CZ31850U1

CZ31850U1 - A culture medium for prolonging the life of mammalian oocytes under in vitro conditions

Info

Publication number: CZ31850U1
Application number: CZ2017-33911U
Authority: CZ
Inventors: David Němeček; Markéta Sedmíková; Eva Chmelíková
Original assignee: Česká zemědělská univerzita v Praze
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2018-06-19

Description

Oblast technikyTechnical field

Řešení se týká kultivačního média na bázi tkáňového média Ml99 donorem oxidu uhelnatého pro zlepšení kvality savčích oocytů během meiotického zrání v podmínkách in vitro.The invention relates to a culture medium based on the M199 tissue medium by a carbon monoxide donor to improve the quality of mammalian oocytes during meiotic maturation in vitro.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

In vitro kultivační systém je velmi důležitý pro meiotické zrání oocytů a rozhoduje o tom, zda budou oocyty schopny být po kultivaci oplozeny a rovněž o tom, jaké bude následné procento životaschopných embryí. In vitro kultivační systémy rutinně používané pro kultivaci oocytů jsou dílky přechodnému osvětlení a zvýšeným koncentracím kyslíku negativně ovlivňovány nárůstem hladin volných kyslíkatých derivátů (ROS) a v nich kultivované oocyty jsou vystaveny oxidativnímu stresu. Oxidativní stres negativně působí na meiotické zrání oocytů, protože vede k poškození mikrofilament, narušuje v oocytů vazbu chromozómů na mikrotubuly, ovlivňuje činnost endoplazmatického retikula a buněčnou signalizaci vápníkovými kationty a redistribuci kortikálních granul během zrání, což snižuje úspěšnost in vitro fertilizace a zvyšuje procento polyspermie.The in vitro culture system is very important for meiotic maturation of oocytes and decides whether oocytes will be able to be fertilized after cultivation as well as what the subsequent percentage of viable embryos will be. In vitro culture systems routinely used for oocyte cultivation, the tiles of transient illumination and increased oxygen concentrations are adversely affected by an increase in free oxygen derivative (ROS) levels and the cultured oocytes are exposed to oxidative stress. Oxidative stress negatively affects meiotic maturation of oocytes by causing damage to microfilaments, disrupting the binding of chromosomes to microtubules in oocytes, affecting endoplasmic reticulum activity and cellular signaling by calcium cations and redistribution of cortical granules during maturation, reducing the success of in vitro fertilization and increasing the percentage of polyspermia.

Hladiny ROS v kultivačním médiu je možné modulovat vhodnými chemickými aditivy a tím předejít vzniku oxidativního stresu, zlepšit průběh meiotického zrání oocytů v in vitro podmínkách a následně pozitivně ovlivnit průběh vývoje embryí využívaných pro reprodukční biotechnologie.ROS levels in the culture medium can be modulated by suitable chemical additives to prevent oxidative stress, improve the course of meiotic oocyte maturation in in vitro conditions and subsequently positively influence the development of embryos used for reproductive biotechnology.

Podstata technického řešeníThe essence of the technical solution

Uvedené nevýhody související s akumulací ROS v kultivačním prostředí pro oocyty odstraňuje kultivační médium na bázi tkáňového média Ml99 pro prodloužení životnosti savčích oocytů v podmínkách in vitro, podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že dále obsahuje přídavek donoru oxidu uhelnatého, kterým je trikarbonyl dichlororuthenium dimer, nebo boranokarbonát sodný, použité v koncentraci do 25,0 μΜ.These disadvantages associated with the accumulation of ROS in an oocyte culture medium are overcome by the M199 tissue medium-based culture medium for extending the life of mammalian oocytes in vitro, according to the invention, which further comprises the addition of a tricarbonyl carbon monoxide donor. dichlororuthenium dimer, or sodium boranocarbonate, used at concentrations up to 25,0 μΜ.

Kultivační médium podle technického řešení je charakterizováno tím, že 1 L kultivačního média, které je připraveno z tkáňového média M199 o složení laktátu vápenatého (2,8 mM), pyruvátu sodného (2,3 mM), gentamicinu (0,1 mM), HEPES (6,3 mM), 13 500 IU koňského choriového gonadotropinu, 6 600 IU lidského choriového gonadotropinu a 10% fetálního séra dále obsahuje donor oxidu uhelnatého, přičemž jako donor oxidu uhelnatého je použit trikarbonyl dichlororuthenium dimer [Ru(CO)jCl2]2 (dále jen CORM-2) v koncentraci 5,0 a 25,0 μΜ nebo boranokarbonát sodný NafHiBCOoH] (dále jen CORM-A1) v koncentraci 5,0 a 25,0 μΜ.The culture medium according to the invention is characterized in that 1 L of the culture medium, which is prepared from tissue medium M199 with the composition of calcium lactate (2.8 mM), sodium pyruvate (2.3 mM), gentamicin (0.1 mM), HEPES (6.3 mM), 13,500 IU equine chorionic gonadotropin, 6,600 IU human chorionic gonadotropin, and 10% fetal serum further contain a carbon monoxide donor using the tricarbonyl dichlororuthenium dimer [Ru (CO) jCl2] 2 as the carbon monoxide donor (hereinafter referred to as CORM-2) at concentrations of 5,0 and 25,0 μΜ or sodium boranocarbonate NafHiBCOoH] (hereinafter referred to as CORM-A1) at concentrations of 5,0 and 25,0 μΜ.

Hromadění ROS a rozvoj oxidativního stresu v in vitro kultivačním systému odstraňuje použití donoru oxidu uhelnatého CORM-2 nebo CORM-A1 jako složky kultivačního média. Podstata spočívá v tom, že se odebrané savčí oocyty kultivují v in vitro podmínkách v kultivačním médiu, do kterého je přidán donor oxidu uhelnatého CORM-2 nebo CORM-A1. Poté jsou oocyty opláchnuty kultivačním médiem bez přídavku donoru oxidu uhelnatého a jsou použity pro reprodukční biotechnologie, jako je například partenogenetická aktivace, oplození in vitro, či příprava cytoplastů.The accumulation of ROS and the development of oxidative stress in the in vitro culture system eliminates the use of the carbon monoxide donor CORM-2 or CORM-A1 as a component of the culture medium. Essentially, the collected mammalian oocytes are cultured under in vitro conditions in a culture medium to which the carbon monoxide donor CORM-2 or CORM-A1 is added. Thereafter, the oocytes are rinsed with culture medium without the addition of a carbon monoxide donor and are used for reproductive biotechnology, such as parthenogenetic activation, in vitro fertilization, or cytoplast preparation.

Použití kultivačního média podle technického řešení se provádí tak, že se z vaječníků samic hospodářských zvířat získají aspirací folikulů o velikosti 2 až 5 mm oocyty. Oocyty ve stádiu zárodečného váčku s celistvou cytoplazmou a kompaktním obalem z kumulámích buněk se propláchnou kultivačním médiem a jsou přeneseny do modifikovaného kultivačního média s přídavkem CORM-2 nebo CORM-A1, kde se kultivují do stádia druhé meiotické metafáze, například oocyty prasete 48 hodin. Po opláchnutí v kultivačním médiu bez přídavku donoru CORM-2 neboThe use of the culture medium according to the invention is carried out by obtaining oocytes from the ovaries of female farm animals by aspiration of 2 to 5 mm follicles. Germ cell-derived oocytes with a compact cytoplasm and compact cell envelope are rinsed with culture medium and transferred to a modified culture medium with the addition of CORM-2 or CORM-A1, where they are cultured to the second meiotic metaphase stage, for example pig oocytes for 48 hours. After rinsing in culture medium without the addition of CORM-2 donor

-1 CZ 31850 U1-1 CZ 31850 U1

CORM-A1 jsou oocyty připraveny pro reprodukční biotechnologie, jako je partenogenetická aktivace, in vitro oplození a následná produkce embryí.CORM-A1 are oocytes prepared for reproductive biotechnology such as parthenogenetic activation, in vitro fertilization and subsequent embryo production.

Původci ověřili, že použití donoru oxidu uhelnatého trikarbonyl dichlororuthenium dimeru [Ru(CO)3Cb]2 (CORM-2) v koncentracích 5,0 a 25,0 μΜ nebo boranokarbonátu sodného NafEbBCChH] (CORM-A1) v koncentracích 5,0 a 25,0 μΜ snižuje až o 40 % tvorbu volných kyslíkových radikálů, které jsou příčinou oxidativního stresu (5,0 μΜ CORM-2 snížilo produkci ROS o 18 %, 25,0 μΜ CORM-2 snížilo produkci ROS o 40 %; 5,0 μΜ CORM-A1 snížilo produkci ROS o 20 %, 25,0 μΜ CORM-A1 snížilo produkci ROS o 38 %). Výsledkem je vyšší podíl kvalitnějších oocytů ve stádiu druhé meiotické metafáze využitelných pro reprodukční biotechnologie.The inventors have verified that the use of the carbon monoxide donor tricarbonyl dichlororuthenium dimer [Ru (CO) 3Cb] 2 (CORM-2) at concentrations of 5.0 and 25.0 μΜ or sodium boranocarbonate NafEbBCChH] (CORM-A1) at concentrations of 5.0 and 25.0 μΜ reduces the production of free oxygen radicals that cause oxidative stress (5.0 μΜ CORM-2 reduced ROS production by 18%, 25.0 μΜ CORM-2 reduced ROS production by 40%; 0 μΜ CORM-A1 reduced ROS production by 20%, 25.0 μΜ CORM-A1 reduced ROS production by 38%). The result is a higher proportion of higher quality oocytes in the second meiotic metaphase stage useful for reproductive biotechnology.

Kultivační médium na bázi tkáňového média M199 s přídavkem CORM-2 nebo CORM-A1 podle technického řešení bylo původci s úspěchem prověřeno v laboratořích přihlašovatele, kterým je Česká zemědělská univerzita v Praze, Česká republika.The culture medium based on tissue medium M199 with the addition of CORM-2 or CORM-A1 according to the technical solution was successfully verified by the applicant in the laboratories of the applicant, which is the Czech University of Life Sciences Prague, Czech Republic.

Příklady uskutečnění technického řešeníExamples of technical solutions

Příklad 1Example 1

Prasečí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexech s kumulámími buňkami (100 komplexů) čerstvě izolovaných folikulámí aspirací ování o velikosti 2 až 5 mm jehlou a stříkačkou byly kultivovány v podmínkách in vitro v médiu obohaceném o 5,0; 25,0 a 50,0 μΜ donoru oxidu uhelnatého TRIC-RuCl - (CORM-2) najeden litr kultivačního média. V kultivačním médiu byly oocyto-kumulámí komplexy kultivovány 48 hodin při teplotě 38 °C a řízené atmosféře 5% CO2.Germ oocytes in germinal stage in complexes with cumulus cells (100 complexes) of freshly isolated follicular aspiration with a 2 to 5 mm needle and syringe were cultured under in vitro conditions in media enriched with 5.0; 25.0 and 50.0 μΜ of carbon monoxide donor TRIC-RuCl - (CORM-2) per liter of culture medium. In the culture medium, the oocyto-cumulus complexes were cultured for 48 hours at 38 ° C under a controlled atmosphere of 5% CO 2.

Produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) byla hodnocena u oocytů po 48 hodinách in vitro kultivace. Oocyty byly barveny 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetátem po dobu 20 minut při teplotě 38 °C a řízené atmosféře 5% CO2 v koncentraci 10 mM. Po inkubaci byly oocyty montovány na podložní skla a množství ROS hodnoceno pomocí konfokálního mikroskopu a programu pro analýzu obrazu.The production of reactive oxygen species (ROS) was evaluated in oocytes after 48 hours of in vitro culture. Oocytes were stained with 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate for 20 minutes at 38 ° C and controlled with 5% CO 2 at 10 mM. After incubation, the oocytes were mounted on slides and the amount of ROS was assessed using a confocal microscope and image analysis program.

V takto ošetřených oocytech se snižuje koncentrace volných kyslíkových radikálů ROS oproti oocytům, které v podmínkách in vitro zrály podle dosavadních postupů bez přídavku sloučeniny sloužící jako donor oxidu uhelnatého.In the treated oocytes, the concentration of free oxygen radicals ROS is reduced compared to oocytes that have matured in vitro according to the prior art without the addition of a carbon monoxide donor compound.

Příklad 2Example 2

Prasečí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexech s kumulámími buňkami (100 komplexů) čerstvě izolovaných folikulámí aspirací ovárií o velikosti 2 až 5 mm jehlou a stříkačkou byly kultivovány v podmínkách in vitro v médiu obohaceném o 5,0 a 25,0 μΜ donoru oxidu uhelnatého boranokarbonátu sodného - CORM-A1 na jeden litr kultivačního média. V kultivačním médiu byly oocyto-kumulámí komplexy kultivovány 48 hodin při teplotě 38 °C a řízené atmosféře 5% CO2.Germ-porcine porcine oocytes in complexes with cumulus cells (100 complexes) of freshly isolated follicular aspiration with a 2 to 5 mm needle and syringe were cultured under in vitro conditions in a medium enriched with 5.0 and 25.0 μΜ carbon monoxide donor sodium boranocarbonate - CORM-A1 per liter of culture medium. In the culture medium, the oocyto-cumulus complexes were cultured for 48 hours at 38 ° C under a controlled atmosphere of 5% CO 2.

-2CZ 31850 Ul-2EN 31850 Ul

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Nové kultivační médium na bázi tkáňového média M199 s obsahem donoru oxidu uhelnatého CORM-2 nebo CORM-A1 snižuje během kultivace savčích oocytů tvorbu volných kyslíkových radikálů, které jsou v in vitro kultivačních systémech původcem oxidativního stresu. Výsledkem je vyšší podíl kvalitnějších dozrálých oocytů využitelných pro reprodukční biotechnologie.The new M199 tissue culture medium containing the carbon monoxide donor CORM-2 or CORM-A1 reduces the production of free oxygen radicals that cause oxidative stress in in vitro culture systems. The result is a higher proportion of better-quality mature oocytes useful for reproductive biotechnology.

Claims

PROTECTION REQUIREMENTS

A tissue culture medium based on Ml99 for extending the life of mammalian oocytes in vitro, further comprising the addition of a carbon monoxide donor which is tricarbonyl dichlororuthenium dimer or sodium boranocarbonate at a concentration of up to 25.0 μΜ.

The culture medium according to claim 1, characterized in that the culture medium comprises 5.0 or 25.0 μΜ of carbon monoxide donor, wherein the carbon monoxide donor is tricarbonyl dichlorouthuthium dimer [RutCOUCbU or sodium boranocarbonate].