CZ338499A3

CZ338499A3 - Použití bílkovin, extrahovatelných z jater savců

Info

Publication number: CZ338499A3
Application number: CZ19993384A
Authority: CZ
Inventors: Alberto Paneral; Pier Luigi Meroni; Alberto Bartorelli
Original assignee: Zetesis S. P. A.
Priority date: 1998-03-16
Filing date: 1998-03-16
Publication date: 2000-02-16

Abstract

Řešení se týká použití bílkovin, extrahovatelných zjatersavců kyselinou chloristou pro výrobu farmaceutických prostředků pro prevenci aléčení patologických stavů, u nichž dochází k hyperprodukci IFN, například roztroušené sklerózy, septického šoku, revmatoidní arthritidy a podobných stavů.

Description

/VýýWPoužití bílkovin, extrahovatelných z jater savců

Oblast techniky

Vynález se týká použití bílkovin, extrahovatelných z orgánů savců, zejména z jejich jater, pro výrobu farmaceutických prostředků pro léčení patologických stavů, při nichž dochází k hyperprodukci faktoru nekrózy nádorů TNF.

Dosavadní stav techniky

TNF, označovaný také jako kachektin, je cytokin, podporující zánětlivé pochody a hrající důležitou úlohu spolu s IL-1 při zahájení kaskády produkce dalších cytokinů a faktorů, které vyvolávají odpověď imunitního systému u infekcí a nádorů. Tato odpověď má zásadní význam pro další osud infekce a metastatických pochodů, avšak může dojít k tomu, že se vyvíjí neřízeným způsobem, takže dochází k poškození vlastního organismu. Hyperprodukce TNF patrně napomáhá vzniku celé řady pathologických stavů, jako jsou septický šok, kachexie u nádorových onemocnění, autoimunitní onemocnění, jako rheumatoidní arthritis a roztroušená skleróza, septikemie, vyvolaná meningokoky, Crohnova nemoc a pod.

V mezinárodní přihlášce WO 92/10197 se popisují bílkovinné frakce, extrahovatelné kyselinou chloristou z orgánů savců a použití těchto látek k potlačení nádorového bujení. V těchto frakcích bylo možno identifikovat 3 hlavní složky s molekulovou hmotností 50000, 14000 a 10000 při stanovení elektroforézou na gelu. Čištěný extrakt s obsahem těchto tří složek bude dále uváděn jako UK 101. Sekvence složky s molekulovou hmotností 14000, která je hlavní, ne-li jedinou bílkovinnou složkou s uváděnou účinností je popsána v mezinárodní přihlášce WO 95/02567 a je podobná sekvencím, které byly popsány dalšími autory například v publikaci Levy-Favatier, ·· • * · • · · • · • · *· • 99 9 ··

9· ·· ·· • · 9 9 9 9

9 9 9 9 • 9 999999

9 9

9999 99 99

Eur.Biochem.,1903, 212 (3) 665-73. Tito autoři se domnívají, že nově identifikované sekvence náleží do skupiny bílkovin, označovaných jako chaperoniny, do nichž náleží také bílkoviny tepelného šoku, HSP.

Bílkoviny, popsané v mezinárodních přihláškách WO 92/10197 a WO 96/02567 a dále označovaná jako UK 114 mají vlastností, které dosud nebyly pozorovány u chaperoninů nebo analogických bílkovin. Nyní bylo zjištěno, že tyto bílkoviny mohou podstatně snižovat koncentraci TNF v krevním oběhu a je tedy možno je použít k léčení patologických stavů, při nichž dochází k hyperprodukci TNF.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří použití bílkovin, extrahovatelných z jater savců kyselinou chlorístou pro výrobu farmaceutických prostředků, určených k prevenci a léčení patologických stavů, při nichž dochází k hyperprodukci TNF. Zvláště se vynález týká použití čištěné bílkoviny UK 114 k tomuto účelu.

Vynález se dále týká použití bílkovin s vysokou homologií vzhledem k UK 114, nejméně 80 %, s výhodou 90 % nebo ještě vyšší.

Účinnost bílkovin UK 101 a UK 114 byla prokázána in vitro na mononukleárních leukocytech z periferní krve a in vivo vyhodnocením účinnosti podávání UK 101 na produkci splenocytů u myší, jak bude dále uvedeno.

Zkoušky in vitro

Mononukleární leukocyty z periferní krve, PBMC v koncentraci 1 milion/ml byly stimulovány in vitro působením lipopolysacharidů v koncentraci lOO.ng/ml po dobu 4 hodin v • · • ·..

··· ·

přítomnosti nebo v nepřítomnosti UK 114 v koncentraci 1 nebo 10 mikrogramů/ml.

Koncentrace TNF byla měřena zkouškou ELISA. Výsledky

Produkce TNF u PBMC byla inhibována přidáním bílkoviny UK 114 in vitro.

Pokles byl 90% při použití koncentrace UK 114 v koncentraci 1 mikrogram/ml a 70% při použití koncentrace UK 114 10 mikrogramů/ml.

Zkoušky in vivo

Myším bylo podáváno 100 mikrogramů UK 101/myš každý druhý den po dobu 15 dnů (celkem 7 injekcí).

Koncentrace TNF byla měřena 48 hodin po první injekci a 48 hodin po posledním podání.

Příprava buněk a měření TNF

Splenocyty v množství 4xl0⁶ buněk/ml byly inkubovány v přítomnosti 10 mikrogramů/ml polyklonálního mitogenu Konkanavalinu-A po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého.

Množství vytvořeného a uvolněného TNF v supernatantu bylo stanoveno imunoenzymatickým postupem ELISA.

Výsledky

Podávání UK 101 významně snížilo produkci TNF u my ších splenocytů.Účinek je zřejmý 48 hodin po prvním podání a stále ještě 48 hodin po sedmém podání. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce jako koncentrace TNF v pg/ml.

h po 1.podání 48 h po 7.podání

Fyziologický roztok 387+/- 72 366+/- 46

UK-101

247+/-30° 264 + /-76, 1° • fl ·· · *· ·· * • flflfl flfl · · · «» · • · · · · · fl··· • ····· fl fl fl flfl fl flfl fl flfl· flfl flfl • fl flfl flflfl ···· flfl flfl = hodnota p

Je zřejmé, že UK 101 a UK 114 mají schopnost modifikovat průběh hyperprodukce TNF nebo zabránit patologickým stavům, charakterizovaným hyperprodukcí TNF, jako jsou roz5 troušená skleróza, revmatoidní arthritis, nádorová onemocnění, septický šok, Crohnova nemoc, apod.

Bílkoviny, zpracované na farmaceutické prostředky se s výhodou podávají injekčním způsobem.

Dávky, frekvence podávání a podobně je nutno stanovit 10 v závislosti na řadě faktorů jako jsou stav nemocného, závažnost onemocnění a další faktory. Obecně je možno uvést denní dávku v rozmezí 1 až 100 mg.

Bílkovinu je možno vyjádřit následující sekvencí:

	Met 1	Ser	Glu
5	Pro 15	Ala	Ala
	Arg	Thr ³⁰	lle
	Ser	Gly	Gin 45
10	Gin	Ala	Leu
	Cys	Asp	Phe
15	Asp 85	lle	Asn
	Tyr	Phe 100	Gin
	Ala	Ala	Leu 115
20	Ala	Val	Gin

Asn	Ser 5	Glu	Glu	Pro	Val
lle	Gly	Pro 20	Tyr	Ser	Gin
Tyr	lle	Ser	Gly 35	Gin	Leu
Leu	Val	Pro	Gly	Gly 50	Val
Thr 60	Asn	lle	Gly	Glu	lle 65
Thr	Asn 75	Val	Val	Lys	Ala
Asp	Phe	Ser 90	Ala	Val	Asn
Ser	Ser	Phe	Pro 105.	Ala	Arg
Pro	Lys	Gly	Gly	Arg 120	Val
Giy 130	Pro	Leu	Thr	Thr	Ala 135

Gly 10	Glu	Ala	Lys	Ala
Ala	Val 25	Leu	Val	Asp
Gly	Met	Asd 40	Pro	Ala
Val	Glu	Glu	Ala 55	Lys
Leu	Lys	Ala	Ala	Gly 70
Thr 80	Val	Leu	Leu	Ala
Asp	Val 95	Tyr	Lys	Gin
Ala	Ala	Tyr 110	Gin	Val
Glu	lle	Glu	Ala 125	lle
Ser	Val

·»

ΦΦ ·· • φ φ · φ · · ♦ » · φφφ * • φ φ φφ φφ φφ ·Φ * φ φφφφ φ φφφφ φ * φφφ φφφ φ φ φ φφφφ φφ φφ

Sekvence

1) Obecné informace

1) přihlašovatel

A) jméno: Zetesis s.p.a.

B) ulice: Galleria del Corso 2

C) město: Milán

E) stát: Itálie

F) poštovní kod (ZIP): 20122 ii) název vynálezu: použití bílkovin, extrahovatelných z jater savců.

iii) počet sekvencí: 1 iv) forma, odečitatelná počítačem

A) prostředí: Floppy disk

B) počítač: IMB PC-kompatíbílni

C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D) software: Patentln Release 1,0, verse 1,30 (EPO)

2) informace o sekvenci č.l

A) délka: 137 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) typ řetězce:

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: bílkovina iii) hypotetická sekvence: 0 iv) nesmyslná sekvence: 0 xi) popis sekvence č.l: odpovídá sekvenci, uvedené na straně 4.

Zastupuje :

Claims

β

PATENTOVÉ NÁROKY • 0 00 · ·· ·· ··

0 4 0 0 · · · · · * · · • « · · · · 0 0 0 0 • 0 ·0· 0 · · · ··♦ ··»

0 0 0 * · · · • 0 ·· ··· ···· ·* *·<->,/ i

1/

1. Použití bílkovin, extrahovatelných kyselinou chloristou z jater savců pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a léčení patologických stavů, u nichž dochází k hyperprodukci TNF.

2. Použití podle nároku 1, při němž se užije bílkovina s následující sekvencí:

5 Met 1 Pro 15 Arg Ser Ser Ala Thr ³⁰ Gly Glu Asn Ser 5 Gly Ile Val Glu Pro 20 Ser Pro Glu Tyr Gly 35 Gly Pro Ser Gin Gly 50 Val Gly Glu Ala Leu Asp 40 Glu Lys Val Pro Ala 55 Ala Asp Ala Lys 10 Gin Ala Leu Gly Val 25 Met Glu Ala Ile Gin 45 Ile Tyr Leu Val Val 10 Gin Ala Leu Thr Asn Ile Gly Glu Ile Leu Lys Ala Ala Gly 60 65 70 Cys Asp Phe Thr Asn Val Val Lys Ala Thr Val Leu Leu Ala 75 80 Asp Ile Asn Asp Phe Ser Ala Val Asn Asp Val Tyr Lys Gin 15 85 90 95 Tyr Phe Gin Ser Ser Phe Pro Ala Arg Ala Ala Tyr Gin Val 100 105 110 Ala Ala Leu Pro Lys Gly Gly Arg Val Glu Ile Glu Ala Ile 115 120 125 20 Ala Val Gin Gly Pro Leu Thr Thr Ala Ser Val 130 135

3. Použití podle nároku 1, při němž se užije bílkovina s homologií nejméně 80 % vzhledem k bílkovině z nároku.

Zastupuje :