CZ333398A3

CZ333398A3 - Protein a farmaceutický prostředek s jeho obsahem

Info

Publication number: CZ333398A3
Application number: CZ983333A
Authority: CZ
Inventors: Anna Maria Helena Boots; Gijsbertus Franciscus Maria Verheijden; Ebo Sybren Bos
Original assignee: Akzo Nobel N. V.
Priority date: 1996-04-18
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 1999-03-17
Also published as: NZ332311A; HUP9903378A2; BR9708714A; HUP9903378A3; CA2251584A1; JP2000509265A; PL187451B1; RU2189248C2; KR20000005476A; TR199802082T2; NO984835D0; US5843449A; AU724547B2; CN1216582A; HU221348B1; WO1997040149A1; PL329350A1; EP0904369A1; NO984835L; AU2386997A

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového autoantigenu a jemu příbuzných proteinů, jejich použití v léčbě chronické destrukce kloubní chrupavky při autoimunitních onemocněních, farmaceutických prostředků obsahujících uvedený autoantigen a/nebo proteiny, způsobu diagnostiky pro určení autoreaktivních buněk T v testovaném vzorku a testovací soupravy pro uvedenou diagnostickou metodu.

Dosavadní stav techniky

Imunitní systém je založen na schopnosti rozlišit mezi cizími antigeny („non-self“ antigeny) a autoantigeny („šelf“ antigeny, odvozené z vlastního organismu), jíž je dosaženo vytvořením tolerance vůči autoantigenům.

is Imunitní systém chrání jedince před cizími antigeny a na setkání s cizím antigenem odpovídá tím, že aktivuje specifické buňky, jako jsou lymfocyty T a B, a produkuje rozpustné faktory jako interleukiny, protilátky a komplementový systém. Antigen, vůči němuž imunitní systém reaguje, je degradován buňkami presentujícími

2o antigen (APCs, antigen presenting celíš) a fragment antigenu je exprimován na buněčném povrchu v kombinaci s glykoproteiny hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) II. třídy. Komplex glykoprotein MHC - fragment antigenu je předkládán buňce T, která prostřednictvím svého T receptoru rozpozná fragment antigenu společně s proteinem MHC II.třídy, s nímž je svázán. Buňka T je aktivována, tzn. proliferuje a/nebo produkuje interleukiny, což vede k expansi aktivovaných lymfocytů namířených proti danému antigenu (Grey et al., Sci.Am., 261: 38-46,1989).

·· ·· · ·· ·· ·· • ·· · · · · · · · · · • ·· · · · · ·· ·· ·· · · · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··· ···· ·· ··

-2Vlastní antigeny jsou rovněž průběžně degradovány a jako fragmenty antigenu vázané na glykoproteinech MHC předkládány buňkám T (Jardetsky et al., Nátuře 353:326-329.1991). Sebe rozpoznávání je tedy vlastní imunitnímu systému. Za normálních okolností je imunitní systém tolerantní vůči svým vlastním antigenům a k aktivaci imunitní odpovědi těmito autoantigeny nedochází.

Při ztrátě tolerance vůči vlastním antigenům je imunitní systém aktivován proti jednomu nebo více vlastním antigenům, což vede k aktivaci autoreaktivnch buněk Tak produkci autoprotilátek. io Tento jev se nazývá autoimunita. Jelikož imunitní odpověď je obecně vzato destruktivní, tzn. má za úkol zničit cizí antigen, který vnikl do organismu, může autoimunitní odpověď způsobit destrukci vlastní tkáně.

Role buněk T v autoimunitních chorobách byla prokázána 15 několika studiemi. U myší je experimentální autoimunitní encefalomyelitida (EAE) zprostředkována velmi úzkou skupinou buněk T, majících společnou specifitu k jedinému epitopu myelinového basického proteinu (MBP) v komplexu s molekulou MHC II. třídy. U laboratorních potkanů inbredního kmene Lewis, tj. kmene s velkou

2o náchylností k různým autoimunitním chorobám, bylo prokázáno, že choroba je zprostředkovaná buňkami T. U lidí se rovněž předpokládá, že autoimunitní choroby souvisejí se vznikem autoagresivních buněk T.

Na autoimunitní destruktivní odpověď se usuzuje u různých

2s chorob jako je např. revmatoidní artritida (RA), při které dochází k poškození kloubní chrupavky chronickým zánětlivým procesem způsobeným přítomností velkého počtu aktivovaných lymfocytů a buněk exprimujících MHC II. třídy. Pouhá přítomnost chrupavky se zdá být postačující k udržení lokální zánětlivé reakce: bylo prokázáno,

3o že poškození chrupavky při RA souvisí s aktivitou autoreaktivních buněk T namířených proti chrupavce (Sigall et al., Clin.Exp.Rheumat.

·· ·· · ·· ·· ·· • ·· · ··· · · · · · • ·· · · · · ·· ·· · · *' · · · · · · · · • · · ·· ··· ···· ·· ··· ···· ·· ···

- 36:59, 1988; Glant et al., Biochem.Soc.Trans. 18:796, 1990; Burmester et al., Rheumatoid arthritis, Smolen, Kalden, Maini (Eds) SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, 1992). Kromě toho, chirurgické odstranění chrupavky vedlo u pacientů s RA k potlačení zánětlivého procesu (G.S.Panayi et a,., Clin.Exp.Rheumatol. 11 (suppl.8):S1-S8, 1993). Bílkoviny chrupavky jsou proto považovány za cílové autoantigeny, schopné stimulovat buňky T. Aktivace těchto autoreaktivních buněk T vede ke vzniku autoimunitní choroby. Autoantigenní komponenty, které hrají roli při nastartování revmatoidní io artritidy však dosud zůstávají neznámé.

Zánětlivá odpověď vedoucí k destrukci chrupavky může být léčena několika typy léčiv jako jsou například steroidní antirevmatika. Tyto léky však často působí jako imunosupresíva, která jsou nespecifická a mají toxické vedlejší účinky. Vzhledem k nespecifické imunosupresi není tato terapie příliš výhodná.

Lákavou alternativu k nespecifické imunosupresi představuje netoxická, k antigenů specifická, imunosupresivní terapie. Tato terapie specifická vůči antigenů spočívá v tom, že pacientům je podáván cílový autoantigen nebo antigeny mající aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje sekvenční homologii s aminokyselinovou sekvencí cílového autoantigenu, nebo syntetické peptidy odvozené z uvedeného autoantigenu nebo uvedeného antigenů. Tyto syntetické peptidy odpovídají epitopům, vůči nimž jsou namířeny buňky T, a mohou být použity k indukci specifické T-buněčné tolerance jak vůči sobě samým, tak vůči autoantigenu. Ačkoliv se může zdát paradoxní desenzibiiizovat imunitní systém právě tím antigenem, který je zodpovědný za aktivaci imunitního systému, regulované podávání cílového (auto)antigenu může být velmi účinným při desenzibilizaci imunitního systému. Desenzibiiizace nebo imunologická tolerance imunitního systému je založena na dávno pozorovaném jevu, že zvířata, která byla krmena nebo inhalovala • ·· ♦ · · ·

antigen nebo jeho epitop byla méně schopná vytvořit systémovou imunitní odpověď vůči uvedenému antigenu nebo epitopu, když jim byl následně uvedený antigen nebo epitop podán standardním způsobem.

Pro účinné využití toleranční terapie na léčbu destrukce chrupavky zprostředkované buňkami T je velmi žádoucí určit zodpovědný autoantigen nebo antigeny mající aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje sekvenční homologii s aminokyselinovou sekvencí cílového autoantigenu, aby bylo možné desenzibilizovat pacienty proti autoantigenu, který aktivuje buňky T zodpovědné za zánětlivý proces.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je poskytnout autoantigen a proteiny mající aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje dostatečnou homologii s aminokyselinovou sekvencí autoantigenu, přičemž uvedený autoantigen a/nebo protein je vhodný k indukci specifické T-buněčné tolerance vůči antigenu chrupavky a je u pacientů trpících destrukcí chrupavky zprostředkovanou buňkami T zodpovědný za tento stav. Dalším předmětem vynálezu je poskytnout zvířecí modely artritidy, které by byly vhodné pro systematické testování nových léků pro potlačení symptomů artritidy. Dalším cílem vynálezu je poskytnout způsob detekce autoreaktivních buněk T, které se účastní destrukce kloubní chrupavky a testovací soupravy k použití při uvedeném způsobu detekce.

U pacientů trpících RA bylo překvapivě zjištěno, že lidský chrupavkový glykoprotein 39 (dále zde označovaný jako HC gp-39) je cílovým autoantigenem, který aktivuje specifické buňky T, a tím . »«**·· ............... - .

• · způsobuje či se podílí na zánětlivém procesu. Artritogenní potenciál HC gp-39 byl potvrzen u myší kmene Balb/c. Jediná podkožní injekce uvedeného proteinu byla u myší Balb/c schopná vyvolat artritické příznaky. Průběh onemocnění vyvolaného HC gp-39 proteinem se vyznačoval pravidelnými relapsy na předních a/nebo zadních tlapkách, a postupným přechodem od mírné artritidy do těžší formy. Rovněž bylo pozorováno symetrické postižení kloubů, což spolu s opakovanými relapsy a tvorbou nodulů připomíná progresi choroby při artritidě, zejména RA.

Ještě překvapivější byl nález, že podávání HC gp-39 vedlo k imunologické toleranci, a co je ještě důležitější, že došlo k oddálení a/nebo potlačení rozvoje artritidy.

Dále bylo překvapivě zjištěno, že proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39 jsou schopné po injikování do zvířat vyvolat artritidu. Obzvláště proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID

2o NO: 1) byly schopné indukovat ve zvířatech artritidu stejným způsobem, jak bylo popsáno pro HC gp-39.

Tyto artritogenní proteiny s výhodou obsahují aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 70%, výhodněji 80%, ještě výhodněji 90% homologii s aminokyselinovou sekvencí proteinu HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1).

Procento sekvenční homologie mezi artritogenními proteiny podle vynálezu a aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 1 se stanovuje pomocí programů obecně užívaných pro srovnávání • · • 49 · 4 4 4 ·· ••49 4 94 444 9 4 • 44 44 444 ···· · 4 4949944 44 44

- 6 sekvencí, např. FASTA (W.R. Pearson a D. J. Lipman, Proč.Nati.Acad.Sci.USA, 85,2444-2448,1988).

Vhodné artritogenní proteiny podle vynálezu jsou např. prasečí heparin-vazebný 38kDa protein, hovězí syrovátkový 39kDa protein, lidský YKL-39 protein, myší 39kDa protein regredující mléčnou žlázu (brp39, breast regressing protein), lidský ovidukt-specifický glykoprotein, myší ovidukt-specifický glykoprotein, křeččí oviduktspecifický glykoprotein, hovězí ovidukt-specifický glykoprotein, prekursor lidské chitotriosidasy a prekursor myšího sekrečního io proteinu YM-1. Artritogenní proteiny podle vynálezu jsou velmi vhodné k indukci systémové tolerance imunitního systému vůči homologním autoantigenům a mohou být použity k oddálení a/nebo potlačení rozvoje artritidy u savců.

HC gp-39 je přítomen v séru jak pacientů, tak zdravých dospělých jedinců, přičemž koncentrace proteinu je asi dvakrát vyšší u pacientů než u zdravých dospělých. Mimoto se mRNA kódující HC gp-39 protein vyskytuje v synoviálních vzorcích nebo v chrupavce pacientů trpících RA, zatímco chrupavka získaná při chirurgických zákrocích od zdravých dospělých jedinců neobsahuje významné

2o množství této mRNA. Při kultivaci kloubních chondrocytů a synoviálních buněk se jako hlavní sekreční produkt nachází HC gp39 (Hakala et al., J Biol.Chem. 268 (34):25803,1993). Artritogenní povaha HC gp-39 nebyla ani popsána, ani zmíněna v publikaci Hakala et al., ani v žádné jiné práci.

Byly popsány proteiny, jejichž aminokyselinová sekvence vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1). Shackelton et al. (1995), J Biol.Chem. 270 (22): 13076-13083 popsal prasečí heparin-vazebný 38kDa protein, avšak žádnou funkci tohoto proteinu nestanovil. Izolaci a charakterizaci hovězího • · ···' ·· ··· ···· *· ··

- 7 syrovátkového 39kDa proteinu popsal J. J. Rejman et al. (1988), Biochem.Biophys.Res.Comm. 150 (1), 329-334. Myší 39kDa protein regredující mléčnou žlázu (brp39) popisují Morrison a Leder, 1994, Oncogene 9, 3417. Nakloňování cDNA kódující lidský ovidukt5 specifický glykoprotein a odpovídající aminokyselinová sekvence jsou popsány vArias et al. (1994), Biology of Reproduction 51, 685-694. Další savčí ovidukt-specifické glykoproteiny jako jsou myší a křeččí ovidukt-specifický glykoprotein jsou zveřejněny v JP-A-07107979, Kinosei Peptide Kenkyusho KK. Purifikace a molekulární klonování io hovězího ovidukt-specifického glykoproteinu je popsána v Y. Senday et al., 1994, Biol. of Reprod. 50, 927-934. Prekursor lidské chitotriosidasy je secernován aktivovanými lidskými makrofágy, a klonování odpovídající cDNA a aminokyselinová sekvence jsou popsány v Boot et al. (1995) J Biol.Chem. 270 (44), 26252-26256.

Aminokyselinová sekvence prekursoru myšího sekrečního proteinu YM-1 byla postoupena do databáze EMBL Data Library, June 1992, Accession No. M94584 (Chang et al., nepublikováno). Aminokyselinovou sekvenci lidského chondrocytového proteinu YKL39 popsal Hu et al. (1996), J Biol.Chem. 271 (32), 19415-19420.

Žádná z výše uvedených publikací však ani v nejmenším nenaznačuje cokoli o artritogenní povaze proteinů podle vynálezu, ani neuvádí skutečnost, že tyto proteiny by mohly být použity v terapii jako léčebný prostředek k indukci specifické T-buněčné tolerance vůči HC gp-39 u savců, přesněji u lidí, trpících destrukcí chrupavky zprostředkovanou buňkami T, jako je např. artritida, přesněji revmatoidní artritida.

Podle vynálezu jsou tedy HC gp-39 a proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí proteinu HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí • t · · • · · · • · · • · · * • · · • · · · · ·

-8YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1) velmi vhodné pro terapii, kdy indukují specifickou Tbuněčnou toleranci vůči HC gp-39 u pacientů trpících destrukcí chrupavky zprostředkovanou buňkami T, jako je např. artritida, přesněji revmatoidní artritida. Vynález se rovněž týká fragmentů proteinu HC gp-39 a artritogenních proteinů podle vynálezu, které jsou schopné v napadené chrupavce indukovat T-buněčnou toleranci vůči HC gp-39 autoantigenu.

Diagnostické využití HC gp-39 jako markéru pro RA je popsáno io v dokumentech WO 95/01995 a WO 95/02188, avšak artritogenní povaha HC gp-39 v nich není ani zveřejněna ani navržena. Není v nich ani zmínky či náznaku ohledně použití v předkládaném vynálezu uvedeného proteinu HC gp-39 nebo jeho fragmentů nebo peptidů, vůči nimž reagují buňky T v antigen-specifické terapii navozující v napadené chrupavce T-buněčnou toleranci vůči HC gp39.

Glykoprotein HC gp-39, artritogenní proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1), a fragmenty odvozené z uvedených artritogenních proteinů podle vynálezu mohou být připraveny pomocí technik rekombinantní

DNA. K tomuto účelu se vloží do expresního vektoru nukleová kyselina kódující HC gp-39 nebo protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1), nebo fragment odvozený z proteinů podle vynálezu nebo multimér uvedeného fragmentu. Vhodné expresní vektory jsou mj. plasmidy, kosmidy, viry a YACy (Yeast Artificial Chromosome, tj. kvasinkový umělý chromosom), které obsahují potřebné kontrolní oblasti pro replikaci a expresi. Expresní vektor se může přivést k expresi v hostitelské buňce. Vhodné hostitelské buňky jsou např. bakterie, kvasinky a savčí buňky. Takovéto techniky jsou v oboru dobře známé (manuál Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).

Těmito technikami rekombinantní DNA lze připravit v hostitelské buňce hovězí syrovátkový protein, jehož sekvence je zde zveřejněna.

Předkládaný vynález tedy poskytuje rovněž izolovanou cDNA, uvedenou v SEQ ID NO:3, jež kóduje hovězí syrovátkový protein, jakož i hovězí syrovátkový protein podle sekvence SEQ ID NO:2. Je zřejmé, že na základě faktů plynoucích z předkládaného vynálezu mohou být připraveny rovněž fragmenty. Termínem „fragment“ se označuje jakákoli aminokyselinová sekvence, která je částí proteinu a která má společné prvky původu, struktury a mechanismu účinku,

2o jichž se týká předkládaný vynález.

Vhodné fragmenty odvozené z artritogenních proteinů podle vynálezu mohou být též připraveny metodami známými v organické chemii pro syntézu peptidů. Metody organické chemie pro peptidovou syntézu zahrnují spojování požadovaných aminokyselin pomocí kondensační reakce, buď v roztoku nebo s použitím tzv. pevné fáze. Nejběžnější způsoby provedení výše uvedených kondensačních reakcí jsou: metoda karbodiimidová, metoda azidová, metoda užívající směsného anhydridu a metoda užívající aktivovaných esterů, jak jsou popsány v The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-3 (Ed.

Gross, E. A Meienhofer, J.) 1979, 1980, 1981 (Academie Press, lne.).

- 10 • · » · • · · • φφ • · • · «··· ·· • · ·· ♦· « · · · · · • ♦ · Φ· • * φφφ « ♦ φ · φ ·

ΦΦΦΦ φ Φ **

Příprava vhodných fragmentů výše uvedeného proteinu HC gp-39 a artritogenních proteinů podle vynálezu metodou „pevné fáze“ je popsána např. v J.Am.Chem.Soc. 85: 2149 (1963) a v Int.J.Peptide Protein Res. 35: 161-214 (1990).

Obzvláště vhodná pevná fáze je např. p-alkoxybenzyl alkoholová pryskyřice (4-hydroxy-metyl-fenoxy-metyl-kopolystyren-1 % divinylbenzen), kterou popsal Wang (1974) J.Am.Chem.Soc. 95:1328. Po syntéze mohou být peptidy od takovéhoto nosiče za mírných podmínek odštěpeny.

io Po syntéze požadované aminokyselinové sekvence následuje odštěpení peptidu z pryskyřice, např. kyselinou trifluoroctovou v přítomnosti akceptorů, např. triisopropyl silanu, anisolu nebo etandithiolu nebo thioanisolu.

Reaktivní skupiny, které se nemají účastnit kondensační reakce je třeba účinně chránit skupinami, které mohou být opět snadno odstraněny hydrolýzou pomocí kyseliny, báze nebo redukcí. Podrobnější rozbor možných chránících skupin lze najít v The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-9 (Eds. Gross, Udenfriend a Meienhofer) 1979 - 1987 (Academie Press, lne.).

Chránící skupiny mohou být odštěpeny různými obvyklými metodami v závislosti na povaze konkrétní skupiny, např. pomocí kyseliny trifluoroctové nebo mírnou redukcí, např. vodíkem v přítomnosti katalyzátoru, např. paladia, nebo pomocí HBr v ledové kyselině octové.

2s Přestože se desenzibilizace imunitního systému přesně týmž antigenem, který je za jeho aktivaci zodpovědný může zdát paradoxní, je tento postup založen na dlouho známem úkazu, že zvířata, která byla krmena nebo která vdechla antigen nebo jeho epitop byla méně schopná vytvořit systémovou imunitní odpověď vůči uvedenému antigenu nebo epitopu, když jim byl následně uvedený antigen nebo epitop injikován standardním způsobem. Takže regulované podávání » «· • φ « • ·· • Φ *« φ φ φ · · ♦ • β · φφ

Φ Λ φφΦΦ Φ

Φ · · · φ ΦΦΦΦ ·♦ ··

- 11 HC gp-39 a/nebo proteinů obsahujících aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID

NO: 1) může účinně desenzibilizovat imunitní systém. Fragmenty proteinů podle vynálezu, jež jsou schopné desenzibilizovat pacienty vůči HC gp-39 jsou rovněž součástí vynálezu.

Pacienti, jejichž chrupavka je napadána autoreaktivními buňkami T, mohou být podle vynálezu léčeni farmaceutickým prostředkem obsahujícím HC gp-39, jeden nebo více proteinů obsahujících aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1) nebo jeden nebo více fragmentů odvozených z proteinu podle vynálezu, a farmaceuticky přijatelný nosič, aby se specifické autoreaktivní buňky T těchto pacientů staly tolerantními vůči HC gp-39 v napadené chrupavce a došlo ke snížení zánětlivé odpovědi.

Proteiny použitelné pro farmaceutický prostředek podle 20 vynálezu jsou proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 70%, s výhodou 80%, ještě výhodněji 90% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID

NO: 1).

Proteiny velmi vhodné na použití do farmaceutického prostředku podle vynálezu jsou např. prasečí heparin-vazebný 38kDa protein, hovězí syrovátkový 39kDa protein, myší 39kDa protein regredující mléčnou žlázu (brp39), myší ovidukt-specifický glykoprotein, křeččí ovidukt-specifický glykoprotein, hovězí ovidukt-specifický glykoprotein, lidský YKL-39, lidský ovidukt-specifický glykoprotein,

φφ φφ φ φ φ φ φφ φ φ

Φ..

·· φφ φ φ φ φ φ φ φφ φ φφφ φ φ φ φ · • · φ ·

- 12prekursor lidské chitotriosidasy a prekursor myšího sekrečního proteinu YM-1.

Velmi vhodné pro použití jako farmaceutický prostředek podle vynálezu jsou rovněž DNA (expresní) vektory obsahující DNA, která kóduje HC gp-39 nebo protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1), nebo jeden nebo více fragmentů odvozených z proteinů io podle vynálezu. Po vnesení může DNA (expresní) vektor exprimovat rekombinantní HC gp-39 nebo protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1), nebo fragmenty podle vynálezu v hladině, která je podobná hladině, jež by byla dosažena přímým podáním farmaceutického prostředku obsahujícího HC gp-39 protein nebo peptidy.

Autoantigen HC gp-39, artritogenní proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1) a fragmenty odvozené z uvedených artritogenních proteinů podle vynálezu jsou výhodné v tom, že narozdíl od nespecifického supresivního účinku steroidních imunosupresív, mají specifický tolerizující účinek na autoreaktivní buňky T, zatímco ostatní složky imunitního systému ponechávají intaktní. Léčba autoantigenem nebo proteiny obsahujícími aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

44 94

4 4 4 4 * • 4 4 4 4

9 444 · 4 • 4 4 4 «••4 44 44 • 4 • · · · · • 99

9 9 9

4 9

9949 44 4

- 13 YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1), nebo fragmenty podle vynálezu bude bezpečná, bez toxických vedlejších účinků.

Tolerance může být dosaženo podáváním vysokých nebo 5 nízkých dávek autoantigenu nebo proteinů podle vynálezu. Množství autoantigenu nebo proteinu bude závislé na způsobu a délce aplikace, věku pacienta, jakož i na jeho všeobecném zdravotním stavu a výživě.

Obecně mohou být použity dávky 0,01 až 1000 pg, s výhodou io 0,5 až 500 pg, ještě výhodněji 0,1 až 100 pg proteinu na kg tělesné váhy.

Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou dobře známé pracovníkům v oboru a zahrnují například sterilní fyziologický roztok, laktosu, sacharosu, fosforečnan vápenatý, želatinu, dextrin, agar, pektin, podzemnicový olej, olivový olej, sezamový olej a vodu. Další nosiče, například molekuly MHC II.třídy, mohou být, je-li to žádoucí, zabudované v Iiposomech.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu může navíc obsahovat jedno nebo více adjuvans. Vhodná adjuvans zahrnují mimo jiné hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, amfigen, tokofenoly, monofosfenyl lipid A, muramyl dipeptid a saponiny jako je Quill A. Množství adjuvans závisí na vlastnostech samotného adjuvans.

Mimoto může farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahovat jeden nebo více stabilizátorů jako jsou například karbohydráty vč. sorbitolu, manitolu, škrobu, sacharodextrinu a glukosy, proteiny jako jsou albumin nebo kasein a pufry, např. fosfátové.

Vhodné způsoby aplikace jsou nitrosvalové injekce, podkožní injekce, nitrožilní injekce nebo intraperitoneální injekce, orální a

14• · « • ·· » · 4 ·· ·· » · · 4 » · ·· t·· ♦ 1 • · « • · ·· intranazální podávání. Orální a intranazální podávání je preferovaným způsobem aplikace.

HC gp-39, jakož i proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1), mohou být díky svým artritogenním vlastnostem použity na vyvolání klinické artritidy u zvířat. Po podání malých množství HC gp-39 nebo jednoho nebo více proteinů obsahujících io aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1) nebo jednoho nebo více fragmentů proteinů podle vynálezu se u uvedených zvířat objeví artritické příznaky vedoucí k obrazu choroby, který připomíná progresi choroby u artritidy, zejména revmatoidní artritidy. Když byly myši kmene Balb/c injikovány podkožně proteinem HC gp-39 nebo proteinem obsahujícím aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s

2o aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1) objevily se u zvířat artritické příznaky. Průběh choroby vyvolané proteinem HC gp-39, jakož i choroby indukované proteinem obsahujícím aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1) se vyznačoval pravidelně opakovanými relapsy v předních

3o a/nebo zadních tlapkách a postupným rozvojem artritidy od mírné do těžší formy. Rovněž bylo pozorováno symetrické postižení kloubů , ·· ·· » * · • ·· ···· ··

- 15což spolu s pozorovanými relapsy a tvorbou nodulů připomíná progresi choroby při artritidě, zejména RA.

Tato postižená zvířata tedy poskytují vhodný zvířecí model pro studium mechanismu vzniku a postupného rozvoje artritidy. Navíc mohou takto postižená zvířata sloužit při vyhledávání nových léků na artritidu a studiu jejich účinku. Jako zvířecí model artritidy, zejména revmatoidní artritidy jsou s výhodou používány myši.

K vyvolání artritidy u uvedených zvířat jim musí být podáno vhodné množství HC gp-39 nebo jednoho nebo více proteinů podle io vynálezu. Vhodná množství jsou 0,1 -1000pg, s výhodou 1 - 100pg, ještě výhodněji 10 - 50pg na kg tělesné váhy. Množství HC gp-39 nebo proteinů obsahujících aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1) nebo jejich fragmentů bude záviset na způsobu a délce aplikace a na typu použitého zvířete. Vhodné způsoby aplikace jsou shodné s již dříve uvedenými. HC gp-39 protein nebo proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1), nebo peptidy podle vynálezu mohou k vyvolání artritidy obsahovat jeden nebo více stabilizátorů nebo adjuvans, jak již bylo uvedeno.

HC gp-39, proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID

NO: 1), nebo jejich fragmenty podle vynálezu jsou rovněž velmi vhodné pro využití v diagnostice na určení přítomnosti aktivovaných ·· ·» • · · · • ·· ♦ · · • · · •··· ··

-16·· ·· • · · · · « • · · ·· • » ··· · · • · · · ···« ·« ·· autoreaktivních buněk T zúčastněných v chronickém zánětu kloubní chrupavky.

Způsob diagnostiky podle vynálezu zahrnuje následující kroky:

a) izolace mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) 5 ze vzorku odebrané krve,

b) kultivace uvedených PBMC za vhodných podmínek,

c) inkubace uvedené kultury PMBC v přítomnosti autoantigenu nebo proteinů podle vynálezu a jejich fragmentů, a

d) detekce odpovědi buněk T, například proiiferační odpovědi, 10 jež indikuje přítomnost aktivovaných autoreaktivních buněk T u testované osoby.

Při detekci odpovědi měřením proiiferační odpovědi autoreaktivních buněk T je mírou proliferace inkorporace radioizotopu jako je například ³H-thymidin. Odpověď autoreaktivních buněk T přítomných v PBMC může být též určena stanovením uvolněného cytokinu pomocí cytokin - specifického testu ELISA nebo stanovením cytotoxicity pomocí testu na uvolnění ⁵¹Cr. Další detekční metodou je stanovení exprese markérů aktivace, např. receptoru IL-2R, pomocí FACS analýzy. Diagnostický prostředek obsahující jeden nebo více peptidu podle vynálezu a vhodné detekční činidlo je tedy součástí vynálezu. V závislosti na typu detekce může detekčním činidlem být radioizotop, enzym nebo protilátky specifické pro buněčné povrchové nebo aktivační markéry.

Vynález rovněž zahrnuje testovací soupravy, které obsahují jeden nebo více peptidu podle vynálezu. Tyto soupravy jsou vhodné pro použití při způsobu diagnostiky podle vynálezu.

Předkládaný vynález tak poskytuje způsob jak určit, zda pacienti trpící destrukcí chrupavky zprostředkovanou buňkami T, jako např. artritidou, obzvláště revmatoidní artritidou, mají přítomny « «

- 17·♦ • · · · • ·· • · · · • · · ···· ·· ·· • · ·«·· • · · • ·

999 9 • ·

9

9 autoagresivní buňky T reaktivní vůči proteinu HC gp-39. Jsou-li tyto HC gp-39 - specifické buňky T přítomny, lze oddálit nebo potlačit progresi artritidy tolerizací těchto buněk T pomocí farmaceutického prostředku, který obsahuje HC gp-39 nebo jeden či více artritogenních proteinů obsahujících aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí HC gp-39, obzvláště s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1), nebo peptidy podle předkládaného vynálezu, nebo nějakou io jejich kombinaci.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Začátek a progrese artritidy u myší kmene Balb/c tolerizovaných a netolerizovaných proteinem HC gp-39. AS = celkové artritické skóre postižených zvířat na den po senzibilizaci. N = počet postižených zvířat na den po senzibilizaci.

Obrázek 2: Začátek a progrese artritidy u myší kmene Baib/c po podání 0,2 pg, 1 pg, 5 pg a 25 pg hovězího syrovátkového 39

2o kOa proteinu. Začátek/progrese je vyjádřen jako kumulativní skóre (celkové arthritické skóre postižených zvířat) na den po senzibilizaci

Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu a v žádném případě je nelze chápat jako omezení rozsahu vynálezu.

í f

r í - 18 í

A · ·· AA « · · • ·· • · • · A

AAAA ··

·<* AA • A A · • A AA ··· · · • · A

A· ·«

Příklady provedení vvnálezu

PŘÍKLAD 1

METODY

Purifikace HC gp-39 z buněčné linie osteosarkomu MG63

Buňky MG63 (lidský osteosarkom, ATCC CRL 1427) byly kultivovány v kultivátorech v bezsérovém médiu DMEM/HAM F12. Protein HC gp-39 byl vyčištěn z buněčného supernatantu afinitní chromatografií na heparinu a dále chromatografií na Superdexu 75. Čistota byla kontrolována pomocí SDS-PAGE. Kromě toho bylo io stanovením N-koncové aminokyselinové sekvence potvrzeno, že purifikovaný protein je identický s proteinem, který popsali Hakaia et al.

Artritogenita HC gp-39 u myší kmene Balb/c nebo 50 pg purifikovaného HC gp-39 ve 100 pl PBS (0,5M

NaCI, 0,01 M pufr fosforečnanu sodného pH 7,5) smíchaných v poměru 1:1 s nekompletním Freundovým adjuvans (IFA) bylo injikováno podkožně v hrudní oblasti 2x4 samic myší kmene Balb/c (Harian CPB, Zeist, Holandsko), zatímco 4 kontroly byly injikovány roztokem PBS (1:1 v IFA). U myší byly denně vyšetřovány klinické

2o příznaky artritidy. Závažnost artritidy byla hodnocena skórem pro každou tlapku podle stupnice 0-3 (viz článek Glant et al.). Stručně, hodnota skóre 0 = žádné změny, skóre 1 = zarudnutí a zduření, skóre 2 = zduření a výskyt deformit, skóre 3 = nepohyblivost způsobená ztrátou schopnosti ohybu a natažení.

Navození tolerance intranazální aplikací HC gp-39 pg proteinu bylo aplikováno intranazálně (2 x 10 pl) 10 samicím myší kmene Balb/c (lehce znecitlivěným preparátem ·· ·· 9 99 ·· 99

9 9 99 9 9 9 9 9 9

999 9 9.9999

99 9 9 · ·····

Enflurance) pomocí mikrotrubičky PT45 a injekční stříkačky Hamilton. Antigen byl podáván 15., 10., a 5. den před indukcí artritidy. Kontrolní myši (n = 10) byly podrobeny stejné proceduře, ale byl jim podáván pouze nosič (PBS) (Tabulka 1).

Imunologická tolerance byla hodnocena stanovením přecitlivělosti oddáleného typu (DTH, delayed type hypersensitivity), která následovala po senzibiiizaci v den O, jak je popsáno výše, při použití 10 gg proteinu. Senzibiiizaci v den 0 následovala 8.den výzevná dávka (challenge) ve formě injekce 10 gg HC gp-39 v objemu io 50 gl do levé zadní tlapky. DTH reakce byly měřeny jako zvětšení tlapky ([zduření levé (mm x 10'³ ) - zduření pravé (mm x 10’³)j / zduření pravé (mm x 10'³ )) x 100%. Zduření tlapky bylo měřeno pomocí mikrometru vlastní konstrukce v časovém odstupu 0, 24 a 48 hodin po výzevné dávce.

Tolerance k vyvolání artritidy u týchž myší byla dále monitorovaná až do 31.dne po senzibiiizaci au myší byly denně vyšetřovány klinické příznaky. Závažnost artritidy byla hodnocena jak uvedeno výše.

· · · • · · · ·· · · ·

-20Tabulka 1. Tolerizační schéma.

DEN	tolerizace vůči HC gp-39	bez tolerizace
-15	28ggHC gp-39 intranazálně	PBS
-10	28ggHC gp-39 intranazálně	PBS
-5	28ggHC gp-39 intranazálně	PBS
0	10ggHC gp-39 subkutánně	10ggHC gp-39 subkutánně
8	10ggHC gp-39 do tlapky	10ggHC gp-39 do tlapky
9	24 hodin DTH	24 hodin DTH
10	48 hodin DTH	48 hodin DTH
0-31	hodnocení příznaků artritidy	hodnocení příznaků artritidy

DTH = přecitlivělost oddáleného typu, PBS = 0,5M NaCI, 0,01 M pufr fosforečnanu sodného pH 7,5

VÝSLEDKY

Artritogenita HC gp-39

Po jedné injekci 50 gg HC gp-39 smíchaného s IFA se u všech myší postupně vyvinula těžká artritida (Tabulka 2). První příznaky artritidy se objevily 15 až 20 dnů po senzibilizaci v předních tlapkách io u 3 ze 4 zvířat. U myši, která v předních tlapkách neměla žádný nález, se artritida projevila v zadních tlapkách do 34. dne po senzibilizaci. Průběh choroby vyvolané proteinem HC gp-39 se vyznačoval pravidelnými relapsy v předních nebo zadních tlapkách a mírná artritida se postupně vyvinula v těžší formu (progrese choroby byla sledována po dobu 62 dnů). Velmi často (víc než v 50%) byla pozorována symetrie v postižení kloubů, tzn., že příznaky artritidy se objevily současně v obou předních tlapkách nebo v obou zadních tlapkách.

Vyvolání artritidy bylo podobně docíleno při použití 10 gg namísto 50 gg HC gp-39 smíchaného s IFA. Hodnoty (skóre) artritických příznaků však byly poněkud nižší (data neukázána). U tři ze čtyř myší se vyvinula těžká artritida. U jedné myši byly po dobu trvání experimentu pozorovány pouze mírné příznaky. Kontrolní myši nevykázaly po celou dobu trvání experimentu žádné příznaky artritidy.

ίο V souhrnu, jak 10gg tak 50gg proteinu postačovalo na vyvolání progresivní artritidy u myší kmene Balb/c. Artritida vyvolaná proteinem HC gp-39 připomíná svoji chronickou povahou, vyznačující se opakovanými relapsy, společně se symetrickým postižením kloubů, progresi choroby při revmatoidní artritidě (RA).

Tabulka 2. Vznik a progrese artritidy u myší kmene Balb/c senzibilizovaných HC gp-39.

Senzibilizace (n=4)	nástup artritidy (den)	příznaky artritidy
	FP	HP	žádné	mírné	těžké
PBS kontroly	-	-	4	0	0
10 gg HC gp-39	13, 15, 57	32,34,36,43	0	1	3
50 gg HC gp-39	13,15,15,48	29,34,34,53	0	0	4

FP=přední tlapka. HP= zadní tlapka. Příznaky artritidy: žádné: skóre=0, mírné: skóre na zvíře nepřevyšuje 2, těžké: skóre na zvíře> 3.

i

-22• · « · · · · · • · Φ e φ φ · Φ e φ φ φ φ · ο φφ

Imunologická tolerance měřená DTH testem

Kontrolní myši injikované proteinem HC gp-39 v den 0 vykazovaly silnou, antigen-specifickou DTH odpověď, což naznačuje, že senzibilizací byla vyvolána buněčná imunitní odpověď vůči

HC gp-39 (Tabulka 3). Intranazální podání HC gp-39 však zcela zrušilo tuto DTH odpověď na výzvu autoantigenem, čímž bylo prokázáno, že HC gp-39-specifické buňky T byly vskutku tolerizovány.

Pozoruhodné je, že u 4 z 10 zvířat netolerizované skupiny se io vyvinula artritida v kotníku sousedícím s místem, kam byla aplikována injekce výzevné dávky. Naopak, u myší z tolerizované skupiny se artritida v kloubech sousedících s místem vpichu nevyvinula, což naznačuje, že imunologická tolerance vůči HC gp-39 vede k ochraně před vznikem artritidy.

Tabulka 3. DTH odpovědi na HC gp-39 po tolerizaci nazální aplikací

ošetření	střední % zduření	artritický kotník
	0 hod	24 hod	48 hod
kontroly (n=10)	-1,3	31,4	38,6	4/10
tolerizované (n=9)	-0,05	3,7	1,5	0/9

Tolerance vůči vyvolání nebo progresi artritidy

U myší kmene Balb/c, tolerizovaných proteinem HC gp-39 a netolerizovaných kontrol, byl sledován vznik a progrese artritidy.

U všech myší kontrolní (netolerizované) skupiny byl po senzibilizaci proteinem HC gp-39 zaznamenán počátek choroby (Tabulka 4). U sedmi myší se postupně vyvinula těžká artritida, ·· ·· · · 4 • 0 0 • 00 0 O «

23♦ · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 » 0 0 0 0 0 0

0- 0 » 0 0 0 0« zatímco u tří myší se projevily jen mírné příznaky (nejvyšší skóre 2). Naproti tomu pět myší ze skupiny tolerizované proteinem HC gp-39 bylo po celou dobu experimentu ochráněno před chorobou. Kromě toho, u dvou zvířat z tolerizované skupiny se po krátká časová období projevily jen mírné příznaky. U tří zvířat se vyvinula těžší artritida s hodnotou skóre 4.

Je zajímavé, že u tolerizovaných zvířat byl nástup artritidy oddálen jak v zadních tak v předních tlapkách, a to minimálně o 7-9 dnů (Obrázek 1). Přestože v tolerizované skupině bylo méně io postižených zvířat, artritické skóre na zvíře pro přední tlapky bylo srovnatelné s hodnotami nalezenými u netolerizovaných zvířat. Artritické skóre na zvíře pro zadní tlapky však bylo u tolerizovaných zvířat poněkud nižší (Obrázek 1).

íiiíS&Ufe..

Tabulka 4. Vznik a progrese artritidy u HC gp-39 - tolerizovaných a netolerizovaných myší kmene Balb/c.

zvířata	nástup artritidy (den)	příznaky artritidy
		žádné	mírné	těžké
kontroly (n=10)	13 - 16	0	3	7
tolerizované (n=10)	23-24	5	2	3

Nástup artritidy: výskyt prvních příznaků - nejvyšší počet postižených zvířat. Příznaky artritidy: žádné: skóre = O, mírné: skóre na zvíře nepřevyšuje 2, těžké: skóre na zvíře je >4.

Výše uvedené experimenty prokazují artritogenní účinek HC gp-39 u myší kmene Balb/c. Průběh choroby vyvolané HC gp-39 proteinem se vyznačoval pravidelnými relapsy v předních a/nebo zadních tlapkách a mírná artritida postupně přecházela do těžší formy.

« * « · • · · » · « · · ·

• · · 9 • · · · • · · · • · · · · • · 9 ’ί

Rovněž bylo pozorováno symetrické postižení kloubů, což spolu s opakovanými relapsy připomíná progresi onemocnění při revmatoidní artritidě. Výrazně artritogenní vlastnosti proteinu HC gp-39 byly patrné po jediné podkožní injekci 10 nebo 50 pg proteinu, která vyvolala příznaky artritidy u všech zvířat. Že senzibilizace proteinem HC gp-39 skutečně způsobí aktivaci HC gp-39 - specifických buněk T bylo prokázáno navozením HC gp-39 specifických DTH odpovědi. Tyto výsledky byly dále potvrzeny průkazem HC gp-39- specifických in vitro proliferačních odpovědí u zvířat, jež byla imunizovaná proteinem HC gp-39 do tlapky (data neukázána). Je důležité, že u netolerizovaných zvířat se vyvinula artritida v kotníku sousedícím s místem injekce, což skutečně svědčí o účasti HC gp-39-specifických buněk T v indukci artritidy.

Intranazáiní podání peptidového antigenů se používá k navození 15 antigen-specifické imunitní tolerance. Pokusy ukázaly, že intranazáiní aplikace HC gp-39 vede k imunologické neodpovídavosti. DTH odpověď následující po desenzibilizaci byla úplně zrušena u HC gp39-tolerizovaných myší, zatímco kontrolní myši vykázaly antigenspecifické zduření. Tato pozorování naznačují, že podání HC gp-39

2o vede k periferní imunitní toleranci.

Ve skupině netolerizovaných zvířat byly DTH odpovědi u čtyř myší z deseti provázeny artritidou v kotníku (sousedícím s místem injekce výzevné dávky). Naproti tomu kotníky HC gp-39-tolerizovaných zvířat byly plně chráněné, což svědčí o tom, že autoreaktivní buňky

T byly účinně umlčeny. Představa, že tolerizace proteinem HC gp-39 chrání před rozvinutím choroby byla dále podpořena zjištěním, že 5 z 10 zvířat v tolerizované skupině bylo zcela ochráněno po celou dobu trvání experimentu. Přestože ostatních pět zvířat ze skupiny nakonec vykázalo klinické příznaky, nástup artritidy byl značně oddálen. Lze tedy učinit závěr, že HC gp-39-specifické buňky T se účastní artritogenního procesu, a co je důležitější, že tolerizací těchto T4 44

4 4

4

9 4 4

4 «

4 4

9 4 «

4 a

4 4 4

-25buněk farmaceutickým prostředkem podle předkládaného vynálezu lze oddálit nebo potlačit vznik artritidy.

PŘÍKLAD 2

METODY

Artritogenita hovězího syrovátkového 39 kDa proteinu u myší kmene Balb/c

0,2, 1, 5 nebo 25 pg purifikovaného hovězího 39 kDa syrovátkového proteinu v objemu 100 μΙ (0,5M NaCI, 0,01 M pufr io fosforečnanu sodného, pH 7,5) smíchaných v poměru 1:1 s nekompletním Freundovým adjuvans (IFA) bylo injikováno podkožně v hrudní oblasti 4 x 10 myších samic kmene Balb/c (Charles River, Sulzfeld, Germany), zatímco 10 kontrol bylo injikováno roztokem PBS (1:1 v IFA). U myší byly každý druhý den vyšetřovány klinické příznaky artritidy. Závažnost artritidy byla hodnocena skórem pro každou tlapku podle stupnice 0-3 (viz článek Glant et al.). Stručně, hodnota skóre 0 = žádné změny, skóre 1 = zarudnutí a/nebo zduření, skóre 2 = silné zduření a/nebo výskyt deformit, skóre 3 = nepohyblivost způsobená ztrátou schopnosti ohybu a natažení.

Klonování cDNA hovězího syrovátkového gp39

Lambda Bluemid(-) cDNA knihovna připravená z kravské mléčné žlázy (jako primery použity oligo-dT a randomní oligonukleotidy, na zakázku zhotovená v Clontech Laboratories lne.) byla amplifikovaná v hostitelském kmeni XL1 Blue MRF. Vysetí knihovny a příprava replik na filtrech byly provedeny podle instrukcí výrobce. Filtry byly hybridizovány s ³²P značeným Pvull fragmentem z HC gp-39 cDNA ·· ·· #······ < ♦ · « 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 99

9 9 9 9 99 ··· 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 9999 99 99

-26(ke značení byl použit oligonukleotidový značící kit firmy Pharmacia). Pozitivní plaky byly amplifikovány, znovu hybridizovány se značenou sondou a DNA inserty z odpovídajících fágů byly osekvenovány s použitím Thermosequenasového kitu (Amersham). Sekvence je uvedena v SEQ ID NO:3. V nukleotidové pozici 954 obsahoval jeden klon C, zatímco jiný kion měl v této pozici T.

VÝSLEDKY

Artritogenita hovězího syrovátkového 39 kDa proteinu

Po jedné injekci 25 pg hovězího syrovátkového 39 kDa proteinu io smíchaného s IFA se u všech myší postupně vyvinula artritida (Tabulka 5). První příznaky artritidy byly pozorovány v předních nebo zadních tlapkách 8-20 dnů po senzibilizaci. Průběh artritidy vyvolané hovězím syrovátkovým 39 kDa proteinem se vyznačoval periodickými relapsy v zadních tlapkách a mírná artritida se postupně vyvinula do těžší podoby (progrese choroby byla sledována po dobu 70 dnů). Velmi často bylo pozorováno symetrické postižení kloubů, tj. příznaky artritidy byly zaznamenány současně v obou předních tlapkách nebo v obou zadních tlapkách.

Vyvolání artritidy bylo podobně docíleno při použití 5, 1, nebo

0,2 pg namísto 25 pg hovězího syrovátkového 39 kDa proteinu smíchaného s IFA.

U myší, kde bylo použito 1 nebo 0,2 pg hovězího syrovátkového 39 kDa proteinu byla pozorována mírnější forma artritidy: u 7, případně u 6 myší se vyvinula mírná artritida, zatímco pouze u 3, případně u 4 myší se vyvinula těžká artritida.

Na konci experimentu byla vypočtena kumulativní skóre na den pro všechny skupiny myší (Obrázek 2). Po imunizaci pomocí 25 pg hovězího syrovátkového 39 kDa proteinu bylo dosaženo maximálního skóre 27 (25 pg) po 30 dnech a pak následovaly zřetelné relapsy. Při • · ♦ * « · · ···« · · » · • ♦ · · · • » · ♦ · ·

imunizaci nižšími dávkami hovězího syrovátkového 39 kDa proteinu vykazovala zvířata poněkud nižší artritické skóre ve srovnání se zvířaty, která obdržela dávku 25 pg. Přes nižší docílené skóre byla artritida ve všech skupinách provázena typickými relapsy.

U kontrolních myší, které byly injikovány roztokem PBS, bylo někdy pozorováno lehké a přechodné zduření zadních tlapek. Tento jev byl též pozorován u naivních, neinjikovaných zvířat. Střední kumulativní zduření připadající na hodnotící (skórovací) den mělo v těchto skupinách myší střední hodnotu 3,4 a bylo považováno za io biologicky variabilní pozadí.

Závěrem, hovězí syrovátkový 39 kDa protein (25, 5, 1 i 0,2 pg) je schopen u myších samic kmene Balb/c vyvolat progresivní artritidu. Artritida vyvolaná hovězím syrovátkovým 39 kDa proteinem připomíná svoji chronickou povahou, vyznačující se opakovanými relapsy, společně se symetrickým postižením kloubů, progresi choroby při revmatoidní artritidě (RA).

• 4 ·· · ·· ·4 44

4*9* ** · · · 4 « 4 ·* 4 * 4 · *4

4« 4 4 · 4444 4

·. · 4 4 * 4 4 4 4 • 444 44 *44 4444 *4 *4

-28Tabulka 5: Vznik a progrese artritidy u myší kmene Balb/c senzibilizovaných hovězím syrovátkovým 39 kDa proteinem.

senzibiiizace (n=10)	nástup artritidy (den)	příznaky artritidy
	FP	HP	žádné	mírné	těžké
0,2 pg hovězího 39kDa syrovátkového proteinu	1 , 9 9 1 -,-,-,14,18	8,14,14,14, 18 18,18,18, 30,54	0	6	4
1 pg hovězího 39kDa syrovátkového proteinu	, » » » , 8,12,12, 16,18	8,8,8,8,8 8,14,16,18, 18	0	7	3
5 pg hovězího 39kDa syrovátkového proteinu	I » » I > 8,10,10,12 ,14	6,6,8,10,10 16,16,18, 20,30	0	0	10
25 pg hovězího 39kDa syrovátkového proteinu	> » » » > -,-,-,-,12	8,8,10,12, 12 14,14,18, 18,20	0	1	9

FP=přední tlapka, HP=zadní tlapka. Příznaky artritidy: žádné :skóre=O, mírné: skóre na zvíře nepřevyšuje 2, těžké:skóre na zvíře> 3.

• A • · • A

-29 A« A A A A * A

A A A A A A

A A A ··· A A

A A A A A

A· A A A A A AA AA

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: AKZO NOBEL N V.

(B) ULICE: Velperweg 76 (C) MĚSTO: Arnhem (E) ZEMĚ: Holandsko (F) PSČ (ZIP): 6824 BM (G) TELEFON: 0412 666376 (H) TELEFAX: 0412 650592 (I) TELEX: 37503 akpha nl (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Nové peptidy odvozené z autoantigenu pro použití v imunoterapii autoimunitních chorob (lil) POČET SEKVENCÍ: 3 (ÍV) POČÍTAČOVÝ FORMÁT:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární ·· » » ♦ «

I · · · ·♦· · I ·« (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser Gin Tyr Arg Glu Gly 15 10 15

Asp Gly Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg Phe Leu Cys Thr His 20 25 30

Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp 35 40 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:

(ii) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 383 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Met 1

Gly Leu

Arg Ala Ala Gin Thr Gly Phe Val Val Leu Val Leu Leu

5

10

15

4 < 'V

Gin

Ser

Cys

Ala

Tyr

Lys

Leu

Ile

Cys

Tyr

Thr

Ser

Trp

Ser

20

25

30

Gin

Tyr

Arg

Glu

Gly

Asp

Gly

Ser

Cys

Phe

Pro

Asp

Ala

Ile

Asp

Pro

35

40

45

Phe

Leu

Cys

Thr

His

Val

Ile

Tyr

Ser

Phe

Ala

Asn

Ile

Ser

Asn

50

55

60

Glu

Ile

Asp

Thr

Trp

Glu

Trp

Asn

Asp

Val

Thr

Leu

Tyr

Asp

Thr

Leu

65

70

75

80

Asn

Thr

Leu

Lys

Asn

Arg

Asn

Pro

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

90 95 i

	• « • • « -31 -	• ·♦ • * 9 99 9 * • • 9 9 9	• ♦ • ♦ * *	* 99 9 9 9 9 9 9 99 999	« • · » « * 4 ♦ . ·	t ·· * * « »4 ♦ « · « 9 9 99	• • 9
Gly Gly Trp	Asn Phe Gly Ser Gin Arg Phe	Ser	Lys	Ile	Ala	Ser	Lys
	100 105				110
Thr Arg Ser	Arg Arg Thr Phe Ile Lys Ser	Val	Pro	Pro	Phe	Leu	Arg
115	120			125
Thr Hia Gly	Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala	Trp	Leu	Tyr	Pro	Gly	Trp
130	135		140
Arg Asp Lys	Arg His Leu Thr Thr Leu Val	Lys	Glu	Met	Lys	Ala	Glu
145	150	155					160
Phe Val Arg	Glu Ala Gin Ala Gly Thr Glu	Gin	Leu	Leu	Leu	Ser	Ala
	165 170					175
Ala Val Pro	Ala Gly Lys Ile Ala Ile Asp	Arg	Gly	Tyr	Asp	Ile	Ala
	180 185				190
Gin Ile Ser	Arg His Leu Asp Phe Ile Ser	Leu	Leu	Thr	Tyr	Asp	Phe
195	200			205
His Gly Ala	Trp Arg Gin Thr Val Gly His	His	Ser	Pro	Leu	Phe	Arg
210	215		220
Gly Gin Glu	Asp Ala Ser Ser Asp Arg Phe	Ser	Asn	Ala	Asp	Tyr	Ala
225	230	235					240
Val Ser Tyr	Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro	Ala	Asn	Lys	Leu	Val	Met
	245 250					255
Gly Ile Pro	Thr Phe Gly Arg Ser Tyr Thr	Leu	Ala	Ser	Ser	Lys	Thr
	260 265				270
Asp Val Gly	Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly	Ile	Pro	Gly	Gin	Phe	Thr
275	280			285
Lys Glu Lys	Gly Ile Leu Ala Tyr Tyr Glu	Ile	Cys	Asp	Phe	Leu	His
290	295		300
Gly Ala Thr	Thr His Arg Phe Arg Asp Gin	Gin	Val	Pro	Tyr	Ala	Thr
305	310	315					320
Lys Gly Asn	Gin Trp Val Ala Tyr Asp Asp	Gin	Glu	Ser	Val	Lys	Asn
	325 330					335	·........-

φ φφ • Φ ·· » Φ Φ 1 φ φφ

Φ * 4 • · « • ΦΦΦ ΦΦ

Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ

ΦΦ < Φ Φ Φ φ Φ • Φ · Φ ΦΦ

Φ Φ Φ ΦΦΦ Φ Φ • · ΦΦΦ

ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ

Lys

Ala

Arg

Ty_r 340

Leu

Lys

Asn

Arg

Gin 345

Leu

Ala

Gly

Ala

Met 350

Val

Trp

Ala

Leu

Asp 355

Leu

Asp

Phe

Arg 360

Gly

Thr

Phe

Cys

Gly 365

Gin

Asn

Leu

Ala

Phe

Pro

Leu

Thr

Ser

Ala

Ile

Lys

Asp

Val

Leu

Ala

Glu

Val

370 375 380 (2) INFORMACE Ο SEQ ID ΝΟ: 3:

(ϋ) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1152 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

ATGGGGCTGA	GGGCGGCTCA	GACAGGTTTT	GTGGTCCTGG	TGCTGCTCCA	GAGCTGTGCT	60
GCATACAAGC	TGATCTGCTA	CTACACCAGC	TGGTCCCAGT	ACCGGGAGGG	TGATGGGAGC	120
TGCTTCCCAG	ACGCCATCGA	CCCCTTCCTG	TGCACCCATG	TCATCTACAG	CTTTGCCAAC	180
ATAAGCAACA	ATGAGATCGA	CACCTGGGAG	TGGAATGACG	TGACGCTCTA	TGACACACTG	240
AACACACTCA	AGAACAGGAA	CCCCAACCTG	AAGACCCTCC	TATCTGTTGG	AGGATGGAAC	300
TTCGGTTCTC	aaagattttc	CAAGATAGCT	TCCAAGACCC	GGAGTCGCAG	GACTTTCATC	360
AAGTCGGTGC	CACCATTTCT	GCGGACCCAT	GGCTTTGATG	GACTGGACCT	AGCATGGCTC	420
TACCCCGGGT	GGAGAGACAA	GCGGCATCTC	ACCACTCTGG	TCAAGGAAAT	GAAGGCTGAG	480
TTTGTAAGGG	AAGCCCAAGC	AGGCACAGAG	CAGCTTCTGC	TCAGTGCAGC	AGTACCTGCA	540

··

- 33 • * «· ·♦·· ► · * ·

I · ·* • » ♦ ♦ · • · · ·« ♦«

GGGAAGATTG CTATTGACAG

ATCAGCCTTT TGACCTATGA

CCCCTGTTTC GAGGCCAGGA

GTGAGCTACA TGCTGAGGCT

TTTGGGAGGA GCTACACTCT

CCAGGAATTC CAGGCCAGTT

GACTTCCTCC ACGGÁGCCAC

AAGGGCAACC AGTGGGTGGC

CTGAAGAACA GGCAGCTGGC

GGCACCTTCT GTGGGCAGAA

GCTGAGGTGT AG

AGGCTATGAC ATCGCCCAGA

CTTTCACGGA GCCTGGCGCC

AGATGCAAGT TCTGACAGAT

GGGGGCTCCA GCCAATAAGC

GGCCTCTTCC AAGACAGATG

CACCAAGGAG AAAGGGATCC

CACCCACAGA TTCCGTGACC

GTATGACGAC CAGGAGAGTG

TGGCGCCATG GTGTGGGCCC

CCTGGCCTTT CCTCTCACAA

TATCCCGACA CCTGGACTTC

AGACAGTCGG ACACCACAGC

TCAGTAACGC TGACTACGCT

TGGTGATGGG TATCCCCACT

TGGGAGCCCC CATCTCAGGG

TTGCCTATTA TGAGATCTGT

AGCAGGTCCC CTATGCCACC

TCAAAAACAA GGCACGGTAC

TGGACTTGGA TGACTTCCGG

GTGCCATCAA AGATGTGCTT

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1152

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID

5 NO: 1) pro použití jako látky k terapeutickým účelům.
2. Použití podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že uvedený protein je hovězí syrovátkový 39 kDa protein nebo lidský YKL-39 protein.
3. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje jeden nebo více proteinů obsahujících aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí is YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1), a farmaceuticky přijatelný nosič.
4. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedený protein je hovězí syrovátkový 39 kDa protein nebo lidský

2o YKL-39 protein.
5. Použití proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID

25 NO: 1) na výrobu farmaceutického prostředku pro indukci specifické T- buněčné tolerance vůči homolognímu autoantigenu u savců trpících destrukcí chrupavky zprostředkovanou buňkami T.
6.

-3599 9« * 9 9 9

9 99

9 9 · 9 • · ·

9999 99 • 9 • 9 •

9999 • 9 ··

9 9 9 9

9 9 99

999 9 9

9 9 9

9« 99

Použití podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedený protein je hovězí 39 kDa syrovátkový protein nebo lidský YKL-39 protein.
7. Jeden nebo více proteinů, obsahujících aminokyselinovou

5 sekvenci, jež vykazuje alespoň 50% homologii s aminokyselinovou sekvencí

YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND (SEQ ID NO: 1) pro použití pro vyvolání artritidy u zvířat, s výhodou u myší.

io
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, ž e uvedený protein je hovězí 39 kDa syrovátkový protein nebo lidský YKL-39 protein.
9. Zvířata, která trpí artritidou, přičemž uvedená artritida byla

15 vyvolána způsobem podle nároku 7 nebo 8.
10. Použití zvířat podle nároku 9 pro systematické testování nových léků pro léčbu artritidy, zejména revmatoidní artritidy.

2o
11. Protein, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2.
12. Izolovaná DNA, kódující aminokyselinovou sekvenci podle nároku 11.

25 13. Izolovaná DNA podle nároku 12, mající nukleotidovou sekvenci

SEQ ID NO:3