CZ389999A3 - Metody testování látek užitečných pro prevenci infekce nebo patogenicity - Google Patents

Abstract

K identifikaci látek využitelných k inhibici infekce nebo patogenicity jsou zveřejněny testovací postupy. Zveřejněny jsou také postupy pro identifikaci patogenních viruleněních faktorů.

Description

Tato přihláška je zčásti pokračováním nevyřízené přihlášky U.S. výrobní a. 08/852,927, zaregistrované 8. května 1997, která je částečně pokračováním nevyřízené přihlášky U.S. výrobní a. 08/411,560, zaregistrované 28. března 1995.

Vynález se týká testovacích postupů, které identifikují látky inhibující infekci nebo chorobu v eukaryontním hostitelském organismu nebo které indukují či stimulují hostitelovi obranné mechanismy proti patogenu. Vynález se také týká použití takových látek jako anti-patogenů. Navíc se vynález týká postupů, které identifikují patogenní virulenční faktory.

Mikrobiální patogeny jako jsou bakterie, prvoci, houby, Nematodes a viry zahrnují velkou a rozmanitou skupinu organismů schopných infikovat živočichy a rostliny. K počátku infekce dochází, je-li infekční organismus patogenní a hostitelský organismus citlivý k patogenní invazi. Po vytvoření kontaktu s citlivými hostitelskými buňkami nebo tkáněmi získává pato gen výživu z hostitele, čímž usnadňuje své vlastní přežití. Během infekčního procesu patogen aktivuje kaskádu molekulárních, biochemických a fyziologických procesů, jejichž výsledkem je uvolnění látek škodlivých pro hostitele a rozvoj choroby (viz např. Scientific American Medicine, W.H.Freeman and Co., CA, San Francisco, 1995; Agrios, G.N., Plant Pathology, Academie Press, 1988). Patogenní efekty mikrobů jsou vyvolávány různými způsoby.

Některé patogeny působí prostřednictvím sekreto váných produktů. Diftérie je například způsobena bacilem Corynebacterium diptheriae. Tento organismus je vdechnut hostitelem a vyvine se infekce v horních dýchacích cestách. Zatímco bakterie sama nevniká do krevního řečiště, její silné toxiny ano. Tyto toxiny jsou pak absorbovány buňkami těla, je narušena funkce enzymů a hostitelské buňky jsou zničeny.

Jiné choroby jsou důsledkem reakce těla na patogen. Například u pneumonie, choroby vyvolané bakterií Streptococcus pneumoniae, způsobuje infekce výlev tekutin a buněk do vzduchových sklípků v plicích, což narušuje dýchání. Houbové infekce kůže podobně vyplývají z takových zánětlivých odpovědí.

Ještě další bakterie jsou oportunními patogeny. Například Pseudomonas aeruginosa infikuje pacienty s teplotními popáleninami a pacienty, kteří jsou imunodeficitní nebo jsou jinak imunologicky narušeni. Infekce P. aeruginosa může být akutní a lokalizovaná v jako komeální vředy a otitis media, chronická jako u pacientů s cystickou fibrózou v plicích nebo systemická po vniknutí do krevního řečiště.

• · · ·

Zájem je také o patogenní choroby rostlin, protože tyto způsobují škody na rostlinách a rostlinných produktech. Fytopatogeny vyvolávají choroby u rostlin jakýmkoliv způsobem, včetně: 1) konzumace výživy hostitele, 2) zabití nebo narušení metabolismu hostitelských buněk prostřednictvím toxinů, enzymů nebo růstových regulátorů, 3) ovlivněním fotosyntézy indukcí chlorózy (např. degradací chloroplastů) a 4) blokováním vodivých tkání a zásahem do normálních fyziologických procesů.

Plodiny, okrasné rostliny, stromy a keře jsou obzvláště náchylné k chorobám způsobeným bakteriemi, houbami, viry a červy. Například fytopatogenní bakterie vyvolávají rozvoj mnoha symptomů choroby včetně listových skvrn a snětí, měkké hniloby, chřadnutí, přerůstání, strupovitosti a rakoviny. Bakteriální choroby se nejčastěji vyskytují na zelenině (a některých okrasných rostlinách), které mají dužnatou zásobní tkáň, jako jsou brambory, mrkev, cibule, kosatce nebo hyacinty. Mohou se také vyskytovat na rostlinách nesoucích dužnaté ovoce (jako je okurka, dýně, baklažán nebo rajče) stejně tak jako u listové zeleniny (jako je zelí, celer, hlávkový salát nebo špenát). Rostlinné bakteriální choroby se vyskytují celosvětově a způsobují vážné škody na plodinách na poli, při přepravě a při skladování.

Mechanismů rostlinné patogeneze je mnoho a jsou velmi rozdílné. Jeden bakteriální patogen, Erwinia, například způsobuje rostlinou chorobu jako je měkká hniloba a horečnaté chřadnutí tím, ze proniká do rostliny skrz rány a přístupné přirozené otvory. Jakmile je bakterie uvnitř, vylučuje enzymy, které rozrušují střední rostlinné lamely, což má za následek maceraci tkáně a nakonec buněčnou smrt. Jiné bakterie, jako jsou určité kmeny Pseudomonas, mohou interferovat s přenosem vody tím, že naruší v rostlině xylém. Pseudomonády se dostávají do xylému kořenů a lodyhy a jakmile jsou uvnitř vylučují enzymy a toxiny, které rostlinu zabijí. Ještě další patogenní bakterie, jako Agrobacterium a Corynebacterium, stimulují buněčné dělení a zvětšení buněk v postižené tkáni. To obecně vede k rozvoji amorfního přerůstání, výrůstků nebo nádorů na kořenech, stonku nebo dalších orgánech (např. korunní výrůstky způsobené Agrobacterium tumefaciens) nebo v proliferaci infikovaných orgánů (např. vlasaté kořínky vyvolané Agrobacterium rhizogenes).

Rychlá identifikace organismu zodpovědného za chorobu je nezbytná pro vhodný výběr antipatogenního agens a úspěšné zdolání klinických a hospodářských infekcí. Avšak extenzivní používání anti-patogenních agens, jako jsou sulfonamidy, tetracykliny, ampiciliny, cefalosporiny a aminoglykosidy, jak v medicíně, tak v zemědělství, silně upřednostnilo selekci rezistentních mikrobiálních druhů. To je obzvláště pravdivé u bakteriálních kmenů obsahujících přenosu schopné rezistentní plazmidy. Například vypuknutí nosokomiálních infekcí u vysoce rezistentních kmenů Serratia, Klebsiella, Pseudomonas, Acinetobacter, Enterobacter a

Streptococcus se stalo závažným a opakujícím se problémem. Jako následek selekce rezistentních kmenů vyšlo najevo, že se během posledních několika desetiletí stal P. aeruginosa závažným a problematickým klinickým patogenem, který způsobuje mezi 10-20 % infekcí v nemocnicích. V současné době existuje několik aminoglykosidů a třetí generace cefalosporinů, které jsou účinné proti P. aeruginosa, ale relativní snadnost, s jakou P. aeruginosa získává resistenci, si vynucuje výzkum nových látek pro potenciální náhradní či alternativní terapii.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Objevili jsme, že obvyklé patogenní faktory virulence jsou součástí infekce a patogenicity jak u zvířecích, tak u rostlinných hostitelů. Identifikace takových na hostiteli nezávislých faktorů virulence usnadnila zlepšené testovací metody určené k hodnocení a identifikaci terapeutických látek užitečných pro inhibici patogeneze buď u zvířecích nebo u rostlinných hostitelů nebo u obou. Navíc náš objev poskytuje podklad pro testovací metody užitečné pro identifikaci různých nových faktorů virulence. Identifikace takových faktorů virulence usnadňuje také vývoj směrovaných látek pro použití jako anti-patogeny.

V první poloze tedy vynález obecně charakterizuje metody pro identifikaci látky, která je schopna inhibovat patogen v eukaryotickém hostitelském organismu. Metoda zahrnuje a) vystavení (buď postupně nebo současně) přinejmenším dvou různých eukaryotických hostitelských organismů, přičemž alespoň jeden z organismů není hlodavec, jednomu patogenu v přítomnosti nejméně jedné kandidátské látky; a b) identifikaci látky, která inhibuje patogen v každém eukaryotickém hostitelském organismu.

Ve výhodném provedení je patogenem bakterie (např. Pseudomonas aeruginosa UCBPPPA14), eukaryotický hostitelský organismus je obratlovec (např. ne hlodavec) a rostlina, obratlovec a bezobratlí, nebo bezobratlí a rostlina. Výhodně představuje bezobratlé červ (např. člen rodu Caenorhabditis) nebo hmyz (např. Lepidoptera nebo Diptera) a rostlina je brukev (např. člen rodu Arabidopsis). V jiném výhodném provedení je každý eukaryotický hostitelský organismus rostlina; je obratlovec; nebo je bezobratlí.

V druhém aspektu vynález obecně charakterizuje metody pro identifikaci látky, která je schopna inhibovat patogen v eukaryotickém hostitelském organismu, který není hlodavec. Metody zahrnují a) expozici eukaryotickém hostitelském organismu, který není hlodavec, jednomu patogenu v přítomnosti přinejmenším jedné kandidátské látky, a b) identifikaci látky, která inhibuje patogen v eukaryotickém hostitelském organismu.

• ·

V jednom výhodném provedení je patogenem bakterie (např. Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14) a eukaryotický hostitelský organismus jiný než hlodavec je červ (např. člen rodu Cenorhabditis) a rostlina je brukev (např. člen rodu Arabidopsis). V druhém výhodném provedení je patogenem bakterie (např. Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14) a eukaryotický hostitelský organismus jiný než hlodavec je rostlina (např. člen rodu Arabidopsis).

Ve třetím aspektu vynález obecně charakterizuje metodu pro identifikaci patogenního virulenčního faktoru. Metoda zahrnuje a) identifikaci patogenů, který je schopen infikovat přinejmenším dva různé eukaryotické hostitelské organismy, přičemž alespoň jeden organismus není hlodavec; b) vytvoření mutantního patogenů; c) vystavení (buď postupně nebo současně) každého z organismů mutovanému patogenů; d) určení, zda-li je mutovaný patogen schopen vyvolat chorobu v každém z organismů, přičemž snížení choroby v obou organismech vzhledem kté, která byla vyvolána původním divokým organismem, naznačuje mutaci v patogenním virulenčním faktoru.

Ve čtvrtém aspektu vynález obecně popisuje metodu pro mutaci patogenního virulenčního faktoru. Metoda zahrnuje: a) identifikaci patogenů, který je schopen infikovat přinejmenším dva různé eukaryotické hostitelské organismy, přičemž alespoň jeden z organismů není hlodavec; b) vytvoření mutace patogenů; c) vystavení (buď postupně nebo současně) každého z organismů mutovanému patogenů; d) určení, zda-li je mutovaný patogen schopen vyvolat chorobu v každém z organismů, přičemž snížení choroby v obou organismech vzhledem k té, která byla vyvolána původním divokým organismem, naznačuje, mutaci v patogenním virulenčním faktoru.

V pátém aspektu vynález obecně popisuje metodu snížení virulence patogenů. Metoda zahrnuje: a) identifikaci patogenů, který je schopen infikovat přinejmenším dva různé eukaryotické hostitelské organismy, přičemž alespoň jeden z organismů není hlodavec; b) vytvoření mutace patogenů; c) vystavení (buď postupně nebo současně) každého z organismů mutovanému patogenů; d) určení, zda-li je mutovaný patogen schopen vyvolat chorobu v každém z organismů, přičemž snížení choroby v obou organismech vzhledem k té, která byla vyvolána původním divokým organismem, naznačuje, mutaci v patogenním virulenčním faktoru.

Ve výhodném provedení pro kterýkoliv z výše popsaných aspektů vynálezu mohou metody vynálezu využít zkoušku rychle zabíjející červy. Navíc taková zkouška může obsahovat využití červů majících zvýšenou permeabilitu pro látky, např. C. elegans s mutací P-glykoproteinu.

Ve šestém aspektu vynález obecně popisuje metodu pro identifikaci patogenního virulenčního faktoru s využitím hmyzu (např. molů nebo mušek). Metoda zahrnuje: a) výběr

0 0 0 · 0 0 0 0 0 0

0 « 0 0 0 0 0 · • 000 000· patogenů, který je schopen infikovat hmyz; b) vytvoření mutace patogenů; c) vystavení hmyzu mutovanému patogenů; d) určení, zda-li je mutovaný patogen schopen vyvolat chorobu v každém z organismů, přičemž snížení choroby v obou organismech vzhledem k té, která byla vyvolána původním divokým organismem, naznačuje, mutaci v patogenním virulenčním faktoru. Ve výhodném provedení je identifikace mutace využita jako markér pro rozpoznání patogenního virulenčního faktoru; a pato genem je bakterie (např. Pseudomonas) nebo houba (např. Fusarium). V jiném výhodném provedení vynález dále zahrnuje vypočítání LD50 pro patogen testováním mutovaného patogenů ve zkoušce úmrtnosti u myší nebo v obou.

„Inhibici patogenů“ se rozumí schopnost kandidátské látky snížit, potlačit, oslabit, zmenšit nebo zastavit rozvoj nebo progresi choroby či infekce způsobené patogenem v eukaryotickém hostitelském organismu. Přednostně taková inhibice snižuje patogenicitu přinejmenším o 5 %, ještě přednostněji o 25 % a nepřednostněji alespoň o 50 % v porovnání s příznaky v nepřítomnosti kandidátské látky v jakékoliv vhodné zkoušce patogenicity (např. v těch zkouškách, které byly popsány výše). V jednom konkrétním příkladu může být inhibice měřena sledováním patogenních příznaků v hostitelském organismu vystaveném testované látce nebo extraktu, přičemž snížení úrovně příznaků vzhledem k úrovni patogenních příznaků u hostitelského organismu, který nebyl vystaven uvedené látce, naznačuje, že látka způsobuje inhibici patogenů.

„Jiný než hlodavec“ znamená jakýkoliv organismus, který není myš, potkan, morče nebo křeček.

„Zkouška rychlého zabíjení“ je myšlena zkouška, ve které je více než 50 % červů v testované populaci zabito za dobu kratší než 36 hodin. Ve výhodném provedení je takového zabití dokončeno za časové období od 12 do 24 hodin. A v ještě výhodnějším provedení je zabití dokončeno během 4 hodin.

„Patogenní virulenční faktor“ znamená buněčnou komponentu (např. protein jako je transkripční faktor), bez kterého není patogen schopen vyvolat chorobu nebo infekci v eukaryotickém hostitelském organismu.

Vynález poskytuje dlouho očekávané výhody oproti širokému spektru standardních testovacích metod využívaných pro rozlišení a vyhodnocení účinnosti látek proti mikrobiálním patogenům. Např. zde popisované testovací metody umožňují simultánní hodnocení hostitelské toxicity stejně tak jako anti-patogenní účinnost v jednoduchém in vivo testu. Kromě toho metody ve vynálezu umožňují vyhodnotit schopnost látky inhibovat mikrobiální patogenezi a ve stejný okamžik posoudit schopnost látky stimulovat a zesílit hostitelskou odpověď na napadení patogenem.

····· ·· · ·· * · ·· · · · · · ···· • · · · · « · · · • · · · · ······ ·· · · · · · · ···· ·· · · · * · ··

Podle toho tedy metody vynálezu poskytují jednoduchý způsob pro identifikaci látek, které jsou bezpečné pro použití u eukaryotických hostitelských organismů (tzn. látky, které negativně neovlivňují normální vývoj a fyziologii organismu) a účinné proti patogenním mikrobům (tzn. potlačují virulenci patogenů). Kromě toho poskytují metody vynálezu cestu pro analýzu prakticky jakéhokoliv počtu látek pro anti-patogenní účinek s velkým rozsahem kapacity, vysokou citlivostí a malou složitostí. Metody jsou rovněž relativně nenákladné v provedení a umožňují analýzu malých množství aktivní substance nalezené buď ve formě purifikovaného nebo hrubého extraktu.

Dále zde odhalené metody poskytují způsoby pro identifikaci anti-patogenních látek, které mají schopnost procházet eukaryotickou buněčnou membránou a které si udržují terapeutickou účinnost v in vivo metodách podání.

Další vlastnosti a výhody vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu jejich výhodných provedení a z patentových nároků.

• ···· · · · · · · · ·· · · · ·· · · · · • 9 9 9 9 · · · « • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

PODSTATA VYNÁLEZU

Nejprve budou popsány obrázky.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obrázek 1 je barevná fotografie ukazující příznaky vyvolané Pseudomonas syringae a Pseudomonas aeruginosa u Arabidopsis (ekotyp Llagostera (LI) listy). Falešná inokulace (vlevo); Pseudomonas syringae pv. Maculicola kmen ES4326 (uprostřed); Pseudomonas aeruginosa kmen UCBPP-PA14 (vpravo).

Obrázky 2A-D jsou grafy ukazující růst Pseudomonas syringae a Pseudomonas aeruginosa na listech Arabidopsis. Obrázek 2A je graf ukazující růst Pseudomonas syringae pv. Maculicola kmen ES4326 (prázdné čtverečky), Pseudomonas aeruginosa kmen UCBPP-PA14 (prázdná kolečka) a Pseudomonas aeruginosa kmen UCBPP-PA29 (prázdné trojúhelníky) u ekotypu Llagostera. Obrázek 2B je graf ukazující růst Pseudomonas aeruginosa kmen UCBPP-PA14 u tří ekotypů Arabidopsis: Columbia (plné čtverečky); Argentat (plná kolečka) a Bensheim (plné trojúhelníky). Obrázek 2C je graf ukazující růst Pseudomonas aeruginosa kmen UCBPP-PA14 (plná kolečka) a isogenních mutanty plcS (prázdné čtverečky) a toxA (prázdné kosočtverce). Obrázek 2D je graf ukazující růst Pseudomonas aeruginosa kmen UCBPP-PA14 (plná kolečka) a isogenních mutant gacA (prázdné kosočtverce) a degP (prázdné čtverečky) na ekotypu LLagostera. Počty bakterií byly prováděny jak je zde popsáno. Jsou ukázány průměry čtyř vzorků ± SD. Podobné výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů. Inkubační podmínky pro rostliny byly shodné s experimenty prezentovanými v Tabulce I, infra.

Obrázek 3 je graf ukazující porovnání mezi letalitou Cenorhabditis elegans rostoucí na původním divokém typu Pseudomonas aeruginosa kmen UCBPP-PA14 a na isogenní mutantě degP.

Obrázek 4 je graf ukazující porovnání letality Cenorhabditis elegans rostoucí na původním divokém typu Pseudomonas aeruginosa kmen UCBPP-PA14 a na isogenní mutantě gacA.

Obrázek 5 ilustruje kinetiku rychlého a pomalého testu zabíjení u červů. P. aeruginosa zabila L4 červy rychleji, když rostla na agaru s nízkým fosfátem pepton-glukózou (PG) než na NGM agaru. 40 L4 červů bylo vystaveno mikrobu PA14 rostoucím buď na PG (kolečka) nebo NGM (čtverečky) a procento zabitých červů představuje průměr tří opakování.

Obrázky 6A-H jsou grafy ukazující, že rychlé a pomalé zabití využívá odlišných mechanismů. Mutanty P. aeruginosa, lasR (Obr. 6A a 6B), gacA (Obr. 6C a 6D), degP (Obr. 6E • · · · · · · ···· • · · · · ···· • ··· · · · · ···· «4 ··· · · 4 9 a 6F) a 49H2 (Obr. 6Ga 6H) byly porovnávány s parentálním divokým typem PA14 na rychlé (levé panely) a pomalé (pravé panely) zabíjení. Jak mutanty lasR (trojúhelníky), tak gacA (kolečka) byly oslabeny v jejich schopnosti zabíjet červy v porovnání s divokým typem PA14 (trojúhelníky) při pomalém zabíjení (Obr. 6B a 6D), ale jejich patogenicita nebyla snížena za podmínek rychlého zabíjení (Obr. 6A a 6C). Oproti tomu se ukázalo, že mutace v degP genu (kosočtverce) zpožďuje pomalé zabíjení (Obr. 6F) a snižuje rychlé zabíjení (Obr. 6E). Mutanta 49H2 (obrácené trojúhelníky) vykazovala opačný účinek v porovnání s mutanty gacA a lasR; byla nerozlišitelná od divokého typu v pomalém zabíjení (Obr. 6H), ovšem byla výrazně oslabena v rychlém zabíjení (Obr. 6G). Každý výsledný bod reprezentuje průměr ± SD ze tří opakování. Pro experimenty s rychlým zabíjením rostly bakterie buď na PGS (Obr. 6A a 6G) nebo PG (Obr. 6C a 6E) agaru. Všechny experimenty s pomalým zabíjením byly prováděny na NGM agaru.

Obrázky 7A-7C jsou grafy ukazující, že účinnost rychlého zabíjení je závislá na druhu a kmenu. Obr. 7A porovnává rychlé zabíjení mezi blízce příbuznými fluorescentními pseodomonádami. Kmen 2-79 P. fluorescens (prázdné kosočtverce) je stejně patogenní jako P. aeruginosa PA14 (prázdné čtverečky), ale P. syringae pv. syringae kmen 4326 není patogenní. Obr. 7B porovnává virulenci různých kmenů P. aeruginosa. PA14 je nejvíc virulentní mezi testovanými kmeny: 80 % červů vystavených PA14 bylo zabito po 12 hodinách. Po 12 hodinách byla u kmenů PAK, PAO1-R, PO37 a PA29 mortalita červů menší než 20 %. Obr. 7C porovnává patogenicitu PAO1 variant. Nebyly pozorovány významné rozdíly mezi laboratorními sbírkami PAO1. Každý výsledný bod reprezentuje průměr ± SD ze tří opakování. Tyto experimenty byly prováděny dvakrát s podobnými výsledky.

Obr. 8A-8F jsou grafy ukazující faktory, ovlivňující zabíjení C. elegans působením P. aeruginosa: vývojové stadium červa (Obr. 8A) a environmentální faktory (8B-8F). Pokud není zmíněno jinak, všechny experimenty byly prováděny s využitím synchronizovaných kultur L4 stadia divokého typu N2 C. elegans rostoucího při 20 °C. Procento zabitých červů představuje průměr ± SD ze čtyř opakování. Všechny misky byly osazeny 40 červy a byly drženy při 25 °C. Obr. 8A je graf ukazující kinetiku zabíjení L4 (čtverečky) nebo jednodenních dospělých (kosočtverce), kteří byli vystaveni PA14 rostoucí na PGS agaru. Obr. 8B je graf ukazující vliv osmolarity na odpověď při rychlém zabíjení. Kinetika zabíjení L4 červů vystavených PA14 rostoucích na Pepton-glukózovém médiu s 0,15 M sorbitolu (plné čtverečky), 0,1 M sorbitolu (plné trojúhelníky) a bez sorbitolu (plná kolečka). Přidání 0,15 M sorbitolu výrazně zvýšilo míru zabíjení v porovnání s 0,1 M sorbitolem nebo bez sorbitolu. Průměr ± SD byly vypočítány ze čtyř opakování. Obr. 8C je graf ukazující vliv koncentrace železa na odpověď při rychlém ····· ·· · · · ·· • · · · ♦ · · · · · · • · · · · · · · « • « · · · ······ • · · · · · · · · ·· · · 99 9 99 9 9 99 zabíjení. L4 červy byly testovány na PGS buď bez přidání železa (plné čtverečky), s přidaným 100 μΜ FeCb (přeškrtnutá kolečka) nebo s přídavkem 400 μΜ chelátoru železa ADDA (přeškrtnuté čtverečky). Míra zabíjení byla významně snížena na miskách s přidaným železem v porovnání s těmi bez přídavku železa nebo s přidaným chelátorem železa. Tento experiment byl proveden třikrát s podobnými výsledky. Obr. 8D je graf ukazující vliv teploty na odpověď při rychlém zabíjení. PA14 rostla na miskách sPGS agarem po dobu 36 hodin při 20 °C (prázdné čtverečky), 25 °C (prázdné kosočtverce), 30 °C (prázdná kolečka) nebo při 37 °C (prázdné trojúhelníky) před přidáním jednodenních dospělých červů. Ukázalo se, že růst ve 37 °C redukoval míru zabíjení v porovnání s nižšími teplotami. Druhý experiment, kde PA 14 rostl při výše uvedených teplotách po dobu 24 hodin, vykazoval podobný trend. Obr. 8E a 8F jsou grafy ukazující vliv zdroje uhlíku na odpověď při rychlém zabíjení. Nahrazení 1 % glukózy (napůl vybarvené čtverečky) z PGS média 1 % glycerolem (plné čtverečky) mělo za následek snížení míry zabíjení působením divokého typu PA14 (Obr. 8E). Avšak u kmene rpn7-lasR (plná kolečka) se zjistilo, že zabíjí rychleji než divoký typ PA14, je-li jako zdroj uhlíku použito glycerolu namísto glukózy (Obr. 8F). Ukázalo, se, že rpn7-lasR produkuje více pyocyaninu než divoký typ PA14, pokud je jako zdroje uhlíku použito glycerolu.

Obrázky 9A-9B jsou histogramy ukazující, že rychlé zabíjení je způsobeno teplotně stabilními difusibilními faktory. Kultury PA14 se nechaly růst na miskách s PGS agarem po dobu 24 hodin před experimentálním působením. Synchronizované kultury ve stadiu L4 divokého typu N2 organismů rostoucích při 20 °C byly použity pro všechny experimenty. Procento zabitých červů je ukázáno jako průměr ± SD ze tří opakování. Obr. 9A ukazuje, že odpověď při rychlém zabíjení nevyžaduje živé bakterie. Mortalita L4 červů na miskách obsahujících živé bakterie PA14 a na miskách s mrtvými bakteriemi se měřila 4 hodiny po expozici (HPE). Živé nebo chloroformem usmrcené bakterie E. coli DH5a byly použity pro kontrolu vlivu působení chloroformu. Misky obsahující živé bakterie PA14 nebo zabité PA14 vykazovaly stejnou účinnost zabíjení. Žádný z červů nebyl zabit na miskách se živými nebo chloroformem zabitými E. coli. Obr. 9B ilustruje, že hlavní faktory způsobující zabíjení červů byly termostabilní. Účinnost zabíjení 4 hodiny E1PE pro nezahřáté misky (0 minut) se porovnávala s PA14 obsahujícími miskami zahřátými na 65 °C po dobu 30 nebo 60 minut. Obě zahřívané misky byly před přidáním červů ochlazeny na laboratorní teplotu. Nebyly nalezeny signifikantní rozdíly v účinnosti zabíjení mezi třemi způsoby působení, což předpokládá, že faktory zodpovědné za zabíjení byly přinejmenším 1 hodinu stabilní při 65 °C.

Obrázky 10A-10B jsou grafy ukazující, že mutantní červy v P-glykoproteinu jsou vysoce senzitivní na rychlé zabíjení, ale ne na pomalé zabíjení. Poměr přežívání L4 stadia kmene

NL130 s dvojitou delecí P-glykoproteinu [pgp-l(pkl7); pgp-3 (pkl8] (kolečka) byl porovnáván sparentálním kmenem N2 (čtverce) na rychlé zabíjení na PG médiu (Obr. 10A) a pomalé zabíjení na NGM médiu (Obr. 10B). V obou experimentech byly použity synchronizované kultury L4 stadia červů rostoucích ve 20 °C. Procenta zabitých červů jsou ukázána jako průměr ± SD ze tří opakování. Přibližně 40 L4 červů bylo přidáno na každou misku a všechny misky byly inkubovány při 25 °C. Podobné výsledky byly získány ze dvou nezávislých skupin experimentů.

Obr. 11 A-l IB jsou grafy ukazující, že alginát není důležitý pro rychlé zabíjení. Míra zabíjení deg P inserční mutanty PA14degP (plné čtverce), algD deleční mutanty v čtecím rámci PA14algDA4 (plná kolečka) a dvojité mutanty PA14degPalgDA4 (plné trojúhelníky) byla porovnávána s divokým typem PA 14 (prázdné čtverce) při podmínkách rychlého zabíjení (Obr. 11 A) a pomalého zabíjení (Obr. 11B). Přibližně 40 L4 N2 červů bylo použito na každé misce. PGS agar byl použit pro rychlé zabíjení a NGM agar pro pomalé zabíjení. Procento zabitých červů je ukázáno jako průměr ± SD ze tří opakování.

Obrázek 12 je graf ukazující, že fosfát redukuje míru rychlého zabíjení. Porovnává se míra zabíjení PA 14 rostoucích na agaru PYS s přidáním 20 mM anorganického fosfátu (Pi) (kosočtverce) nebo bez přidání Pi (čtverce). Procento zabitých L4 červů (průměr ± SD ze tří opakování) po 8 hodinové expozici PA14 bylo vyšší za fosfát-limituj ících podmínek. Dva nezávislé experimenty daly podobné výsledky.

Obrázky 13A-13B jsou grafy ukazující, že rezistence k rychlému zabíjení koreluje s paraquatrezistencí. Resistence nebo citlivost C. elegans kmenů TJ1052, age-1 (hx546)II, TK22, mevl(knl)III, PH13 a rad-8 (mnl63)I byla porovnávána s divokým typem N2 kmenů při podmínkách rychlého zabíjení. Procenta přežívání jsou ukázána jako průměr ± SD ze tří opakování. Obr. 13A ukazuje, že mutace v genu age-1 uděluje rezistenci k rychlému zabíjení po PA14. Míry přežívání L4 age-1 (hx 546) (prázdné trojúhelníky) červů jsou signifikantně vyšší v porovnání s N2 (prázdné čtverce). Obr. 13 B ukazuje, že mutace v mev-1 a rad-8 genech má za následek zvýšenou senzitivitu k rychlému zabíjení po PA14. Míry přežívání mev-1 (knl) a rad-8 (mni 63) byly testovány jak u PA14, tak u OP50. OP50 kontroly byly použity ke zjištění jakékoliv mortality z důvodu kyslíkové toxicity. Ukázalo se, že tyto mutanty mají zvýšenou citlivost na kyslík. Zabíjení obou kmenů OP50 (plné kosočtverce a kroužky) bylo zanedbatelné. Bylo zjištěno, že dospělý mutanti jak mev-1 (kn-1) (prázdné kosočtverce), tak rad-8 (mnl63) (prázdná kolečka) jsou citlivější k rychlému zabíjení v porovnání s jejich parentálním divokým typem N2 kmenů (prázdné čtverce).

Obrázek 14 je graf ukazující křivku zabíjení F. oxysporum u G. Mellonella.

• · ♦ · ···· ·· · · ·· ··· ·· ··

Obrázek 15 je graf ukazující zabíjení Or^R mušek působením PA14.

Níže popisujeme experimentální důkazy ukazující, že bakteriální patogen je schopen vyvolat chorobu jak u zvířete, tak u červů a že existuje překryv ve virulenčních faktorech zodpovědných za vyvolání mikrobiální patogenní choroby v rostlinách, živočiších a Nematodech. Tyto experimentální příklady jsou určeny k ilustraci, ne k ohraničení, pole působnosti nárokovaného vynálezu.

Identifikace společných virulenčních faktorů potřebných pro patogenicitu Pseudomonas aeruginosa v rostlinách a živočiších

Abychom identifikovali multi-hostitelské virulenční faktory, hledali jsme prvně bakteriální patogeny schopné vyvolat chorobu jak u rostlinného, tak u zvířecího modelu patogeneze. Několik izolátů P. aeruginosa se testovalo s využitím listové patogeneze infiltračního systému u Arabidopsis thaliana. Izoláty, které vyvolávaly příznaky choroby u Arabidopsis, byly pak testovány na patogenicitu v myším modelu plné tloušťky popálené kůže a v potravinovém testu Nematod.

Specificky, nejprve jsme testovali soubor kmenů P. aeruginosa, které zahrnovaly 30 lidských klinických izolátů, 20 půdních izolátů a 25 rostlinných izolátů (získaných z University of California v Berkeley, oddělení rostlinné patologie. Každý z těchto izolátů byl nezávisle injikován do listů 4 různých ekotypů Arabidopsis (druhy z pozemků nebo divoké přírůstky), aby se určilo, je-li izolát rostlinným patogenem. Několik ekotypů Arabidopsis bylo testováno, aby se zvýšila pravděpodobnost identifikace vhodného patogenů, protože rostlinné patogeny včetně patogenů Arabidopsis, typicky vykazují vysokou hladinu specifity pro hostitelský kultivar nebo ekotyp. Byly prováděny také mnohonásobné hostitelské testy, protože u kmenů P. aeruginosa vykazujících ekotypovou specifitu, bylo pravděpodobnější, že budou poctivými rostlinnými patogeny (spíše než arteficiální patogeny schopné infikovat rostliny pouze za umělých podmínek vytvořených v laboratoři).

Testovací experimenty s využitím listové patogeneze infiltračního systému Arabidopsis byly prováděny následujícím způsobem. Kmeny P. aeruginosa se nechaly růst na médiu Luria Broth (LB) při 37 °C, dvakrát se promyly 10 mM MgSO4, resuspendovaly se na optickou hustotu při 600 (ODóoo) = 0,2 v 10 mM MgSC>4, naředily se 1:100 (odpovídá bakteriální hustotě 103 cfu/cm²) a injikovaly se do listů 6 týdnů starých rostlin Arabidopsis. Rostliny se nechaly v růstové komoře během experimentu v 28-30 °C a za relativní vlhkosti 90-100 %. Příznaky choroby a růst se monitorovaly denně po dobu 5 dní. Příznaky vykazované po 5 dnech byly

charakterizovány jako; „žádné“, bez příznaků, „slabé“ lokalizované slabé promáčení vodou a chloróza (žloutnutí) tkáně obklopující místo injekce, „střední“ střední promáčení a chloróza s většinou změklé tkáně okolo inokulačního místa, nebo „závažné“ závažné měkké tlení v celém inokulovaném listu, charakterizované vodou mokvající reakční zónou a chlorózou obklopující místo injekce po 2-3 dnech od injekce. Příznaky měkké hniloby pronikly do listu 4-5 dní po injekci. Listová mezibuněčná tekutina obsahující bakterie byla sebrána po 5 dnech a počet bakterií se určil podle standardních postupů (viz např. Dong et al. (1991) Plant Cell 3:61). Byly odebrány 4 různé vzorky s využitím dvou listových disků na vzorek. Tři nezávislé experimenty daly podobné výsledky. Kontrolní rostliny inokulované 10 mM MgSO₄ nevykazovaly během experimentu příznaky, V jiných kontrolních experimentech žádný z geneticky charakterizovaných kmenů P. aeruginosa PAK, PAO1 nebo PO37 nevyvolal znatelné příznaky jakéhokoliv testovaného ekotypu Arabidopsis. Ukázalo se, že tyto kmeny nejsou u testovaných ekotypů patogenní, ale jsou patogenní v kultuře.

Zatímco většina ze 75 kmenů P. aeruginosa, které byly testovány, nevyvolávala na listech Arabidopsis žádné příznaky, několik kmenů vykazovalo slabé až střední symptomy měkké hniloby charakterizované chlorózou a promáčením vodou ve tkáni obklopující místo injekce. Dva kmeny, UCBPP-PA14 (lidský klinický izolát) a UCBPP-PA29 (rostlinný izolát), vyvolávaly v některých testovaných ekotypech závažné příznaky měkké hniloby, které jsou typické pro vysoce virulentní bakteriální patogeny rostlin. Tabulka I ukazuje růst P. aeruginosa UCBPP-PA14 a UCBPP-PA29 pět dní po injekci a příznaky choroby vykazované těmito kmeny P. aeruginosa u rozdílných ekotypů Arabidopsis. Konkrétně kmen UCBPP-PA14 vyvolával závažnou měkkou hnilobu v obou ekotypech Arabidopsis Llagostera (Ll) a Columbia (Col), ale nevyvolával příznaky u ekotypu Argentat (Ag) a pouze střední příznaky u ekotypu Bensheim (Be). Tabulka I také ukazuje, že kmen UCBPP-PA29 vyvolával závažné příznaky u Ll a slabé příznaky u Col, ale nevyvolával příznaky u Ag nebo Be.

Tabulka I

	P. aeruginosa UCBPP-PA14	P. aeruginosa UCBPP-PA29
Ekotyp Arabidopsis	Cfu/cm2 listové plochy	Příznaky	Cfu/cmz listové plochy	Příznaky
Llagostera	2,6 x 107 ± 2,0 x 107	Závažné	2,7 x 107 ± 1,3 x 107	Závažné
Columbia	9,0 x 106± 6,0 x 106	Závažné	6,0 x 105±3,0x 105	Slabé
Argenta	3,0 x 105± 1,4 x 105	Žádné	1,5 x 105 ± 9,0 x 104	Žádné
Bensheim	1,1 x 106±4,9x 105	Slabé	4,5 x 105 ± 2,0 x 105	Žádné

Jak je ukázáno na obr. 1, závažné příznaky vykazované u UCBPP-PA14 (zcela vpravo) byly charakterizovány vodou zmáčenou reakční zónou a chlorózou mající za následek kompletní

ΦΦ ΦΦ • Φ Φ Φ « Φ Φ Φ

Φ Φ Φ »

Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ • φφφφ φφ • · φ · · φ • * φ φ

Φ · ΦΦΦ

ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ maceraci a kolaps listů 4 až 5 dní po infekci (porovnat s kontrolami zcela vlevo). Tyto příznaky byly téměř nerozlišitelné od příznaků vyvolávaných vysoce virulentním patogenem Arabidopsis Pseudomonas syringae pv. maculicola kmen ES4326 (ukázaný uprostřed).

Aby se ověřilo, že závažnost příznaků choroby se koreluje s bakteriální proliferací, byl zjišťován růst každého z kmenů UCBPP-PA14 a UCBPP-PA29 během několika dní na listech Arabidopsis, jak bylo popsáno výše. Jak je ukázáno na obr. 2A, kmeny UCBPP-PA14 (prázdná kolečka) a UCBPP-PA29 (prázdné trojúhelníky) dosáhly maximální bakteriální hustoty přibližně 10⁷ buněk/cm² listové plochy pátý den u ekotypu Ll, což odpovídalo 10⁴-násobnému zvýšení původního inokula. Růstové profily těchto kmenů vLl byly podobné virulentnímu patogenů Arabidopsis Pseudomonas syringae pv. maculicola kmen ES4326 (obr. 2A, prázdné čtverce). Kmen UCBPP-PA14 také proliferoval 1 (/-násobně v ekotypu Col (obr. 2B, plné čtverce, Tabulka I). Oproti tomu kmen UCBPP-PA14 se zvětšil pouze 10³- a 1 (/-násobně v listech Be a Ag, resp. (obr. 2B, plné trojúhelníky a plná kolečka, resp., Tabulka I), a kmen UCBPP-PA29 se zvětšil pouze 10² až 6 χ 1 (/-násobně v ekotypu Col, Ag a Be (Tabulka I). V každém případě odrážely nižší počty bakterií v listech rozvoj méně závažných příznaků. Podle toho každý z těchto kmenů P. aeruginosa byl podobný jiným fytopatogenním bakteriím v jejich schopnosti vyvolat chorobu způsobem specifickým pro ekotyp.

UCBPP-PA14 a UCBPP-PA29 izoláty, u kterých se zjistilo, že vyvolávají příznaky choroby u Arabidopsis, byly pak testovány v myším modelu plné tloušťky popálené kůže. Ten zahrnuje 5 % povrchu myšího těla modelovaného na roztažené oblasti abdominální kůže (Stevens et al. (1994) J. of Burn Care and Rehabil. 15: 232). V tomto modelu dochází u poškozené epidermis a dermis ke koagulačni nekróze, ale pod ní ležící svaly rectus abdomini (RA) nejsou poškozeny. Při absenci infekce přežívají všechna zvířata.

Aby se provedl tento patogenní test, inokulum P. aeruginosa se injikuje intradermálně do těžiště záhybu popáleninového strupu. Bakterie proliferují v popálenině a některé kmeny mohou vniknout do vaskulatury. Počet bakterií nalezených ve svalech RA ležících pod nebo přiléhajících k popálenině po 24 hodinách dává kvantitativní míru lokální invazivity a mortalita indikuje jak lokální, tak systemickou invazivitu.

Studie myšího modelu plné tloušťky popálené kůže byly prováděny následujícím způsobem. Šestitýdenní samci CD-I myší (Charles River Animal Farm) vážící mezi 25 a 35 gramy byly použity ve všech experimentech, přičemž se postupovalo podle zvířecího modelu popálenin (Stevens et al., supra). Myším se injikovalo 5 χ 10³ buněk. Žádné živé bakteriální buňky nebyly nalezeny v podkladovém RA svalu okamžitě po bakteriální injekci nebo u zvířat, která měla předstírané zranění v jiných studiích. Ve studiích mortality bylo myším okamžitě po popálení

9999 t# · φ© *· • · · ·· 9 · * · * 999 9999 injikováno 10 buněk a počet myší, které zemřely na sepsi, byl sledován každý den po dobu deseti dní. Dvě skupiny kontrolních myší, které se skládaly z i) myší popálených, ale neinjikováných a ii) myší injikovaných teplem-usmrcenými bakteriemi UCBPP-PA14, měly 0 % mortalitu.

Data v Tabulce II (níže) ukazují proliferaci kmenů P. aeruginosa v myším modelu plné tloušťky popálené kůže. Tabulka II indikuje, že kmeny UCBOO-PA14 a UCBPP-PA29 proliferovaly a pronikaly do RA svalů podobně jako dobře charakterizované lidské izoláty P. aeruginosa PO37, PAK a PAO1. Všechny kmeny dosáhly titrů pohybujících se od 1,8 x 108 do 3,6 x 108 cfu na gram tkáně v biopsiích RA svalů, které byly odebrány přímo pod popáleninou a infekčním místem (Tabulka II). Dále všechny kmeny dosáhly titrů pohybujících se od 4,0 χ 10⁷ do 8,2 x 10⁷ cfu na gram tkáně v biopsiích RA svalů, které byly odebrány z místa přiléhajícího k popálenině. Navíc, tkáňové vzorky zpracované pro rutinní histologii odhalily, že kmen UCBPP-PA14 pronikal do svalu ve stejné míře jako kmen PO37.

Tabulka II

Kmen P-aeruginosa	Průměrný titr ± SD v biopsiích pod popáleninou	Průměrný titr ± SD v biopsiích přiléhajících k popálenině
UCBPP-PA14	20,0 χ 107 ± 9,0 χ 107	6,0xl07±2,lxl07
UCBPP-PA29	36,0 x 107± 10,0 χ 107	8,2 χ 107 ± 2,0 χ 107
PO37	30,0 x 107± 11,0 χ 107	5,8 χ 10γ± 1,0χ 107
PAK	18,0 χ 107 ± 9,1 χ 107	6,0 x 107± 1,2 χ 107
PAO1	31,0 x 107± 10,0 χ 107	4,0 χ 107 ± 1,8 χ 107

Virulence kmenů UCBPP-PA14 a UCBPP-PA29 v porovnání sPO37 byla také zjišťována provedením studie mortality v myším modelu plné tloušťky popálené kůže, jak bylo popsáno výše. Kmeny UCBPP-PA14, UCBPP-PA29 aPO37 vyvolaly 77 =, (17/22), 6 % (1/16) a 22 % (2/9) mortalitu, resp., desátý den po popálenině a infekci (Tabulka III). Další experimenty ukázaly, že kmeny PAO1 a PAK vyvolaly signifikantně nižší mortalitu v tomto modelu než UCBPP-PA14.

Kmen UCBPP-PA14 byl pak vybrán pro další studie, protože byl infekční jak u rostlinných, tak u živočišných modelů patogenicity, ve kterých může být výsledná patogenicita kvantifikována, a protože úroveň virulence v těchto modelech byla srovnatelná se známými rostlinnými a živočišnými patogeny. Specificky, usilovali jsme o zjištění, jestli u kmene UCBPP-PA14 existovaly společné virulenní determinanty, které byly nezbytné pro patogenicitu u obou hostitelů. Naší strategií bylo využít způsob výměny markérů k vytvoření UCBPP-PA14 mutant nesoucích inzerční mutaci ve čtyřech rozdílných genech, přičemž o dvou z nich se ví, že

9·9· * · · ·· 9 9 · * • *99 4 « « « · 4 9 999994 • ··· 9·9* • * 99 Λ9· «9 *9 jsou virulenční determinantou pro P. aeruginosa ve zvířecích hostitelích, jeden z nich je virulenční determinantou pro fytopatogenní bakterie v rostlinném hostiteli a jeden je virulenční determinantou pro několik zvířecích bakteriálních patogenů ve zvířecím hostiteli. Dva zvířecí geny virulence P. aeruginosa byly plcS a toxA kódující exportované proteiny fosfolipázu C a exotoxin A, resp. (Ohman et al. (1980) Infect. Immun. 28: 899, Ostroff et al. (1987) J. Bacteriol. 169: 4597). Exotoxin A ribosiluje G proteiny a fosfolipáza C přednostně degraduje fosfolipidy eukaryotických buněk (Iglewski et al. (1975) Proč. Nati. Acad. Sci. 72: 2284, Berka et al. (1982) J. Bacteriol. 152: 239). Virulenční determinanta rostlinného patogenů byla gacA, identifikovaná jako globální regulátor exkretovaných anti-fungálních faktorů v nepatogenní půdní bakterii P. fluorescens (Laville et al. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. 89:1562, Gaffney et al. (1994) Mol. Plant-Microbe Interact. 7: 455). Ve fytopatogenu P. syringae pv. syringae a P. cichorii se ukazuje, že gacA slouží jako transkripční regulátor genů, které kódují extracelulární produkty účastnící se patogenicity (Rich e al. (1994) J. Bacteriol. 176: 7468). Další zvířecí virulenční determinanta, degP (aké známá jako htrA), byla identifikována jako na stres-reagující proteáza, která je odpovědná za degradaci nesprávně složených periplazmatických proteinů v Brucella a Salmonella (Elzer et al. (1994) Infection and Immunity 62: 4135, Johnson et al. (1991) Mol. Microbiol. 5: 410).

Produkty zUCBPP-PA14 homologické kplcS a toxA byly identifikovány vgenomové kosmidové knihovně kmene UCBPP-PA14 s využitím klonovaných DNA fragmentů odpovídajících genům plcS a toxA kmenu PAK P. aeruginosa jako hybridizační próby. Genomová knihovna UCBPP-PA14 byla připravena podle standardních metod vkosmidovém klonovacím vektoru pJSRl, kerý byl sám konstruován připojením 1,6 kb fragmentu BglII obsahujícího cos místo bakteriofágů lambda zpHC79 (viz např. Hohn e al. (1980) Gene 11: 291). Do BglII místa pRR54 (viz např. Roberts et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 6204). 1,7 kb fragment BamHl izolovaný z plazmidu pMS150 obsahující toxA gen (viz např. Lory et al. (1983) Gene 22: 95) a 3,0 kb fragment BamHl-Pstl izolovaný z plazmidu pSL2 (viz např. Lory e al. (1988) J. Bacteriol. 170: 714) obsahující plcS gen byly použity k prohledávání UCBPPPA14 genomové knihovny v pJSRl.

UCBPP-PA14 homolog gac A byl identifikován ve stejné kosmidové knihovně použitím produktu amplifikovaného pomocí PCR ke konzervované oblasti gacA genu P. fluorescens podle standardních postupů. Oligonukleotidy 5'-GCTAGTAGTCGATGACC-3' (SEQ ID NO:1) a 5'-GCGGCATCAACCATGC-3' byly vytvořeny na základě sekvence gacA genu (Laville et al. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. 89: 1562) a byly použity k amplifikaci produktu o 625 párech bází obsahujícího gacA gen P. fluorescens, který byl poté použit k prohledávání • · · · • · · · · ···· • ··· ···· • ··· ······ • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ·· genomové knihovny UCBPP-PA14 vpJSRl popsané výše. UCBPP-PA14 homolog genu degP byl identifikován v UCBPP-PA14 kosmidové knihovně s využitím degP genu P. syringae pv. maculicola jako próby.

Všechny čtyři geny byly sub-klonovány a mutovány inzercí kazety kódující rezistenci ke gentamicinu s využitím standardních metod.

Kromě toho 6 kb fragment BamHl izolovaný z kosmidového klonu obsahujícího plcS gen kmene UCBPP-PA14 byl sub-klonován zkosmidu odvozeného od pJSRl do BamHl místa u pBR322. Výsledný klon, pLGRIOl, byl mutován inzercí DNA kazety kódující gentamicin do Xhol místa genu plcS, aby vznikl pLGR 201. Genová kazeta s gentamicinovou rezistencí je 1,8 kb fragment BamHl z plazmidů pHIJI (viz např. Rubín (1987) Plasmid 18, 84). 1,6 kb fragment BamHl obsahující toxA gen byl sub-klonován z kosmidu odvozeného od pJSRl do pBR322, aby se vytvořil pLGR102 a následně byl mutován vložením gentamicinové kazety do BglII místa toxA genu, aby se vyvořil plazmid pLGR202. A 2,5 kb HindlII-EcoRI fragment obsahující gacA gen kmene UCBPP-PA14 P. aeruginosa byl sub-klonován zkosmidu odvozeného z pJSRl do pBR322, aby vznikl pLGR103. Předpokládaný gacA gen byl částečně sekvenován, aby se potvrdilo, že byl klonován gacA gen UCBPP-PA14. PLGR103 byl mutován inzercí gentamicinové kazety do Sáli místa genu gacA, aby vznikl plazmid pLGR203. 1,6 kb fragment Pstl obsahující čás genu degP byl sub-klonován zpPY201, derivátu kosmidového klonu pH126 kmene UCBPP-PA14, do pstl místa pUC19, aby se vyvořil pNAS. 1,6 kb fragment Sáli obsahující gentamicinovou kazetu byl vložen do Xhol místa genu degP v pNAS, aby vznikl pNASGm. Dále 3,2 kb fragment SphI/Xhol byl izolován z vektoru pNASGm a subklonován do SphI/Xhol místa vpCVD442, aby vznikl pPY206, který obsahuje mutovaný gen degP.

Mutované geny se přenesly do UCBPP-PA14 genomu použitím standardních technik výměny markérů a vzniklé mutace výměnou markérů se ověřily analýzou DNA blotů. Akto se plazmidy pLGR201, pLGR202, pLGR203 a pPY206 použily pro genovou náhradu genů plcS, toxA, gacA a degP, resp., způsobem popsaným v Rahme et al. (J. Bacteriol. 170: 575, 1991) s využitím gentamicinu v koncentraci 30 mg/ml k testování ztráty vektoru. Žádná z těchto mutací neměla jakýkoliv detekovatelný vliv na růs bakterií v porovnání s divokým typem ať už na obohaceném nebo minimálním médiu.

Vliv mutací genů plcS, toxA, gacA a degP na patogenicitu UCBPP-PA14 v modelu Arabidopsis se testoval infilrací mutovaných kmenů do Llekotypu Arabidopsis. Na rozdíl od divokého ypu UCBPP-PA14, žádná z mutant nevyvolala maceraci nebo kolaps listů. Specificky, izogenní mutanta toxA vyvolala slabší příznaky měkké hniloby a chlorózy bez doprovodné • · · · · · · • · · · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

999 99 99 macerace napadené tkáně, což je charakterisické pro UCBPP-PA14. Mutanty plcS, gacA a degP způsobily ještě slabší příznaky vyvolávající pouze chlorózu. V souladu se slabšími příznaky byl růst mutant oxA, plcS, gacA a degP po 5 dnech přibližně lOx, 10²x, 5 x 10³-krát a 10²-krát nižší, resp., než růst divokého typu (obrázky 2C a 2D).

Růst a příznaky tří testovaných mutant (plcS, toxA a gacA) byly zcela obnoveny do úrovně divokého typu v rostlinách, kde byly tyto mutanty komplementovány plazmidy nesoucími odpovídajícími geny divokého typu. To bylo provedeno sub-klonováním 6 kb fragmentu BamHI zkosmidového klonupB85 genomové knihovny obsahující operon plcSR kmene UCBPP-PA14 do BamHI místa plazmidu pRR54, aby vznikl pLGR301. Plazmid pLGR301 se pak použil pro genetické doplňovací studie mutant plcS. 2,4 kb fragment EcoRI/EcoRV izolovaný z plazmidu pMS150 obsahující toxA gen kmene PAK byl sub-klono ván do EcoRI/EcoRV míst plazmidu pBR322, aby se vytvořil pLGRIOó. SphI/Pstl fragment z pLGRIOó obsahující toxA byl klonován do SphI/Pstl míst pRR54, aby vznikl pLRG206. 1,2 kb fragment HindlII/Xhol obsahující gacA gen se izoloval z kosmidového klonu pH106 a byl sub-klonován do HindlII/Xhol míst plazmidu pRR54, aby se vytvořil pLGR204. Plazmidy pLRG206 a pLGR 204 se pak použily genetické doplňovací studie mutant toxA a gacA.

Tabulka III ukazuje studii letality odpovídající těmto 3 mutantům kmenů P. aeruginosa v myším modelu plné tloušťky popálené kůže. V takových studiích letality myši, které byly popáleny a infikovány buď mutantem plcS nebo toxA, vykazovaly signifikantně nižší mortalitu (40 % u obou mutant) v porovnání s infekcí kmenem divokého typu (77 %). Mutanty gacA a degP nevyvolávaly mortalitu (Tabulka III). Rozdíly v míře mortality mezi mutanty a divokým typem byly statisticky signifikantní na 95 % nebo vyšším konfidenčním intervalu. Statistická významnost pro data o mortalitě byl vypočítán chí-kvadrát testem s Yatesovou korekcí. Skupiny byly považovány za statisticky významné na P< 0,05. Všechny mutanty dosáhly statistické významnosti (plcS a toxA, P = 0,05, gacA, P = 0,00005).

Tabulka III:

Kmen P. aeruginosa	Míra mortality u myší 10 dní po popálení a infekci
UCBPP-PA14	17/22
UCBPP-PA14	6/15
UCBPP-PA14	6/15
UCBPP-PA14	0/10
UCBPP-PA14	0/11
UCBPP-PA29	1/16
PO37	4/9

• · • · ··· · · · ·· · · · · · ·· · · ·‘

Výše uvedené výsledky ukazují, že plcS, toxA, gacA a degP se účastní jak rostlinné, tak živočišné patogeneze a indikují společnou nebo sdílenou část patogenní mašinérie nezbytné pro rozvoj choroby v živočišném a rostlinném hostiteli. Jeden ze sdílených virulenčních faktorů, gacA, je aktivní na regulační úrovni, což ukazuje, že mechanismy pro regulaci virulenčních faktorů jsou konzervovány mezi rostlinnými a živočišnými patogeny. Genové produkty plcS a toxA jsou specifickými virulenčními determinantami, které pravděpodobně napadají membránu a inhibují proteosyntézu jak u rostlinných, tak u živočišných buněk, resp.

Aby se tyto výsledky rozšířily i na třetí hostitelský systém, měřila se patogenicita P. aeruginosa UCBP-PA14 v potravinovém testu Nematod. Potravinový test byl postaven následujícím způsobem. Nejprve 5 μί přes noc rostoucích kultur P. aeruginosa UCBPP-PA14 nebo izogenního kmene P. aeruginosa UCBPP-PA14 nesoucího mtaci degP nebo gacA se inokulovalo doprostřed misky s NGM agarem a kultivovalo se 24 hodin při 37 °C. Po několika hodinách ochlazení na laboratorní teplotu se misky osadily osmi červy Cenorhabditis elegans ve stadiu L4. Misky byly následně inkubovány v temnu při 25 °C a usmrcení červy byly počítáni každých 6 hodin. Červ je považován za mrtvého, pokud se nehýbe, nevykazuje aktivitu faryngeální pumpy a nevykazuje defekační chování.

Obrázky 3 a 4 ukazují výsledky potravinového testu letality Nematod při využití divokého typu UCBPP-PA14 a jeho izogenních mutant degP a gacA, resp. Výsledky popisované na obrázcích 3 a 4 ukazují, že P. aeruginosa UCBPP-PA14 zabíjí C. elegans. Výsledky také ukazují, že izogenní mutanty P. aeruginosa UCBPP-PA14 nesoucí inzerce, které funkčně vyřadily buď gen degP nebo gacA, měly signifikantně omezenou schopnost virulence jak u nematod, tak u myšího modelu plné tloušťky popálené kůže (obrázky 3 a 4, Tabulka III). Gen gacA je znám jako virulenční determinanta pro P. syringae u rostlinného hostitele a degP jako virulenční faktor jak pro P. syringae, tak pro Salmonella typhimurium. Jak je diskutováno níže, použily jsme tyto testovací metody pro identifikaci několika mutant, které vykazují redukovanou patogenicitu v nematodech a u Arabidopsis. Bylo zjištěno, že tři z těchto mutant, které byly izolovány, jsou méně patogenní u myší.

Systém multi-hostitelských zvířecích/rostlinných patogenů popsaný zde má několik praktických důsledků. Například tyto výsledky ukazují, že molekulární základ patogeneze je nápadně podobný u rostlin a živočichů. Proto, jak je popsáno níže, systém multi-hostitelských patogenů může být využit pro identifikaci a studium nových virulenčních faktorů. Konkrétně celý genom P. aeruginosa může být prohledáván na geny mající co dělat s patogenicitou testováním individuálně mutovaných P. aeruginosa v různých hostitelských organismech, např. využitím zde popisovaných testů Arabidopsis nebo Nematod. Geny identifikované tímto • · · ···· ···· • · ··· ···· • · ··· ······ ·· ··· ···· ··· · ·· ··· ·· ·· způsobem mohou být pak testovány v myším modelu plné tloušťky popálené kůže. Tento systém také usnadňuje objasnění molekulárního základu hostitelské specifiky bakteriálních patogenů. Virulenění faktory identifikované s využitím tohoto modelového systému poskytují cíle pro vývoj nových generací chemických terapií jak pro klinické, tak pro agrokulturní mikrobiální choroby.

Testovací systémy pro identifikaci společných genů virulence Na základě výše popsaných výsledků ukazujících, že sada virulenčních faktorů P. aeruginosa je zahrnuta v patogenicitě u třech různých hostitelských organismů a že tyto společné virulenění determinanty definují základní rysy bakteriální patogenicity, které jsou na hostiteli nezávislé, vyvinuli jsme metodu pro identifikaci virulenčních determinant důležitých pro patogenicitu v rostlinách a zvířatech. Test využívá multi-hostitelský zvířecí/rostlinný patogen (např. p. aeruginosa UCBPP-PA14) a využívá schopnosti snadno testovat tisíce náhodně vytvořených mikrobiálních mutant v téměř jakémkoliv hostitelském organismu. Užitečné hostitelské eukaryotické organismy zahrnují, ale neomezují se jen na ně, červy (např. cenorhabditis elegans), rostliny (např. semeno nebo list Arabidopsis), kvasinky nebo jiné houby, ryby (např. zebrafish), mušky (např. Drosophila melanogaster), myši a podobně. Obecně, mikrobiální patogen je mutován podle standardních postupů známých odborníkům v oboru a pak jsou následně ohodnocovány na schopnost indukovat chorobu v hostitelském organismu. Ty mutované pato geny, u kterých byla zjištěna snížená patogenicita nebo které jsou nepatogenní, jsou užitečné v metodě tohoto vynálezu. Takové mutované patogeny jsou pak využity pro identifikaci na hostiteli závislých nebo na hostiteli nezávislých virulenčních faktorů zodpovědných za patogenicitu podle metod známých odborníkům v oboru.

Následující je pracovní příklad viruleněního faktoru z testovacího systému nematod, který využívá lidský klinický izolát P. aeruginosa UCBPP-PA14, který se ukázal být infekční ve třech rozdílných modelech: myším modelu plné tloušťky popálené kůže, potravinovém modelu u červa C. elegans a u listového infiltraěního modelu Arabidopsis thaliana. Výhoda použití červa jako hostitele pro studium lidských nebo rostlinných patogenů jako je Pseudomonas, spočívá v relativní jednoduchosti identifikace nepatogenní ch mutant Pseudomonas v červech. Například test s C. elegans se skládá z položení dvou červů L4 stadia na misku s mutantem P. aeruginosa a ze sledování přežívajících červů po 5 dnech. Patogen jako je P. aeruginosa UCBPP-PA14 je mutován podle jakýchkoliv standardních postupů, zn. Standardních in vivo nebo in vitro inzerčních metod mutageneze (viz Kleckner et al. (1977) J. Mol. Biol. 116: 125). Další metody jsou také k dispozici, tzn. chemická mutageneze. Pátý den lze nalézt jen velmi málo nebo žádné • 9« · živé červy na miskách osazených divokým typem patogenní bakterie, zatímco na miskách s E. coli nebo nepatogenním mutantem jsou přítomny stovky nebo tisíce živých potomků původních dvou hermafroditních červů. Tak červy rostoucí v přítomnosti mutované P. aeruginosa jsou indikací, že geny zodpovědné za patogenicitu byly inaktivovány. Pozice inaktivujících muací jsou mapovány, vedou ke klonování a identifikaci mutovaných virulenčních faktorů (tzn. sekvenováním nukleotidů).

K identifikaci genů účastnících se patogenicity jsme vytvořily mutanty P. aeruginosa UCBPPPA14 s využitím standardních technik trasnpozónové mutageneze (viz např. Manoil et al. (1985) Proč. Nati. Acad. Sci. 82: 8129, Taylor et al. (1989) J. Bacteriol. 171: 1870); bylo vytvořeno více než 8000 mutant. Patogenicita 1900 těchto mutant byla testována s využitím výše popsaného potravinového testu na C. elegans. Jka je ukázáno v Tabulce IV, izolovali jsme 8 UCBPP-PA14 mutant, které vykazovaly oslabenou patogenicitu u C. elegans.

Kromě toho jsme také zjišťovali patogenicitu u jiné sbírky mutant vytvořených transpozónovou mutagenezí v patogenním testu salátových listů s využitím standardních metod (viz např. Cho et al. (1975) Phytopathology 65: 425). Použitím tohoto testu jsme izolovali 2900 UCBPP-PA14 mutant s oslabenou patogenicitou na salátových listech. Tyto mutanty byly následně testovány na patogenezi u listů Arabidopsis podle zde popsaných postupů. Jak je ukázáno v tabulce IV, izolovali jsme 12 UCBPP-PA14 mutant, které vykazují oslabenou patogenicitu u Arabidopsis.

Tabulka IV.

	Arabidopsis thaliana	C. elegans
Počet testovaných mutant	2900	1900
Počet oslabených mutant	12	8

Jedna zUCBPP-PA14 mutant izolovaných z infiltračního testu Arabidopsis byla pak testována na patogenicitu jak potravinovým testem C. elegans, tak v myším modelu plné tloušťky popálené kůže. Zjistili jsme, že UCBPP-PA14 mutant byl méně patogenní v obou systémech v porovnání s divokým typem kmene UCBPP-PA14. Kromě toho jsme také testovali dvě mutanty identifikované biologickém testu patogenicity u Arabidopsis v myším modelu plné tloušťky popálené kůže. Zjistilo se, že také tyto mutanty jsou méně patogenní u myší v porovnání s divokým typem kmene UCBPP-PA14. Tyto výsledky dohromady poskytují další důkaz pro existenci společných virulenčních faktorů pro patogenicitu u rostlin a živočichů.

Výše popsané výsledky ukazují, že k patogenním interakcím dochází mezi P. aeruginosa UCBPP-PA14 a C. elegans. Kmen UCBPP-PA14 zabíjí C. elegans. UCBPP-PA14 je také infekční v infiltračním listovém testu Arabidopsis thaliana (obrázky 1 a 2, Tabulka I) a v myším

• ·*·*	·* ·	44	··
·· ·	•		•	··	9	4	•	4
• ·	•		•	•	•	4	•	•
								«
• ·	•		•	•	•	•	•
·· · ·		··		• · *		• «	• 4

modelu plné tloušťky popálené kůže (Tabulky II a III). Kromě toho jsme ukázali, že nulové mutace v UCBPP-PA14 genech degP a gacA signifikantně redukují patogenezi ve všech třech modelech. Tak jsme poskytli první důkaz pro existenci společných virulenčních faktorů patogenicity u rostlin a živočichů. Takové virulenční faktory umožňují izolovat látky, které působí na funkci virulenčních faktorů (tzn. přes přímé omezení patogenicity nebo přes zesílenou hostitelskou odpověď) a také umožňují identifikaci těchto látek v jednoduchém experimentálním systému (např. C. elegans).

Testovací systémy pro identifikaci společných virulenčních genů s využitím testu „rychlého zabíjení“ Nematod

Skutečnosti popsané výše ukazují, že P. aeruginosa kmen UCBPP-PA14 je schopen zabít C. elegans během 2,5 až 5 dní, když PA14 roste na NGM agaru. Míra usmrcení pozorovaná za těchto podmínek je definována jako „pomalé zabíjení“. V krátkosti, za podmínek „pomalého zabíjení“ je přidáno 5 ml přes noc rostoucí kultury PA14 rozšířeno do centra misky s NGM (nebo M9) agarem a nechá se růst při 37 °C po dobu 24 hodin. Misky jsou pak ochlazeny na laboratorní teplotu po dobu několika hodin. Červi ve čtvrtém larválním stadiu (L4) se přidají do agaru, ale ne do kontaktu s bakteriálním podkladem. Červi se typicky pohybují směrem k bakteriálnímu podkladu a začínají se krmit. Oproti tomu rostou-li červi na pepton-glukózasorbitol médiu (PGS), bohatším médiu s vyšší osmolaritou, je dosaženo jiných výsledků. Když byli červi přidání na PGS misky, červi se stali netečnými, pak paralyzovanými a pak uhynuli během 4-24 hodin (obrázek 5). Někteří červi uhynuli ještě před příchodem do přímého kontaktu s bakteriálním podkladem. Toto rychlejší zabíjení na PGS agaru je nazváno „rychlé zabíjení“.

Aby se určilo, jestli rozdíl v kinetice mezi rychlým a pomalým zabíjením byl způsoben rozdíly v základních mechanismech nebo zda-li rychlé zabíjení bylo jednoduše urychlením procesu pozorovaného u pomalého zabíjení, testoval se účinek PA14 bakteriálních mutant za těchto podmínek. Vybrané křivky zabíjení jsou ukázány na obrázcích 6A-6H a data jsou sumarizována v Tabulce V.

000

0000 « 00 00 0 0 00 #000 • 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 00 000 00 00

Tabulka V

Schopnost zabít C. elegans za těchto podmínek Kmen Rychlé Pomalé Genová identita
PA14 Patogenní jak v rychlém, tak v pomalém zabíjení PA14plcS PA14algDÁ4 16G12 25A12 33A9 33C7 Zpomalené pouze u pomalého zabíjení PA14toxA 35A9 44B1 25F1 41A5 410 34H4 Narušené pouze v pomalém zabíjení PA14gacA 50E12 rpn7-lasR Narušené pouze v rychlém zabíjení 49H2 Narušené v rychlém a zpomalené v pomalém zabíjení PA14degP Phol5 34B12 Narušené v rychlém a pomalém zabíjení pho23	+ + + + + + + + + + + + + + + + +	+ + + + + + + + + + + + + + + + + +	PlcS AlgD Není partner Není partner Není partner Není partner ToxA Není partner Nesekvenován Není partner Není partner Nesekvenován Není partner GacA Dst* u invA LasR Nesekvenován DegP DsbA Dst* u phnB Není partner

Jak je vidět u obrázků 6A-6H, mutace v PA14 genech gacA nebo lasR, z nichž oba jsou transkripční mi regulátory extracelulární ch virulenční ch faktorů (Gambello et al. (1993) Infection and Immunity 61: 1180-84, Rahme et al. (1995) Science 268: 1899-902), kompletně zrušily pomalé zabíjení, ale neměly vliv na rychlé zabíjení (obrázky 6A-6D). Opačně, mutace • · vPA14 genu degP, který kóduje periplazmatickou proteázu, a TnphoA inzerce v necharakterizovaném genu (Tnpho mutant 49H2), dramaticky redukovaly rychlé zabíjení, ale pouze zpomalily pomalé zabíjení (obrázky 6E-6H). Data ukázaná na obrázcích 6A-6H a v Tabulce V jsou nejvíce v souladu s hypotézou, že PA14 využívá rozdílných mechanismů při zaqbíjení C. elegans v závislosti na médiu, ve kterém bakterie rostou.

Patogenicita jiných druhů a kmenů Pseudomonas

Ukázalo se, že podobně jako u E. coli, P. fluorescens (kmeny 55, 2-79 a WCS365) a P. syringae pv. maculicola kmen ES4326 nezabíjí C. elegans za podmínek pomalého zabíjení popsaných výše, bakteriální podklady jsou kompletně zkonzumovány a červi se vyvíjejí a reprodukují normálně. Zatímco E. coli, P. syringae pv. maculicola E4326 a P. fluorescens 55 byly také nepatogenní za podmínek rychlého zabíjení, P. fluorecens 2-79 (obrázek 7A) a P. fluorescens WCS365 (údaje nejsou ukázány) byly stejně virulentní jako P. aeruginosa PA14 za podmínek rychlého zabíjení. Zajímavé je, že jak P. fluorescens 2-79 a WCS365 jsou účinnými kolonizátory kořenů a jsou studují se intenzivně kvůli jejich schopnosti zabraňovat fungálním infekcím (Mazolla et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58: 2616-624).

Protože různé kmeny P. aeruginosa produkují různá množství extracelulámích virulenčních faktorů (Hamood et al. (1992) Infection and Immunity 60: 510-517), testovala se také virulence různých kmenů P. aeruginosa za podmínek rychlého zabíjení. Jak je vidě na obrázku 7B, žádný z dalších testovaných kmenů P. aeruginosa nebyl tak virulentní jako PA14 za podmínek rychlého zabíjení. Preston et al. (Infect. Immun. 63: 3497-3501, 1995) ukázal, že varianty stejného parentálního kmene PAO1, držené v různých laboratořích, vykazovaly signifikantní rozdíly ve virulenci u myší korneální infekce a tak jsme také testovaly různé laboratorní sbírky kmene PAO1. Avšak všechny testované varianty PAO1 byly méně virulentní než PA14 a mezi nimi neexistovaly signifikantní rozdíly (obrázek 7C). Jelikož další kmeny P. aeruginosa nebyly tak virulentní jako PA14, pokračovaly jsme ve využití PA14 pro všechny další experimenty popsané níže.

Faktory ovlivňující P- aeruginosa-vyvolané usmrcení C. elegans

Vývojové stadium červů. Ukázali jsme, že za podmínek pomalého zabíjení hynuli dospělí červi rychleji než L4 stadia. Proto jsme testovali vliv vývojového stadia červů na jejich senzitivitu k rychlému zabíjení. Jak je vidět na obrázku 8A, červi L4 byli více citliví k rychlému zabíjení než jednodenní hermafroditní dospělci. Například 12 hodin po expozici P. aeruginosa

9 · · ····

9 9 9 9 99 9 99 99

PA 14 bylo přes 90 % L4 červů mrtvých, zatímco méně než 10 % jednodenních dospělých červů zahynulo za stejných podmínek (obrázek 8A).

Bakteriální faktory. Bakterie má nevídanou schopnost modulovat genovou expresi jako odpověď na environmentální stimuly. Tento typ regulace může být nezbytný pro adaptaci na změny fyzikálního prostředí a/nebo expresi virulenčních faktorů. Některé ze známých faktorů, které modulují genovou expresi v bakteriích jsou osmolarita, teplota, železo a koncentrace fosfátu a zdroj uhlíku. Média pro pomalé zabíjení (NGM nebo M9) mají hodně fosfátu, zatímco médium pro rychlé zabíjení je chudé na fosfát. Testovali jsme změny osmolarity, růst teploty, koncentraci železa a zdroj uhlíku u M9 agaru na kinetiku pomalého zabíjení. Kromě koncentrace železa v růstovém médiu, kde vzestup koncentrace železa měl za následek slabé opoždění při zabíjení, žádný z dalších parametrů signifikantně neovlivňoval pomalé zabíjení. To nebylo překvapující, protože pomalé zabíjení je následek bakteriálního usazení se a proliferace uvnitř střeva červa a in vivo podmínky mnohem pravděpodobněji ovlivní patogenicitu P. aeruginosa než in vitro růstové podmínky.

Osmolarita. Míra zabíjení na Pepton-glukózovém médiu (PG) byla značně vyšší na sušších miskách. Aby se otestovalo, jestli toto zvýšené zabíjení je funkcí zvýšené osmolarity, byl použit sorbitol ke zvýšení osmolarity bez zvýšení koncentrace elektrolytů. Pepon-glukózové médium bylo použito bez sorbitolu (PG) nebo v přítomnosti 0,1 M a 0,15 M sorbitolu (PGS). Míra růstu PA14 byla stejná v PG i PGS médiu. Avšak jak je vidět na obrázku 8B, mortalita C elegans byla signifikantně vyšší a míra zabíjení byla rychlejší, pokud sezvyšovala osmolarita média, což předpokládá zvýšenou produkci osmolaritou-regulovaných virulenčních faktorů. V souladu s touto hypotézou, že osmolarita ovlivňuje sekreci bakteriálních virulenčních faktorů, se u Aeromonas hydrophila, dalšího oportunního lidského patogenu, ukázalo, že buňky rostoucí ve vyšší osmolaritě vykazují zvýšenou hemolytickou, cytooxickou a caseinolytickou aktivitu a jsou více virulentní u modelu patogenicity ryb a myší v porovnání s buňkami rostoucími v médiu s nižší osmolaritou (Aguilar et al. (1997) Infect. Immun. 65: 1245 50). Alternativní hypotéza je, že zesílené rychlé zabíjení v médiu o vysoké osmolaritě je způsobeno sníženou tolerancí nematod. Opravdu jsme pozorovali, že pokud L4 C. elegans byly umístěni do agarového média o vysoké osmolaritě (PG s 0,15 M sorbiolem) obsahujícím E. coli nebo nepatogenní kmen PA14, červi byli zpočátku paralyzováni, ale pak se zotavili.

Železo. Dostupnost železa je důležitým stimulem využívaným mnoha patogenními bakteriemi k indukci exprese virulentních faktorů. Železem-limitované podmínky vyvolávají zvýšenou syntézu toxinu A, alkalické proteázy a elastázy (Bjom e al. (1978) Infection and Immuniy 19: 785-91, Bjorn et al. (1979) J. Bacteriol. 138: 193-200). Mnoho z těchto exoproduktů přispívají • · · · · · · • · · · · · · · • · · · * ♦ · ·· · · · · · · • · · · · · · • · · ·« ·<· · · kvirulenci P. aeruginosa patogeneze. V souladu s těmito výsledky kmen PAO1 P. aeruginosa způsobuje signifikantně větší komeální poškození, pokud roste na médiu chudém na železo v porovnání s poškozením vzniklým při růstu na médiu bohatém na železo (Woods et al. (1982) Infection and Immunity 35: 461-64), ačkoliv účastnící se virulenční faktor(y) nebyly hlášeny.

K ujištění se, jestli jakýkoliv z virulenční ch faktorů zahrnutých v rychlém zabíjení C. elegans byl regulován železem, byla testována účinnost zabíjení PA14 za železo-limitujících podmínek a za podmínek dostatku železa. Jak je ukázáno v obrázku 8C, přidání chelátoru železa (400 μΜ EDDA) neovlivnilo signifikantně rychlé zabíjení, zatímco přidání 100 μΜ FeCL signifikantně snížilo zabíjení. Z těchto pozorování může být vyvozeno několik závěrů. Zaprvé, protože PGS médium je pravděpodobně železo-limituj ící, přidání chelátoru železa nemá významný dopad na koncentraci dostupného železa. Za druhé, snížení zabíjení za podmínek s přebytkem železa předpokládá, že buď tvorba podskupiny faktorů zahrnutých v zabíjení C. elegans je železem potlačována (transkripční regulace), nebo je redukována aktivita jednoho nebo více faktorů (post-translační regulace) za podmínek vysoké koncentrace železa.

Teplota. Vliv růstu teploty na rychlé zabíjení na PGS-médiu byl testován na narostlém podkladu divokého typu PA 14 při 20, 25, 30 a 37 °C po dobu 36 hodin. Po osazení jednodenními dospělými červy byly všechny misky inkubovány při 25 °C. Jak je vidět na obrázku 8D, nebyly vidět signifikantní rozdíly v mortalitě červů pro bakterie rostoucí při 20, 25, a 37 °C. Avšak PA14 rostoucí v těchto třech teplotách byly signifikantně virulentnější než PA14 rostoucí ve 37 °C. Rozdíly v teplotě na míru mortality nebyly zřejmé, pokud se použila citlivější L4 stadia (data nejsou ukázána). Podobné zvýšení virulence bylo také hlášeno pro A. hydrophila. V porovnání s buňkami kultivovanými při 37 °C, buňky rostoucí ve 20 °C byly více virulentní u ryb a myší a vykazovaly zvýšené extracelulámí aktivity (Merino et al. (1992) Infect. Immun. 60: 4343-49). V kmenu PA103 P. aeruginosa je znám přinejmenším jeden virulenční faktor regulovaný teplotou. Ve studii využívající toxA-lacZ promotorovou fůzi integrovanou do PA 103 chromozomu na místě toxA, docházelo k maximální produkci beta-galaktozidázy při 25 °C a její produkce se snižovala se vzrůstající teplotou (Vasil et al. (1989) Mol. Microbiol. 3: 371-381). Obecně však zůstává nepotvrzeno, jestli konkrétní virulenční faktory P. aeruginosa jsou produkovány ve zvýšené míře při teplotě 20-30 °C v porovnání s jejich produkcí při 37 °C.

V souvislosti s modelem C. elegans může objasnění mechanismu podporujícího snížení virulence, když buňky rostou ve 37 °C poskytnout klíč pro záhadnou skutečnost, že navzdory vlastnění mnoha virulenční ch faktorů, zůstává P. aeruginosa oportunním patogenem lidí a jiných savců, kde je optimální tělesná teplota 37 °C.

• · • · · · · · · • Φ » · 9 9 9 · · 9 9

Zdroj uhlíku. Exprese virulentních determinant mnoha patogenními bakteriemi je řízena zdrojem uhlíku využívaného pro růst. Při testování vlivu zdroje uhlíku na virulenci PA14, bylo PGS médium modifikováno nahrazením glukózy v 1 % celkového konečného objemu (PGS) glycerolem o stejné koncentraci (PYS). Jak je ukázáno na obrázku 8E, je rychlé PA14 zabíjení C. elegans účinnější, pokud PA 14 roste na Pepton-sorbitolu s glukózou (PGS) namísto glycerolu (PYS) jako zdroje uhlíku. Rozdíly v účinnosti zabíjení nebylo možné zdůvodnit rozdíly v bakteriální růstové míře na různých zdrojích uhlíku, protože PA14 rostly stejně za obou podmínek (data nejsou ukázána).

Ačkoliv divoký typ PA14 zabíjel efektivněji na glukózovém než na glycerolovém médiu, PA14 mutanta obsahující Tnpho inzerci v genu lasR (kmen rpn7-lasR) zabíjela rychleji než její parentální PA14 na PYS, ve kterém byl spíše než glukóza použit glycerol jako zdroj uhlíku (obrázek 8F). Kinetika zabíjení mezi kmeny rpn7-lasR a divokým typem PA14 byla na PGS médiu nerozlišitelná. Zajímavé bylo, že kmen rpn7-lasR rostoucí na PYS médiu vykazoval zvýšenou modrozelenou pigmentaci agaru. Pěstovali jsme jak rpn7-lasR, tak PA 14 na kapalném PYS médiu a zjistili jsme 3-5 krát zvýšenou produkci pyocyaninu v rpn7-lasR v porovnání s divokým typem PA14. Ačkoliv jsme nevyloučili nadprodukcí jiných pigmentů nebo látek, tento výsledek potvrdil korelaci mezi zvýšenou mírou zabíjení a zvýšenou tvorbou pyocyaninu.

Bakteriální faktory zahrnuté v PA14-mediovaném rychlém zabíjení

Rychlé zabíjení a pozorování, že někteří červi zahynuli ještě před tím, než se dostali do přímého kontaktu s bakteriemi nás pobídlo k tomu, abychom otestovali, jestli difuzibilní toxiny hrají důležitou roli při rychlém zabíjení. P. aerginosa rostla na PGS agarovém médiu za podobných podmínek jako v předchozím testu s výjimkou toho, že po růstu se bakteriální nárůst seškrábl z agarového povrchu a zbývající bakterie se zabili vystavením výparům chloroformu. Před přidáním červů se odstranil reziduální chloroform odvětráním misek po dobu jedné hodiny v digestoři. E. coli kmen DH5a byl použit jako kontrola pro působení na červy. Jak je vidět na obrázku 9A, účinnost zabíjení byla stejná jak s živými PA14 bakteriemi, tak bez nich. Působení chloroformu nemělo škodlivý účinek na červy, protože žádný z červů nezahynul na chloroformu vystavených miskách s DH5a. Podobné výsledky byly získány při zabíjení PA14 bakterií účinkem UV záření (data nejsou ukázána). Tyto výsledky ukázali, že po periodě růstu bakterií na PGS agaru byla jedna nebo více látek, které difundovaly do agaru, dostatečné pro rychlé zabíjení. Stejné chloroformové experimenty byly provedeny na bakteriích rostoucích na NG agaru, médiu pro pomalé zabíjení, a žádný z červů nezahynul. To naznačuje, že difuzibilní • 9 · · • ·

• 9 9 9 9 · · · • 9 9 9 9 9 · • 9 9 99 99 9

9 9 9 9 9 9 «99 99 9» toxiny, pokud jsou vůbec v NGM agaru přítomny, se vyskytovaly v tak nízkých koncentracích, že neměly žádný dopad na zabíjení červů při podmínkách pomalého zabíjení.

Aby se zjistilo, jestli by mohly být látky zodpovědné za rychlé zabíjení inaktivovány vysokou teplotou, zahřáli jsme misky obsahující nárůst bakterií PA14 při 65 °C na dobu 30 minut nebo 60 minut. Jak je vidět z obrázku 9B, nedocházelo k signifikantnímu rozdílu v zabíjení mezi zahřátými miskami a nezahřátými kontrolami, což naznačuje, že hlavní faktory zodpovědné za rychlé zabíjení byly relativně termostabilní.

K další podpoře hypotézy, že difuzibilní toxiny se účastní rychlého zabíjení, jsme testovali citlivost P-glykoproteinové mutanty C. elegans (kmen NL130 [pgp-l(pkl7), pgp-3(pkl8)] na PA14-mediované rychlé zabíjení. P-glykoproteiny patří do skupiny evolučně konzervovaných ATP-vážících membránových transportérů a má se za to, že chrání buňky před exogenními toxiny tím, že je aktivně vylučují z buněk (Higgins (1995) Cell 82: 693-96). Kmen NL130 má deletovány geny pro pgp-1 a pgp-3 a bylo zjištěno, že je citlivější k k cytotoxické látce kolchicinu a k anti-malariku/anti-protozoální látce chloroquinu (Broeks et al. (1995) EMBO J.

14: 1858-66). NL130 je také citlivější k fungálnímu toxinu fumonisinu Bp Porovnávala se citlivost L4 stadia červů NL130 k PA14 rostoucím na PGS agaru s citlivostí parentálního divokého typu kmene N2. Paralelně jsme také testovali jak NL130, tak N2 za podmínek pomalého zabíjení. Jak je vidět na obrázku 10A, v souladu s hypotézou, že rychlé zabíjení je mediováno difuzibilním toxinem, bylo 70 % N2 červů stále živých 4 hodiny po expozici PA14 za podmínek rychlého zabíjení, zatímco přežívalo pouze 5 % NL130 červů. Oproti tomu takový dramatický vzrůst citlivosti nebyl pozorován u NL130 za podmínek pomalého zabíjení, kde se zdá, že mechanismus zabíjení zahrnuje bakteriální kolonizaci a proliferací ve střevě červů (obrázek 10B).

Alginát není důležitý pro rychlé zabíjení

Jak bylo popsáno výše, PA14 mutanta degP měla signifikantně narušenu schopnost vyvolat rychlé zabíjení. Navíc k oslabenému patogennímu fenotypu měla PA14 mutanta degP signifikantně sliznatější než divoký typ na PGS agaru z důvodu nadprodukce exopolysacharidového alginátu. V souladu se sliznatým fenotypem ukázala sekvenční DNA analýza UCBPP-PA14 degP genu, stejně tak jako nezávislá sekvenční DNA analýza v různých kmenech P. aeruginosa (Boucher et al. J. Bacteriol. 178: 511-523, 1996), že degP gen leží v těsném shluku se čtyřmi dalšími geny, u kterých se ukázalo, že se zapojují do regulace alginátu.

Aby se zjistilo, jestli oslabený patogenní fenotyp mutanty PA14degP byl způsoben jednoduše nadprodukcí alginátu, byla vytvořena dvojitá mutanta PA14degPalgD a testována za podmínek i

• · • · « · • Λ

9 * 4» · 9 ·

9 9 9 9 9 9 9-9 rychlého a pomalého zabíjení C. elegans. Gen algD kóduje enzym GDP manóza dehydrogenázu, která katalyzuje časné kroky v biosyntéze alginátu (Deretic et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 4567-4581, Lightfoot a J.L. (1993) Mol. Microbiol. 8: 771-782). Kmen PA14algDÁ4 byl vytvořen výměnou markérů algD delecí ve čtecím rámci s divokým typem genu algD v PA14. PA14algDA4 nebyl slizovitý na Pseudomonádovém izolačním agaru (PIA), což potvrdilo absenci alginátu (Yorgey a Ausubel, nepublikováno). Jak je ukázáno na obrázku 11A a 11B, PA14algDÁ4 zabíjel C. elegans ve stejné míře jako divoký typ PA14 jak v testu rychlého, tak pomalého zabíjení. Navíc PA14degPalgDD4 dvojitá mutanta vykazovala stejný oslabený patogenní fenotyp jako degP mutanta u rychlého i pomalého zabíjení, což předpokládá, že degP se pravděpodobně účastní regulace dalších s virulencí-spřízněných faktorů kromě alginátu.

Kromě těchto dat byly další dvě PA14 mutanty, toxA a plcS mutanta, neodlišitelné od divokého typu v testu rychlého zabíjení (Tabulka 5). Proto hemolytická fosfolipáza C (kódovaná plcS) a exotoxin A (kódovaný toxA) nejsou také nezbytné pro rychlé zabíjení.

Fenaziny přispívají kprocesu rychlého zabíjení

Jak je v detailu popsáno v níže uvedených Materiálech a metodikách, provedli jsme test k izolaci PA14:TnphoA transpozónové inzerčních mutant, které byly defektní v rychlém zabíjení. To vedlo k identifikaci pěti mutant z 2400 testovaných (frekvence 0,21 %), které vykazovaly fenotyp s oslabeným rychlým zabíjením v porovnání s divokým typem parentálních PA14 kontrol. Analýza těchto a několika dalších PA14 mutant naznačuje, že rychlé zabíjení u PA14 je multifaktoriální a že jeden z těchto faktorů náleží ke skupině pigmentů společně známých jako fenaziny.

DNA sekvence získaná z 800 bp IPCR produktu 3' k TnphoA inzerci jedné z mutant, 3E8, byla klonována a sekvenována. Předběžná analýza DNA sekvence odhalila, že mutanta 3E8 vymezuje TnphoA inzerci v genu podobném phzB; sekvence 177 bp ihned po směru od TnphoA inzerce vykazovala 69 % identitu na nukleotidové úrovni s genem phzB, jednoho z genů zahrnutých do biosyntézy fenazinů v blízce příbuzném P. fluorescens kmenu 2-79 (NRRL B15132). P. aeruginosa je také producent fenazinů a nejlépe charakterizovaný fenazin produkovaný P. aeruginosa, pyocyanin, byl zahrnut do toho, že hraje důležitou roli v patogenezi u živočichů (Sorensen a Joseph (1993) Phenazine Pigments in Pseudomonas aeruginosa Infection. V Pseudomonas aeruginosa as an opportunistic pathogen, Campa, Bendenelli a Friedman, eds. (New York Plenům Press), str. 43-57). Důležité je, že PA14 mutanta 3E8, která má omezené rychlé zabíjení, je také defektní v produkci pyocyaninu, syntetizuje pouze 50 % úrovně divokého typu (Tabulka VI).

Tabulka VI

Kmen	Mutovaný gen	pyocyanin3 (podíl PA14)	% zabitých červů
Divoký typ PA14		1,00	87
PA14phnAphnB	PhnAphnB	0,50	50
3E8	Podobný phzB	0,50	10
34B12	neznámý	0,03	50
49H2	neznámý	0,11	0

³ Kvantifikace pyocyaninu je založena na měření absorbance při 520 nm (OD520) v kyselých roztocích, modifikováno podle metody popsané Essarem a spol., 1990 (ohledně detailů viz Metody v kapitole 2). Uvedené hodnoty jsou poměrem dat pro OD520 vztažených k údajům pro divoký typ PA-14 po přepočtu buněk na ml kultury; průměr tří měření.

^b Procento červů zabitých představuje průměr ze tří měření. Podmínky rychlého zabíjení jsou detailně popsány v metodách.

Další podpora pro účast fenazinů v procesu rychlého zabíjení vzešla z analýzy dvou dalších mutant PA14 Tnpho, 34B12 a 49H2. PA14 Tnpho mutant 34B12, který produkoval pouze 3 % množství pyocyaninu z divokého typu, byl izolován během testu PA14 mutant oslabených v rostlinné patogenezi a byl signifikantně narušen v rychlém zabíjení (Tabulka V). Mutant 34B12 tvořil charakteristické bezpigmentové kolonie na PGS médiu. Tnpho mutant 49H2, který produkoval 11 % množství pyocyaninu z divokého typu, byl identifikován na základě skutečnosti, že také tvořil bezpigmentové kolonie a vykazoval oslabené příznaky na hlávkovém salátu. Důležité je, že 49H2 byl také oslaben v rychlém zabíjení (Tabulka V): průměrné procento mrtvých červů 12 hodin po expozici pro 3E8, 34B12,49H2 a divoký typ PA 14 bylo 10 %, 5 %, 0 % a 87 %, resp. (Tabulka VI).

Aby se dále podpořil závěr, že pyocyanin (a jiné fenaziny) hrály důležitou úlohu v rychlém zabíjení, byl vytvořen kmen PA14phnAphnB, který měl gentamicinovou kazetu vloženu v překrývající se oblasti spolu přepisovaných genů phnA a phnB. Geny phnA a phnB kódují a a b podjednotky antranylát-syntázy, která je nezbytná pro syntézu pyocyaninu (Essar a spol. (1990) J. Bacteriol. 172: 884-900). PA14phnAphnB produkoval střední hladiny pyocyaninu a také vykazoval střední fenotyp v rychlém zabíjení (Tabulka VI).

φ φ · « φ · · φ φφ φ φ • · · · · · Φ Φ · · φ

Φ · Φ Φ Φ ΦΦΦΦ

Φ Φ «ΦΦ φφφφφφ • · ΦΦΦ φφφ» « · » · φφ «ΦΦ «Φ φφ

Konečně se ví, že nedostatek fosfátu spouští syntézu pyocyaninu účinkem P. aeruginosa a že vysoká koncentrace fosfátu inhibuje tvorbu pyocyaninu (Ingledew a Campbell (1969) Can. J. Microbiol. 15: 595-598). Proto jsme testovali PA14 rychlé zabíjení v agaru PY snebo bez přidání 20 mM fosfátu (Pi). Nebyl rozdíl mezi růstovou rychlostí PA14 v těchto dvou médiích.

V souladu s předchozími zprávami bylo produkováno méně pyocyaninu ve fosfátem-nasyceném médiu, což koresponduje s oslabeným rychlým zabíjením; 16 HPE byla průměrná mortalita pro PA14 rostoucí na médiu bez fosfátu 62 % v porovnání s 24 % na fosfátem-nasyceném médiu (Obrázky 13A 13B).

Hostitelova odpověď na rychlé zabíjení: rezistence k rychlému zabíjení koreluje s rezistencí k oxidativnímu stresu

Využili jsme dříve známých mutant C. elegans, které jsou rezistentnější nebo více senzitivní k oxidativnímu stresu, abychom poskytli další důkaz, že fenaziny jsou důležité toxiny v PA14mediovaném zabíjení. Některé fenaziny jako je pyocyanin a fenazin-1-karboxylová kyselina jsou redox-aktivní látky. Například za aerobních podmínek pyocyanin prochází spontánně redukcí elektronů a reoxidací s koincidenční jednomocnou redukcí O2 na O2’ (superoxidové aniony) (Hassan a Fridovich (1980) J. Bacteriol. 141: 1556-163, Hassett a spol. (1992) Infect. Immun. 60: 328-336). Podobně v přítomnosti vhodného redukčního zdroje může pyocyanin vytvářet kontinuální tok cytotoxických O2 a H2O2 v hostitelských tkáních. V přítomnosti siderofor-železnatého komplexu, ferripyochelinu, jsou tyto reaktivní kyslíkové druhy (ROS) dále přeměněny na vysoce toxické hydroxylové radikály (Coffman a spol. (1990) J. Clin. Invest.

86: 1030-1037, Britigan a spol. (1992) J. Clin. Invest. 90: 2187-2196). V několika studiích (Hassan a Fridovich (1980) J. Bacteriol. 141: 1556-163, Hassett a spol. (1992) Infect. Immun.

60: 328-336), ale ne ve všech (viz Baron a spol. (1989) Curr. Microbiol. 18: 223) bylo naznačeno, že pyocyanin vykazuje svoji cytotoxicitu přes svou schopnost indukovat tvorbu ROS v cílových buňkách, což je blízké s cytotoxickým účinkem jiného superoxidového producenta, paraquatu (metyl viologen).

Age-1 (hx546) mutant C. elegans byl poprvé identifikován z důvodu dlouho žijícího fenotypu (Johnson, 1990, Science 249: 908-912) a následně se ukázalo, že jsou rezistentní kH2O2 z důvodu zvýšené produkce katalázy a superoxid-dismutázy (Larsen (1993) Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 90: 8905-8909, Vanfleteren (1993) Biochemical Journal 292: 605-608). Byly také identifikovány mutanty, které jsou silně citlivé k metyl viologenu, zahrnují mev-1 a rad-8 (Ishii a spol. (1990) Mutation Res. 237: 165-171), Ishii a spol. (1993) Mechanisms of Aging and Development, 68: 1-10). Usuzujeme, že jestliže rychlé zabíjení u P. aeruginosa je mediováno přes pyocyanin nebo jiné redox-aktivní fenazin(y), mutant age-1 by měl být rezistentní z důvodu své zvýšené rezistence k oxidativnímu stresu. Jak je vidět na obrázku 13A, age-1 (hx546) byl rezistentnější k zabíjení účinkem PA14 než jeho parentální kmen N2. Naopak, metyl viologensenzitivní mutanty mev-1 (kn-1) a rad-8 (mnl63) byly vysoce senzitivní k zabíjení účinkem PA14 obrázek 13B). Tyto výsledky potvrdily, že citlivost nematod k zabíjení účinkem P. aeruginosa silně korelovalo s rezistencí nematod k ROS-generujícím látkám.

Souhrn výsledků z testů rychlého zabíjení

P. aeruginosa má působivý rozsah hostitelů a v jediném hostiteli může vyvolávat široké spektrum chorob v závislosti na tkáni, kterou infikuje. U lidí P. aeruginosa může infikovat popáleniny nebo chirurgické rány, močové cesty, gastrointestinální trakt, dýchací cesty, oči, uši a mozkové blány (Bach a Smith (1994) Pseudomonas aeruginosa: Infections and treatment. (New York: Marcel Dekker, lne.). Mnoho rozdílných virulenčních determinant je vyžadováno pro odhalení choroby v jakékoliv určité tkáni, ale sada faktorů se může lišit u jednoho typu tkáně k druhému. Například hemolytická fosfolipáza C je důležitým virulenčním faktorem zapříčiňujícím mortalitu u popálených myší (Rahme a spol. (1995) Science 268: 1899-1902), ale není nezbytná pro korneální infekci u myší (Preston a spol. (1995) Infect. Immun. 63: 34973501). Analýza různých bakteriálních mutant ukazuje, že zabíjení C. elegans účinkem P. aeruginosa je také multifaktoriální. Zdá se, že exprese faktorů potřebných pro rychlé zabíjení, je regulována železem, zdrojem uhlíku, teplotou a osmolaritou.

V případě rychlého zabíjení výše uvedená data ukazují, že přinejmenším některé virulenční determinanty jsou termostabilní difusibilní toxiny. Avšak testováním isogenních PA14 mutant toxA, plcS a algD se ukázalo, že dva známé toxiny, hemolytická fosfolipáza C a exotoxin A, stejně jako exopolysacharidový alginát, nejsou nezbytné pro zabíjení červů za podmínek rychlého zabíjení. Kromě toho z důkazu, že kmen nesoucí mutaci lasR, důležitý transkripční regulátor extracelulární exprese virulence, byl stále virulentní za podmínek rychlého zabíjení, byl učiněn závěr, že alkalinní proteáza (Gambello a spol. (1993) Infection & Immunity 61: 1180-4), stafylolytická proteáza (Toder a spol. (1991) Mol. Microbiol. 5: 2003-10) a elastáza (Gambello a Iglewski (1991) J. Bacteriol. 173: 3000-9), které jsou pozitivně regulovány genem lasR, nejsou nezbytné pro rychlé zabíjení. Navíc se ukázalo, že virulenční faktory nejsou inaktivovány zahřátím na 65 °C po dobu 60 minut, chloroformem nebo UV-zářením, což předpokládá uplatnění malých neproteinových molekul.

Důkaz, že se fenaziny účastní rychlého zabíjení

9 *·» ·» * ·

Výše popsané výsledky naznačují, že jeden z toxinů účastnících se rychlého zabíjení, je fenazin. Tyto výsledky následují dále.

PA14 mutanty ovlivňovaly produkci pyocyaninu. Analýza jedné z mutant oslabených v rychlém zabíjení, kmen 3E8, vykazoval inzerci TnphoA uprostřed phzB-podobnému genu. Má se za to, že phzB gen kóduje enzym účastnící se biosyntézy fenazinu v P. fluorescens kmen 279. V souladu s tím jsme ukázali, že inzerce TnphoA do phzB-podobného genu měla za následek 50 % snížení produkce pyocyaninu, nejlépe charakterizovaného fenazinu u P. aeruginosa. Podobně inzerce Tnpho do rozpojeného genu v kmeni 34B12 měla za následek jak oslabení rychlého zabíjení, tak dramatický pokles tvorby pyocyaninu. Byla také ukázána korelace mezi deficiencí pyocyaninu a oslabením rychlého zabíjení u knene 49H2; avšak nebyla vyloučena možnost, že mutace v 49H2 by mohla být alelická k těm u kmenů 34B12 nebo 3E8.

Fosfát ovlivňuje jak tvorbu pyocyaninu, tak rychlé zabíjení. Kromě důkazu, že vysoká koncentrace fosfátu v růstovém médiu inhibovala produkci pyocyaninu, ukázalo se, že také rychlé zabíjení bylo redukováno v médiu bohatém na fosfát v porovnání s médiem bez fosfátu.

Termostabilita toxinu. Skutečnost, že difusibilní látka nezbytná pro rychlé zabíjení, byla termostabilní a nebyla inaktivována chloroformem nebo UV, byla v souladu se závěrem, že toxin je nebo má jako jednu komponentu fenazin. Fenaziny jsou termorezistentní (Dakhama a spol. (1993) J. Appl. Phycology 5: 297-306).

Mutanty C. elegans. Má se za to, že pyocyanin zapříčiňuje toxicitu tím, že indukuje tvorbu superoxidů (Hassan a Fridovich (1980) J. Bacteriol. 141: 1556-163; Hassett a spol. (1992) Infect. Immun. 60: 328-336). Jak je popsáno výše, červí mutant age-1 (hx546), který je rezistentnější kparaquatu jakožto producentu superoxidů, byl také rezistentnější k rychlému zabíjení účinkem PA14. Naopak mutace v rozpojeném genu C. elegans mev-1 (kn-1) nebo rad-8 (mni63) vedla ke zvýšené citlivosti na paraquat (Ishii a spol. (1990) Mutation Res. 237: 165171; Ishii a spol. (1993) Mechanisms of Aging and Development 68: 1-10) a k zesílenému rychlému zabíjení účinkem PA14.

Úloha fenazinu jiných než pyocyanin v rychlém zabíjení Tyto výše sumarizované výsledky dohromady poskytují přesvědčivý důkaz, že alespoň jeden z fenazinů, pyocyanin, hraje významnou úlohu v rychlém zabíjení. Avšak pyocyanin je terminální produkt biosyntézy fenazinů u P. aeruginosa (Byng a spol. (1979) J. Bacteriol. 138: 846-852). Kromě pyocyaninu jsou další fenaziny produkované P. aeruginosa oxychlorafin, fenazin-1-karboxylová kyselina, chlorafin, 1-hydroxyfenazin a pyorubin (nebo aeruginosin A a B) (Turner a Messenger (1986) Adv. Microbial. Physiol. 27: 211-273). Bylo publikováno, že • » · » ·* · «· »9 • · * · · · » · « • * * « < » · · * « · » »····· « · · · -4*·* «··* * · · · · · · ·· mnoho kmenů P. aeruginosa produkuje více než jeden fenazin (Byng a spol. J. Bacteriol. 138: 846-852), a relativní množství produkce bylo ovlivněno růstovými podmínkami (Chang a Blackwood (1969) Can. J. Bacteriol. 15: 439-444). Účast dalších fenazinů, buď nezávisle nebo ve spolupráci s pyocyaninem při zabíjení červů je možná, protože ani identita, ani kvantita jiných fenazinů produkovaných PA14 nebyla v jakémkoliv zvýše uvedených experimentů zjišťována. Kromě toho všechna měření pyocyaninu byla prováděna v KA médiu, ale médium používané pro zabíjení červů bylo PGS. Protože kvantita pyocyaninu a jiných fenazinů je ovlivněna rozličnými faktory, odchylky v médiích mohly přispět k výsledkům.

Jiné fenaziny mohou být také důležité pro zabíjení C. elegans. Zaprvé, jak bylo diskutováno výše, P. aeruginosa produkuje i jiné fenaziny kromě pyocyaninu. Výše se ukázalo, že P. aeruginosa kmen PAO1 byl signifikantně méně virulentní než PA14 za podmínek rychlého zabíjení, ačkoliv produkoval podobná množství pyocyaninu a pyorubinu jako PA14. Protože je známo, že P. aeruginosa produkuje několik dalších fenazinů jako je fenazin-1-karboxylová kyselina a 1-hydroxyfenazin, může být oslabená virulence PAO1 způsobena nepřítomností nebo sníženým množstvím jiných fenazinů. Navíc se ukázalo, že P. fluorescens kmen 2-79 a kmen WCS365 zabíjí C. elegans, ale tyto kmeny netvoří pyocyanin. Tyto kmeny jsou efektivními biokontrolními agens proti Fusariovému chřadnutí a vše-beroucími chorobami (způsobenými F. oxysporum F. sp. Lini a Gaeumannomyces graminis var. Tritici, resp.). Efektivita P. fluorescens kmene 2-79 jako biokontrolního agens je následek fenazinového antibiotika, fenazin-1karboxylové kyseliny (Thomashaw a Weller (1988) J. Bacteriol. 170: 3499-3508), jeden z fenazinů produkovaných P. aeruginosa. Zajímavé je, že fenazin-1-karboxylová kyselina podobně jako pyocyanin má redox cyklující schopnosi (Turner a Messenger (1986) Adv. Microbial Physiol. 27: 211-273) a může být proto důležitá v toxicitě proti C. elegans.

Interakce mezi C. elegans a bakteriemi je antagonistická. Protože C. elegans využívá bakterie jako potravu není překvapující, že některé druhy bakterií si vyvinuly mechanismy ke své ochraně proti tomuto predátoru. Výše popsané výsledky ukazují, že fenaziny obecně a pyocyanin konkrétně jsou některými z difusibilních toxinů využívanými P. aeruginosa proti C. elegans. Nasazení fenazinů jako chemických zbraní se mohlo vyvinout mnohem dříve proti jiným mikroorganismům a proti prvokům jako je améba. Antimikrobiální působení pyocyaninu může také pomáhat eliminovat kompetující mikroorganismy v jej ich přirozeném prostředí (Hassan a Fridovich (1980) J. Bacteriol. 141: 1556-163). Selektivní výhoda získaná produkováním fenazinů je tak velká, že je udržována i na úkor růstu u některých druhů. Například Pseudomonas phenazinum produkující fenazin voří menší kolonie a nižší maximální hustotu buněk (ale nemá nižší růstovou míru) v porovnání s neprodukujícími mutanty. Kromě • ftftftft ·· ft ftft ft* « · ftftftft ftftft· • ft ftftft · * · « ft ♦ « · ft ftftftft·* ·· ftftft ftftftft «••ft ftft «ftft ftft ftft toho neprodukující mutanty mají vyšší přežívání než jejich produkující rodiče za podmínek s limitovanými živinami. Přesto rostou-li společně, produkující rodiče překonají neprodukující mutanty (messenger a Turner (1981) Soc. Gen. Microbiol. Quarterly 8: 2263-264) a rozšířením také překonají jiné neprodukující konkurenty jiných druhů. Použitím P. aeruginosa kmenů, které produkují pyocyanin a jiné fenaziny, několik studií ukázalo, že améby, které pohltily tyto bakterie buď vytvoří cysty nebo zahynou. V některých případech nejsou fenazin-produkující bakterie pojídány (Singh (1945) Br. J. Expt. Pathol. 26: 316-325, Groscop a Brent (1964) Can. J. Microbiol. 10: 579-584). Z výsledků zde popisovaných také předpokládá potřeba fenazinů pro nematocidální efekt, že produkce fenazinů u P. fluorescens a P. aeruginosa může pomoci v přežívání proti nematodům živícím se bakteriemi. Je možné, že sekundární metabolit, který byl poprvé objeven pro přežívání proti jednoduchým eukaryotům, byl následně kooptován během evoluce, aby ochránil P. aeruginosa před nematody živícími se bakteriemi jako je C. elegans a před fagocyty během savčích infekcí. Opravdu, pyocyanin defektivní mutanty 49H2, 34B12 a 3E8 jsou oslabeny v patogenicitě u myšího modelu infekce popálenin.

Materiál a metody

Kmeny a plazmidy. Používané bakteriální kmeny a plazmidy jsou uvedeny v Tabulce VII.

Tabulka VII

Kmen nebo plazmid	Relevantní charakteristika	Zdroj nebo reference
Pseudomonas aeruginosa PA14	Rif divoký typ	Rahme a spol., 1995
PAO1-R	Divoký typ	Rahme a spol., 1995
PAO1-G	Divoký typ	J. Goldberg
PAO1-V	Divoký typ	M. Preston
PAO1-I	Divoký typ	M. Preston
PAO1-J	Divoký typ	K. Jaeger
PAK	Divoký typ	S. Lory
PA29	Divoký typ	Rahme a spol. 1995
PO37	Divoký typ	Stevens a spol. 1994
PA14toxA	Gmr toxA inzerční mutant PA 14	Rahme a spol. 1995
PA14plcS	Gmr plcS inzerční mutant PA14	Rahme a spol. 1995
PA14gacA	Gmr gacA inzerční mutant PA 14	Rahme a spol. 1995
PA14degP	Gmr degP inzerční mutant PA14	Tato sudie
PA14algDÁ4	AlgD „in-frame“ deleční mutant PA14	Tato studie
PA14degPalgDÁ4	AlgD „in-frame“ deleční mutant a degP inzerční mutant PA14	Tato studie
PA14phnAphnB	Kmr, mutant anthranilát syntázy PA 14	Rahme a spol. 1995
P. fluorescens 2-79 (NRRLB15132)	Phz+ divoký typ	E. Schott
55	Divoký typ	E. Schott

WCS365	Divoký typ	G. O'Toole
P. syringae pv. maculicola ES4326	Smr divoký typ	Davis a spol., 1991

Kmeny červů a podmínky kultivace. Kmeny se držely a manipulovalo se s nimi na NG agaru sE. coli ΘΡ50 jako zdrojem potravy (Sulston a Hodgkin (1988) Methods. V The Nematode Cenorhabditis elegans, Wood ed. (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory), str. 587-606, Lewis a Fleming (1995) Basic cilture methods. V Cenorhabdiis elegans: Modem Biological Analysis of an Organism, Vol. 48, Epstein a Shakes, eds. (San Diego, CA: Academie Press), str. 4-31). Genetická nomenklatura se řídí směrnicemi popisovanými Horvitzem a spol. (Mol. Gen. Genet. 175: 129-133, 1979). Bristolské kmeny červů používané zde zahrnují divoký typ kmene N2 (Brenner (1974) Genetics 77: 71-94) a následující kmeny: TJ1052, age-1 (hx546)II, TK22, mev-l(knl)III, PH13, rad-8(mnl63)I. Tyto kmeny byly poskytnuty Genetickým centrem Cenorhabditis.

Média a antibiotika. Kompletní médium pro bakteriální kultivaci a udržování byl Luria bujón (LB) a King's bujón (KB) (King a spol. (1954) J. Lab. Clin. Med. 44: 301-307, Miller 1972, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory) a minimální médium bylo M9 (Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory). Izolační agar pro Pseudomonas (PIA) byl získán od Difco. NGM médium je popsáno v referenci Sulston a Hodgkin (1988, Methods. V The Nematode Cenorhabditis elegans, Wood ed. (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory), str. 587-606). Pepton-sorbitol (PGS), pokud není uvedeno jinak, bylo médium používané pro rychlé zabíjení, sestávalo se z 1 % Bacto Pepton (Difco), 1 % NaCl, 1 % glukózy, 0,15 M sorbitolu (Fischer Scientific) a 1,7 % Bacto Agaru (Difco). Koncentrace antibiotik používané pro P. aeruginosa PA14, rifampicin 100 μg/ml, neomycin 200 pg/ml a carbenicillin 300 pg/ml.

Zabijecí test červů. Zabíjení červů působením P. aeruginosa bylo prováděno v miskách. Pro test rychlého zabíjení se 5 pl přes noc rostoucí King's B (King a spol. (1954) J. Lab. Clin. Med. 44: 301-307) kultury PA14 nebo testovaného kmene rozšířilo na misku s průměrem 3,5 cm obsahující PGS nebo PG agar. Bakteriální pokryv s průměrem přibližně 2 cm rostl v centru misky po inkubaci ve 37 °C po dobu 24 hodin. Po ochlazení na laboratorní teplotu (v rozmezí 412 hodin po vyjmutí z 37 °C inkubátoru) se přidalo 40 červů do agaru. Pokud nebylo uvedeno jinak, všechny kmeny červů byly inkubovány při 20 °C a bylo použito čtvrté larvální (L4) stadium. Experiemnty se prováděly ve 3-4 opakováních na kmen. Brostol N2 se používal jako divoký kmen a E. coli OP50 jako negativní kontroly. Misky osazené červy se inkubovaly při 25 °C. Mortalita červů se zjišťovala v různých časových intervalech. Červ se považoval za * « 9 9 ··»··· · · · 9 · 9 9 • · · · 99 ··♦ 99 99 mrtvého, pokud nebyl detekovatelný pohyb po lehkém doteku. Test pomalého zabíjení se prováděl obecně tak, jak bylo popsáno výše.

Faktory ovlivňující zabíjení.

A. Vliv osmolarity. Přes noc rostoucí kultury PA14 byly umístěny na agarové misky obsahující pepton-glukózové (PG) médium nebo vysoce osmolaritní PG médium obsahující přídavek 0,1 M a 0,15 M sorbitol (Fisher).

B. Vliv železa. Za podmínek, kdy je železo limitováno, se do PGS média přidá 400 μΜ EDDA (Ankenbauer a spol. (1986) J. Bacteriol. 167: 7-11), aby se vyvázalo veškeré volné železo, zaímco v médiu bohatém na železo se jako doplněk železa přidává 100 μΜ FeCb (Meyer a spol. (1996) Infect. Immun. 64: 518-523). Takto se testovaly v porovnání s PGS kontrolami.

C. Vliv růstové teploty. Přes noc rostoucí kultury PA14 se umístily na agar a rostly po dobu 36 hodin ve 20, 25, 30 a 37 °C. Všechny misky se nechaly v 25 °C po osazení červy.

D. Vliv zdroje uhlíku. PGS obsahuje 1 % glukózu (v/v). Pouze glukózová složka média byla nahrazena 1 % glycerolem (v/v), aby vznikl pepton-glycerol-sorbitol agar (PYS).

Test na PA14::TnphoA mutanty defektní v rychlém zabíjení. Vytvořily se dvě nezávislé knihovny PA14::TnphoA mutant využitím širokospektrálního hostitelského carbenicillin rezistentního (Cb^r) smrtícího vektoru pRT733 (Taylor (1989) J. Bacteriol. 171: 1870-1878) nesoucí TnphoA (která uděluje neomycinovou rezistenci, Nm^r) vE. coli kmeni SMlOlpir. Tento kmen se použil k přenosu TnphoA do PA14. Konjugace se prováděla v King's B médiu (King a spol. (1954) J. Lab, Clin. Med. 44: 301-307), které dávalo vyšší frekvenci transkonjugací než LB médium. Pro testování kandidátských mutant se použily podmínky podobné testům rychlého zabíjení s následujícími výjimkami. Individuální klony PA14::TnphoA mutant se umístily na misky a na každou se přidalo 5 červů L4. Jako pozitivní kontrola se použila PA14. Muatnty, které stále obsahovaly 3-5 přežívajících červů po 24 hodinách se definovaly jako domnělé oslabené mutanty a testovaly se ve výše popsané analýze rychlého zabíjení. Mutantní kmeny, které důsledně vykazovaly signifikantně nižší míru zabíjení v porovnání s divokým parentálním typem PA14, se vybraly pro další charakterizaci.

Využití metody rychlého zabíjení červů

Test rychlého zabíjení červů podobně jako test pomalého zabíjení je užitečný pro identifikaci chorob-způsobujících mikrobiálních virulenčních faktorů. Kromě toho je test užitečný pro identifikaci léčiv, která jsou schopna buď inhibovat patogenicitu nebo zvýšit schopnost < · * » φ φφφφ ·»·· * φ φ φ φφφφ φ «φ» φφφ φφφ φ φφ« φφφφ φφ φ φ «φφ φφ φφ rezistence organismu k patogenu. V preferovaném provedení se test rychlého zabíjení provádí s využitím mnene červů, který ma zvýšenou permeabilitu pro látku, např. pro toxin jako je kolchicin. Příklady červů majících takovou zvýšenou permeabilitu zahrnují, ale nejsou omezeny jen na ně, zvířata mající mutaci v P-glykoproteinu, např. PGP-1, PGP-3 nebo MRP-1. Takové mutanty červů jsou použitelné pro test rychlého zabíjení z důvodu jejich zvýšené citlivosti na toxiny, která je následkem zvýšené membránové permeability. Tato charakteristika má za následek test se zvýšeným rozdílem mezi plnou citlivostí a plnou rezistencí k toxické látce.

V jednom pracovním příkladu se použil test F2 mutageneze k identifikaci mutací v genech C. elegans, které přispívají k rezistenci při rychlém zabíjení. Identifikovalo se 6 mutant testováním přibližně 5000 haploidních genotypů. Tyto mutanty jsou užitečné nejen kvůli poskytnutí informací o mechanismu rychlého zabíjení, ale také pro poskytnutí informací o imunitě C. elegans.

Jiní hostitelé pro identifikaci patogenních viruleněních faktorů

Galleria mellonella (větší voskový mol)

Objevili jsme, že larvy Galleria mellonella (větší voskový mol) jsou také užitečné pro identifikaci patogenních viruleněních faktorů u ukázkových organismů, Pseudomonas aeruginosa a Fusarium oxysporum, buď samotné nebo v kombinaci s jakoukoliv zvýše popsaných testovacích metod.

Pseudomonas aeruginosa

Pro určení patogenicity Pseudomonas aeruginosa na Galleria mellonella se bakterie injikovali do larev G. Mellonella následujícím způsobem. Kultury P. aeruginosa se nechali růst přes noc v King's B médiu (King a spol. (1954) J. Lab. Clin. Med. 44: 301-307). Tato kultura se pak naředila 1:100 ve stejném médiu a kultivovala se. Po dvou hodinách růstu se kultury zcentrifugovaly a buňky se resuspendovaly ve stejném objemu 10 mM MgSO₄. Každá kultura se následně naředila na Οϋβοο ~ 0,1 (přibližně 10⁸ buněk/ml). Hamiltonovou stříkačkou se injikoválo 5 μΐ seriálně lOx ředěných roztoků (10°-10'⁶) do jednoho z abdominálních parapodií G. mellonella (Lysenko (1963) Journal of Insect Pathology, 5: 78-82). Bakteriální počty se určily standardními metodami. Larvy G. mellonella byly získány z Van der Horst Wholesale, St. Mary's, OH.

Po injekci bakterií se larvy G. mellonella umístily na Petriho misky a inkubovaly se při 25 °C. Letalita se vizuálně zjišťovala po 48 hodinách sledováním změny barvy (z bílé na černou) u každé larvy a určením larvální motility. Každá jednotlivá nepohybující se larva byla považována • »9·· ·· 9 *9 99 * · 9 9999 9999

9 999 9999

9 «99 999 99 9

9 9 9 9999

999 9 99 ·♦· 99 99 za mrtvou. Obecně lze říci, že larvy, které byly po 48 hodinách stále živé, již nechcíply ani když se prodloužil čas testu.

Aby se určila LD50,10 larev se injikovalo seriálně naředěnými roztoky bakterií. Zjišťovala se smrt larev a údaje se vynášely do grafu (procento zabitých larev oproti počtu injikovaných bakterií). Křivka podle vzorce: procento zabitých = A + (1-A)/(1 + exp (B - G x log(počet bakterií) se přizpůsobí datům s použitím počítačového programu Systat Ver. 5.2, kde A je frakce mrtvých larev z kontrolní injekce a B a G jsou parametry, které jsou měněny, aby odpovídaly křivce (Systat Version 5.2 pro počítače Macintosh, Systat lne., 1992, Evanston, Illinois).

S využitím tohoto programu bylo B a G určeno s počítačově vykalkulovaným nejlepším přizpůsobením se a pak se vypočítala LD₅₀ při použití následující rovnice: LD₅₀ = exp(B/G) x (1 -2xAHl/G).

Injikovali jsme mutantní P. aeruginosa (které byly izolovány s použitím výše popsaných testů na rostlinách a červech nebo které byly vyvořeny s využitím dříve klonovaných genů) do larev G. mellonella a vypočítali jsme hodnoty LD₅o. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny v Tabulce VIII (níže), ukazují porovnání hodnot LD₅₀ u G. mellonella a procento zabitých myší při dvou různých koncentracích bakterií.

Tabulka VIII

LD50 kmenů P. aeruginosa v G. mellonella
Kmen PA 14	LD50 v G. mellonella	% mortaliy myší při indikované dávce	Původ mutanty
5x 103	5 x 105
PA14	1	53	100	Divoký typ
41A5	1	NT1	100	C. elegans
41C1	1	NT	85	C. elegans
35A9	1	NT	55	C. elegans
16G12	2	20	100	Test rostlin
34H4	2	0	33	Test rostlin
toxA	2	40	NT	Vytvořen
34B12	3	0	56	Test rostlin
LasR	4	NT	50	C. elegans
49H2	8	NT	50	C. elegans
3E8	10	NT	6	C. elegans
25A12	10	11	87	Test rostlin
degP	10	0	63	Vytvořen
35H7	10	NT	NT	C. elegans
36A4	20	NT	NT	C. elegans
ID7 (gacA)	20	0	50	Test rostlin
23A2	30	NT	NT	C. elegans
33A9	40	0	0	Test rostlin
13C9	80	NT	NT	C. elegans
gacA	100	0	50	Vytvořen
44B1	500	NT	70	C. elegans
50E12	600	NT	NT	C. elegans
33C7	2000	0	0	Test rostlin
25F1	2000	0	20	Test rostlin
dsbA	6000	0	62	Test rostlin

Φ φ· Φ · · φφ φφ φ φ φ · φ φ φ φ « φ φφ · · φ φ · ♦ « · » ···>«· • · · · φ φ φ φ • ·· φ ·φ · φ· φφ φ · ) pho23 I 50000 | Ο | 10 | Test rostlin [

NT = netestováno

Výsledky ukázané v Tabulce VIII odalily, že existovala signifikantní korelace mezi zvýšenou LD50 u G. mellonella a sníženým zabíjením v myším modelovém systému.

Statistická korelace, která byla pozorována mezi virulencí P. aeruginosa v G. mellonella a u myší ukazuje, že savčí virulenční determinanty mohou být identifikovány testováním bakteriálních izolátů, které mají redukovanou LD50 v G. mellonella. Takový test může být rozšířen z P. aeruginosa tak, aby zahrnoval i jiné patogeny, které jsou virulentní jak u hmyzu, tak u savců. Dva možní kandidáti jsou bakterie rodu Serratia a proteus, kteří jsou nejen závažnou příčinou nasokomiálních infekcí, ale jsou také silně patogenní v G. mellonella (Chadwick (1967) Federation Proceedings 26: 1675-1679). V případě klinických izolátů Serratia marcescens existuje korelace mezi zvýšenou LD₅₀ v G. mellonella (Chadwick a spol. (1990) Journal of Invertebrate Pathology 55: 133-134).

Larvální testovací systém G. mellonella může být využit k identifikaci virulenčních faktorů P. aeruginosa, které jsou nezbytné pro infekci u savců, podobně jako výše popsaný testovací systém nematod a rostlin. V jednom pracovním příkladu jsou mutantní izoláty P. aeruginosa s redukovanou virulencí v G. mellonella identifikovány s využitím výše popsané injekční metody. Knihovna mutantních bakterií s redukovanou virulencí jsou vytvořeny standardními metodami a kultury mutantních izolátů jsou pak naředěny do bodu, kdy je 100 až 1000 bakterií v 5 μΐ. Tento objem je pak injikován do larev G. mellonella. Jestliže konkrétní mutantní izolát není schopen zabít G. mellonella při této koncentraci, jsou provedeny další injekce, aby se určila LD50 mutantního kmene v G. mellonella. Bakteriální izoláty mající redukovanou virulenci v hmyzím modelovém systému se berou za kandidáty pro další studie k identifikaci savčích virulenčních faktorů P. aeruginosa.

Testovací systém s voskovým molem může být také použit u jiných patogenů, kteří infikují jak hmyz, tak savce. Například je určena LD₅₀ pro divoký typ určitého patogenů v G. mellonella a pak jsou mutagenizované izoláty patogenů injikovány v koncentracích signifikantně vyšších než je LD₅₀ izolátů divokého typu. Mutanty, které nezabíjí při vyšších dávkách, jsou kandidáty pro identifikaci patogenních virulenčních faktorů.

Fusarium oxysporum

Úspěch použití larev G. mellonella jako modelu pro infekci Pseudomonas aeruginosa nás pobídlo také k otestování infektivity houby Fusarium oxysporum v tomto systému.

Patogenicita Fusarium oxysporum v Galleria mellonella byl určen následovně. Jedna spora F. oxysporum byl použita pro začátek kultury F. oxysporum na misce s bramborovým

ΦΦΦΦΦ φφ φ φφ φφ ·· φ φ φ φ · φφφφ φ φ φφφ φφφφ φ φ «φφ φ · φ φ · φ φφ φφφ φφφφ φφφφ φφ φφφ φφ φφ dextranovým agarem (Difco) podle standardních metod. Povrch misky se omyl 2 ml média Armstrong Fusarium (Armstrong a Armstrong (1948) Phytopathology 38: 808-826) a yto 2 ml média se přidají do malých lahviček s dalšími 25 ml stejného média. Po dvou dnech v laboratorní teplotě se vyvine hustá sporo vá kultura F. oxysporum a je použita pro injekční experimenty. Vzorky této sporové kultury se stočí v mikrocentrifůze a spory se následně resuspendují v 10 mM MgSC>4 s 5 mg/ml carbenicillinu. Carbenicillin byl použit, aby larvy G. mellonella nezahynuly z bakteriální infekce ještě před podlehnutím F. oxysporum. Desetinásobná seriální ředění sporových kultur byla připravena ve stejném médiu a 5 μί naředěných vzorků (10°, 10'¹, IO² a 10'³) se injikovalo do larev G. mellonella Hamiltonovou stříkačkou. Počet spor v každém ředění se určil podle standardních metod, například vysazením alikvotních naředěných sérií na médium Armstrong Fusarium a spočítáním vyklíčených spor. Jako kontrola se do další sady larev injikoval také 10 mM MgSCú s 5 mg/ml carbenicillinu. Injikované larvy se umístily na Petriho misky (10 na misku). Po sedmi dnech ve 25 °C se spočítaly mrtvé larvy. Mrtvé larvy se staly černými a často měly bílý povlak z houby.

LD50 pro F. oxysporum v G. mellonella se spočítal úpravou křivky z údajů o zabíjení larev do rovnice, která je popsána výše s využitím Systat programu. Výsledky z dvou nezávislých injekčních experimentů jsou ukázány níže v Tabulce IX a reprezentativní křivka zabíjení je vidět na Obr. 14. Počítačový program Systat se použil pro úpravu křivky s daty jak bylo popsáno výše (kde b = 4,51, g = 1,11) a LD₅q pro F. oxysporum v G. mellonella byla spočítána na 60 spor.

Tabulka IX

Počet injikovaných spor	Počet zabitých larev (z 20)
1700	20 (100%)
170	13 (65%)
17	2(10%)
1,7	1 (5%)
0	0 (0%)
1800	20 (100%)
180	18(90%)
18	6 (30%)
1,8	2(10%)
0	0 (0%)

LD50 (přibližně 60 spor) F. oxysporum v G. mellonella, která byla určena vtěcho experimentech ukazovala, že tento systém je užitečný v testech vypracovaných pro identifikaci virulenčních faktorů F. oxysporum. V jednom pracovním příkladu je F. oxysporum mutován restrikčním enzymem mediovanou integrací (REMI) podle standardních metod (Kuspa a Loomis (1994) Genetics 138: 665-674, Tang a spol. (1992) Mol. Microbiol. 6: 1663-1671, Lu Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 12649-12653,1994, a Bolker (1995) Mol. Gen. Genet. 248: 54741

• ·♦♦· • * • ·	• · • · • «	• • · •	·· * ♦ · • · ·
• · • · ·	• * • ·	• ·♦»	• · « ♦ Φ

552). Knihovna hub mutovaných tímto způsobem je pak testována na redukovanou virulenci injekcí do larev G. mellonella a standardními meodami jsou identifikovány houbové geny, které ovlivňují virulenci (např. inverzní PCR využívající vloženou DNA a následné sekvenování přiložené houbové DNA). F. oxysporum s redukovanou virulenci v G. mellonella se pak testuje na redukovanou virulenci v rostlinách a vyšších savcích a identifikují se společné virulenční faktory. Využií G. mellonella jako testovacího systému umožňuje relativně rychlou a nenákladnou identifikaci důležitých houbových virulenčních faktorů.

Výhody testovacího systému G. mellonella

Využití G. mellonella jako hostitelského systému je výhodné pro identifikaci savčích virulenčních faktorů P. aeruginosa, F. oxysporum a dalších patogenů. Jak je uvedeno výše, jedna důležitá výhoda, kterou tento systém poskytuje, je fakt, že mutantní izoláty patogenů mohou být rychle a nenákladně testovány. V různých experimentech se za hodinu injikovalo až 250 G. mellonella vzorky P. aeruginosa. Tato rychlá propustnost umožňuje otestovat velké počty mutantní ch patogenů v relativně krátkém časovém úseku. Kromě toho je možné s G. mellonella určit LD50 pro patogen. Takové zjištění usnadňuje posouzení relativní virulence různých patogenních izolátů. Ještě jinou výhodou je to, že zabíjení myší účinkem P. aeruginosa vykazuje lepší korelaci k virulenci v G. mellonella než u jiných modlových organismů, které byly použity. Podle toho je s využitím tohoto systému při testování patogenních mutant vysoce pravděpodobné, že budou identifikovány savčí (například lidské) virulenční determinanty. Konečně je pravděpodobné, že použití G. mellonella identifikuje virulenční faktory nenalezené v jiných multi-hostitelských testech.

Plutella xylostella (diamantový mol)

Objevili jsme také, že larvy Plutella xylostella (diamantový mol) jsou užitečné pro identifikaci patogenních virulenčních faktorů Pseudomonas aeruginosa.

Patogenicita P. aeruginosa u Plutella xylostella se určovala s využitím larválního potravinového testu se zelenou hořčicí. Larvy Plutella xylostella byly krmeny hořčičnými listy infiltrovanými Pseudomonas aeruginosa následujícím způsobem. P. aeruginosa se kultivovala vKing's B médiu (King a spol. (1954) J. Lab. Clin. Med. 44: 301-307). Přes noc rostoucí kultury byly zcentrifugovány a promyly se 10 mM MgSO4, Buňky se pak resuspendovaly v 10 mM MgSO₄ a naředily se na ODóoo ⁼ 0,1. Larvy Pl. Xylostella byly udržovány na semisyntetické dietě z pšeničných klíčků podle standardních metod (Shelton a spol. (1991) J. Ent. Sci., 26: 17-26).

9 9 9 · · 9 99 99

9999 9999

99 9 9999 • 99 9 9 9 9 9 9 9

999 9 · 9 9

99 999 99 99

Hořčičná zeleň (z Cambridge Naural Foods, Cambridge, MA) se rozstříhala na kousky okolo 10 cm a ponořily se do 10 mM MgSO₄ obsahující P. aeruginosa. Ponořené listy se umístily do vakua a vakuum se náhle uvolnilo, aby se bakteriální roztok infiltroval do listů. Jako kontrola se listy infiltrovaly pouze 10 mM MgSO₄. Infiltrovaný listový materiál se inkuboval při 23 °C na Petriho miskách s dvaceti larvami Pl. Xylostella, které se nechaly nakrmit podle libosti. Pošlé larvy se počítaly po 48 hodinách. Larvy, které se po doteku koncem pipety nehýbaly, se považovaly za mrtvé.

Divoký typ P. aeruginosa kmen PA14 a PA01 způsobovaly mortalitu blížící se 100 % zabitých larev Pl. xylostella. Tři mutanty izolátů PA14 však vykazovaly silně redukované zabíjení. Tyto výsledky ukazují, že 1) P. aeruginosa byla letální po pohlcení hmyzími larvami a 2) mutantní izoláty P. aeruginosa kmene PA 14 měly redukovanou virulenci v tomto modelovém systému. Souhrn těchto výsledků prezentuje Tabulka X (níže).

Tabulka X

Kmen	Počet	Počet mrvých larev po 48 hodinách
PA14	80	79 (99%)
PAO1	80	76 (95%)
PA 14 dsbA	40	10(25%)
PA14 pho23	40	3 (8%)
PA 14 lasR	40	8 (20%)
MgSO4 kontrola	80	2 (3%)

Drosophila melanogaster (ovocná muška)

V ještě dalším příkladu jsme zjistili, že ovocná muška, Drosophila melanogaster, je užitečná pro hodnocení patogeneze Pseudomonas aeruginosa.

Patogenicita P. aeruginosa u Drosophila melanogaster se zjišťovala s využitím následující abdominální propichovací test. Zásoba mušek OregonR nebo značeného kmene žlutá bílá (yw) se kultivovala za standardních podmínek na médiu z kukuřičné mouky. Dvě různá genetická pozadí se testovala, protože se ukázalo, že některé kmeny jsou citlivější k bakteriálnímu působení (Lemaitre a spol. (1996) Cell 86: 973-983). Kultury P. aeruginosa kmene PA14a kontrola E. coli DH5a se nechaly růst přes noc na King's B médiu (King a spol. (1954) J. Lab. Clin. Med. 44: 301-307). PO kultivaci přes noc se buňky naředily 1:10 a nechaly se růst další 45 hodin. Buňky se pak dvakrát promyly, resuspendovaly se v desilované vodě a pak se použily na propíchnutí abdomenu v následujících čtyřech koncentracích: neředěné, naředěné 1/10, lOx koncentrované a lOOx koncenrované.

Vystavení bakeriím bylo provedeno propíchnutím abdomenu dospělých mušek za anestezie tenkou jehlou, která byla ponořena do různých koncentrací PA14 nebo DH5a. Po vystavení • · • · · · t >··* •«•4 ♦· 449 «4 *4 bakteriím se mušky umístily do 28 °C a sledovala se smrt, což bylo posuzováno ztrátou pohybu.

V každé koncentraci bakterií se posuzovalo 18 až 20 mušek a spočítal se průměr a směrodatná odchylka. Zjistili jsme, že PA14 účinně zabíjela dospělce D. melanogaster v závislosti na dávce.

U experimentů s kontrolním kmenem DH5a bylo pozorován slabé zabíjení. Výsledky těchto experimentů využívající kmen OrR jsou sumarizovány na obr. 15. Podobné výsledky byly pozorovány na genetickém pozadí yw.

Jak bylo diskutováno výše, zjistilo se, že P. aeruginosa účinně zabíjí Drosophila melanogaster v testu zahrnujícím vnesení P. aeruginosa do abdomenu dospělých mušek pomocí jednoduchého vpichu jehlou. Jiné metody pro vnesení měřitelných množství P. aeruginosa zahrnují, ale neomezují se jen na ně, přímou injekci a pohlcení (např. přidáním P. aeruginosa do růstového média mušek). Je-li to vyžadováno, larvy mušek mohou být použity v experimentech patogenicity.

Jednou z výhod použití D. melanogaster je, že pro studium bakteriální patogeneze mohou být využity vícenásobné molekulární a genetické přístupy usnadněné tímto modelem. D. melanogaster je vynikající model pro studium vrozené imunitní odpovědi a mnoho genů účastnících se této odpovědi bylo klonováno z tohoto hmyzu (Hoffmann (1995) Curr. Biol. 7: 410). Mutace v těchto genech mohou být využity ve spojení s mutacemi bakteriálních virulenčních faktorů izolovaných z testů zahrnujících rozmanité hostitele P. aeruginosa, aby poskytly hodnotné informace o způsobu účinku těchto virulenčních faktorů.

Testovací systémy pro identifikaci terapeutických látek nebo protektivní ch látek rostlin

Jak bylo diskutováno výše, ukazují naše experimentální výsledky, že sestava virulenčních faktorů P. aeruginosa se účastní patogenicity ve třech růaných hostitelích, a že tyto společné virulenční determinanty definují u bakteriální patogenicity základní rysy, které jsou nezávislé na hostiteli. Na základě tohoto objevu jsme vyvinuly testovací postup pro identifikaci terapeutických látek (např. anti-patogenních farmaceutických látek), které mohou být použity k inhibici patogenů schopných nezávisle na sobě infikovat buď zvíře (např. lidského pacienta) nebo rostlinu (např. komerční plodinu). Obecně řečeno postupy zahrnují testování jakéhokoliv počtu látek pro terapeuticky nebo agrokultumě aktivní agens využitím multi-hostitelského zvířecího/rostlinného patogenního (např. P. aeruginosa UCBPP-PA14) systému, který je zde popsán. Na základě našeho zjištění, že existují společné virulenční faktory pro patogenicitu v rostlinách, myších a červech, bude snadno pochopitelné, že látka, která interferuje s funkcí takového virulenčního faktoru v červech poskytuje také účinnou terapeutickou látku u savců (např. lidských pacientů) nebo u rostlin. Zatímco většinu současně používaných antibiotik

A *··*· Α· * AA AA ·♦ · A · A A A · · » • A A · · · A · A • * A· A AAA AAA • A AAA AAAA • A A ♦ A · AAA ·· AA v medicíně nebo zemědělství představují buď baktericidní nebo bakteriostatické látky, což favorizuje kmen nebo mutanty k nim rezistentní, látky identifikované v testovacích procedurách zde popsaných (např. systém nematod) nezabíjí bakterie, ale namísto toho je udržují nepatogenní. Navíc vzhledem k tomu, že testovací procedury vynálezu jsou prováděny in vivo, je nepravděpodobné, že by identifikované látky byly silně toxické pro eukaryotický hostitelský organismus.

Podle tohozjednodušují metody vynálezu hodnocení, identifikaci a vývoj aktivních agens jako jsou léčiva nebo protektivní látky rostlin k léčbě patogenních chorob, včetně chorob vyvolaných bakteriemi, houbami, viry, kroužkovci, červy, hlísty a prvoky. Obecně poskytují testovací metody vynálezu přístupné prostředky pro selekci přírodních produktových extraktů nebo látek dle zájmu z velké populace, a tyto látky jsou pak dále hodnoceny a zahuštěny na několik aktivních a selektivních materiálů. Složky tohoto souboru jsou pak purifikovány a hodnoceny v metodách vynálezu, aby se zjistila jejich anti-patogenní aktivita.

Níže popisujeme testovací metody pro hodnocení účinnosti láky jako anti-patogenního agens. Tyto příklady jsou určeny k tomu, aby ukázaly, ale neomezovaly se jen na ně, steru působnosti nárokovaného vynálezu.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Testované extrakty a látky

Obecně nové anti-patogenní látky nebo rostlinné protektanty jsou identifikovány z velkých knihoven jak přírodních produktů nebo syntetických (či semi-syntetických) extraktů nebo chemických knihoven podle metod známých odborníkům v oboru. Ti, kteří jsou vzděláni v oboru objevování a vývoje léčiv, budou rozumět tomu, že přesný zdroj testovaných extraktů nebo látek není rozhodující pro testovací procedury vynálezu. Podle toho může být testován téměř neomezený počet chemických extraktů nebo látek s využitím zde popsaných metod. Příklady takových extraktů nebo látek zahrnují, ale nejsou omezeny jen na ně, rostlinné, houbové, prokaryotické nebo živočišné extrakty, fermentační bujóny a syntetické látky stejně tak jako modifikace existujících látek. Jsou také k dispozici mnohé metody pro tvorbu náhodné nebo řízené syntézy (např. semi-syntéza nebo úplná syntéza) jakéhokoliv počtu chemických látek včetně - ale neomezují se jen na ně - látek na základě sacharidů, lipidů, peptidů a nukleových kyselin. Knihovny syntetických látek jsou komerčně dostupné z Brandon Associates (Merrimack, NH) a Aldrich Chemical (Milwaukee, WI). Alternativně jsou z mnoha zdrojů

Ο«· 4« 4 «4 4»

4444 4444 ♦ · 4 «444 • 4 4 4 444 44 4

444 4444

444 4 «4 444 «4 44 k dispozici knihovny přírodních látek ve formě bakteriálních, houbových, rostlinných a živočišných extraktů, včetně Bioics (Sussex, UK), Xenova (Slough, UK), Harbor Branch Oceanographics Institute (Ft. Pierce, FL) a PharmaMar, USA (Cambridge, MA). Kromě toho jsou vytvářeny přirozeně nebo synteticky produkované knihovny, je-li to vyžadováno podle metod známých odborníkům v oboru, např. standardními extrakčními a frakcionovacími metodami. Navíc je-li to vyžadováno je jakákoliv knihovna nebo látka snadno modifikována pomocí standardních chemických, fyzikálních nebo biochemických metod.

Kromě toho ti, kteří jsou odborníky v oboru snadno porozumí tomu, že metody pro dereplikaci (např. taxonomickou dereplikaci, biologickou dereplikaci a chemickou dereplikaci nebo jejich jakoukoliv kombinaci) nebo pro eliminaci kopií nebo opakování materiálů, které jsou již známy pro svou anti-patogenní aktivitu, by měly být použity kdykoliv je to možné.

Pokud se zjistí, že hrubý extrakt má anti-patogenní aktivitu, je nezbytná další frakcionace pozitivního extraktu, aby se izolovala chemická složky odpovědné za pozorovaný efekt. Proto je cílem extrakčního, frakcionačního a purifikačního procesu pozorná charakterizace a identifikace chemické entity uvnitř hrubého extraktu, která má anti-patogenní aktivitu. Metody frakcionace a purifikace takových heterogenních extraktů jsou známy odborníkům v oboru. Je-li to vyžadováno, jsou látky, které se ukazují být užitečnými pro léčbu patogenicity, chemicky modifikovány podle metod známých odborníkům v oboru.

Nyní následují příklady systémů vysoké propustnosti užitečných pro hodnocení účinnosti molekuly nebo látky podporující rezistenci k patogenu nebo inhibující patogen.

Biologický testovací systém na červech

Aby bylo umožněno testovat velká množství přírodních produktů, extraktů nebo látek účinným a systematickým způsobem, kultivují se hermafroditní L4 larvy Caenorhabditis elegans v jamkách mikrotitrační destičky, což umožňuje semiautonomní manipulace a plně automatizovaný sběr dat. Jak je diskuováno výše, objevili jsme, že P. aeruginosa UCBPP-PA14 infikuje a zabíjí C. elegans, zatímco P. aeruginosa UCBPP-PA14 nesoucí mutovaný virulenční gen je nepatogenní. Jestliže má patogen sníženou patogenicitu, pak L4 červy žijí a vyvíjejí se do dospělých hermafroditů a produkují tisíce živých potomků. Stejně tak jestliže je C. elegans inkubován s patogenem, červ chcípne, pokud není přítomna látka redukující patogenicitu P. aeruginosa. Přítomnost takového živého potomstva je snadno detekovatelné s využitím různých metod, včetně vizuálního sledování standardními mikroskopy.

Testovaná látka nebo extrakt je inokulován v příslušné dávce do NGM agaru osazeného příslušným množstvím přes noc kultivovaného patogenu, např. P. aeruginosa UCBPP-PA14,

0« • · • ·

0 0

0 · aby se vyhodnotila schopnost testované látky nebo extraktu podporovat rezistenci hostitele k patogenů neboomezovat patogeniciu patogenů. Je-li to vyžadováno, mohou být inokulovány různé koncentrace testované látky nebo extraktu, aby se zjistil vliv dávky jak na hostitele, tak na patogen. Kontrolní jamky jsou inokulovány nepatogenní bakterií (negativní kontrola) nebo patogenem bez testované látky nebo extraktu (pozitivní kontrola). Destičky jsou pak inkubovány 24 hodin při 37 °C, aby se usnadnil růst patogenů. Mikrotitrační destičky jsou následně ochlazeny na 25 °C a na desku se přidají 2 hermafroditní larvy C. elegans a inkubují se při 25 °C, což je horní limit pro normální fyziologickou integritu C. elegans. Ve vhodných časových intervalech, např. 4 až 5 dní, jsou jamky kontrolovány na přežívající potomstvo, např. monitorováním pohyby červů při využití detektoru pohybu.

Komparativní studie mezi léčenými a kontrolními larvami se užívají k určení relativní účinnosti testované molekuly nebo látky pro podporu hostitelovi rezistence k patogenů nebo pro inhibici virulence patogenů. Testovaná látka, která účinně stimuluje, stupňuje, zesiluje, zvyšuje nebo podporuje rezistenci hostitele k patogenů nebo která inhibuje, inaktivuje, suprimuje, zabraňuje nebo kontroluje patogenicitu patogenů a neovlivňuje negativně normální fyziologii, reprodukci nebo vývoj červů je považována za užitečnou ve vynálezu.

Biologický testovací systém na rostlinách

Aby se umožnilo masové tesování velkých množství přírodních produků, extraktů nebo látek účinným systematickým způsobem, hostitelské rostliny (např. semena, semenáčky, rostlinky, embrya, zralé rostliny nebo listy) se kultivují v jamkách mikrotitrační destičky nebo jakéhokoliv jiného vhodného zásobníku, což umožňuje semi-automatizaci manipulací a plnou automatizaci sběru dat. Konkrétní příklady vhodných rostlinných hostitelů užitečných v tomto biologickém testu zahrnují, bez omezení, petúnie, rajčata, brambory, tabák, Arabidopsis, sóju, kukuřici, pšenici, žito, rýži, ječmen nebo jakoukoliv jinou rostlinu komerčně nebo zemědělsky významnou. Metody pro kultivaci rostlin jsou známy odborníkům v oboru (viz např. Vasil, I.K. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants Vol I, II, III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academie Press, New York, 1984, Dixon R.A., Plant Cell Culture - A Practical Approach, IRL Press, Oxford University, 1985). Jak bylo diskutováno výše, objevili jsme, že P. aeruginosa UCBPP-PA14 infikuje a zabíjí Arabidopsis thaliana, zatímco P. aeruginosa UCBPPPA14 nesoucí mutovaný gen virulence je nepatogenní. Stejně tak má-li patogen sníženu patogenicitu, u rostliny se nerozvinou příznaky nebo se případně vyvinou oslabené příznaky v porovnání s kontrolními rostlinami. Jestliže jsou rostliny Arabidopsis thaliana inkubovány s patogenem, rostliny zahynou nebo mají rozličné příznaky choroby (např. chlorózu nebo

•	····	·· ·	··	··
··	•	•	•	• ·	•	•	« ·
•	•	•	•	•	•	•	• te
•	•	•	•	•	•	•	• «
···	•	··		···	··		··

měkkou hnilobu), pokud není přítomna látka, aby redukovala patogenicitu P. aeruginosa. Přítomnost takových živých semenáčků a snimi spojených příznaků choroby je lehce detekovatelná pomocí různých metod, včetně vizuálního testu.

Testovaná látka nebo extrakt je v příslušné dávce inokulován do tkáňového kulivačního média (např. ztuhlého agarového média), aby se hodnotila schopnost testované látky podpořit hostitelovu (např. Arabidopsis thaliana) rezistenci kpatogenu nebo omezovat patogenicitu patogenu. Navíc je-li to vyžadováno, může být hostitelská rostlina předléčena kandidátskou protektivní látkou rostliny nebo anti-patogenní látkou jakýmkoliv konvenčním způsobem, např. semenáčky nebo rostlinky mohou bý postříkány roztokem obsahujícím testovanou látku. Hostitelské rostliny jsou testovány pomocí jakýchkoliv standardních testovacích systémů paogeneze, např. výše popsaná infiltrační listová zkouška nebo standardní infiltrační vakuovou technikou. Např. hostitelské semenáčky jsou paogenem infdtrovány ve vakuu za standardních podmínek. Po infiltraci ve vakuu se semenáčky kultivují podle metod známých odborníkům v oboru (např. metody pro kultivaci Arabidopsis se nacházejí v Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C., Chua, N.-H., Schell, J., eds. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., Singapore, 1992). Je-li to vyžadováno, mohou být inokulovány různé koncentrace testované látky nebo extraktu, aby se zjistil vliv dávky na hostitele a na patogen. Kontrolní semenáčky se infiltrují nepatogenní bakterií (negativní konrola) nebo patogenem v nepřítomnosti testované látky nebo extraku (pozitivní kontrola). Ve vhodných časových intervalech, např. 3 až 5 dní, se semenáčky kontrolují na příznaky choroby. Porovnávací studie mezi léčenými a kontrolními semenáčky se používají ke zjištění relativní účinnosti testované molekuly nebo látky v podpoře hostitelovi rezistence k patogenu nebo v inhibici virulence patogenu. Testovaná látka, která účinně stimuluje, stupňuje, zesiluje, zvyšuje nebo podporuje rezistenci hostitele k patogenu nebo která inhibuje, inaktivuje, suprimuje, zabraňuje nebo kontroluje patogenicitu patogenu a neovlivňuje negativně normální fyziologii, reprodukci nebo vývoj červů je považována za užitečnou ve vynálezu.

Použití

Metody vynálezu poskytují jednoduché způsoby k identifikaci mikrobiálních virulenčních faktorů a látek schopných buď inhibovat patogeniciu nebo zesilovat rezistenční schopnost organismu vůči patogenu. Stejně tak chemické entity, u nichž je s pomocí zde popsaných metod objeveno, že mají medicínskou nebo zemědělskou hodnotu užitečnou jako léčiva, protektivní rostlinné látky nebo jako informace pro strukturní modifikace existujících anti-patogenní ch látek, např. racionálním designem léčiv. Takové metody jsou užitečné pro testování látek • · · ·

• · · · · «· · • · · · · · · • · · · · * · · • · · · · · · ·· · · · ·· · · majících vliv na různé patogeny včetně bakterií, virů, hub, kroužkovců, červů, hlístů a prvoků, ale neomezují se jen na ně. Příklady patogenních bakterií obsahují, bez omezení, Aerobacter, Aeromonas, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Bacteroides, Bartonella, Bortella, Brucella, Calymmatobacterium, Campylobacter, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Hafnia, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Listeria, Morganela, Moraxella, Próteus, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Xanthomonas, Vibrio a Yersinia.

Pro terapeutické účely mohou být složky nebo agens idenifikované s pomocí zde objevených metod podávány systemicky, např. formulované ve farmaceuticky-přijatelných pufrech jako je fyziologický roztok. Preferované způsoby podání zahrnují například subkutánní, intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární nebo intradermální injekce, které poskytují kontinuální, trvalé hladiny léčiva v pacientovi. Léčba lidských pacientů nebo jiných zvířat bude prováděna s pomocí terapeuticky účinných množství anti-patogenní látky ve fyziologicky-přijatelném nosiči. Vhodné nosiče ajejich formulace jsou popsány například v Remingtonů Pharmaceutical Sciences od E.W. Martina. Množství anti-patogenní látky, které má být podáno, seliší v závislosti na způsobu podání, věku a váze pacienta, na typu choroby a rozsahu choroby. Obecně bude množství v rozmezí dávek používaných pro další agens užívané pro léčbu jiných mikrobiálních chorob, ačkoliv v určitých případech budou potřeba nižší množství z důvodu zvýšené specificity látky. Látka je podána v dávce, která inhibuje mikrobiální proliferaci. Například pro systemické podání je látka typicky podávána v rozmezí 0,1 ng - 10 g/kg tělesné váhy.

Složky a agens identifikované s využitím metod zde uveřejněných mohou být pro zemědělské použití využity jako chemikálie aplikované jako spreje nebo poprašky na listy rostlin. Typicky jsou aková agens dodávána na povrch rostlin před patogenem, aby se zabránilo infekci. Semena, cibule, kořeny, nádory a hlízy jsou také ošetřovány, aby se zabránilo patogennímu útoku po zasazení tím, že je na ně nanesený patogen nebo patogen existující v půdě v místě vysazení udržen pod kontrolou. Půda, která má být zasazena se zeleninou, okrasnými rostlinami, keři nebo stromy může být také ošetřena chemickým zaplynováním, aby se různí mikrobiální patogeni udrželi pod kontrolou. Ošetření se přednostně provádí několik dní nebo týdnů před vysazením. Chemikálie mohou bý aplikovány buď mechanizovaným způsobem, např. traktorem nebo ruční aplikací. Navíc mohou být chemikálie identifikované pomocí metod testu využity jako dezinfekční látky.

·· · ·· ·· • ··· · · · · • · · · · · · ·· ······ • · · · · · · ·· ··· ·· · ·

Všechny publikace a patenty zmiňované v této specifikaci jsou zde připojeny referencí ve stejném rozsahu, jako by každá individuální publikace nebo patent byly specificky a individuálně indikovány, že jsou připojeny referencí.

Z předchozího popisu si může odborník v oboru snadno zjistit podstatné charakteristiky tohoto vynálezu, mohou vytviřit různé změny a modifikace vynálezu, aby se přizpůsobil rozličným využitím a podmínkám. Proto do patentovaných nároků patří i jiná provedení.

Depozitum

Pseudomonas aeruginosa kmen UCBPP-PA14 byl uložen s American Type Culture Collection 22. března 1995 a nese přístupové číslo ATCC No. 55664. Žadatelé berou na vědomí svou odpovědnost nahradit tento kmen, pokud by měl ztratit životnost před koncem termínu zde vydávaného patentu, a svou odpovědnost za oznámení American Type Culture Collection vydání takového patentu, přičemž v té chvíli bude depozitum k dispozici veřejnosti. Do té doby bude depozitum dáno k dispozici členovi patentové komise za podmínek podle CFR § 1.14 a 35 USC §112.

1) Informace o sekvenci s identifikačním číslem 1:

i) Charakteristiky sekvence:

A) délka: 17 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) vláknovitost: jednoduchá

D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomová) iii) Popis sekvence: sekvence idenifikační číslo 1:

GCTAGTAGTC GATGACC

2) Informace o sekvenci s identifikačním číslem 2:

i) Charakteristiky sekvence:

A) délka: 17 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) vláknovitost: jednoduchá

D) topologie: lineární

··*· ·· · ·· ·· · · ii) Typ molekuly: DNA (genomová) iii) Popis sekvence: sekvence identifikační číslo 2: GCTGGCATCA ACCATGC

Claims (23)

1. Způsob k identifikaci látky, která je schopná inhibovat patogen v eukaryotickém organismu, vyznačující se tím, že

a) přinejmenším dva různé eukaryotické organismy, přičemž alespoň jeden z uvedených organismů je červ, jsou vystaveny patogenů v přítomnosti přinejmenším jedné kandidátské látky, přičemž vystavení uvedeného červa zmiňovanému patogenů zahrnuje podmínky rychlého zabíjení; a

b) identifikuje látku, která inhibuje zmiňovaný patogen v každém z uvedených eukaryotických organismů.

2. Způsob podle nároku 1, kde zmiňovaný organismus zahrnuje buď

a) červa a rostlinu,

b) červa a obratlovce,

c) červa a bezobratlého, nebo

d) červa a hmyz.

3. Způsob k identifikaci látky, která je schopna inhibovat patogen v eukaryotickém organismu, vyznačující se tím, že

a) červ je vystaven patogenů v přítomnosti alespoň jedné kandidátské látky, kde uvedené vystavení uvedeného červa zmiňovanému patogenů a zmiňované kandidáské látce zahrnuje podmínky rychlého zabíjení; a

b) identifikuje látku, která inhibuje uvedený patogen, kde zmiňovaná identifikace uvedené látky je brána za důkaz toho, že uvedená látka je schopna inhibovat patogen v eukaryotickém organismu.

4. Způsob podle nároků 1 nebo 3, vyznačující se tím, že uvedený patogen je bakterie.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedená bakterie je Pseudomonas aeruginosa

UCBPP-PA14.

···· · · · · · · · · ·

6. Způsob podle nároků 1 nebo 3, vyznačující se tím, že uvedený červ je Caenorhabditis elegans.

7. Způsob podle nároků 1 nebo 3, vyznačující se tím, že druhý uvedený eukaryotický organismus je rostlina nebo savec.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedená rostlina je Arabidopsis.

9. Způsob pro identifikaci patogenního virulenčního faktoru, vyznačující se tím, že

a) identifikuje patogen, který je schopen infikovat alespoň dva různé eukaryotické organismy, kde přinejmenším jeden z uvedených organismů je červ;

b) vytváří mutantu uvedeného patogenů;

c) vystavuje uvedený eukaryotický organismus a uvedeného červa zmiňovanému mutovanému patogenů, kde uvedený červ je vystaven uvedenému patogenů za podmínek rychlého zabíjení;

d) zjišťuje, jestli uvedený mutovaný patogen je schopen vyvolat chorobu v každém z uvedených organismů, přičemž redukce choroby u obou uvedených organismů v porovnání s chorobou vyvolanou divokým typem patogenů ukazuje na mutaci ve zmiňovaném virulenčním faktoru; a

e) využívá uvedenou mutaci jako markér pro identifikaci zmiňovaného virulenčního faktoru.

10. Způsob podle nároků 1, 3 nebo 9, vyznačující se tím, že podmínky rychlého zabíjení zahrnují použití červa majícího mutaci v P-glykoproeinu.

11. Způsob k identifikaci patogenního virulenčního faktoru, vyznačující se tím, že

a) vybírá patogen, který je schopen infikovat hmyz;

b) vytváří mutantu uvedeného patogenů;

c) vystavuje uvedený hmyz zmiňovanému mutovanému patogenů; a • ·» · ·· ··· ·· ·»

d) zjišťuje, jestli jestli uvedený mutovaný patogen je schopen vyvolat chorobu v uvedeném hmyzu, přičemž redukce choroby v porovnání s chorobou vyvolanou divokým typem patogenů ukazuje na mutaci ve zmiňovaném virulenčním faktoru.

12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že identifikace uvedené mutace je využívána jako markér pro identifikaci uvedeného patogenního virulenčního faktoru.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedený hmyz je mol nebo muška.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedený mol je Galleria mellonella nebo

Plutella xylostella, nebo uvedená muška je Drosophila melanogaster.

15. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený patogen je bakterie nebo houba.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená bakterie patří do rodu

Pseudomonas, nebo uvedená houba patří do rodu Fusarium.

17. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že krok d) dále obsahuje výpočet LD₅o patogenů.

18. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že dále obsahuje testování uvedeného mutovaného patogenů v myším testu mortality.

19. Způsob k identifikaci látky, která je schopna inhibovat patogen v eukaryotickém organismu, vyznačující se tím, že

a) vystavuje hmyz patogenů v přítomnosti alespoň jedné kandidátské látky; a

b) identifikuje látku, která inhibuje uvedený patogen, přičemž zmiňovaná identifikace uvedené látky se bere za důkaz toho, že uvedená látka je schopna inhibovat patogen v eukaryotickém organismu.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený hmyz je mol nebo muška.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že uvedený mol je Galleria mellonella nebo

Plutella xylostella, nebo uvedená muška je Drosophila melanogaster.

22. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený patogen je bakterie nebo houba.

····· · · · ·· · · • · · ···· ·♦♦· • · · · · · · · · • · ··» ······ ·· · · · ···· ···· ·· · · · · · ··

23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že uvedená bakterie patří do rodu Pseudomonas, nebo uvedená houba patří do rodu Fusarium.