CZ310754B6

CZ310754B6 - Palmitovaný analog peptidu uvolňujícího prolaktin určený pro intranasální podání

Info

Publication number: CZ310754B6
Application number: CZ2022-499A
Authority: CZ
Inventors: Lenka Maletínská; CSc. Maletínská Lenka RNDr.; Jaroslav Kuneš; DrSc. Kuneš Jaroslav RNDr.
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.
Priority date: 2022-11-29
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2026-07-22
Also published as: WO2024114846A1; AU2023404843A1; CZ2022499A3; EP4626459A1; IL320632A

Abstract

Popisuje se palmitovaný analog peptidu uvolňujícího prolaktin Palm11-PrRP31 vzorce 1, jakož i farmaceutický prostředek s jeho obsahem. Palm11-PrRP31 i farmaceutický prostředek s jeho obsahem nacházejí uplatnění při léčení obezity, hyperglykémie a/nebo diabetu a podávají se intranasálně.

Description

Lipidované analogy peptidu uvolňujícího prolaktin představují anorexigenní látky, které po periferním, subkutánním nebo intraperitoneálním, podání snižují příjem potravy i hladinu glukosy v krvi a jsou tedy potenciálními antiobezitiky. V této přihlášce vynálezu jsou popsány jejich anorexigenní a antiobezitní účinky, nově zjištěné i po intranasálním podání.

Dosavadní stav techniky

Obezita představuje stále rostoucí problém rozvíjejících se i vyspělých zemí, pro který zatím neexistuje účinná terapie. Jediným lékem dostupným v ČR je Orlistat, inhibitor střevní lipázy, který snižuje vstřebávání tuků z tenkého střeva. Má však vedlejší účinky, jako např. průjmy. Z trhu byl stažen Sibutramin, inhibitor zpětného vychytávání serotoninu a noradrenalinu, který navozuje pocit sytosti, při jehož užívání bylo zjištěno zvýšené riziko výskytu srdečních chorob [Heal et al. 2012], V nedávné době se do klinické praxe dostaly dva analogy peptidu uvoňujícího glukagon (glucagon-like peptide 1, GLP-1), liraglutide (Saxenda) a semaglutide (Wegovy) [Knudsen et al. 2019], nicméně účinky těchto látek jsou nedostatečné a vývoj dalších možných antiobezitik je velmi žádoucí.

V posledním desetiletí 20. století byla objevena řada látek, které zásadně ovlivňují regulaci energetického metabolismu, a mezi nimi i neuropeptid PrRP (prolactin-releasing peptide, peptid uvolňující prolaktin) [Hinuma et al. 1998], V organismu se vyskytují dvě formy PrRP. jedna obsahuje 31 aminokyselin (PrRP31) a druhá 20 aminokyselin (PrRP20) [Hinuma et al. 1998], Díky objevu PrRP v hypotalamických jádrech PVN a DMN (paraventrikulámím a dorsomediálním jádru), která jsou důležitá pro udržování energetické rovnováhy, se o PrRP začalo uvažovat jako o faktoru ovlivňujícím příjem potravy [Lawrence et al. 2000], Anorexigenní efekt PrRP31 se projevil po jeho injektování do třetí mozkové komory, jejíž přední stěna a dno jsou tvořeny hypotalamem (tzv. intracerebroventrikulámí podání, ICV). U potkanů došlo k významnému krátkodobému snížení příjmu potravy, které dále způsobilo snížení hmotnosti [Lawrence et al. 2004],

Ke zjištění funkcí PrRP v organismu byla využívána i geneticky modifikovaná zvířata (tzv. knock-out, KO zvířata s vyloučeným genem kódujícím PrRP či jeho receptor GPR10) [Bjursell et al. 2007], Myši s vyloučeným genem pro PrRP trpí hyperfagií, kdy není ovlivněna frekvence příjmu jednotlivých dávek potravy, ale dochází ke zvětšení každé jednotlivé dávky jídla. U těchto jedinců nedochází ke snížení energetického výdeje, neboť jejich tělesná teplota i spotřeba kyslíku jsou srovnatelné s kontrolními jedinci [Takayanagi et al. 2008],

V našich předchozích studiích bylo zjištěno, že navázání mastné kyseliny v A-koncové oblasti PrRP31 zvyšuje řádově afinitu i funkčnost jak přirozeného peptidu, tak jeho analogů obou těchto forem (EP 2872124). Účinek byl pozorován jak při pokusech in vitro, tak in vivo. Statisticky velmi významného snížení příjmu potravy u hladových myší po podání lipidovaných peptidů PrRP31 a analogů bylo zcela nově dosaženo i po periferním (subkutánním, SC nebo intraperitoneálním, IP) podání [Mráziková et al. 2021, Maletínská et al. 2015, Pražienková et al. 2019], Nejúčinnější analog přirozeného peptidu PrRP31 byl palmitován v pozici 11 přes raménko gama-glutamové kyseliny (palmⁿ-PrRP31) (EP 3094643). Tento analog prokázal antiobezitní a antidiabetické účinky po chronickém periferním podání v několika modelech myší a potkanů s obezitou indukovanou vysokotukovou dietou [Maletínská et al. 2015, Čermáková et al. 2019, Holubová et al. 2016].

Intranasální (IN) podávání léků si získává oblibu zejména u léků cílených na centrální nervový

- 1 CZ 310754 B6 systém (CNS). Několik studií prokázalo, že IN podávání určitých léků vede k vyšším hladinám těchto látek v mozkomíšním moku a čichovém laloku než po intravenózním nebo subkutánním podání. To je důsledek toho, že IN podání umožňuje lékům/neuropeptidům být v přímém kontaktu s čichovým neuro-epitelem a zároveň obcházet respirační epitel, což potenciálně maximalizuje vstup do CNS spíše než do krevního oběhu nebo periferních tkání [Veronesi et al. 2011], Současně je intranasální použití jako neinvasivní metoda podání upřednostňováno pro jednoduchost podávání léčiv bez asistence zdravotnických pracovníků.

Podstata vynálezu

Palmitovaný analog palmⁿ-PrRP31, který vykazoval velmi signifikantní (P <0,001) snížení příjmu potravy u hladových myší po periferním podání v dávce 5mg/kg, byl nyní podáván také intranasálně v řádově nižší dávce (0,01 a 0,1 mg/kg), kdy vykázal stejné snížení příjmu potravy jako po SC podání. Navíc tento analog v dávce 0,3 mg/kg IN po opakovaném podávání obézním potkanům kmene Wistar Kyoto (WKY) na vysokotukové dietě snížil hmotnost a snížil hladinu glykovaného hemoglobinu v krvi (jako ukazatele prediabetu nebo diabetů 2. typu) do stejné míry, jako po IP podání v dávce 5 mg/kg po 30 dnů. Až doposud nebyly publikovány žádné lipidované analogy neuropeptidů, které by po intranasálním podání vykazovaly tak výrazné antiobezitní účinky a účinky snižující glukosu.

Předmětem vynálezu je palmitovaný analog peptidu uvolňujícího prolaktin o vzorci 1

SRTH RH SMEIKTPDINPA W Y ASRG1RP VG RF-NH > í (1), kde palm je kyselina palmitová a X² je γ-glutamová kyselina, pro použití jako léčivo k intranasálnímu podávání.

Předmětem vynálezu je také palmitovaný analog peptidu uvolňujícího prolaktin o vzorci 1, pro použití jako antiobezitní léčivo nebo léčivo k léčení hyperglykémie a diabetů, podávané intranasálně.

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek pro intranasální podání člověku, obsahující jako aktivní složku farmaceuticky účinné množství palmitovaného analogu peptidu uvolňujícího prolaktin o vzorci 1.

Předmětem vynálezu je také farmaceutický prostředek pro intranasální podání člověku, obsahující jako aktivní složku farmaceuticky účinné množství palmitovaného analogu peptidu uvolňujícího prolaktin o vzorci 1 a jeden nebo více z farmaceuticky přijatelných excipientů.

Získané výsledky lze shrnout následovně:

V testu příjmu potravy u myší palmⁿ-PrRP31 významně snižoval příjem potravy jak po SC, tak i po IN podání, přičemž pro IN podání byla dávka pro dosažení stejného účinku dokonce o 1 až 2 řády nižší než pro SC podání. Jde o vůbec první popis modifikovaného neuropeptidu, který snižuje příjem potravy po intranasálním podání.

V testu chronické aplikace palmⁿ-PrRP31 obézním potkanům byla IP aplikovaná dávka 5 mg/kg 1 x denně stejně účinná jako IN dávka 0,3 mg/kg Ix denně a způsobila velmi signifikantní snížení hmotnosti při podávání 30 dnů.

-2 CZ 310754 B6

Ve stejném testu byl pak po 30 dnech IN podávání naměřen v krvi významný úbytek glykovaného hemoglobinu jako ukazatele snížení glukosy a zlepšení diabetů 2. typu.

Intranasální podání má výhodu v možnosti širšího farmaceutického použití než v případě injekčního podání, jeho zcela zásadní výhodou je neinvazivnost.

Objasnění výkresů

Obrázek 1 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po SC a IN podání palmitovaného analogu PrRP31 hladovým myším C57BL/6. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy' v gramech (n = 6). Signifikance je ***P <0,001 vs fyz. roztok (oneway ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem), · - fýz. roztok, A - palm¹¹ - PrRP31 v dávce 0,01 mg/kg IN, o - palmⁿ-PrRP31 v dávce 0,1 mg/kg IN, -palm^u-PrRP31 v dávce 5 mg/kg SC.

Obrázek 2 znázorňuje změnu hmotnosti obézních potkanů WKY na vysokotukové dietě po chronickém (30 dnů) podání palm¹¹-PrRP31 v dávce 5 mg/kg IP Ix denně nebo IN v dávce 0,3 mg/kg Ix denně a dále fyz. roztoku IP nebo IN. Na ose x je vynesen čas ve dnech, na ose y změna hmotnosti potkanů ve srovnání s hmotností na začátku pokusu (n = 5 až 8). Signifikance je ***p<0,001 vs fýz. roztok (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem), · fyz. roztok, □ - palmⁿ-PrRP31 vdávce 0,3 mg/kg IN, - palm¹¹- PrRP31 v dávce 5 mg/kg IP.

Obrázek 3 znázorňuje hladinu glykovaného hemoglobinu (HbAlc) jako ukazatele dlouhodobého snížení glukosy v krvi obézních WKY potkanů po 30 dnech podávání palm¹¹- PrRP31 v dávce 5 mg/kg IP Ix denně nebo IN v dávce 0,3 mg/kg Ix denně a dále fýz. roztoku IP nebo IN (n = 5-8). Na ose y jsou hodnoty HbAlc v procentech vůči celkovému hemoglobinu. □ - fýz. roztok, □ palm¹¹ - PrRPS 1 v dávce 0,3 mg/kg IN, - palmⁿ-PrRP31 v dávce 5 mg/kg IP.

Signifikance je *P < 0,05, ***P < 0,001 vs fýz. roztok (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem).

Příklady uskutečnění vynálezu

Použité zkratky

ANOVA analýza rozptylu

IN intranasální

IP intraperitoneální

SC subkutánní

PrRP peptid uvolňující proláklin

Metody použité v testech s analogy PrRP

Peptid o sekvenci SRTHRHSMEIK(N-y-E(N-palmitoyl)) TPDINPAWYASRGIRPVGRF- NH₂byl syntetizován metodou syntézy na pevné fázi na dle postupu Pražienkové et al. 2019 s využitím Fmoc strategie na syntetizátoru ABI 433A (Applied Biosystems. Poster City, CA, USA). Lipidizace příslušnou mastnou kyselinou byla provedena před odštěpením peptidu z pryskyřice popsaným postupem [Maletínská et al. 2015],

Ve většině studií na malých laboratorních zvířatech (tj. potkanech, myších) se používají roztoky léčiv rozpuštěné obvykle ve fýziologickém roztoku, který se pipetuje po kapkách (3 až 10 μΐ) do nosní dutiny zvířete. To je po dobu aplikace udržováno v poloze na zádech. Výhodou této metody je, že je neinvazivní a zvíře nemusí být v anestezii během procedury. Nicméně roztok

-3 CZ 310754 B6 léku aplikovaný přes nosní dutinu musí nejprve překročit dýchací epitel a vomeronasální orgán (VNO), kde může docházet k určitým ztrátám [Veronesi et al. 2011], Zvířata bez anestézie mohou být také náchylná ke kýchání, což by mohlo dále snižovat přesnost metody. V našich experimentech jsme však žádné tyto komplikace nepozorovali.

Příklad 1: Test příjmu potravy po SC nebo IN podání analogu palm-PrRP31

Myší samci kmene C57BL/6 (Charles River, Německo) byli chováni v akreditovaném zvěřinci UOCHB A V ČR, v. v. i., Praha v areálu ústavů akademie věd v Krči při teplotě 22 ±2° C a měli volný přístup k potravě i k pití. Rytmus světlo/tma byl 12/12 hodin (začátek světla 6:00). Se zvířaty se zacházelo podle zákona o ochraně zvířat proti týrání (zákon č. 246/1992 Sb.). Samci byli krmeni standardní dietou Ssniff R/M-H (Ssniff Spezialdiáten GmbH, Soest, Německo). 16 hodin před aplikací lipidovaného peptidu byla myším odebrána potrava, ale zůstal volný přístup k pití. Aplikace fýziologického roztoku a lipidovaného analogu PrRP po rozpuštění ve fyziologickém roztoku bylo prováděno SC v dávce 5 mg/kg (objem 0,15 ml/myš) nebo IN pomocí pipety s tenkou špičkou v dávce 0,01 a 0,1 mg/kg (5 pl/myš).

minut po aplikaci lipidovaného peptidu byla myším podána předem zvážená potrava. Potrava pak byla vážena každých 30 minut po dobu 7 hodin. Experiment byl u každé dávky lipidovaného analogu PrRP prováděn nejméně dvakrát a jedna skupina myší čítala minimálně 6 myší. Výsledky jsou vyjádřeny v procentech příjmu potravy ve srovnání s kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem.

Pro statistické vyhodnocení byl použit program Graph-Pad Prism Software (San Diego, CA, USA), metoda one-way ANOVA s následným Dunnettovým post-hoc testem. Rozdíly v příjmu potravy mezi jedinci, jimž byl injektován fyziologický roztok, a jedinci, kterým byl injektován hodnocený peptid, byly považovány za statisticky významné při P < 0,05.

Výsledky jsou shrnuty v obrázku 1.

Palmitovaný analog PrRP31 snižoval velmi významně a dlouhodobě příjem potravy u hladových myší, a to ve stejné míře po SC podání v dávce 5 mg/kg jako po IN podání v dávce 0,01 a 0,1 mg/kg, tedy 50x a 500x nižší.

Příklad 2: Test změny hmotnosti a glykovaného hemoglobinu po chronickém podávání palm¹¹PrRP31 IP a SC obézním WKY potkanům

Potkani - samci kmene WKY (Charles River, Německo) byli chování v akreditovaném zvěřinci Fyziologického ústavu AV ČR, v.v.i., Praha v areálu ústavů akademie věd v Krči při teplotě 22 ±2 °C a měli volný přístup k potravě i k pití. Rytmus světlo/tma byl 12/12 hodin (začátek světla 4:00). Se zvířaty se zacházelo podle zákona o ochraně zvířat proti týrání (zákon č. 246/1992 Sb.). Samci byli krmeni vysokotukovou dietou Dl2492 (Research Diets. USA) o obsahu 60 % tuku, 20 % proteinu a 20 % sacharidů. Od 8. týdne věku byli krmeni touto dietou po dobu 4 měsíců. Poté byli rozděleni do skupin po 5 zvířatech (IP podání fyz. roztoku nebo palm¹ ’-PrRP31 ve fýz. roztoku v dávce 5 mg/kg) nebo po 8 zvířatech (IN podání fyz. roztoku nebo palmⁿ-PrRP31 ve fyz. roztoku v dávce 0,3 mg/kg). Eátka byla aplikována IP nebo IN lx denně 1 hodinu před zhasnutím po dobu 30 dnů. Po celou dobu byla 3x týdně monitorována hmotnost potkanů a na konci byl v krvi odebrané z ocasu změřen glykovaný hemoglobin. Glykovaný hemoglobin (HbAlc) byl stanoven s použitím Tina-quant HbAlc Gen. 3 kitu (Roche, Mannheim, Germany).

Pro statistické vyhodnocení byl použit program Graph-Pad Prism Software (San Diego, CA, USA), metoda one-way ANOVA s následným Dunnettovým post-hoc testem. Rozdíly v příjmu potravy mezi jedinci, jimž byl injektován fyziologický roztok, a jedinci, kterým byl injektován hodnocený peptid, byly považovány za statisticky významné při P <0,05.

-4 CZ 310754 B6

Výsledky jsou shrnuty v obrázcích 2 a 3.

Palm¹ ’-PrRP31 po chronickém podání snižoval hmotnost potkanů stejnou měrou jak po IP, tak po IN podání, ale IN podání bylo prováděno v dávce 0,3 mg/kg, tedy 16x nižší, než byla dávka pro IP podání. Dále byl na konci experimentu naměřen významně snížený glykovaný hemoglobin jak po IN, tak po IP podání.

Průmyslová využitelnost

Palmⁿ-PrRP31 je potenciální antiobezitikem pro neobyčejně výhodnou intranasální aplikaci samotným pacientem.

Literatura:

1. Heal DJ, Gosden J, et al. Neuropharmacology, 63( 1), 132-146 (2012).

2. Knudsen LB, Lau J. Front Endocrinol (Lausanne), 10, 155 (2019).

3. Hinuma S, Habata Y, et al. Nature, 393(6682), 272-276 (1998).

4. Lawrence C, Celsi F, et al. NatNeurosci, 3(7), 645-646 (2000).

5. Lawrence C, Liu Y, et al. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 286(1), R101 -107 (2004).

6. Bjursell M, Lenneras M, et al. Biochem Biophys Res Commun, 363(3), 633-638 (2007).

7. Takayanagi Y, Matsumoto H, et al. J Clin Invest, 118(12), 4014-4024 (2008).

8. Mráziková L, Neprašová B, et al. Front Pharmacol, 12, 779962 (2021).

9. Maletínská L, Nagelová V, et al. Int J Obes (Lond), 39(6), 986-993 (2015).

10. Pražienková V, Holubová M, etal. PLoSOne, 12(8), e0183449-e0183449 (2017).

11. Čermáková M, Pelantová H, et al. JProteome Res, 18(4), 1735-1750 (2019).

12. Holubová M, Zemenová J, et al. J Endocrinol, 229(2), 85-96 (2016).

13. Veronesi MC, Kubek DJ, et al. Methods Mol Biol, 789, 303-312 (2011).

Claims

1. Palmitovaný analog peptidu uvolňujícího prolaktin vzorce 1 ^{: : :} ί ^:

5 (1), kde palm je kyselina palmitová a X² je γ-glutamová kyselina, pro použití při léčení obezity, hyperglykémie a/nebo diabetů, přičemž palmitovaný analog peptidu uvolňujícího prolaktin vzorce 1 je podáván intranasálně.

2. Farmaceutický prostředek, který obsahuje jako aktivní složku farmaceuticky účinné množství ίο palmitovaného analogu peptidu uvolňujícího prolaktin vzorce 1 uvedeného v nároku 1, pro použití při léčení obezity, hyperglykémie a/nebo diabetů, přičemž tento farmaceutický prostředek je podáván intranasálně.