CZ33918U1

CZ33918U1 - Test kit to determine the antimicrobial biological activity of phage preparations on Staphylococcus aureus

Info

Publication number: CZ33918U1
Application number: CZ2020-37223U
Authority: CZ
Inventors: Marek MOŠA; Martin Benešík
Original assignee: MB PHARMA s.r.o.
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2020-02-06
Publication date: 2020-04-14

Description

Testovací sada ke stanovení antimikrobiální biologické účinnosti fágových přípravků na bakterii Staphylococcus aureusTest kit for determining the antimicrobial biological activity of phage preparations against Staphylococcus aureus

Oblast technikyField of technology

Technické řešení se týká testovací sady obsahující fágový lyzát působící na bakterie Staphylococcus aureus. Sada je vhodná pro testování antimikrobiální biologické účinnosti fágového lyzátu na patogenní bakterie S. aureus přímo u uživatele.The technical solution relates to a test kit containing a phage lysate acting on Staphylococcus aureus bacteria. The kit is suitable for testing the antimicrobial biological activity of a phage lysate against pathogenic S. aureus bacteria directly at the user.

Dosavadní stav technikyPrior art

Bakterie rodu Staphylococcus jsou častým původcem onemocnění lidí i zvířat. V posledních letech jsou velkým problémem v humánní medicíně i veterinárním prostředí. Podle světové zdravotnické organizace (WHO) v souvislosti s bakteriemi rezistentními k antibiotikům zemře ročně v zemích EU 33 000 lidí. Podle současných odhadů WHO bude v roce 2050 počet úmrtí kvůli infekcím způsobených bakteriemi rezistentními k antibiotikům vyšší než počet úmrtí způsobených rakovinným onemocněním. V rámci řešení antibiotické krize je nutné přijít s novými antimikrobiálními látkami, ale také se zcela jiným přístupem k léčbě a diagnostice bakteriálních původců onemocnění (Duval et al., 2019).Staphylococcus bacteria are a common cause of disease in humans and animals. In recent years, they have been a major problem in human medicine and the veterinary environment. According to the World Health Organization (WHO), 33,000 people die each year in EU countries from antibiotic-resistant bacteria. According to current WHO estimates, in 2050 the number of deaths due to infections caused by antibiotic-resistant bacteria will be higher than the number of deaths caused by cancer. As part of the solution to the antibiotic crisis, it is necessary to come up with new antimicrobial substances, but also with a completely different approach to the treatment and diagnosis of bacterial pathogens (Duval et al., 2019).

Kromě jiných možných antimikrobiálních látek jsou jednou z možností bakteriofágy a jejich použití proti bakteriím. Takzvaná fágová terapie není ničím novým a v současnosti se dostává stále více do středu zájmu lékařů a vědeckých týmů, právě v souvislosti s rezistencí bakterií k antibiotikům (Lín et al., 2017). Princip fágové terapie byl popsán již velmi dávno, ale až s rozvojem moderních mikrobiologických a molekulárně biologických metod, popisujících jak fágy, tak patogenní bakterie, může být bezpečně a rychle zavedena do praxe. Ovšem přístup k léčbě bakteriálních infekcí pomocí fágů se diametrálně liší od antibiotik. Zatímco antibiotika bývají často širokospektrální a působí napříč bakteriálními rody a druhy, fágy jsou často velmi specifické a působí na konkrétní bakteriální rod, druh, případně pouze specifické bakteriální kmeny. Zatímco antibiotika lze aplikovat bez detailní znalosti bakteriálního původce onemocnění, u léčby fágy je nutná diagnostika bakterií. Detailní diagnostika se u antibiotické léčby praktikuje, až když nezaberou širokospektrá antibiotika a je třeba zjistit, zdaje k některému antibiotiku bakterie senzitivní. U fágů a mixu fágů je důležitá taková diagnostika hned před začátkem léčby. Jelikož se tiší mechanismus působení fágů a antibiotik, je nutné modifikovat rychlé diagnostické metody dle potřeb fágové terapie.Among other possible antimicrobials, one of the possibilities is bacteriophages and their use against bacteria. The so-called phage therapy is nothing new and is currently becoming more and more the focus of physicians and scientific teams, precisely in connection with the resistance of bacteria to antibiotics (Lín et al., 2017). The principle of phage therapy has been described for a long time, but only with the development of modern microbiological and molecular biological methods, describing both phages and pathogenic bacteria, can it be safely and quickly put into practice. However, the approach to treating bacterial infections with phages is diametrically opposed to antibiotics. While antibiotics are often broad-spectrum and act across bacterial genera and species, phages are often very specific and act on a particular bacterial genus, species, or only specific bacterial strains. While antibiotics can be administered without detailed knowledge of the bacterial agent of the disease, phage diagnosis is necessary in the treatment of phage. Detailed diagnostics is practiced in antibiotic treatment only when broad-spectrum antibiotics do not work and it is necessary to find out whether the bacteria are sensitive to any antibiotic. For phages and phage mixes, such diagnosis is important prior to treatment. As the mechanism of action of phages and antibiotics is silenced, it is necessary to modify rapid diagnostic methods according to the needs of phage therapy.

Existuje několik lékopisných metod pro testování účinnosti antimikrobiálních látek, které jsou již rutinou v mikrobiologických laboratořích. Jedná se o difúzní metodu, kdy se antibiotikum z disku uvolňuje do okolí a eliminuje růst bakterie v přítomnosti antibiotika. Účinnost se pak sleduje dle velikosti inhibiční zóny kolem disku. V případě rezistence bakterie k antibiotiku rezistentní zóna nevzniká. Tato metoda však není dobře aplikovatelná na bakteriofágy, jelikož jsou mnohem větší než antibiotika, proto nedifundují do prostředí tak rychle.There are several pharmacopoeial methods for testing the efficacy of antimicrobials that are already routine in microbiological laboratories. It is a diffusion method in which an antibiotic is released from the disc into the environment and eliminates the growth of bacteria in the presence of the antibiotic. Efficacy is then monitored according to the size of the inhibition zone around the disc. In the case of antibiotic resistance, an antibiotic resistance zone does not arise. However, this method is not well applicable to bacteriophages, as they are much larger than antibiotics, so they do not diffuse into the environment as quickly.

Další metodou je minimální inhibiční koncentrace (MIC), kdy se stanovuje koncentrace antibiotika, která inhibuje viditelný bakteriální růst (Andrews, 2002). Posuzuje se pouhou vizuální kontrolou a není potřebný spektrofotometr. Zde se určuje minimální koncentrace antibiotika, které inhibuje růst bakterie. Koncentrace (CFU) bakterie musí být pro test jasně definovaný. Na obdobné bázi se určuje minimální baktericidní koncentrace (MBC), což je koncentrace, která zabrání růstu bakterií v médiu. Pro tyto metody jsou definované postupy Státním zdravotním ústavem, které využívají diagnostická pracoviště v nemocnicích a jiných institucích. Pro stanovení antimikrobiální biologické účinnosti fágových lyzátů však žádné oficiálně schválené metody neexistují a výsledky testování v jednotlivých laboratořích se tak mohou značně tišit. Metodou pro fágy, která se snad blíží určení antimikrobiálního účinkuAnother method is the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), which determines the concentration of antibiotic that inhibits visible bacterial growth (Andrews, 2002). It is assessed by visual inspection alone and no spectrophotometer is required. Here, the minimum concentration of antibiotic that inhibits bacterial growth is determined. The concentration (CFU) of the bacterium must be clearly defined for the test. On a similar basis, the minimum bactericidal concentration (MBC) is determined, which is the concentration that prevents the growth of bacteria in the medium. Procedures for these methods are defined by the State Institute of Public Health, which uses diagnostic workplaces in hospitals and other institutions. However, there are no officially approved methods for determining the antimicrobial biological activity of phage lysates, and the results of testing in individual laboratories can thus vary considerably. A method for phages that may be close to determining the antimicrobial effect

- 1 CZ 33918 U1 antibiotik, je tzv. Appelmanův test používaný od roku 1921 (Merabishvili et al., 2014), který se ovšem liší od stanovení MIC, tedy výsledky obou testů nelze k sobě vztáhnout. Navíc testování biologické účinnosti fágů je většinou záležitostí několika specializovaných pracovišť, která s fágy pracují. Od izolace patogenní bakterie, transportu do specializovaného zařízení a celá zpětná vazba zpět k pacientovi tak zabere velmi dlouhý časový úsek, než kdyby byla biologická aktivita testována přímo v zařízení, kde se nachází pacient.- 1 CZ 33918 U1 antibiotic, is the so-called Appelman's test used since 1921 (Merabishvili et al., 2014), which, however, differs from the determination of MIC, so the results of both tests can not be related. In addition, testing the biological efficacy of phages is usually a matter for several specialized workplaces that work with phages. From the isolation of the pathogenic bacterium, transport to a specialized facility and all the feedback back to the patient, it takes a very long period of time than if the biological activity were tested directly in the facility where the patient is located.

Existuje několik metod, jak stanovit účinnost bakteriofágů na konkrétní danou bakterii. Jde o plakovou plotnovou metodu, kdy se jednotlivá ředění fága vykapávají na rostoucí bakteriální kulturu ve dvouvrstvém agaru a tím se stanovuje koncentrace bakteriofágů, tzv. plaque forming unit (PFU) (Anderson et al., 2011). Fágy se mohou na kulturu v příslušném ředění vykapat, nebo jsou přidány přímo do agaru k bakteriální kultuře. Na základě počtu plak a příslušného ředění se tak počítá koncentrace životaschopných fágů, obsažených v 1 ml lyzátu. Někdy se mohou počty lišit na základě použitého růstového média, titrační bakterie atd. Tato metoda poskytne výsledek, který určí počet životaschopných fágů, ale podává jen částečnou informaci o míře antimikrobiální biologické účinnosti fága na bakterii. Pouze ze srovnání nakapání fága na více kmenů lze usoudit, jak je fág účinný. Tato metoda je však náročná na materiál, zahrnuje více kroků, v kterých lze udělat chybu, a je nutné ji na každém pracovišti optimalizovat. Ke stanovení počtu bakterií se dají použít i jiné metody jako qPCR atd., ovšem ty nepodávají informaci o tom, kolik fágů je schopných pomnožit se na hostitelské bakterii (Anderson et al., 2011).There are several methods for determining the effectiveness of bacteriophages on a particular bacterium. It is a plaque plate method in which individual dilutions of phage are dripped onto a growing bacterial culture in bilayer agar and thus the concentration of bacteriophages, the so-called plaque forming unit (PFU), is determined (Anderson et al., 2011). Phages can be dripped onto the culture at the appropriate dilution or added directly to the bacterial culture agar. Based on the number of plaques and the respective dilution, the concentration of viable phages contained in 1 ml of lysate is calculated. Sometimes the numbers may vary based on the growth medium used, titration bacteria, etc. This method will give a result that determines the number of viable phages, but provides only partial information on the degree of antimicrobial biological activity of the phage on the bacterium. Only by comparing phage dripping to multiple strains can it be judged how effective the phage is. However, this method is materially intensive, involves multiple steps in which an error can be made, and must be optimized in each workplace. Other methods such as qPCR, etc. can be used to determine the number of bacteria, but these do not provide information on how many phages are able to multiply on the host bacterium (Anderson et al., 2011).

Firmy, laboratoře a sbírky mikroorganismů často vlastní velmi specifické fágy a jejich proškolený personál zná metodiky k určení citlivosti bakterií. V takovém případě pacient či zdravotnické zařízení musí odebrat patogenní, často rezistentní bakterii a zaslat ji na testování. Jelikož nemusí fungovat specifické fágy uložené u jednoho zdroje, bakterii je vhodné rozeslat na testování na více míst. To neumožňuje rychlou a efektivní diagnostiku citlivosti bakterie k fágům. Vzhledem k velké dynamice vzniku rezistence bakterií k antibiotikům je nutná rychlá metodika na určení citlivosti bakterií k jiným antimikrobiálním látkám, kterými mohou být také bakteriofágy. Taková metodika prozatím v diagnostických laboratořích chybí a nikde nejsou dostupné fágy k testování s metodou, která by se dala rutinně využít právě v diagnostických laboratořích, nebo přímo tam kde byly patogenní bakterie izolovány. To může být řešeno dobrým proškolením personálu nebo vhodnou testovací sadou, která půjde použít kdekoliv.Firms, laboratories, and collections of microorganisms often own very specific phages, and their trained staff knows methodologies to determine the susceptibility of bacteria. In this case, the patient or medical facility must remove the pathogenic, often resistant bacterium and send it for testing. Since specific phages stored at a single source may not work, it is advisable to distribute the bacteria for testing at multiple sites. This does not allow rapid and effective diagnosis of bacterial susceptibility to phages. Due to the high dynamics of the development of bacterial resistance to antibiotics, a rapid methodology is needed to determine the susceptibility of bacteria to other antimicrobial substances, which may also be bacteriophages. Such a methodology is currently lacking in diagnostic laboratories, and no phages are available for testing with a method that could be routinely used in diagnostic laboratories or directly where pathogenic bacteria have been isolated. This can be solved by good staff training or a suitable test kit that can be used anywhere.

Podstata technického řešeníThe essence of the technical solution

Výše zmíněné nedostatky eliminuje test na určení biologické účinnosti fágů působících proti bakterii S. aureus. Bakteriofágy jsou obsažené ve stripech mikrozkumavek v různých ředěních. Do těchto koncentračních řad jsou přidány bakterie o přesně dané koncentraci, podobným postupem, jenž je popsán pro aplikaci při stanovení MIC, které jsou pro diagnostické laboratoře rutinní. Stripy jsou pak kultivovány při teplotě 37 °C po dobu nejméně 15 hodin a poté jsou vyhodnoceny výsledky právě podobně jako u stanovení MIC. Pokud je bakterie k fágu senzitivní, nedochází k zakalení vzorku u ředění až -4. Pokud je bakterie k fágu rezistentní, zůstanou všechny nebo většina jamek zakalených. U neředěného vzorku často nedochází k zákalu, to je působeno tím, že fág ve velké koncentraci (v řádu 10⁹) inhibuje růst, i když není schopen se na bakterii pomnožit. Až když je čirý vzorek při koncentraci v řádu 10⁷ (ředění na -3), lze s určitostí prohlásit, že bakterie jek fágu senzitivní. Výsledky této metody pak mohou být porovnány s působením antibiotik, jelikož byly stanoveny podobnou metodikou a mohou být k sobě vzájemně vztaženy.The above-mentioned drawbacks are eliminated by the test for determining the biological activity of phages against S. aureus. Bacteriophages are contained in strips of microtubes in various dilutions. Bacteria of the exact concentration are added to these concentration ranges, similar to the procedure described for application in MIC determinations, which are routine for diagnostic laboratories. The strips are then cultured at 37 ° C for at least 15 hours and then the results are evaluated just as in the MIC assay. If the bacterium is phage sensitive, the sample will not become cloudy at dilutions up to -4. If the bacteria are resistant to phage, all or most of the wells will remain cloudy. For an undiluted sample often no haze, that is caused by the phage at a high concentration (of the order of 10 ⁹⁾ inhibits growth, although not able to propagate bacteria. Only when the clear sample is at a concentration in the order of 10 ⁷ (dilution to -3) can it be stated with certainty that the bacterium is phage sensitive. The results of this method can then be compared with the action of antibiotics, as they were determined by a similar methodology and can be related to each other.

Sada jako taková obsahuje strip mikrozkumavek s jedním fágem, kde je v každé zkumavce stripu fág o jiné koncentraci. Koncentrace první zkumavky je v řádu 10⁹ a koncentrace vedlejší zkumavky se snižuje 10x (Obrázek 1 a 2). Testovací sada bude obsahovat také zkumavku s lyofilizovanou bakterií, která bude senzitivní k fágu/fágům obsaženým v testovací sadě. Tato bakterie bude připravena stejným způsobem jako klinický testovaný izolát. StripyAs such, the kit contains a strip of single-phage microtubes, where each tube of the strip contains phage of a different concentration. The concentration of the first tube is in the order of ¹⁰⁹ and the concentration of the secondary tube decreases 10x (Figures 1 and 2). The test kit will also contain a tube of lyophilized bacteria that will be sensitive to the phage (s) contained in the test kit. This bacterium will be prepared in the same way as the clinically tested isolate. Stripy

-2 CZ 33918 U1 mikrozkumavek s tekutými fágovými lyzáty je nutné skladovat v teplotě od 0 °C do 10 °C. Při nevhodném skladování může být ovlivněna aktivita, z důvodu degradace fágů. Z každé vyrobené šarže testovacích stripů si výrobce u sebe ponechá 10 % ve vhodných skladovacích podmínkách pro případ ověření aktivity dané šarže u sporných případů.-2 CZ 33918 U1 microtubes with liquid phage lysates must be stored at a temperature of 0 ° C to 10 ° C. Improper storage may affect activity due to phage degradation. The manufacturer shall keep 10% of each batch of test strips produced in suitable storage conditions in order to verify the activity of that batch in disputes.

Základem pro přípravu testovací sady je fágový lyzát působící proti bakteriím .S', aureus, a to konkrétně fág MB 403 (Tabulka 1) o koncentraci (titru) IxlO⁹ až IxlO¹⁰. Lyzát je rozředěn následovně v desítkovém ředění a rozdělen v daném množství do mikrozkumavek ve stripu.The basis for the preparation of test kits phage lysate is acting against bacteria .S 'aureus, namely phage 403 MB (Table 1) with the concentration (titer) IxlO ⁹ to IxlO ^10th The lysate is diluted as follows in decimal dilution and divided in the given amount into microtubes in a strip.

Tabulka 1: Bakteriofág použitý v testovací sadě na stanovení biologické účinnosti fágových lyzátůTable 1: Bacteriophage used in the test kit to determine the biological activity of phage lysates

/. . „ % citlivých kmenů ve ../. . "% Of susceptible strains in ..

Baktenofág Čeleď sbírce MBP Velikost genomuBactenophagus Family MBP Collection Genome size

MB 403 Mytmridae 73% 151 kbMB 403 Mytmridae 73% 151 kb

Příprava zásobních lyzátů na přípravu stripu:Preparation of stock lysates for strip preparation:

1. Do sterilní 50 ml zkumavky číslo 1 odměříme 50 ml fágového lyzátů o minimální koncentraci IxlO⁹ až IxlO¹⁰.1. Dispense 50 ml of phage lysates with a minimum concentration of Ix10 ⁹ to Ix10 ¹⁰ into a sterile 50 ml tube number 1.

2. Do dalších 8 zkumavek (číslo 2 až 8) sterilně odměříme 45 ml tekutého sterilního SA média (Trypton 5g/l, Yeast extract 2 g/1, NaCl 5g/l).2. Sterile dispense 45 ml of liquid sterile SA medium (Trypton 5g / l, Yeast extract 2 g / l, NaCl 5g / l) into another 8 tubes (numbers 2 to 8).

3. Ze zkumavky číslo 1 sterilně přeneseme do zkumavky číslo 2 přesný objem 5 ml lyzátů a zkumavku číslo 2 důkladně promícháme (Obrázek 1).3. Sterile transfer an exact volume of 5 ml of lysates from tube number 1 to tube number 2 and mix tube number 2 thoroughly (Figure 1).

4. Ze zkumavky číslo 2 přeneseme sterilně do zkumavky číslo 3 přesný objem 5 ml lyzátů a zkumavku číslo 3 důkladně promícháme. Postupujeme stejným způsobem až po zkumavku číslo 8. Ve zkumavkách 1 až 7 je ve výsledku 45 ml lyzátů ave zkumavce číslo 8 je 50 ml nejředěnějšího lyzátů.4. Sterile transfer the exact volume of 5 ml of lysates from tube number 2 to tube number 3 and mix tube 3 thoroughly. Proceed in the same way up to tube number 8. In tubes 1 to 7 there is a result of 45 ml of lysates and in tube number 8 there is 50 ml of the most diluted lysate.

Příprava Stripu ze zásobních lyzátů:Strip preparation from stock lysates:

Jeden strip mikrozkumavek obsahuje vždy jeden kmen fága v ředěních lišících se o jeden řád v řádech od 10⁹ až 10^{1 2 * * * * *} jdoucí za sebou vedle sebe sestupně od nejvyššího po nejnižší ředění (od zkumavky č. 1 ve stripu po zkumavku č. 8).One strip of microtubes always contains one phage strain in dilutions differing by one order of magnitude in the order from 10 ⁹ to 10 ^{1 2 * * * * *} consecutive descending from the highest to the lowest dilution (from tube No. 1 in the strip to the tube No. 8).

1. Z 50 ml zkumavky obsahující fágy o koncentraci IxlO⁹ přeneseme 100 lyzátů do mikrozkumavky 1 na stripu. Dalších 100 μΐ lyzátů nižšího ředění desítkové řady (IxlO⁸) přeneseme do následující mikrozkumavky.1. From a 50 ml tube containing phages with a concentration of Ix10 ^9, transfer 100 lysates to microtube 1 on the strip. Transfer another 100 μΐ of lower dilution decimal lysates (Ix10 ⁸ ) to the following microtube.

2. Obdobně postupujeme až zaplníme všechny mikrozkumavky ve stripu (Obrázek 2).2. Proceed in a similar way until we have filled all the microtubes in the strip (Figure 2).

Dva druhy bakterie (citlivá 1137 a méně citlivá-rezistentní SA A 4609 FNO) .8' aureus byly zaočkovány do 10 ml média, a to bylo kultivováno při 37 °C po dobu 18 až 24 hodin. Z takto narostlé kultury bylo připraveno inokulum pro testování biologické účinnosti fágů. Noční kultura se naředí na hodnotu zákalu 1 McFarland a 2 ml tohoto ředění se doplní do 20 ml médiem/fyziologickým roztokem. Tato suspenze se naleje na sterilní Petriho misku. Do suspenze se namočí sterilní špičky na multikanálové pipetě a po smočení se přenesou a omočí v mikrozkumavkách strip. Ten se nechá kultivovat při 37 °C po dobu 12 až 18 hodin. Na základě zákalu v jednotlivých zkumavkách se poté vyhodnocuje výsledek (Tabulka 2). Z výsledků jeTwo species of bacteria (susceptible 1137 and less susceptible-resistant SA A 4609 FNO) .8 'aureus were inoculated into 10 ml of medium, and this was cultured at 37 ° C for 18 to 24 hours. An inoculum was prepared from the thus grown culture to test the biological activity of the phages. The overnight culture is diluted to a turbidity value of 1 McFarland and 2 ml of this dilution is made up to 20 ml with medium / saline. This suspension is poured into a sterile petri dish. Sterile tips on a multichannel pipette are soaked in the suspension and, after soaking, transferred and soaked in strip microtubes. It is allowed to cultivate at 37 ° C for 12 to 18 hours. The result is then evaluated based on the turbidity in the individual tubes (Table 2). From the results is

-3 CZ 33918 U1 vidět patrný rozdíl v citlivosti bakterie 1137 a méně citlivého/rezistentního kmene SA A 4609 FNO.-3 CZ 33918 U1 visible difference in susceptibility of bacterium 1137 and less sensitive / resistant strain SA A 4609 FNO.

Tabulka 2: testování senzitivní a rezistentní bakterie na ředění fága MB 403. Čísla označují ředění, K- je kontrola růstu bakterie a KS je kontrola sterility práce a lyzátu ve stripech. je označena lyže, velmi mírný zákal a zákal.Table 2: Testing of sensitive and resistant bacteria for MB 403 phage dilution. Numbers indicate dilution, K- is control of bacterial growth and KS is control of sterility of work and lysate in strips. is marked ski, very mild turbidity and turbidity.

Testování citlivé bakterie Testing of susceptible bacteria MB403 MB403 K- TO- KS KS -9 -9 -8 -8 ~7 ~ 7 -6 -6 iliii iliii lil lil Ilill Ilill III III ililll ililll liillll liillll Testování mírně rezistentní Testing slightly resistant Dakterie Bacteria MB403 MB403 K- TO- KS KS -9 -9 -8 -8 -7 -7 -6 -6 -5 -5 -4 -4 -3 -3 -2 -2 ililll ililll iiii iiii

Objasnění výkresůExplanation of drawings

Obrázek 1: Příklad ředění fágových lyzátů v 50 ml sterilních zkumavkách se šroubovacím víčkem typu falcon.Figure 1: Example of dilution of phage lysates in 50 ml sterile tubes with a falcon screw cap.

Obrázek 2: Příprava stripu mikrozkumavek, kdy se 100 pl fágového lyzátu přenese ze zásobní zkumavky do mikrozkumavky ve stripu.Figure 2: Preparation of a strip of microtubes, where 100 μl of phage lysate is transferred from the storage tube to the microtube in the strip.

Obrázek 3: Příklady výsledků testu biologické účinnosti fágových lyzátů. V případě nejasnosti (může být rezistentní i senzitivní) je dobré dotestovat nakapáním.Figure 3: Examples of results of the biological activity assay of phage lysates. In case of ambiguity (it can be resistant or sensitive), it is good to test by dripping.

Příklady uskutečnění technického řešeníExamples of technical solution

Příklad 1Example 1

Izolovanou kulturu bakterie .S', aureus zaočkujeme do 10 ml média a necháme růst při 37 °C po dobu 18 až 24 hodin. Z takto narostlé kultury připravíme inokulum pro testování biologické účinnosti fágů. Noční kultura se naředí na hodnotu zákalu 1 McFarland a 2 ml tohoto ředění se doplní do 20 ml médiem/fýziologickým roztokem. Tato suspenze se nalije na sterilní petriho misku. Do suspenze se namočí sterilní špičky na multikanálové pipetě a po smočení se přenesou a omočí v mikrozkumavkách stripu. Strip se nechají kultivovat při 37 °C po dobu 15 až 18 hodin. Na základě zákalu v jednotlivých zkumavkách se poté vyhodnocuje výsledek (Obrázek 3). Pro přesnost výsledků je dobré provádět testování biologické účinnosti ve 3 paralelních experimentech.An isolated culture of S. aureus is inoculated into 10 ml of medium and allowed to grow at 37 ° C for 18 to 24 hours. From such a grown culture, we prepare an inoculum for testing the biological activity of phages. The overnight culture is diluted to a turbidity value of 1 McFarland and 2 ml of this dilution is made up to 20 ml with medium / saline. This suspension is poured into a sterile petri dish. Sterile tips on a multichannel pipette are soaked in the suspension and, after soaking, transferred and soaked in strip microtubes. The strips are cultured at 37 ° C for 15 to 18 hours. The result is then evaluated based on the turbidity in the individual tubes (Figure 3). For the accuracy of the results, it is good to perform biological efficacy testing in 3 parallel experiments.

Příklad 2Example 2

Izolovanou kulturu bakterie .8'. aureus zaočkujeme do 10 ml média a necháme růst při 37 °C po dobu 18 až 24 hodin. Z takto narostlé kultury připravíme inokulum pro testování biologické účinnosti fágů tímto způsobem. Do 5 ml média (nebo fyziologického roztoku) přidáme 5 μΐ noční kultury. Objem 100 μΐ této suspenze se pak přenese do mikrozkumavek stripu obsahujících fágy. Strip se nechá kultivovat při 37 °C po dobu 15 až 18 hodin. Na základě zákalu v jednotlivých zkumavkách se poté vyhodnocuje výsledek (Obrázek 3). Pro přesnost výsledků je dobré provádět testování biologické účinnosti ve 3 paralelních experimentech.An isolated culture of .8 'bacteria. Inoculate the aureus in 10 ml of medium and allow to grow at 37 ° C for 18 to 24 hours. From such a grown culture, we prepare an inoculum for testing the biological activity of phages in this way. Add 5 μΐ of overnight culture to 5 ml of medium (or saline). A volume of 100 μΐ of this suspension is then transferred to phage-containing strip microtubes. The strip is allowed to cultivate at 37 ° C for 15 to 18 hours. The result is then evaluated based on the turbidity in the individual tubes (Figure 3). For the accuracy of the results, it is good to perform biological efficacy testing in 3 parallel experiments.

Příklad 3Example 3

Izolovanou kulturu bakterie .8'. aureus zaočkujeme do 10 ml média a necháme růst při 37 °C do zákalu 0,5 McFarland. Z takto narostlé kultury připravíme inokulum pro testování biologické účinnosti fágů tímto způsobem. Objem 2 ml tohoto ředění se doplní do 20 ml médiem/fyziologickým roztokem. Tato suspenze se nalije na sterilní Petriho misku. Do suspenze se namočí sterilní špičky na multikanálové pipetě a po smočení se přenesou a omočí v mikrozkumavkách stripu. Strip se nechají kultivovat při 37 °C po dobu 15 až 18 hodin. Na základě zákalu v jednotlivých zkumavkách se poté vyhodnocuje výsledek (Obrázek 3). Pro přesnost výsledků je dobré provádět testování biologické účinnosti ve 3 paralelních experimentech.An isolated culture of .8 'bacteria. Inoculate the aureus in 10 ml of medium and allow to grow at 37 ° C to a turbidity of 0.5 McFarland. From such a grown culture, we prepare an inoculum for testing the biological activity of phages in this way. Make a volume of 2 ml of this dilution to 20 ml with medium / saline. This suspension is poured into a sterile petri dish. Sterile tips on a multichannel pipette are soaked in the suspension and, after soaking, transferred and soaked in strip microtubes. The strips are cultured at 37 ° C for 15 to 18 hours. The result is then evaluated based on the turbidity in the individual tubes (Figure 3). For the accuracy of the results, it is good to perform biological efficacy testing in 3 parallel experiments.

SekvenceSequence

Bakteriofág MB 403:Bacteriophage MB 403:

AAATATAATAGGGAAAAAGTTAGTATAAATTTACACCTCCCCACCGTTTAAAATAAA CGATTATACAAATCAAAACTTATAAATTCACTTATCATTTCTTTACTAAACTTATAAA TACTGTTCACCAACTTTAACAACTTATCAAACCTATTAAATATTCATCAAATAAAAA ATTTATGTATCTATTGACTTTTATTCAAAGTTATGATTTGAAATTAAAATCTTATTTCT TCTATTAAATAGTATTTATAAAATTATTTAAACTTTTTAAGAAAAACTGTTGACAAAA CTTTTAAATGTTTGCTATACTATGTATGTAATCAAACAAGGAGGTAACAAAATGGAA AATGAAACAAAAAACATTGAGTTGAAGCATGTTTTTCGTTTTAAGAATGGAAATTTA TGTATAGCGTTATTTGATAGAACAGAAAATGAAATTTCATTTTATGATGTTGACATTG ATGAAATTGAAGATTTAAATCATAATTCTGTTTTACGTGTAATTTCAACTTTATTAGG ATGTGATAATAATGATTAATGTTGATAATGCACCAGAAGAAAAAGGACAAGCCTAC ACTGAAATGTTGCAACTATTCAATAAAATGATTCAATGGAATCCAGCTTATACATTT GACAATGCAATTAACTTAGTAGCAGCTTGCCAACAACTATTATTAAACTATAACAGT TCTGTTGTTCAATTCTTAAAAGATGAACTAAACAATGAAATTAAACCAGAATCAATA TTATCTTACATTGCTGGTGATGACCCAATAGAACAATGGAATATGCACAAAGGATTT TATGAAACGTATAACGTTTACGTTTTTTAGAAAGGAGTGATATAATAATGAAACCTG ATGATATTGTTACATTACGAATTAAAGGTTATATTCTTCACTATTTAGATGATAAAAA TGAATATGTTGAAGAATTTATACCACTTCATGAGTATCATTTATCAAAAACACAAGC AAAAGACTTATTACCTAATTCACACAAACTTTTATCCACTACACGCACAACGAAAAC AATTCAAGTTTATTACAATGATTTAATAAAAATCGCAATTCCAGAAAGCAAATAATT TAAATAAGAGGAGACATAAAAATGACAAACGTAAAAGATATTTTATCAAGACACCA AAACACATTAGCGAGATTCGAATTTGAGGAAAAAGAAAGAGAATTTATCAAACTTT CAGAACTTGTAGAAAAATATGGAATAAAAAAAGAATACATCGTTAGAGCATTATTC ACAAACAAAGAATCAAAATTCGGTGTACAAGGTGTTATCGTCACTGACGACTATAAT GTAAACTTACCGAACCACTTAACAGAGTTAATTAAAAAAATGAGAGCAGATGAGGA CGTTGTTAACATTATCAATGCTGGTGAAGTGCAATTTACAATTTATGAATATGAAAA CAAAAAAGGTCAAAAAGGTTACTCAATCAACTTTGGTCAAGTATCATTTTAATACAA TTTCATAGGGGATATTTATCCCCTATTTTTATGAGGTGCTAAACAATGGAAAAAATAT ACACTGCCGTATTATTATACAATGTATCAATTAATGAAACATATGAACATGAAATTG AACAATTCGAAAAAATAAATAAAGTTAAGGTAATATATAGTTATTTTGACGCAAACT TTTACAAAAAAGGTGCATATAATCTTTGTGTAAAATACATTAAGGAGATATAAAATG AAAATTAAAAAAATTTTTAAATTATTAGATTTACTTTGTTACATTGATGATAATAGAG AAAAATTTAAAGACAAAAAAATACAATTTATTTCTGATAGTGGTTTTAATTTTGTTGG TATTGATTCTGATAATGATATTACTATCAATTTTTCTGAAGCTCATAATAACGATTTA ACAATGAATAATGATTTATTCACTTTAGACGCTGACATTAATATTCATACTCATCGTT TTGATTTTCTTAAAGTTATTTATGGAAAATTTTCAAATAAAAATTATAGAAAAGAAA TATTTACAGGTTGCACTATTGATGATGTATTAAAATATTTCGAGAATCTATTATATGA TGATATTATAATAATTTACCAAAACAAAGTTATATACGATAACGGGAAAGTGATAGA CCATGAATAATATACTGGATATTATTATTGTTTTCCTTTTAGCATTTTTAATTACACTT GTAATACTTATGACAATGCATATACGTGTGTCATTTGGTGTTTTATTTACTACATTGA TTATATTCTACATTATCTTTTTAGTGGTTATATATGGTTTATATGGAGGTCGTTAGCA ATGGTTAGACATACGTCCGAAATGGATAAATGGAAAAAAGAAAGAGACGCAAGAA AAGAGCAGGAAAAAGAATTGTTTTTAAATGATTTTAGTACTGTTAATTTTAAATTTG ATGATAAAGATTTACAAGAGGCGTACATAGACGCATGGAAACATTTCGCACATTTGC CCTATTTTCCAAAAGAAAGACACGTGTCACATGCAAATGCTGTATCATTGGTAAGAGAAATATAATAGGGAAAAAGTTAGTATAAATTTACACCTCCCCACCGTTTAAAATAAA CGATTATACAAATCAAAACTTATAAATTCACTTATCATTTCTTTACTAAACTTATAAA TACTGTTCACCAACTTTAACAACTTATCAAACCTATTAAATATTCATCAAATAAAAA ATTTATGTATCTATTGACTTTTATTCAAAGTTATGATTTGAAATTAAAATCTTATTTCT TCTATTAAATAGTATTTATAAAATTATTTAAACTTTTTAAGAAAAACTGTTGACAAAA CTTTTAAATGTTTGCTATACTATGTATGTAATCAAACAAGGAGGTAACAAAATGGAA AATGAAACAAAAAACATTGAGTTGAAGCATGTTTTTCGTTTTAAGAATGGAAATTTA TGTATAGCGTTATTTGATAGAACAGAAAATGAAATTTCATTTTATGATGTTGACATTG ATGAAATTGAAGATTTAAATCATAATTCTGTTTTACGTGTAATTTCAACTTTATTAGG ATGTGATAATAATGATTAATGTTGATAATGCACCAGAAGAAAAAGGACAAGCCTAC ACTGAAATGTTGCAACTATTCAATAAAATGATTCAATGGAATCCAGCTTATACATTT GACAATGCAATTAACTTAGTAGCAGCTTGCCAACAACTATTATTAAACTATAACAGT TCTGTTGTTCAATTCTTAAAAGATGAACTAAACAATGAAATTAAACCAGAATCAATA TTATCTTACATTGCTGGTGATGACCCAATAGAACAATGGAATATGCACAAAGGATTT TATGAAACGTATAACGTTTACGTTTTTTAGAAAGGAGTGATATAATAATGAAACCTG ATGATATTGTTACATTACGAATTAAAGGTTATATTCTTCACTATTTAGATGATAAAAA TGAATATGTTGAAGAATTTATACCACTTCATGAGTATCATTTATCAAAAACACAAGC AAAAGACT TATTACCTAATTCACACAAACTTTTATCCACTACACGCACAACGAAAAC AATTCAAGTTTATTACAATGATTTAATAAAAATCGCAATTCCAGAAAGCAAATAATT TAAATAAGAGGAGACATAAAAATGACAAACGTAAAAGATATTTTATCAAGACACCA AAACACATTAGCGAGATTCGAATTTGAGGAAAAAGAAAGAGAATTTATCAAACTTT CAGAACTTGTAGAAAAATATGGAATAAAAAAAGAATACATCGTTAGAGCATTATTC ACAAACAAAGAATCAAAATTCGGTGTACAAGGTGTTATCGTCACTGACGACTATAAT GTAAACTTACCGAACCACTTAACAGAGTTAATTAAAAAAATGAGAGCAGATGAGGA CGTTGTTAACATTATCAATGCTGGTGAAGTGCAATTTACAATTTATGAATATGAAAA CAAAAAAGGTCAAAAAGGTTACTCAATCAACTTTGGTCAAGTATCATTTTAATACAA TTTCATAGGGGATATTTATCCCCTATTTTTATGAGGTGCTAAACAATGGAAAAAATAT ACACTGCCGTATTATTATACAATGTATCAATTAATGAAACATATGAACATGAAATTG AACAATTCGAAAAAATAAATAAAGTTAAGGTAATATATAGTTATTTTGACGCAAACT TTTACAAAAAAGGTGCATATAATCTTTGTGTAAAATACATTAAGGAGATATAAAATG AAAATTAAAAAAATTTTTAAATTATTAGATTTACTTTGTTACATTGATGATAATAGAG AAAAATTTAAAGACAAAAAAATACAATTTATTTCTGATAGTGGTTTTAATTTTGTTGG TATTGATTCTGATAATGATATTACTATCAATTTTTCTGAAGCTCATAATAACGATTTA ACAATGAATAATGATTTATTCACTTTAGACGCTGACATTAATATTCATACTCATCGTT TTGATTTTCTTAAAGTTATTT ATGGAAAATTTTCAAATAAAAATTATAGAAAAGAAA TATTTACAGGTTGCACTATTGATGATGTATTAAAATATTTCGAGAATCTATTATATGA TGATATTATAATAATTTACCAAAACAAAGTTATATACGATAACGGGAAAGTGATAGA CCATGAATAATATACTGGATATTATTATTGTTTTCCTTTTAGCATTTTTAATTACACTT GTAATACTTATGACAATGCATATACGTGTGTCATTTGGTGTTTTATTTACTACATTGA TTATATTCTACATTATCTTTTTAGTGGTTATATATGGTTTATATGGAGGTCGTTAGCA ATGGTTAGACATACGTCCGAAATGGATAAATGGAAAAAAGAAAGAGACGCAAGAA AAGAGCAGGAAAAAGAATTGTTTTTAAATGATTTTAGTACTGTTAATTTTAAATTTG ATGATAAAGATTTACAAGAGGCGTACATAGACGCATGGAAACATTTCGCACATTTGC CCTATTTTCCAAAAGAAAGACACGTGTCACATGCAAATGCTGTATCATTGGTAAGAG

-5 CZ 33918 U1-5 CZ 33918 U1

GTAAAAGACATGAACAATTAAACTATATACTTGAAATATATAACCGTAAAGATGAAT CTAATAATAAAAACGCTAAAAAACATAAATATGCTTTATATGAATTACAAGCAAAA AATAATAATTCTTCTATGTATAAATATATAAAGGAAATTGACACTTTATACAAAGAA ATTGGTAAATCAGATAGACCAGTGACTACTATTGATGATGAAGATGTGAGGTATAAC TTTTTATATTATGCAACATTTGAAGACTAATTTTAATACTGTAAACGACATAATAAAC TATTACAAGGAGCAAAAACATGGTGAAACAAAATCGTTTAGACATGGTAAGAGATT ATCAAAATGCGGTCAATCATGTAAGGAAAAAAATACCAGAAAACTATAATCAAATA GAATTAGTTGATGAACTCATGAATGATGATATAGACTATTATATATCTATTTCAAACC GTTCTGACGGAAAATCGTTCAACTATGTTTCATTCTTTATTTATTTAGCTATAAAACT TGATATTAAATTTACTTTATTATCACGTCATTATACATTACGTGACGCTTATCGTGAT TTTATTGAGGAAATCATAGACAAAAACCCACTATTCAAATCTAAGCGTGTCACATTC AGAAGCGCTAGGGACTATTTAGCTATTATTTATCAAGATAAAGAAATCGGTGTGATT ACAGATTTGAATAGCGCTACTGATTTAAAATATCATTCTAACTTTTTAAAACACTACC CTATTATTATATATGATGAATTCTTAGCGCTTGAAGATGACTATTTAATTGATGAGTG GGATAAGTTAAAAACAATTTATGAATCAATCGACCGTAACCATGGTAATGTTGATTA TATTGGTTTTCCTAAAATGTTTTTACTAGGTAATGCTGTCAACTTTTCAAGTCCTATAT TATCCAATTTAAATATTTATAATTTATTACAAAAACATAAAATGAATACATCAAGAC TTTACAAAAACATTTTTTTAGAAATGCGTCGAAACGATTACGTCAATGAAAAGCGTA ATACACGTGCGTTTAATTCAAATGATGACGCTATGACAACTGGCGAGTTTGAATTTA ACGAATATAATTTGGCAGATGATAATTTAAGAAATCATATTAACCAAAACGGTGATT TTTTCTATATTAAAACTGACGATAAATATATAAAAATTATGTATAATGTTGATACATT TAATGCTAACATCATTGTTATACCTTATACAAAACAATATGAGTTTTGTACTAAAATC AAAGATATAGACGACAATGTTATTTATCTAAGAGAAGATATGTTTTATAAAGAAAAC ATGGAACGTTATTATTACAATCCAAGCAATTTACATTTTGACAATGCATATTCGAAA AATTACGTGGTTGATAATGATAGATATTTATATTTAGACATGAATAAAATTATAAAA TTTCATATAAAAAATGAAATGAAGAAAAACATCAACGAATTTGAAAGAAAAGAAAA AATATATGAAGATAACTATATAGAAAATACAAAGAAGTATTTAATGAAACAATACG GTTTATAAAAGGTGTGTAAGATTATGGGATTACTTGAGTGTATGAAATATCATAAAA ATCAAAGCAAAATGATATTGTATTGGGATATTGAAACATTATCATACAATAAAATAA ACGGACGTAATAAACCTACGCTATATAAAAACGTAACGTATTCTGTTGCGATTGGTT GGTTTAATGGTTACGAAATTGATGTTGAAGTATTCCCTAGTTTTGAAGCCTTTTATGA TGATTTTTACAAGTATGTTAACCGTCGTGATACAATCACAAAATCAAAAACAGATAT TATTATGATTGCACATAACTGTAATAAGTACGACAATCATTTTTTACTTAAAGACACT ATGCGTTATTTTGATAATATCACACGTGAAAATATATATTTAAAATCTGCAGAAGAA AATGAACACACACTAAAAATGCAAGAGGCTACTATTTTAGCAAAAAATCAAAATGT GATTTTAGAAAAACGTGTAAAATCCTCTATTAATTTAGATTTAACAATGTTTITAAAC GGATTTAAATTTAATATTATCGATAATTTTATGAAAACCAATACATCAATTGCGACAT TAGGTAAGAAATTACTTGATGGTGGTTATTTAACAGAAAACCAACTTAAAACAGATT TTAATTATACGATTTTTGATAAAGATAATGATATGAATGATAGTGAAGCCTATGACT ATGCTGTAAAGTGTTTCGCTAAACTCACACCTGATCAACTTACATACATTCATAATGA CGTGATTATATTAGGTATGTGTCATATTCATTATAGTGATATATTCCCAAATTTTGAC TATAACAAATTAACATTCTCATTGAATATTATGGAATCTTATTTGAATAATGATATGA CACGTTTTCAGTTACTTAATCAATATCAAGATATTAAAATATCTTATACACATTATCA TTTCCATGATATGAATTTTTATGACTATATTAAATCATTCTATCGTGGTGGTTTAAAT ATGTATAACACCAAATACATCAATAAACTTATTGATGAGCCATGTTTTTCTATAGAC ATCAATTCGAGTTATCCTTATGTGATGTATCATGAGAAAATTCCGACGTGGTTATACT TTTATGAACACTATTCAGAACCAACGTTAATCCCTACTTTTTTAGATGATGACAATTA TTTTTCATTATATAAGATTGATAAAGATGTATTTAACGATGATTTATTAATTAAAATT AAATCACGTGTATTACGTCAAATGATTGTAAAATACTATAATAACGATAATGATTAC GTTAATATCAATACAAATACATTAAGAATGATTCAAGACATTACGGGTATTGATTGC ACACATATACGTGTCAATTCGTTTGTAATATATGAATGTGAATACTTTCATGCACGTG ATATTATTTTTCAAAATTATTTTATTAAAACACAAGGTAAGTTAAAAAATAAAATCA ATATGACATCACCTTACGACTATCATATCACTGATGACATCAACGAACACCCATACT CAAATGAGGAGGTTATGTTGTCAAAAGTGGTACTCAATGGTTTATATGGTATACCTG CTTTACGTTCACATTTTAACTTATTTCGTTTAGATGATAACAATGCACTATACAATATGTAAAAGACATGAACAATTAAACTATATACTTGAAATATATAACCGTAAAGATGAAT CTAATAATAAAAACGCTAAAAAACATAAATATGCTTTATATGAATTACAAGCAAAA AATAATAATTCTTCTATGTATAAATATATAAAGGAAATTGACACTTTATACAAAGAA ATTGGTAAATCAGATAGACCAGTGACTACTATTGATGATGAAGATGTGAGGTATAAC TTTTTATATTATGCAACATTTGAAGACTAATTTTAATACTGTAAACGACATAATAAAC TATTACAAGGAGCAAAAACATGGTGAAACAAAATCGTTTAGACATGGTAAGAGATT ATCAAAATGCGGTCAATCATGTAAGGAAAAAAATACCAGAAAACTATAATCAAATA GAATTAGTTGATGAACTCATGAATGATGATATAGACTATTATATATCTATTTCAAACC GTTCTGACGGAAAATCGTTCAACTATGTTTCATTCTTTATTTATTTAGCTATAAAACT TGATATTAAATTTACTTTATTATCACGTCATTATACATTACGTGACGCTTATCGTGAT TTTATTGAGGAAATCATAGACAAAAACCCACTATTCAAATCTAAGCGTGTCACATTC AGAAGCGCTAGGGACTATTTAGCTATTATTTATCAAGATAAAGAAATCGGTGTGATT ACAGATTTGAATAGCGCTACTGATTTAAAATATCATTCTAACTTTTTAAAACACTACC CTATTATTATATATGATGAATTCTTAGCGCTTGAAGATGACTATTTAATTGATGAGTG GGATAAGTTAAAAACAATTTATGAATCAATCGACCGTAACCATGGTAATGTTGATTA TATTGGTTTTCCTAAAATGTTTTTACTAGGTAATGCTGTCAACTTTTCAAGTCCTATAT TATCCAATTTAAATATTTATAATTTATTACAAAAACATAAAATGAATACATCAAGAC TTTACAAAA ACATTTTTTTAGAAATGCGTCGAAACGATTACGTCAATGAAAAGCGTA ATACACGTGCGTTTAATTCAAATGATGACGCTATGACAACTGGCGAGTTTGAATTTA ACGAATATAATTTGGCAGATGATAATTTAAGAAATCATATTAACCAAAACGGTGATT TTTTCTATATTAAAACTGACGATAAATATATAAAAATTATGTATAATGTTGATACATT TAATGCTAACATCATTGTTATACCTTATACAAAACAATATGAGTTTTGTACTAAAATC AAAGATATAGACGACAATGTTATTTATCTAAGAGAAGATATGTTTTATAAAGAAAAC ATGGAACGTTATTATTACAATCCAAGCAATTTACATTTTGACAATGCATATTCGAAA AATTACGTGGTTGATAATGATAGATATTTATATTTAGACATGAATAAAATTATAAAA TTTCATATAAAAAATGAAATGAAGAAAAACATCAACGAATTTGAAAGAAAAGAAAA AATATATGAAGATAACTATATAGAAAATACAAAGAAGTATTTAATGAAACAATACG GTTTATAAAAGGTGTGTAAGATTATGGGATTACTTGAGTGTATGAAATATCATAAAA ATCAAAGCAAAATGATATTGTATTGGGATATTGAAACATTATCATACAATAAAATAA ACGGACGTAATAAACCTACGCTATATAAAAACGTAACGTATTCTGTTGCGATTGGTT GGTTTAATGGTTACGAAATTGATGTTGAAGTATTCCCTAGTTTTGAAGCCTTTTATGA TGATTTTTACAAGTATGTTAACCGTCGTGATACAATCACAAAATCAAAAACAGATAT TATTATGATTGCACATAACTGTAATAAGTACGACAATCATTTTTTACTTAAAGACACT ATGCGTTATTTTGATAATATCACACGTGAAAATATATATTTAAAATCTGCAGAAGAA AATGAACACACACTAAAAATG CAAGAGGCTACTATTTTAGCAAAAAATCAAAATGT GATTTTAGAAAAACGTGTAAAATCCTCTATTAATTTAGATTTAACAATGTTTITAAAC GGATTTAAATTTAATATTATCGATAATTTTATGAAAACCAATACATCAATTGCGACAT TAGGTAAGAAATTACTTGATGGTGGTTATTTAACAGAAAACCAACTTAAAACAGATT TTAATTATACGATTTTTGATAAAGATAATGATATGAATGATAGTGAAGCCTATGACT ATGCTGTAAAGTGTTTCGCTAAACTCACACCTGATCAACTTACATACATTCATAATGA CGTGATTATATTAGGTATGTGTCATATTCATTATAGTGATATATTCCCAAATTTTGAC TATAACAAATTAACATTCTCATTGAATATTATGGAATCTTATTTGAATAATGATATGA CACGTTTTCAGTTACTTAATCAATATCAAGATATTAAAATATCTTATACACATTATCA TTTCCATGATATGAATTTTTATGACTATATTAAATCATTCTATCGTGGTGGTTTAAAT ATGTATAACACCAAATACATCAATAAACTTATTGATGAGCCATGTTTTTCTATAGAC ATCAATTCGAGTTATCCTTATGTGATGTATCATGAGAAAATTCCGACGTGGTTATACT TTTATGAACACTATTCAGAACCAACGTTAATCCCTACTTTTTTAGATGATGACAATTA TTTTTCATTATATAAGATTGATAAAGATGTATTTAACGATGATTTATTAATTAAAATT AAATCACGTGTATTACGTCAAATGATTGTAAAATACTATAATAACGATAATGATTAC GTTAATATCAATACAAATACATTAAGAATGATTCAAGACATTACGGGTATTGATTGC ACACATATACGTGTCAATTCGTTTGTAATATATGAATGTGAATACTTTCATGCACGTG ATATTATTTTTCAAAATTATTTTAT TAAAACACAAGGTAAGTTAAAAAATAAAATCA ATATGACATCACCTTACGACTATCATATCACTGATGACATCAACGAACACCCATACT CAAATGAGGAGGTTATGTTGTCAAAAGTGGTACTCAATGGTTTATATGGTATACCTGTTACACTTTACACTTTAC

-6 CZ 33918 U1-6 CZ 33918 U1

CATTAACGGTTATAAAAACACTGAACGTAATATTTTATTCTCTACATTTGTTACATCA CGTTCATTGTATAACTTATTGGTACCTTTCCAATACTTAACGGAAAATGAAATTGACG ACAATTTTATTTATTGTGACACTGATAGTTTGTATATGAAATCCGTTGTTAAACCCTT ATTGAACCCCAGTTTATTCGACCCGATAGCCTTAGGTAAATGGGATATTGAAAACGA ACAGATAGATAAGATGTTTGTACTGAATCATAAGAAATATGCATATGAAGTGAATGG AAAGATTAAAATTGCTTCTGCTGGTATACCGAAAAACGCCTTTGATACAAGCGTCGA TTTTGAAACCTTTGTACGTGAACAATTCTTTGACGGTGCCATTATAGAAAACAATAA AAGTATCTATAATGAACAGGGTACAATATCGATATATCCGTCTAAAACTGAAATTGT ATGTGGTAATGTATATGATGAATATTTTACTGATGAACTTAATATGAAACGTGAATTT ATATTAAAAGACGCTAGAGAAAATTTCGATCATAGTCAATTTGATGATATTCTTTAT ATTGAAAGTGACATCGGTTCATTTTCACTTAACGACTTATTTCCAGTTGAACGTTCAG TACATAATAAATCAAATTTAAATATATTAAAAAATCAACATGATGACATCAAAAAAG GCAACTGTTAAATAACAGTCGCCTTTTTCTTTTGAGATAACATGAAAAATGTGTACG AAAATTGATTATGTTTTGTATTTTATTTACTAGCATTACTAGCATGTGTTCATTATAGC ATAATTCTTTACGCAATACCACTGAAGAATACAATATTATCACCAGCGTTTTCTGGTA CACCATTAATGAGTGTATACAACACCACACGTGACGGCGCAACGTAAGGTGGTACAT TATAGTTTGCAACTAAAAACGAACCATCGTCAAATACAGCAACAACAACACCAGTGT GACCAATACCATATGCAGTTGCTTGTAAGTATGGTGGTTTACTAGAAAAACCATACC CTACTGTTGGATTATGTGTTGTTTTTGCACCTAACTTTTTATAGACGTACCATACACG TTGACCGTTTGTGATTTGGCCGTCGTCGGTAGGTTGTCTTTTTCCATGTAGTTGTGAC ATATACGCCCATGTTAATTCTGTACACTGACCAGCATTACCAGTTTGAGGAAATATG TTACCTGGTTTGTATAAATATTCTTTTTTGAATAAAGGTACACCAATTGCTTTTTTATA TTTTTCTGGTAACTGTGCGTACGTCCAGTTACCACCAATCACACGACCACTTTTTCCA TTTGGTTTGACTGATTTACCACTAATTGGTTTATGATCTCCGTCATCATCAGTAGGGT TAGAACTGCTACCCCCGCTATCCACTTGCACGCTATCAATCAATTTTTTTAATGAATC AAGTAAGCCAATTGTCATTTTAATATGATATGTGTTGTTGAATGTTTTTTGTAATGTA AAATAATCATTACTAAAAAATTTATCACTACCAATACTGTGAACGTCCCATTGTAAT GCGTCTTGTACTTTTTTTAATAATTCTTGCATGGCTTGTTTAGCTAAAGCGAGTAGTG AACTACCACTGTCACCACTACTACCACTGTCAGACGTGTCACTAGGTGAACCACCTT TACCGTCTAATTTACCACCCCATGCTAAAATAGTATTTGCACCGTCTAAAAAAGGAT TACCATAGTTTTGTACTTTATTATATGACGCTTTCAAACCTAGGGGATAATATGCAGC CCAAGTAGCCGCTGCTGTTAATGGAATATATGCACGTCCAATTGTACCTGCTTTCATA TTTTTAGCAAAATCTGCATTACCCTTTCTTTGTACGTCTTGAGGTACAAAGTGGACAA TGTTACCTGCGTCATACCAAGACGGTTGTCCAGCTTGTTTTGATTGTGATACTAACTT TCTTGCAATAAATTTAGCGTCTGTTAAATAATCACCACGTGCAGACGTATGATTTAAC CAACCTAAACCGGCACTATACCCCTCATTTTTTTCATATACAGCAAAAAGAGTAGGT GACACACCTATCTCTTTTACTGCTTTTAATACTTGTCTGATTTTACTTTCATTACCACC TAGCCATACATTAAAGCGTCCATACCCTTTTACTTTAGGCACTAACTGGTCTATCGTT AAACCGAAATCATCATTAATATACGAATGTGTAAATTTATCTATCTTCTCTTGGTCGT TCATTATTATCACTCTTTTCAGAATCGTTTTTAATTACTCTTAATTTATCTTTAATTTGT TCAGGCACTAATACGTCCATTTCTGCACAATTTTCTACGATAGATAAGCCTTCATTAG CGATATAATAGAAAATCGTAATCATGAGTAAGCCACCTTTTAATTGTAAAATCTGGT CAATGATGTTCGCTAAAATGATAATACAGAATATCAATAATTTTTTAGCAAAACCTT TCATTGATTTTTTTGACCATAAGTTATTATTTTTAATGGCTTTAGCAAAACCAGTAAT TACATCAACGATCATTAAAACAAATAAAAAATATAGTAATTTTAAATCACCTGCATA TATGAACATATGAAACGCTTCTGTATCGGTGAATCTTAATTTTACCTCATTCATTTTA TACACCCTCTCTAAATTTATTATTTAATGGATTTTGTAACATTGGATTACCTGAACCG TCATTATGCCAAAATCTCACACCGGACTCTAAAATCGCTTTTAATTGCTCCATTAACA TGGGGTCAATGTCACGTATAGTATACGTACCTGTACATTTTAAATAATTGCAAACAG TCATACTGTTAATTGGTTCAATAAATGAATTATAGTCATTTACTTCAAAACCAAACAA CATATAATATTTTTGTAAAAATGTAATTTCTTTTGGTGACGGTACACTAATTTTCATC GTTAAACCGTTAATGCTATTCGCAATTTGGAATGCGTTGCCCATTTCTGATTCAGTTA CAGACGGTGGTTGTAAGGCTAAATCTTTATATTCAGCTTGTTGTTGTTTGTAGAAATT ATATTCTTCATTAAACTTACCAAATAAAGCAGTTGGACTTAAATTACTTGCTACACTC ACAGCGTCATAAAATCGTGATTTTGGGTCACTACCATTTAATACATTATCAATACGATCATTAACGGTTATAAAAACACTGAACGTAATATTTTATTCTCTACATTTGTTACATCA CGTTCATTGTATAACTTATTGGTACCTTTCCAATACTTAACGGAAAATGAAATTGACG ACAATTTTATTTATTGTGACACTGATAGTTTGTATATGAAATCCGTTGTTAAACCCTT ATTGAACCCCAGTTTATTCGACCCGATAGCCTTAGGTAAATGGGATATTGAAAACGA ACAGATAGATAAGATGTTTGTACTGAATCATAAGAAATATGCATATGAAGTGAATGG AAAGATTAAAATTGCTTCTGCTGGTATACCGAAAAACGCCTTTGATACAAGCGTCGA TTTTGAAACCTTTGTACGTGAACAATTCTTTGACGGTGCCATTATAGAAAACAATAA AAGTATCTATAATGAACAGGGTACAATATCGATATATCCGTCTAAAACTGAAATTGT ATGTGGTAATGTATATGATGAATATTTTACTGATGAACTTAATATGAAACGTGAATTT ATATTAAAAGACGCTAGAGAAAATTTCGATCATAGTCAATTTGATGATATTCTTTAT ATTGAAAGTGACATCGGTTCATTTTCACTTAACGACTTATTTCCAGTTGAACGTTCAG TACATAATAAATCAAATTTAAATATATTAAAAAATCAACATGATGACATCAAAAAAG GCAACTGTTAAATAACAGTCGCCTTTTTCTTTTGAGATAACATGAAAAATGTGTACG AAAATTGATTATGTTTTGTATTTTATTTACTAGCATTACTAGCATGTGTTCATTATAGC ATAATTCTTTACGCAATACCACTGAAGAATACAATATTATCACCAGCGTTTTCTGGTA CACCATTAATGAGTGTATACAACACCACACGTGACGGCGCAACGTAAGGTGGTACAT TATAGTTTGCAACTAAAAACGAACCATCGTCAAATACAGCAACAACAACACCAGTGT GACCAA TACCATATGCAGTTGCTTGTAAGTATGGTGGTTTACTAGAAAAACCATACC CTACTGTTGGATTATGTGTTGTTTTTGCACCTAACTTTTTATAGACGTACCATACACG TTGACCGTTTGTGATTTGGCCGTCGTCGGTAGGTTGTCTTTTTCCATGTAGTTGTGAC ATATACGCCCATGTTAATTCTGTACACTGACCAGCATTACCAGTTTGAGGAAATATG TTACCTGGTTTGTATAAATATTCTTTTTTGAATAAAGGTACACCAATTGCTTTTTTATA TTTTTCTGGTAACTGTGCGTACGTCCAGTTACCACCAATCACACGACCACTTTTTCCA TTTGGTTTGACTGATTTACCACTAATTGGTTTATGATCTCCGTCATCATCAGTAGGGT TAGAACTGCTACCCCCGCTATCCACTTGCACGCTATCAATCAATTTTTTTAATGAATC AAGTAAGCCAATTGTCATTTTAATATGATATGTGTTGTTGAATGTTTTTTGTAATGTA AAATAATCATTACTAAAAAATTTATCACTACCAATACTGTGAACGTCCCATTGTAAT GCGTCTTGTACTTTTTTTAATAATTCTTGCATGGCTTGTTTAGCTAAAGCGAGTAGTG AACTACCACTGTCACCACTACTACCACTGTCAGACGTGTCACTAGGTGAACCACCTT TACCGTCTAATTTACCACCCCATGCTAAAATAGTATTTGCACCGTCTAAAAAAGGAT TACCATAGTTTTGTACTTTATTATATGACGCTTTCAAACCTAGGGGATAATATGCAGC CCAAGTAGCCGCTGCTGTTAATGGAATATATGCACGTCCAATTGTACCTGCTTTCATA TTTTTAGCAAAATCTGCATTACCCTTTCTTTGTACGTCTTGAGGTACAAAGTGGACAA TGTTACCTGCGTCATACCAAGACGGTTGTCCAGCTTGTTTTGATTGTGATACTAACTT TCTTGCA ATAAATTTAGCGTCTGTTAAATAATCACCACGTGCAGACGTATGATTTAAC CAACCTAAACCGGCACTATACCCCTCATTTTTTTCATATACAGCAAAAAGAGTAGGT GACACACCTATCTCTTTTACTGCTTTTAATACTTGTCTGATTTTACTTTCATTACCACC TAGCCATACATTAAAGCGTCCATACCCTTTTACTTTAGGCACTAACTGGTCTATCGTT AAACCGAAATCATCATTAATATACGAATGTGTAAATTTATCTATCTTCTCTTGGTCGT TCATTATTATCACTCTTTTCAGAATCGTTTTTAATTACTCTTAATTTATCTTTAATTTGT TCAGGCACTAATACGTCCATTTCTGCACAATTTTCTACGATAGATAAGCCTTCATTAG CGATATAATAGAAAATCGTAATCATGAGTAAGCCACCTTTTAATTGTAAAATCTGGT CAATGATGTTCGCTAAAATGATAATACAGAATATCAATAATTTTTTAGCAAAACCTT TCATTGATTTTTTTGACCATAAGTTATTATTTTTAATGGCTTTAGCAAAACCAGTAAT TACATCAACGATCATTAAAACAAATAAAAAATATAGTAATTTTAAATCACCTGCATA TATGAACATATGAAACGCTTCTGTATCGGTGAATCTTAATTTTACCTCATTCATTTTA TACACCCTCTCTAAATTTATTATTTAATGGATTTTGTAACATTGGATTACCTGAACCG TCATTATGCCAAAATCTCACACCGGACTCTAAAATCGCTTTTAATTGCTCCATTAACA TGGGGTCAATGTCACGTATAGTATACGTACCTGTACATTTTAAATAATTGCAAACAG TCATACTGTTAATTGGTTCAATAAATGAATTATAGTCATTTACTTCAAAACCAAACAA CATATAATATTTTTGTAAAAATGTAATTTCTTTTGGTGACGGTACACTAATTTTCATC GTTAAA CCGTTAATGCTATTCGCAATTTGGAATGCGTTGCCCATTTCTGATTCAGTTA CAGACGGTGGTTGTAAGGCTAAATCTTTATATTCAGCTTGTTGTTGTTTGTAGAAATT ATATTCTTCATTAAACTTACCAAATAAAGCAGTTGGACTTAAATTACTTGCTACACTC ACAGCGTCATAAAATCGTGATTTTGGGTCACTACCATTTAATACATTATCAATACGAT

-7 CZ 33918 U1-7 CZ 33918 U1

TTGTAATTAATTGACTTTCTGCATTCTTTTGTCTATTCGCTTGTTGTGATTGTCCTAAG ATACCATTATTGATTAATATTGGTACTTGTGCAAAACTATTAAATGTTATATTTGTAT TTAAGAATGAACCCGTATCAATCAATATTTCTTTATTTTTAGCAAGTATGGGTCTGTC GTTTTCAGCACTGTTATAATCTACTGGATATACTCTAACTTCATTATGATAACCAATG ATCGATTTTGTACGTAACTTAACACCTGTTTTTTGTGAAATTTTACCAGCGTCGAGTA ACATCGTATTTCCATTCCAATCATAAAATTCAATTGTCATATACTCATTACGTATCAT ATGTTTAAATTCATCTTTTTTAGATAACATCATTTCTTGAAGTTTTGTAAAACTTAATG ATAAATCTTTTAGACTCCATTCTTTTGATTTACCACCCTGTTTTAATGTTTTTAATCCT GTAATTTTTTCACTGGTTTTTACGTCCTCTAAATCTTTTGTATTAATAAAGTCTTTAGG TAACATTTGAACCTTTTGAAAGTTTTGTGTAATCCATGGATATGCACTCATTTTATCC ATAAAGTTAATAAAGTCACCATATTCCATAACGTATAAGTTAACTGGTGATGTGATA TTGTCATATATCGTACCCTTAGACGTGTCTAAGTTTGGCTCTTTTTTCGTACCAAATTT CTTTGATAAATCAGCACTTGACTGGAATAATACTATATTTTCCAAATATTGTTGCATT TGGTTATACACATAGTTTTTATTCGATACTTTTAACACATCGTCATTATTACGCAACA TTGGTAACATATAGTTATAGGTGCGTTTTGATAAATGTTGACGTTCAATATTGACGTT TGAGAGTTGCTCTAATACATTACCTTGCGTGTACGTCATAATAGTATCAATCACAAA ATATATTTTAACCACAACATCATTCACATATTCGATTTGATTCACAAACGCATAATAA CGTCTGTCCTCAAAATCTGATAAAAACGTCATGTAGTTAATCCCTTGTGCGTCATGCC ACTGCATATCAACATTGATTTCCATTCTATCACGTATAAAATTATACGGTTGTTTGGA ATAGTCTAACGATTTAAAATGACGTCCATTTAAAAAATAATCATCACGCTCTTTATTA CTATTAAAATGAATCGTATTTTGATAATCAGTAAACGGTGTGTTATAGAAAAATTTA AAATTTGTTAATTTTCTCATTTTTACCTCCATAAAAAATAGTCGTATAAATAATTTAT ACGACTATTATAACATTTTTATTCAATGATTTGTGTATCTATTGCAAAACGTTTATCA CCATTTGTTAAGTCACTATCGCTATAATTTGATGTAACAAAATGTAATTCATTATTAA AGTTTAAATATAATCTTGTATTCATCATTTTATTATCAATCGCACATTGTGTGTAGTG ATGTGTTGATTTTAAGTTTGCGTTAATCGTACCTAATTTAATATCACCGTTTTTCTTAA TCCCTTTTAATACTCCTTTTAATTGTATCGTTTTAACACCATTAATTGTGACAATACGA TATTGCGGTGCGGGATATCCACCATTGCTATCACTTCCAACTATACCACTTTCGAGCG ATATATCTTGCCAACCTGTATCATTAAATTGTAATTTTGCACTGTTAATTTTTTGATTA AAATTTTGTTCAATTTCTGATTTAGATTGAGCAATTTTATTATCTATATTTAAGTTATT CACTTTTGTTGATAAACTGTTAATACTTGATTCGTTTGTTGATGTTTTTTGTTTTAAAT CACTAATATCATTATCATATTTAGATAAATCAACGTTACCGTTACTGTTAACAACTGG TCTATCTTTTAATTCTTGAATATCTTTTTCAATTTTTGATATTTTATCATTATTTGTTTT TAAAGTAGCGATGTCAGATTTAATTGAATTAATATCCTGTGTATAATCTTTTTGGTTA ATACTGTTTAATTTTGTTTCTAACTCTTTTATCTTATCAAGATTAGCATTTGTTTTAAT ATCATTAATGGATTGTTCTAACGATTCAAGTTTACCTGCACTTGAATTTTGTTTTAAC TTATTAATATCCTCTTGTATTTCTTGAATTGTGTTGTCATTGTTTTGTTTAGATTTTAAT AATTCAATTTGTCTTTCAATGTCTTTTATTTTATCAATATTAACACTTTTTTTAACTTC AGTTAATTCTCTTTTTAATGCGTCAATGTTTTCAGCACCAGTATTTGCTTTAATTAAAT TAATTTCATCTGTGTTACGTCCTACACTATCTTTAGTAGCGTTTAATGATTGTGTAAG GGTTTCATATTTATCATCATATTTTAATATTGATTTTTCAAATTCATTTAATTGTGTTT GATGTTGTTCTAAACTTTCATTTAATATGACATCTTTTTCTTTTAATGAATCAATCTCT TTTTTATTACTATCAATCATTGGTTGGAATTTTTTTATCTTCTCTAAAAATGTTGATAT TTTTTCTTTGTTATCATTAATTGCAATATCATGACTTTCTATTTGACCACTGTATTTAT TAATCAATGTTTTTAAATCATTATAAAATGTTAACTTATAATAACCAGTATCAGTACG GACATAAATATGCCCGTCTGATGTACTGATTAAGTCATTTTCTTCTGTTAAAAAATCT GCTAACCTGTCTATTGTTTCAACTTGTCTTAAACTTCTTACGATTCTATCAGCCATTGT TCACACCTCTTATTTGTATCGTTTCCAACTAAATTCAAAGAAAAAGCCTAAAATACCC ATTATGAGAACACCCCCCACGGTACACCAACACTGTAACTATTACCTGTTTTACCATT CCATTGCCTTACTGGTAAATAATAACGTGTACCTTGCCAATTATAACCAATCCATACG TAACCATCTGATAAACAAATTTCGTCATATGGTGTATAACCATTTGGTTGGAACCAA TAGCCATTAGGTTCTGATAATTTTGGACTGCCGACACGTGCAAATATTGGTAAAAAT CCACATGTAAATGTTCCATTCTCATTTCTGTAATACGTACCATATTGGTTTTGTTTCCA ATTTCCAAATGTATTGACCATTGATGTTTCTAATTTTTTACTATTACTACCTGAAAATT TTGGACGAATAAAGTGTGTTACACCGTCATAATAATGTGTTCTGATGGTTGCTTTTTCTTGTAATTAATTGACTTTCTGCATTCTTTTGTCTATTCGCTTGTTGTGATTGTCCTAAG ATACCATTATTGATTAATATTGGTACTTGTGCAAAACTATTAAATGTTATATTTGTAT TTAAGAATGAACCCGTATCAATCAATATTTCTTTATTTTTAGCAAGTATGGGTCTGTC GTTTTCAGCACTGTTATAATCTACTGGATATACTCTAACTTCATTATGATAACCAATG ATCGATTTTGTACGTAACTTAACACCTGTTTTTTGTGAAATTTTACCAGCGTCGAGTA ACATCGTATTTCCATTCCAATCATAAAATTCAATTGTCATATACTCATTACGTATCAT ATGTTTAAATTCATCTTTTTTAGATAACATCATTTCTTGAAGTTTTGTAAAACTTAATG ATAAATCTTTTAGACTCCATTCTTTTGATTTACCACCCTGTTTTAATGTTTTTAATCCT GTAATTTTTTCACTGGTTTTTACGTCCTCTAAATCTTTTGTATTAATAAAGTCTTTAGG TAACATTTGAACCTTTTGAAAGTTTTGTGTAATCCATGGATATGCACTCATTTTATCC ATAAAGTTAATAAAGTCACCATATTCCATAACGTATAAGTTAACTGGTGATGTGATA TTGTCATATATCGTACCCTTAGACGTGTCTAAGTTTGGCTCTTTTTTCGTACCAAATTT CTTTGATAAATCAGCACTTGACTGGAATAATACTATATTTTCCAAATATTGTTGCATT TGGTTATACACATAGTTTTTATTCGATACTTTTAACACATCGTCATTATTACGCAACA TTGGTAACATATAGTTATAGGTGCGTTTTGATAAATGTTGACGTTCAATATTGACGTT TGAGAGTTGCTCTAATACATTACCTTGCGTGTACGTCATAATAGTATCAATCACAAA ATATATTTTAACCACAACATCATTCACATATTCGATTTGATTCACAAACGCAT Aatami CGTCTGTCCTCAAAATCTGATAAAAACGTCATGTAGTTAATCCCTTGTGCGTCATGCC ACTGCATATCAACATTGATTTCCATTCTATCACGTATAAAATTATACGGTTGTTTGGA ATAGTCTAACGATTTAAAATGACGTCCATTTAAAAAATAATCATCACGCTCTTTATTA CTATTAAAATGAATCGTATTTTGATAATCAGTAAACGGTGTGTTATAGAAAAATTTA AAATTTGTTAATTTTCTCATTTTTACCTCCATAAAAAATAGTCGTATAAATAATTTAT ACGACTATTATAACATTTTTATTCAATGATTTGTGTATCTATTGCAAAACGTTTATCA CCATTTGTTAAGTCACTATCGCTATAATTTGATGTAACAAAATGTAATTCATTATTAA AGTTTAAATATAATCTTGTATTCATCATTTTATTATCAATCGCACATTGTGTGTAGTG ATGTGTTGATTTTAAGTTTGCGTTAATCGTACCTAATTTAATATCACCGTTTTTCTTAA TCCCTTTTAATACTCCTTTTAATTGTATCGTTTTAACACCATTAATTGTGACAATACGA TATTGCGGTGCGGGATATCCACCATTGCTATCACTTCCAACTATACCACTTTCGAGCG ATATATCTTGCCAACCTGTATCATTAAATTGTAATTTTGCACTGTTAATTTTTTGATTA AAATTTTGTTCAATTTCTGATTTAGATTGAGCAATTTTATTATCTATATTTAAGTTATT CACTTTTGTTGATAAACTGTTAATACTTGATTCGTTTGTTGATGTTTTTTGTTTTAAAT CACTAATATCATTATCATATTTAGATAAATCAACGTTACCGTTACTGTTAACAACTGG TCTATCTTTTAATTCTTGAATATCTTTTTCAATTTTTGATATTTTATCATTATTTGTTTT TAAAGTAGCGATGTCAGATTTAATTGAATTAATATCCTGTGTAT AATCTTTTTGGTTA ATACTGTTTAATTTTGTTTCTAACTCTTTTATCTTATCAAGATTAGCATTTGTTTTAAT ATCATTAATGGATTGTTCTAACGATTCAAGTTTACCTGCACTTGAATTTTGTTTTAAC TTATTAATATCCTCTTGTATTTCTTGAATTGTGTTGTCATTGTTTTGTTTAGATTTTAAT AATTCAATTTGTCTTTCAATGTCTTTTATTTTATCAATATTAACACTTTTTTTAACTTC AGTTAATTCTCTTTTTAATGCGTCAATGTTTTCAGCACCAGTATTTGCTTTAATTAAAT TAATTTCATCTGTGTTACGTCCTACACTATCTTTAGTAGCGTTTAATGATTGTGTAAG GGTTTCATATTTATCATCATATTTTAATATTGATTTTTCAAATTCATTTAATTGTGTTT GATGTTGTTCTAAACTTTCATTTAATATGACATCTTTTTCTTTTAATGAATCAATCTCT TTTTTATTACTATCAATCATTGGTTGGAATTTTTTTATCTTCTCTAAAAATGTTGATAT TTTTTCTTTGTTATCATTAATTGCAATATCATGACTTTCTATTTGACCACTGTATTTAT TAATCAATGTTTTTAAATCATTATAAAATGTTAACTTATAATAACCAGTATCAGTACG GACATAAATATGCCCGTCTGATGTACTGATTAAGTCATTTTCTTCTGTTAAAAAATCT GCTAACCTGTCTATTGTTTCAACTTGTCTTAAACTTCTTACGATTCTATCAGCCATTGT TCACACCTCTTATTTGTATCGTTTCCAACTAAATTCAAAGAAAAAGCCTAAAATACCC ATTATGAGAACACCCCCCACGGTACACCAACACTGTAACTATTACCTGTTTTACCATT CCATTGCCTTACTGGTAAATAATAACGTGTACCTTGCCAATTATAACCAATCCATACG TAACCATCTGATAAACAAATTTCGTCATATG GTGTATAACCATTTGGTTGGAACCAA TAGCCATTAGGTTCTGATAATTTTGGACTGCCGACACGTGCAAATATTGGTAAAAAT CCACATGTAAATGTTCCATTCTCATTTCTGTAATACGTACCATATTGGTTTTGTTTCCA ATTTCCAAATGTATTGACCATTGATGTTTCTAATTTTTTACTATTACTACCTGAAAATT TTGGACGAATAAAGTGTGTTACACCGTCATAATAATGTGTTCTGATGGTTGCTTTTTC

-8 CZ 33918 U1-8 CZ 33918 U1

CCAACCGTCAAAACCACCATTTAACCAGTTTTGCTCTAAACATGTATAATAATCTAA ATTTCCACTTATCACACATTGAATATGACCATATTGAGAATTAGTATAAACAGCAAC GTCTCCTAATTGTGGTTTAAAGCTCGGTGTATTTTTATACACCGTTGCTAAACCTTTA AAGTCATTATTAATAGCGTCTTTGGCATTGCCCCACATACGAACTTTACCGTCTGTAA TGTAATATACATAAGCAACTGCTAAGTCCATACATTGAAATCCATATGCACCATCAA AATCAACACCTACACCCTCATGATTATATATCCATTCTTTTGCTTGTTGTTGTGATTTC ATTTATATCACTCCTATTTTTGATGTTTTGCTACCCAACCATATTCACGATGTTTCGTT TCAGCATTAACATTACTAAAGAATTCTTTATGCACTTTAACGTTAGCCTCCAACGTTT GTCTTACTTCTCCAACAGCGTTACCACTTGAAACACGTAACCATGCACCCACTTTTTT AATTTCTTCTGGTGCGTCTCTAAACAATTCCATTTGGTTGCCAGTAATATAATATTCA CCAGGTGTAGTAACGTAAGCTATCCAATTATTATATTGACTCGCTTCTAAATATTCTT GATATGGTGCATCTGTTTTGATTGTAGTCCATAAACCATAATCCCATTTTAATTTAAA TACGTCGAGTGTCATACCACGCACAATTTTAACCATTTTTCGACCAGTAGAAAAACG TGTTAATTCTTGTACTGTGCCTAATGTTTGTGTTGTAGGGTATACATTGATAAAACAA CCAGCGTCTATAATTTTTTTACTACCATTCATTGGCATATTTTTAAGTTTGCTAGCTGT ACCACCGTCAATATAATAAAATCCTGGTTGTGTTAAGTCGTTTAAGTCGTCAATATTG TCTGGAATAGATAATGCACGTCCATCGTCTTTTGTTAATTTATAGTTTTGTGAACCTC TCGCACGTAATGCTTCAAAGTGTTCATACTCACCAAGTTGAAAGAACCCATATAAAT TATTGAATCGTTTTCCACCACCGCCATTAGTCATAGCAAGTAATAACGATTTACGTTT TGTTTTTGGATTGGTATAAATACAAATACCCTCCGGCTCTTTAAAGTTATCACGTGGA AAATTAATACCGTCTTGATATGATAATTTAAACGGATAATCATAAATCTTTTGACCA GTGGTTAATGAATATTTACCAATTTGAACGTGTGAATTAACTGAACTGTTACCACTTA ACCAGTATAAATCATCACCATCAACGGCAATCCCTTGCATCCATCGATTATCATTGTT TTCTGAATTATCAATCGTCATTTCTTTTTCTACATTATCAATGTGATTTTTTACGTCAG CTCTTGAACGTACCTGTATTGTCCCGTCACCGAATCTTAAAACGATTTTGTCATTTGC TTCATCGATTAAAGGTGTAAACGTATGTTTGTTTAAAAGTGACTGTGGTGTGTAATCT GTTAAACCTTTAGCCTCTTCTAAATCTAATACATAATTATCTTTATATGCGACTTGTA ACAGTTTCGCGACACCGTCATGATGTAACCAAATTTTCATTTCTCCATTGGATTGACG TTCTAATCCGATTGTTGTACCGTGACCACCTTGTACAATACGCATACTAGAAATTAAG TCACCGCTAGGCGTTAATTTATTAATCCAAAAACCTTCTGGGTTTTGTGAATCTGATT GTGTAGAGTACATTTGATTCGTTTCTTTATCGATATTAATTGATTGGTTTACTGCGTTA CGAATACCACCGAAGCCCATAACAAACTTTGGTTCAAGCTCATTTAATTCAAAACCA TTAACTAAACGGTCAATGTCTTTAATTAGGTCTTTCACTTCTGCTTTAAAATCATTCA TTTGTTTCATTTCTGCGACTTTAAATAATGCAAATGCAGATGTTAAACCAGCACTATA TTTAGTAAACTCATCGTGAATGATTTTATCAATCGTACCGTCGTTTAACCAACCTCTA AATAAGTCTTTTGCTTGGTCTGGGAATGCTTTCATTAAATCGTCCCAGTTTTTGAAAC _{GTTTTTTTAACTCACCGTCATAGTCCCAAATACGATATGCTAATACTTCAATGAGTTr}TGATAATCTTGAAATATAATCATAATATGATTTTGAATTGGTATTATAATCTGCTCTA TCATCGTAAAACGGTGTGTAACGTTCTCTATTTTTATATATTTCGTCTAAAAATGGAC GAATGTCGTCAAAATATTTAAATTCGTTTTCATTATATGCCATAATTTTCCACCTTTA CCAAATTTGTAAAAAACATTTTTTATCAAATTCATTTAAAATTTTCTTTCTTAAATCGT ATACTTTATCAATATTATCAATTAAATACTGTTTTGAAAATTGTGTACCTTTCGCATT ACCTTTTTGATTTTGATTACGTTTTGCGTTTTGATTACTTTCGTTACTTGATTTATTCAC AGTTTTACCGTTATCAATTGTATTATTGTCTGCAAATTGTAACGTTGTTTTATCAACAT CTATGTTAACCTCGCTTTGTGGTAATGACGCATAAGCATTTCTGTTCGCTGTCATACC AGTTGAATTGTCTAAAGATGTAGCATTTTGATTTGAGGTTTCATCTGTGTTGTTTGTT GTATCTTCATTATGTTCTGTAAAACCTTGTGATTGTAGATATTTTTCAACTTCGCTTGA TGAATAAACCACATTCAAATAATCTTCATGTGTGATACATACAGTAATCACTTGCAT GCCAAACGCTTCAACTGTTTGTCTGTTGATTTCTCTATCTAAAAAGTGTATTGTAAAT GATTTTTTGAAAAGTAAGTCAGATAAGTCATCTTTAAGTTTAAAACCTTTAAACACTT TTTCATTAACGATGGCTAAAACGTCTTTGTCAAACTTCAACATTTTTTGCATGAATTG AAATTCATCATCATAAAACGTTAATTTATCATTATTTACAAATTCATTAAAACCTTTT TTAATTAATTCTGATTTAATAAAATCAAATAAAGTCATTGTATATCTAGCCATTGTAT TCACTACTTTCATCATTAGACAATGTATCTATCATTGTGATTTCTGAAGTAACTTCAT CGTCGTAATACGGTTTAATATCTAAACCATAACGTTTTGATAAGAATGTAATCGGTTCCCAACCGTCAAAACCACCATTTAACCAGTTTTGCTCTAAACATGTATAATAATCTAA ATTTCCACTTATCACACATTGAATATGACCATATTGAGAATTAGTATAAACAGCAAC GTCTCCTAATTGTGGTTTAAAGCTCGGTGTATTTTTATACACCGTTGCTAAACCTTTA AAGTCATTATTAATAGCGTCTTTGGCATTGCCCCACATACGAACTTTACCGTCTGTAA TGTAATATACATAAGCAACTGCTAAGTCCATACATTGAAATCCATATGCACCATCAA AATCAACACCTACACCCTCATGATTATATATCCATTCTTTTGCTTGTTGTTGTGATTTC ATTTATATCACTCCTATTTTTGATGTTTTGCTACCCAACCATATTCACGATGTTTCGTT TCAGCATTAACATTACTAAAGAATTCTTTATGCACTTTAACGTTAGCCTCCAACGTTT GTCTTACTTCTCCAACAGCGTTACCACTTGAAACACGTAACCATGCACCCACTTTTTT AATTTCTTCTGGTGCGTCTCTAAACAATTCCATTTGGTTGCCAGTAATATAATATTCA CCAGGTGTAGTAACGTAAGCTATCCAATTATTATATTGACTCGCTTCTAAATATTCTT GATATGGTGCATCTGTTTTGATTGTAGTCCATAAACCATAATCCCATTTTAATTTAAA TACGTCGAGTGTCATACCACGCACAATTTTAACCATTTTTCGACCAGTAGAAAAACG TGTTAATTCTTGTACTGTGCCTAATGTTTGTGTTGTAGGGTATACATTGATAAAACAA CCAGCGTCTATAATTTTTTTACTACCATTCATTGGCATATTTTTAAGTTTGCTAGCTGT ACCACCGTCAATATAATAAAATCCTGGTTGTGTTAAGTCGTTTAAGTCGTCAATATTG TCTGGAATAGATAATGCACGTCCATCGTCTTTTGTTAATTTATAGTTTTGTGAACCT C TCGCACGTAATGCTTCAAAGTGTTCATACTCACCAAGTTGAAAGAACCCATATAAAT TATTGAATCGTTTTCCACCACCGCCATTAGTCATAGCAAGTAATAACGATTTACGTTT TGTTTTTGGATTGGTATAAATACAAATACCCTCCGGCTCTTTAAAGTTATCACGTGGA AAATTAATACCGTCTTGATATGATAATTTAAACGGATAATCATAAATCTTTTGACCA GTGGTTAATGAATATTTACCAATTTGAACGTGTGAATTAACTGAACTGTTACCACTTA ACCAGTATAAATCATCACCATCAACGGCAATCCCTTGCATCCATCGATTATCATTGTT TTCTGAATTATCAATCGTCATTTCTTTTTCTACATTATCAATGTGATTTTTTACGTCAG CTCTTGAACGTACCTGTATTGTCCCGTCACCGAATCTTAAAACGATTTTGTCATTTGC TTCATCGATTAAAGGTGTAAACGTATGTTTGTTTAAAAGTGACTGTGGTGTGTAATCT GTTAAACCTTTAGCCTCTTCTAAATCTAATACATAATTATCTTTATATGCGACTTGTA ACAGTTTCGCGACACCGTCATGATGTAACCAAATTTTCATTTCTCCATTGGATTGACG TTCTAATCCGATTGTTGTACCGTGACCACCTTGTACAATACGCATACTAGAAATTAAG TCACCGCTAGGCGTTAATTTATTAATCCAAAAACCTTCTGGGTTTTGTGAATCTGATT GTGTAGAGTACATTTGATTCGTTTCTTTATCGATATTAATTGATTGGTTTACTGCGTTA CGAATACCACCGAAGCCCATAACAAACTTTGGTTCAAGCTCATTTAATTCAAAACCA TTAACTAAACGGTCAATGTCTTTAATTAGGTCTTTCACTTCTGCTTTAAAATCATTCA TTTGTTTCATTTCTGCGACTTTAAATAATGCAAATGCAGATGTTAAACCAGCACT ATA TTTAGTAAACTCATCGTGAATGATTTTATCAATCGTACCGTCGTTTAACCAACCTCTA AATAAGTCTTTTGCTTGGTCTGGGAATGCTTTCATTAAATCGTCCCAGTTTTTGAAAC _{GTTTTTTTAACTCACCGTCATAGTCCCAAATACGATATGCTAATACTTCAATGAGTTr} TGATAATCTTGAAATATAATCATAATATGATTTTGAATTGGTATTATAATCTGCTCTA TCATCGTAAAACGGTGTGTAACGTTCTCTATTTTTATATATTTCGTCTAAAAATGGAC GAATGTCGTCAAAATATTTAAATTCGTTTTCATTATATGCCATAATTTTCCACCTTTA CCAAATTTGTAAAAAACATTTTTTATCAAATTCATTTAAAATTTTCTTTCTTAAATCGT ATACTTTATCAATATTATCAATTAAATACTGTTTTGAAAATTGTGTACCTTTCGCATT ACCTTTTTGATTTTGATTACGTTTTGCGTTTTGATTACTTTCGTTACTTGATTTATTCAC AGTTTTACCGTTATCAATTGTATTATTGTCTGCAAATTGTAACGTTGTTTTATCAACAT CTATGTTAACCTCGCTTTGTGGTAATGACGCATAAGCATTTCTGTTCGCTGTCATACC AGTTGAATTGTCTAAAGATGTAGCATTTTGATTTGAGGTTTCATCTGTGTTGTTTGTT GTATCTTCATTATGTTCTGTAAAACCTTGTGATTGTAGATATTTTTCAACTTCGCTTGA TGAATAAACCACATTCAAATAATCTTCATGTGTGATACATACAGTAATCACTTGCAT GCCAAACGCTTCAACTGTTTGTCTGTTGATTTCTCTATCTAAAAAGTGTATTGTAAAT GATTTTTTGAAAAGTAAGTCAGATAAGTCATCTTTAAGTTTAAAACCTTTAAACACTT TTTCATTAACGATGGCTAAAACGTCTTTGTCAAACTTCAACATTTTTT GCATGAATTG AAATTCATCATCATAAAACGTTAATTTATCATTATTTACAAATTCATTAAAACCTTTT TTAATTAATTCTGATTTAATAAAATCAAATAAAGTCATTGTATATCTAGCCATTGTAT TCACTACTTTCATCATTAGACAATGTATCTATCATTGTGATTTCTGAAGTAACTTCAT CGTCGTAATACGGTTTAATATCTAAACCATAACGTTTTGATAAGAATGTAATCGGTTC

-9 CZ 33918 U1-9 CZ 33918 U1

ACGACCTTTTAAATAAATATTACTATTTGATGTGGTAAAACCTCGGTTGCTTTTTGCT TCTTCGTCCGAAACACCGCTTTCCTTATCCACTGCTAGTGAATTAATACCCAAATAGT TACTTAATTCACTAATTTTATTTTGGTATTCTCTTTTCATCTCAGTTAGTGCTGGAATC ACACTATTACTGGTTAAATCTATGATATCATCATCGGCGTTAAACATAGGTGACATTT TAACAAATGGTGCACCGTTATATATTTCCGATACAAGTTGATTAACTGACTCATCATT AATGTCTGATTTAAATATTTTGCTAAATTTTGCTTGCATAATTAATGAAAATCGAGAT AAAACAACCTCAGATAATTCATCAGTATAATGTTCTATAATTTCTATATCACTATTAT ATTGAATTGGTTTATTTTGCATGACAACAAAGTTGCCACTCATACAGTTATCATATAT TTTATGAATCTGTAAGCATTCATCTGGTATTAAATAGTCTGGAACAATGAAATAAAT ATCATCTTTTGTTAATCGTTTTTGAAATTGAAAATTGAAATTTGATGAAAAGTTTGGG GCTTGATTAAAATAAGTGTTGTTAACATAGCCCAAAATCATGATTTGTTCATTTCTTG CTTTACCAACAACAACATTAATGTTTTGCCTTAATGCAGATTCTAATTGAATAAAATC TATACCAACCGAATCTCGATTGGTATAGTTAATTAATAGTGGTAAAAATTCCAAATA ACGATTAAACATAAGACGTTTAAATCTGTTGCGATGTTCTACAACACGTTTATTGATT TCTTTAGATAATTCAACCTGTACGCCTTTATTATGTTTAGTCATTTATAGCACCTCTAT AATTCTGTTCTCGGTGTAACATCTTGGTCAGTAATTAAAATTTTATTAAAGAATGGGC TAATGGCTTTAAATGAATAATAATGAATCCAGTGTGTGACTTCATCAAATTCACCATT ATAGAATGGTTGTTTTAACATACCTTTTGTGTAACGTTTATATTTAATTGAATTAATA TCCAAAATAAATGCGTATAAATCTGATTTTGGTTTAATTTCTTCAACGTTAGACTTAA ATTCAGATAAATTTGAAACATCATAAGTGAATACTGAACCAACTGGAATTGTATCAC CTTTATGAGTTTGATAATCACCGTAAGCACGTAAGAAATTAACTGATTCGTCACTTG ATACGACAATATCTTTAGTAACTTTAAAAACTCCACCTAAATCATCAAAACTAATAA CGTGGTCTGTAAAGTCAATCCCTGCTACTTGGAACGTGTTAGCAATCTTTGTATCTAA AAGATAAGATTTTAAGCTATCAGTCGTTAAAATAACAATATCTTTTAATTTTGAAACT GTTGTATATTGTCCAATAGCACCACCTGAAGCACGATGAACTTCATTATATTTAGCAC TGTTGTTTTGTAAGTTAAGAATAGCTTCAAAAACTTTACTTGCTAAATCTTCTTTTGA TGTTGCTTTACGTACATTTGATTCAGATAATTGATTCAATGAATAATCAACTAACATT GCACGCATTTCTTTTTCTTCTAATACGTTAATATCAGAAATTTTCTTTTTATAGACACC TAATGCATAATTAGTTGCGTCTGCTAATGTTTGGAAATTGAAACGTGTATCATTGTTA TTTAATGTAAATTTTTGTTTCTTCACAATACCACTACCATATAACTTAGTAGCCATAC GTGGGTAGTTACGTTTCAACATTAGTTCTTCATTTTTAGATAAGTCCATGTTAATAGG TACTGTATCCATAATTACATATTCTTCACTGTATTGACCAATAAAGTCCTGCTCTTTA GCTAACCAATTAAAACGGTTACCTAATGCAATATCGATTAATAACGTTTCATTAATCT TAGGGAATAAAAATTTATTTACAAATGTTTCAAACATTGTATTAGAATTATCCCACTT ATCACCAAACGTCCATGATTTTGAATAAGTATGATTAAAGTCTTGTAATGCAGATTT AGCTGACTTTGCAACTAATAGTGCTGTTTCGTTTTTTGTACTCTTTTCTGCCATGATTT ATTATTCCTCCTCTACATCGCCAGTAAATGACTGTTTTGAAAGTGAATGAATTTGTAC ACCATAACTATCTTCACTTTTATTTGTATCAATTGACATATTTTCATTTAATTCTGTTC GTTTATTTAATCTTGAATCTTCATATGATGTACCCATCATAGAACGCATGTTGTTACC CTCGTACATGTTTAAATTCCTCCTAATCTAAATCTAATTTATCGACAAGTTCTTCATCT GAATAGTCTTTATCATTGTTATCTGTTTCATTTGATTCTGGTTGTGGTTGTGGTTGTGG TTGTTGCATTTGTGATGTTTCAAAATTAGTAAATCGTTGTTCTAATGAAGCGATACGT TGTTCTAAAACAACTGGGTCTAATTTTGCACTATCTTCATCTGTTATAGTAGGTTCTA ATTTGTTTTCATTTTCTTCTTCGATTGTTTCTACTGTTTTATCTTCAGTTGATTCTTCAG TTGATTCTTCAGTTGATTCTTCAGTTTCTTCTGTTGATTCTTCAGTTGATTCTTCAGTT AATTCTTTGTCGTCTGATTTTACGATTTCCTCAAATTCTGTCATTTAGACACCTCCAAA TATTTTATAACTAATTATATCATAGAATATTTAAATAAGTAAATTAAATTTATITTAA TTTCAAATCATAACTTTGAATAAAAGTCAATAGATACATAAATTTTTATTTGATGAAT ATTTAATAGGTTTGATAAGTTGTTAAAGTTGGTGAACAGTATTTATAAGTTTAGTAAA GAAATGATAAGTGAATTTATAAGTTTTGATTTGTATAATCGTTTATTTTAAACGGTGG GGAGGTGTAAATTTATACTAACTTTTTCCCTATTATATTTACGACCTTTTAAATAAATATTACTATTTGATGTGGTAAAACCTCGGTTGCTTTTTGCT TCTTCGTCCGAAACACCGCTTTCCTTATCCACTGCTAGTGAATTAATACCCAAATAGT TACTTAATTCACTAATTTTATTTTGGTATTCTCTTTTCATCTCAGTTAGTGCTGGAATC ACACTATTACTGGTTAAATCTATGATATCATCATCGGCGTTAAACATAGGTGACATTT TAACAAATGGTGCACCGTTATATATTTCCGATACAAGTTGATTAACTGACTCATCATT AATGTCTGATTTAAATATTTTGCTAAATTTTGCTTGCATAATTAATGAAAATCGAGAT AAAACAACCTCAGATAATTCATCAGTATAATGTTCTATAATTTCTATATCACTATTAT ATTGAATTGGTTTATTTTGCATGACAACAAAGTTGCCACTCATACAGTTATCATATAT TTTATGAATCTGTAAGCATTCATCTGGTATTAAATAGTCTGGAACAATGAAATAAAT ATCATCTTTTGTTAATCGTTTTTGAAATTGAAAATTGAAATTTGATGAAAAGTTTGGG GCTTGATTAAAATAAGTGTTGTTAACATAGCCCAAAATCATGATTTGTTCATTTCTTG CTTTACCAACAACAACATTAATGTTTTGCCTTAATGCAGATTCTAATTGAATAAAATC TATACCAACCGAATCTCGATTGGTATAGTTAATTAATAGTGGTAAAAATTCCAAATA ACGATTAAACATAAGACGTTTAAATCTGTTGCGATGTTCTACAACACGTTTATTGATT TCTTTAGATAATTCAACCTGTACGCCTTTATTATGTTTAGTCATTTATAGCACCTCTAT AATTCTGTTCTCGGTGTAACATCTTGGTCAGTAATTAAAATTTTATTAAAGAATGGGC TAATGGCTTTAAATGAATAATAATGAATCCAGTGTGTGACTTCATCAAATTCACCA TT ATAGAATGGTTGTTTTAACATACCTTTTGTGTAACGTTTATATTTAATTGAATTAATA TCCAAAATAAATGCGTATAAATCTGATTTTGGTTTAATTTCTTCAACGTTAGACTTAA ATTCAGATAAATTTGAAACATCATAAGTGAATACTGAACCAACTGGAATTGTATCAC CTTTATGAGTTTGATAATCACCGTAAGCACGTAAGAAATTAACTGATTCGTCACTTG ATACGACAATATCTTTAGTAACTTTAAAAACTCCACCTAAATCATCAAAACTAATAA CGTGGTCTGTAAAGTCAATCCCTGCTACTTGGAACGTGTTAGCAATCTTTGTATCTAA AAGATAAGATTTTAAGCTATCAGTCGTTAAAATAACAATATCTTTTAATTTTGAAACT GTTGTATATTGTCCAATAGCACCACCTGAAGCACGATGAACTTCATTATATTTAGCAC TGTTGTTTTGTAAGTTAAGAATAGCTTCAAAAACTTTACTTGCTAAATCTTCTTTTGA TGTTGCTTTACGTACATTTGATTCAGATAATTGATTCAATGAATAATCAACTAACATT GCACGCATTTCTTTTTCTTCTAATACGTTAATATCAGAAATTTTCTTTTTATAGACACC TAATGCATAATTAGTTGCGTCTGCTAATGTTTGGAAATTGAAACGTGTATCATTGTTA TTTAATGTAAATTTTTGTTTCTTCACAATACCACTACCATATAACTTAGTAGCCATAC GTGGGTAGTTACGTTTCAACATTAGTTCTTCATTTTTAGATAAGTCCATGTTAATAGG TACTGTATCCATAATTACATATTCTTCACTGTATTGACCAATAAAGTCCTGCTCTTTA GCTAACCAATTAAAACGGTTACCTAATGCAATATCGATTAATAACGTTTCATTAATCT TAGGGAATAAAAATTTATTTACAAATGTTTCAAACATTGTATTAGAATTATCCCA CTT ATCACCAAACGTCCATGATTTTGAATAAGTATGATTAAAGTCTTGTAATGCAGATTT AGCTGACTTTGCAACTAATAGTGCTGTTTCGTTTTTTGTACTCTTTTCTGCCATGATTT ATTATTCCTCCTCTACATCGCCAGTAAATGACTGTTTTGAAAGTGAATGAATTTGTAC ACCATAACTATCTTCACTTTTATTTGTATCAATTGACATATTTTCATTTAATTCTGTTC GTTTATTTAATCTTGAATCTTCATATGATGTACCCATCATAGAACGCATGTTGTTACC CTCGTACATGTTTAAATTCCTCCTAATCTAAATCTAATTTATCGACAAGTTCTTCATCT GAATAGTCTTTATCATTGTTATCTGTTTCATTTGATTCTGGTTGTGGTTGTGGTTGTGG TTGTTGCATTTGTGATGTTTCAAAATTAGTAAATCGTTGTTCTAATGAAGCGATACGT TGTTCTAAAACAACTGGGTCTAATTTTGCACTATCTTCATCTGTTATAGTAGGTTCTA ATTTGTTTTCATTTTCTTCTTCGATTGTTTCTACTGTTTTATCTTCAGTTGATTCTTCAG TTGATTCTTCAGTTGATTCTTCAGTTTCTTCTGTTGATTCTTCAGTTGATTCTTCAGTT AATTCTTTGTCGTCTGATTTTACGATTTCCTCAAATTCTGTCATTTAGACACCTCCAAA TATTTTATAACTAATTATATCATAGAATATTTAAATAAGTAAATTAAATTTATITTAA TTTCAAATCATAACTTTGAATAAAAGTCAATAGATACATAAATTTTTATTTGATGAAT ATTTAATAGGTTTGATAAGTTGTTAAAGTTGGTGAACAGTATTTATAAGTTTAGTAAA GAAATGATAAGTGAATTTATAAGTTTTGATTTGTATAATCGTTTATTTTAAACGGTGG GGAGGTGTAAATTTATACTAACTTTTTCCCTATTATATTT

- 10CZ 33918 U1- 10CZ 33918 U1

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Sada obsahující ve stripu ředění jednotlivých fágů uchovávaných v chladničkové teplotě (4 až 10 °C) půjde využít pro stanovení míry citlivosti (biologická účinnost) bakterie k fágu v lokálních podmínkách uživatele. Metoda lze provést v běžně vybavené mikrobiologické laboratoři s využitím metod určených pro stanovení jiných antimikrobiálních látek. Strip s různými druhy fágů bude uchováván v lednici a v případě, že u pacienta nezabere léčba antibiotiky, se otestuje bakteriální kmen na citlivost k bakteriofágům přímo v zařízení, které bakterii izolovalo a identifikovalo.The kit containing in the strip a dilution of individual phages stored at a refrigerator temperature (4 to 10 ° C) can be used to determine the degree of sensitivity (biological activity) of the bacterium to phage in the local conditions of the user. The method can be performed in a commonly equipped microbiological laboratory using methods for the determination of other antimicrobial agents. The strip with the different types of phages will be stored in the refrigerator, and if the patient is not treated with antibiotics, the bacterial strain will be tested for bacteriophage susceptibility directly in the device that isolated and identified the bacterium.

LiteraturaLiterature

Anderson, B., Rashid, Μ. H., Carter, C., Pastemack, G., Rajanna, C., Revazishvili, T., Dean, T., Senecal, A., & Sulakvelidze, A. (2011). Enumeration of bacteriophage particles. Bacteriophage. https://doi.Org/10.4161/bact.l.2.15456Anderson, B., Rashid, Μ. H., Carter, C., Pastemack, G., Rajanna, C., Revazishvili, T., Dean, T., Senecal, A., & Sulakvelidze, A. (2011). Enumeration of bacteriophage particles. Bacteriophage. https://doi.Org/10.4161/bact.l.2.15456

Andrews, J. M. (2002). Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, https://doi.org/10.1093/jac/dkf083Andrews, J. M. (2002). Determination of minimum inhibitors concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, https://doi.org/10.1093/jac/dkf083

Duval, R. E., Grare, M., & Demoré, B. (2019). Fight against antimicrobial resistance: We always need new antibacterials but for right bacteria. In Molecules. https://doi.org/10.3390/molecules24173152Duval, R. E., Grare, M., & Demoré, B. (2019). Fight against antimicrobial resistance: We always need new antibacterials but for right bacteria. In Molecules. https://doi.org/10.3390/molecules24173152

Lin, D. M., Koskella, B., & Lin, H. C. (2017). Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi -drug resistance. World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics. https://doi.org/10.4292/wjgpt.v8.i3.162Lin, D. M., Koskella, B., & Lin, H. C. (2017). Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi -drug resistance. World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics. https://doi.org/10.4292/wjgpt.v8.i3.162

Merabishvili, M., Vandenheuvel, D., Kropinski, A. M., Mast, J., De Vos, D., Verbeken, G., Noben, J. P., Lavigne, R., Vaneechoutte, M., & Pimay, J. P. (2014). Characterization of newly isolated lytic bacteriophages active against Acinetobacter baumannii. PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/joumal.pone.0104853.Merabishvili, M., Vandenheuvel, D., Kropinski, AM, Mast, J., De Vos, D., Verbeken, G., Noben, JP, Lavigne, R., Vaneechoutte, M., & Pimay, JP (2014 ). Characterization of newly isolated lytic bacteriophages active against Acinetobacter baumannii. PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/joumal.pone.0104853.

Claims

CLAIMS FOR PROTECTION

A test kit for determining the biological antimicrobial activity of a phage lysate based on a strip of microtubes, characterized in that the individual tubes contain at least 50 to 100 μΐ of phage lysate MB 403 in decimal dilution in concentrations UlO ⁹ to 1x10 ² .

The assay kit according to claim 1, which contains, in addition to the phage lysate, a CaCTo concentration of 0.1 to 1 mM in the individual microtubes.

The assay kit according to claim 1, comprising the phage lysate in a unit dilution within one order, i. IxlO ⁹ to 9χ ΙΟ ⁹ , 1χ 10 ⁸ to 9χ ΙΟ ⁸ , 1χ I0 ⁷ to 9χ ΙΟ ⁷ , 1χ I0 ⁶ to 9χ10 ⁶ , 1χ I0 ⁵ to 9xl0 ⁵ , lxl0 ^{4 to} 9xl0 ⁴ .