mM)	0,403	0,017795	0,078168	1,1
SP (1 mM)	0,49125	0,034189	0,002146	1,4

SP = kyselina salicyloxy-a-propionová

Kyselina mléčná zvyšovala produkci GAG, kyselina salicylová nikoliv (data nejsou uvedena).

Z údajů v tabulce 2 je vidět, že přídavek kyseliny salicyloxy-apropionové v koncentraci 1 mM ke kulturám fibroblastů vede ke io zvýšení produkce GAG, jak ukazují vyšší hodnoty odečtené densitometrem v porovnání s kontrolou. Maximální násobek přírůstku proti kontrole pozorovaný v tomto testu s použitím transformujícího růstového faktoru beta byl přibližně 2.

· • 0

- 23 • · · • 0 0··

Příklad 4

Tento příklad popisuje analýzu potlačení mazu různými testovanými sloučeninami in vitro.

Test sebocytové lipogeneze in vitro:

Lidské kožní žlázy byly izolovány z nosu muže (věk 60 let) a kultivovány s technikou submerzních tkáňových kultur (Bajor a další, J. Invest. Dermatol. 102: 1994, str. 564). Tyto sebocyty akumulují intracelulárně kapičky lipidu charakteristické pro zralé lidské sebum. Kyselina mléčná a salicylová byly získány od firmy Sigma.

io Sklizené a pasážované sebocyty byly přidány do každé jamky jamkové tkáňové kultivační destičky a inkubovány při 37 °C v přítomnosti 7,5% CO2 10 dnů. V den experimentu bylo růstové médium odstraněno a sebocyty byly třikrát promyty fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS). Do každé jamky bylo přidáno

0,5 ml čerstvého PBS a 5 ml testovaného prostředku v konečné koncentraci od 0,001 % do 0,2 %. Pro každý vzorek bylo použito tří jamek. Kontroly se skládaly z PBS, dimethylsulfoxidu (DMSO) použitého pro solubilizaci kyseliny salicyloxy-a-propionové a fenolčerveni, sloučenina, která má aktivitu podobnou estrogenům (fenolčerveň snižuje produkci mazu a byla použita jako kontrola pro ověření integrity sebocytového testu). Všechny kultury byly inkubovány při 37 °C/7,5 % CO2 30 min. Radioaktivní označení bylo získáno přídavkem 100 ml ¹⁴C značené kyseliny octové (Amersham, sodná sůl, specifická aktivita 56 mCi/mmol, tj. 2,072 GBq/mmol) k 10 ml 50 mM pufru s octanem sodným. Potom bylo do každé jamky přidáno 50 ml roztoku s obsahem sebocytů a testovaných látek. Kultury byly vloženy zpět do inkubátoru na 4 hodiny. Potom byly sebocyty třikrát propláchnuty čerstvým PBS pro odstranění nenavázané aktivní látky a radioaktivní sloučeniny. Radioaktivní sonda zbylá v kultivovaných sebocytech byla počítána scintilačním čítačem Beckman. Výsledky byly vyjádřeny jako procento snížení ve srovnání s kontrolou (DMSO).

·· · • ♦ · · · · · » · f · « « · ·· · · ♦ · · ······· * · · · *9 » • · · · · ···· _ 24 - .....

Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 3.

Tabulka 3

Sloučenina	% konečné koncentrace	% snížení inkorporace sondy ¹⁴C	Standardní odchylka
Experiment 1
SP	0,001	3,9	31,4
	0,01	18,7	4,5
	0,10	67,8	5,3
	0,20	68,9	3,6
Experiment 2
SP	0,001	24,4	5,6
	0,01	53,3	3,8
	0,10	91,6	1,2
	0,20	87,1	5,0
Fenolčerveň	0,01	20,5	22,5
Experiment 3
SP	0,001	- 57,0	4,7
	0,005	-49,3	7,7
	0,10	75,8	17,4
Experiment 4
SP	0,01	2,4	14,8
	0,05	22,6	9,1
	0,10	73,8	11,7

• 9

- 25 #9 9 • · · • 9 9 • 9 9

Experiment 5
Kyselina mléčná	0,001	5,9	20,1
	0,01	3,0	10,9
	0,1	38,6	5,0
	1,0	15,1	1,9
Experiment 6
Kyselina salicylová	0,0014	10,1	10,5
	0,014	13,1	13,4
	0,14	3,6	7,4

SP = kyselina salicyloxy-a-propionová

Z výsledků v tabulce 3 je vidět, že při koncentraci kyseliny salicyloxy-a-propionové 0,10 % a vyšší se ve všech případech dosáhlo potlačení sekrece mazu sebocyty. Ve třech ze čtyř experimentů byla kyselina salicyloxy-a-propionová účinná i při koncentraci nižší než 0,01 %. Kyselina mléčná měla podstatně nižší účinnost při koncentraci 0,1 % než kyselina salicyloxy-a-propionová při stejné koncentraci. Kyselina salicylová nebyla účinná.

Příklad 5

Tento příklad popisuje analýzu schopnosti zesvětlovat kůži kyseliny salicyloxy-a-propionové in vitro.

Buňky B16 byly získány od ATCC (Rockville, MD).

Subkonfluentní buňky B16 byly zaočkovány do 96 jamkových mikrotitračních destiček na hustotu 5000 buněk/jamku a kultivovány

• ·

- 26 9 «

přes noc v médiu DMEM (Life Technologies, NY) s obsahem 10 % fetálního bovinního séra, 1 % penicilin/streptomycin bez fenolčerveni při 37 °C v 5 % CO₂. Po 24 hod byla média nahrazena čerstvým médiem s obsahem testovaných látek. Buňky byly inkubovány 72 hod, přičemž v kontrolách byl viditelný melanin. Potom bylo médium s obsahem melaninu z každé jamky převedeno na čistou 96 jamkovou destičku a kvantifikováno odečítáním absorbance při 530 nm s použitím spektrofotometru pro destičky.

Aby bylo zajištěno, že inhibice melaninu nebyla způsobena io jednoduše usmrcením buněk, byla testována viabilita buněk spotřebou neutrální červeni. Po odstranění média bylo do každé jamky přidáno 200 μΙ předehřátého média obsahujícího 25 pg/ml neutrální červeni a destička byla inkubována 3 hodiny. Buňky byly dvakrát promyty PBS. Barvivo bylo extrahováno přidáním 100 μΙ směsi

50 H₂O : 9 ethanol : kyselina octová za mírného třepání při pokojové teplotě 20 min. Barvivo bylo kvantifikováno odečtením absorbance při 530 nm. Předpokládá se, že barvivo budou spotřebovávat pouze životaschopné buňky a absorbance je tedy přímo úměrná počtu životaschopných buněk, které přežily působení látek.

Pro každou testovanou látku byl vypočten průměr ze čtyř opakovaných odečítání jako procento vztažené na průměr pro neošetřenou kontrolu. Statistická významnost byla hodnocena použitím Studentova t-testu (uvádí se pouze pro analýzy, u kterých bylo dosaženo životaschopnosti více než 50 %).

Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 4. Protože množství melaninu je vyjádřeno jako procenta z neošetřené kontroly, čím menší jsou tato čísla, tím lepší je aktivita (jestliže hodnoty pro neutrální červeň se blíží 100).

• · · ···· • · * ··· · « ·· hCN

I

Tabulka 4

'03 >

O c

o

Q.

O ίΟ.

i i

>.

X

O o

óš ω

C

O ω

II

CL ω

• ·

- 28 • · « • t · • · · » » ·

Z výsledků v tabulce 4 je vidět, že kyselina salicyloxy-apropionová inhibovala melanin výrazně při koncentraci 1 mM a vyšší, což ukazuje na to, že kyselina salicyloxy-a-propionová je účinná látka pro zesvětlování živé kůže.

Příklad 6

Příklad 6 ilustruje prostředky pro místní podávání podle předkládaného vynálezu. Prostředky mohou být zpracovány běžným způsobem. Jsou vhodné pro kosmetické použití. Prostředky jsou io zvláště vhodné pro použití na vrásčitou, drsnou, šupinkovou, zestárlou kůži a/nebo kůži poškozenou UV-zářením a/nebo olejovitou kůži pro zlepšení vzhledu a pocitu na kůži, stejně jako pro použití na zdravou kůži pro. zabránění nebo zpomalení jejího poškozování.

·· B • ·

- 29 • · · • BBBB • B

BBBB B

B B B B

B B B ·

B B B B

B· BB

Emulze olej ve vodě

Složka	% hmotnostních
Deionizovaná voda	73,40
Carbomer	0,30
Dvojsodná sůl EDTA	0,10
Glycerol	3,00
Polysorbát 20	2,50
Butylenglykol	2,00
Methylparaben	0,30
Triethanolamin 99 %	0,30
Kyselina salicyloxy-cc-propionová	8,00
Izopropylmyristát	5,00
Oktylpalmitát	3,00
Cětylalkohol	1,00
Dimethicone, 10‘⁴m²s'¹	0,50
Včelí vosk	0,30
Propylparaben	0,10
Germall II	0,10
Vonné látky	0,10
Celkem	100,00

• · ·· « • · · · ♦ ·· • · · · · · • ···· · · · · • · t · · ···· · ·« ···

- 30 • · • · • · ♦ · ·· ««

Emulze olej ve vodě

Složka	% hmotnostních
Deionizovaná voda	71,20
Xanthanová guma	0,20
Dvojsodná sůl EDTA	0,10
Glycerol	5,00
Butylenglykol	2,00
Methylparaben	0,30
Kyselina salicyloxy-a-hexadekanová	8,00
Izopropylmyristát	5,00
Oktylpalmitát	3,00
Cetylalkohol	1,00
Dimethicone, 10‘⁴m²s'¹	0,50
Steareth-2	0,40
Steareth-21	3,00
Propylparaben	0,10
Germall II	0,10
Vonné látky	0,10
Celkem	100,00

- 31 ·· · 9·

9 · 9 9 • 9 9 9 9

9999 99 9

9 9 9

9999 9 99

99 99 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

999 99 99

Emulze voda v oleji

Složka	% hmotnostních
Deionizovaná voda	63,30
Dvojsodná sůl EDTA	0,10
Glycerol	3,00
Propylenglykol	2,00
Chlorid sodný	0,70
Methylparaben	0,30 -
Cyklomethicon	14,00
Kyselina salicyloxy-a-pentanová	5,00
Izopropylmyristát	5,00
Oktylpalmitát	3,00
Dimethicon kopolyol	2,50
Dimethicone, 10'⁴m²s'¹	0,50
Včelí vosk	0,30
Propylparaben	0,10
Germall II	0,10
Vonné látky	0,10
Celkem	100,00

Hydrogel

Složka	% hmotnostních
Deionizovaná voda	82,85
Butylenglykol	5,00
PPG-5-Ceteth 20	5,00
Glycerol	3,00
Carbomer	1,20
Triethanolamin 99 %	1,20
Kyselina salicyloxy-a-heptanová	1,00
Methylparaben	0,30
Polysorbát 20	0,25
Dvojsodná sůl EDTA	0,10
Germall II	0,10
Celkem	100,00

- 33 44 ·

4 4 • 4 4 • 4 444

4

4444 4

4« 44

4 4 4

44

Bezvodé sérum

Složka	% hmotnostních
Cyklomethicon	72,40
Kyselina salicyloxy-a-propionová	5,00
Izopropylmyristát	5,00
Oktylpalmitát	3,00
Polyglycerol-6-dioleát	5,00
Butylenglykol	4,00
Dimethicon, 10'⁴m²s¹	5,00
Včelí vosk	0,30
Propylparaben	0,20
Vonné látky	0,10
Celkem	100,00

·· 9 · 9 9 9 • · 9 9 9

999999 9

9 9 9

9999 9 99

- 34 9 9 9 9

9 9 9

9 9 *

99

Vodně-alkoholovy gel

Složka	% hmotnostních
Deionizovaná voda	52,85
Alkohol SDA40B	30,00
Butylenglykol	5,00
PPG-5-Ceteth 20	5,00
Glycerol	3,00
Carbomer	1,20
Triethanolamin 99 %	1,20
Kyselina salicyloxy-a-dodekanová	1,00
Methylparaben	0,30
Polysorbát 20	0,25
Dvojsodná sůl EDTA	0,10
Germall II	0,10
Celkem	100,00

Zastupuje:

Claims

·· ··

PATENTOVÉ NÁROKY

Kosmetický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje (a) od 0,0001 do 20 % hmotnostních kyseliny salicyloxy-akarboxylové vzorce I:

kde R je atom vodíku nebo alkylový radikál obsahující od 1 do 16 atomů uhlíku a M je atom vodíku nebo kationt kovu

15 zvoleného ze skupiny alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin; a (b) kosmeticky přijatelné vehikulum.
2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, 20 že skupinou R v kyselině salicyloxy-a-karboxylové je ,CH₃.
3. Prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že skupinou M v kyselině salicyloxy-a-karboxylové je atom vodíku nebo sodík.

I
·· 4 • · · • · 4 • 4444 • 4 4444 « - 36 - 99 9 • 4 44 • · · 4 4 4 « · • · « 44 ··« 4· 44 • · * · • 4 4 · • 4 4 4 4 4 4 · • 4 ·· 4. Kosmetický způsob regulace mastnosti kůže, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení

prostředku podle některého z nároků 1 až 3 na kůži.
5. Kosmetický způsob snížení, prevence nebo regulace vylučování mazu ze sebocytů v kůži, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení prostředku podle některého z nároků 1 až 3 na kůži.
6. Kosmetický způsob stimulace syntézy kolagenu a glykosaminoglykanu fibroblasty v kůži, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení prostředku podle některého z nároků 1 až 3 na kůži.
7. Kosmetický způsob péče o zestárlou, působením světla zestárlou, suchou, rýhovanou nebo vrásčitou kůži, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení prostředku podle některého z nároků 1 až 3 na kůži.
8. Kosmetický způsob stínění kůže před škodlivým zářením UVA a UVB, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení prostředku podle některého z nároků 1 až 3 na kůži.
9. Kosmetický způsob zesvětlení kůže, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení prostředku podle některého z nároků 1 až 3 na kůži.