CZ310469B6 - Použití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 k produkci metabolitů kyseliny ferulové - Google Patents

Abstract

Řešení se týká použití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 k produkci senzoricky a biologicky aktivních metabolitů kyseliny ferulové, zejména kyseliny vanilové a 4-vinylguajakolu. Způsob výroby metabolitů kyseliny ferulové podle vynálezu brání před mikrobiální kontaminací běžnou mezofilní mikroflórou, výrazně snižuje riziko kontaminace a nároky na sterilitu procesu.

Description

Použití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 k produkci metabolitů kyseliny ferulové

Oblast techniky

Vynález se týká využití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107. k produkci senzoricky a biologicky aktivních metabolitů kyseliny ferulové, zejména kyseliny vanilové a 4-vinylguajakolu.

Dosavadní stav techniky

Kyselina ferulová je fenolická látka přírodního původu, která je běžnou součástí rostlinné biomasy. V rostlinách se tato látka nachází buď jako volná molekula, z větší části je však kovalentně vázaná na lignin a hemicelulózy, přičemž se významným způsobem podílí na stavbě a mechanických vlastnostech buněčné stěny rostlin [1], Kyselinu ferulovou je možné získat relativně jednoduchým izolačním postupem z celé řady rostlinných zdrojů včetně odpadních surovin potravinářského průmyslu, jako jsou například pšeničné nebo kukuřičné otruby [2], pivovarské mláto [3] nebo ananasové slupky [4], Ferulová kyselina je velice zajímavá látka, která je díky svým anti-oxidačním a anti-mikrobiálním účinkům považována za velice hodnotné přírodní potravinářské aditivum, které má potenciál významně navýšit stabilitu a údržnost řady potravin případně nahradit některé syntetické pomocné látky. Dále kyselina ferulová vykazuje i protizánětlivou, anti-trombickou a proti-rakovinovou aktivitu. Díky tomu má řadu aplikací také v oblasti farmacie, péče o zdraví a kosmetiky [5],

Zároveň může být kyselina ferulová využita jako prekurzor pro výrobu řady dalších látek s ještě významně vyšší přidanou a tržní hodnotou. Typickým příkladem takovéhoto procesu je mikrobiální bio-transformace kyseliny ferulové na vanilin a jeho deriváty (především kyselinu vanilovou a vanilyl alkohol). Jedná se o se látky, které jsou obecně známy díky své charakteristické „vanilkové“ chuti a vůni a jsou tedy využívány v potravinářském průmyslu jakožto ochucovadla [6], Nicméně kromě senzorické aktivity vykazují deriváty vanilinu také celou řadu vysoce hodnotných vlastností. Například kyselina vanilová je známa tím, že brání nežádoucím oxidačním a zánětlivým pochodům, stimuluje imunitní systém, chrání nervovou soustavu, játra a kardiovaskulární systém. Díky těmto významným farmakologickým aktivitám je vanilová kyselina považována například za velice zajímavou aktivní látku při léčbě Alzheimerovy choroby, obezity nebo diabetů [7], Zároveň jsou vanilin a jeho deriváty velice zajímavé také z pohledu materiálové chemie jakožto komponenty pro přípravu a modifikaci vlastností řady polymemích materiálů [8].

Jak již bylo naznačeno výše, vanilin a jeho deriváty je možné připravit z kyseliny ferulové pomocí metabolické aktivity mikroorganismů. Doposud byla schopnost konverze kyseliny ferulové na vanilin a příbuzné látky popsána pro celou řadu mikroorganismů, ať už se jedná o kvasinky Saccharomyces cerevisiae [9] nebo Rhodotorula mucilaginosa [10], plísně patřící do rodu Aspergillus [4], nebo celou řadu bakterií jako jsou například Bacillus subtilis [11], Cupriavidus sp. B-8 [12], Pseudomonas putida [13], Streptomyces sannensis [14], Streptomyces setonii [15] nebo Amycolaptosis sp. CSW4 [16], Principiálně existuje celá řada metabolických drah a dějů, které vedou od kyseliny ferulové k vanilinu a jeho derivátům, přičemž samozřejmě konkrétní metabolický proces a stejně tak spektrum vzniklých produktů je závislý především na použitém mikroorganismu a částečně také procesních podmínkách. Kromě mikroorganismů schopných transformovat ferulovou kyselinu pomocí homologních metabolických drah, existuje samozřejmě také řada studií a procesů, které využívají nástrojů genetického inženýrství a syntetické biologie, přičemž v drtivé většině případů je jako biologická platforma využit některý z kmenů Escherichia coli [17; 18; 19; 20],

- 1 CZ 310469 B6

Tradiční mikrobiálně biotechnologické procesy využívající čisté kultury mesofilních mikroorganismů často trpí relativně nízkou cenovou konkurenceschopností, pokud k nim existuje alternativa na bází chemické výroby téhož produktu. Jedním z hlavních důvodů je náchylnost klasického biotechnologického procesu vůči kontaminaci běžnou mikroflórou, která s sebou nese vysoké náklady na zajištění sterility procesu a zároveň obvykle brání možnosti realizovat výrobu formou výhodné kontinuální nebo semi-kontinuální kultivace. Možným řešením této závažné limitace je koncept průmyslových biotechnologií nové generace (Next-Generation Industrial Biotechnology, NGIB), který využívá jakožto produkční jednotky extremofilní mikroorganismy. Tyto organismy se v průběhu evoluce adaptovaly na extrémní prostředí, jako je například vysoká osmotická síla prostředí, vysoká/nízká teplota nebo extrémní hodnoty pH. A právě tyto extrémní podmínky brání biotechnologické procesy nové generace před masivní kontaminací, dramaticky snižují nároky na vybavení i energetické nároky na realizaci procesu a zároveň umožňují realizaci kontinuálních kultivací [21],

Je na místě poznamenat, že k mikrobiální transformaci kyseliny ferulové byly doposud využívány především mesofilní mikroorganismy a cílené využití extremofilních mikroorganismů bylo doposud mimo pozornost odborné veřejnosti. Přitom konverze kyseliny ferulové na vanilin a jeho deriváty v souladu s konceptem průmyslových biotechnologií nové generace může představovat jak technologicky, tak i ekonomicky významnou výhodu.

Jak rodové jméno napovídá, zástupci rodu Halomonas jsou halofilní bakterie, které typicky kolonizují niky s vysokou salinitou, obecně preferují osmotickou sílu prostředí v rozmezí 5 až 25 % hmota. NaCl. Jedná se o gram-negativní, heterotrofní, obligátně aerobní gammaproteobakterie s relativně nízkými nutričními nároky a vysokou katabolickou a metabolickou flexibilitou. Díky svým vlastnostem nachází některé kmeny spadající do rodu Halomonas své uplatnění v biotechnologiích nové generace především jako velice slibní producenti řady biopolymerů jako jsou polyhydroxyalkanoáty [22] nebo polysacharidy [23], je možné je využít k produkci technologicky významných enzymů tzv. extremozymů [24], ale také nízkomolekulámích látek jako jsou ektoiny [25], 3-hydroxybutyrát a oxalacetát [26; 27] nebo tetrahydropyrimidin [28], jako bakterie podporující růst rostlin [29] nebo k degradaci antropogenních polutantů, jako jsou polyaromatické uhlovodíky [30] nebo fenol [31], Původní vědecká literatura zahrnuje dvě zmínky o možnosti využití bakterie Halomonas elongata k biotransformaci kyseliny ferulové [32; 33],

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je využití halofilní bakteriální kultury Halomonas neptunia CCM 7107 ke konverzi kyseliny ferulové na senzoricky a biologicky aktivní látky jako jsou vanilová kyselina, vanilin, a/nebo 4-vinylguajakol.

Kultura Halomonas neptunia CCM 7107 je v tomto kontextu unikátní biotechnologickou platformou. Je schopna vysoké efektivity transformace kyseliny ferulové na hodnotné metabolity jako jsou vanilin, vanilyl alkohol, kyselina vanilová, a 4-vinylguajakol, přičemž dominantním metabolitem je kyselina vanilová. Další velkou výhodou bakterie H. neptunia je její halofilní charakter. H. neptunia je schopna realizovat konverzi kyseliny ferulové při koncentraci NaCl až do 10 % hmota., což brání proces před mikrobiální kontaminací běžnou mezofilní mikroflórou, výrazně snižuje riziko kontaminace a nároky na sterilitu procesu.

Předmětem vynálezu je použití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 k produkci metabolitů kyseliny ferulové, kdy kultura bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 se kultivuje 24 h v aerobním prostředí při 30 °C za stálého míchání v komplexním médiu při počátečním pH 7,2, následně se centrifugu) e a sediment se rozsuspenduje v komplexním médiu obsahujícím NaCl v koncentraci 81 g/1 s přídavkem ferulové kyseliny

-2 CZ 310469 B6 v množství 0,5 g/1, a kultivuje se 48 až 72 h za stálého míchání při 30 °C za vzniku vanilové kyseliny a 4-vinylguajakolu.

Předmětem vynálezu je také použití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 k produkci metabolitů kyseliny ferulové, kdy kultura bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 se kultivuje 24 h v kapalném hydrolyzátu získaném z odpadních pšeničných otrub s obsahem ferulové kyseliny v aerobním prostředí při 30 °C za stálého míchání při počátečním pH 7,2 po dobu 48 až 72 hodin za vzniku 4-vinylguajakolu.

Podle výhodného provedení kapalný hydrolyzát obsahuje přídavek komplexního média, přičemž se po kultivaci získá 4-vinylguajakol a vanilová kyselina.

Objasnění výkresů

Obrázek 1: Růstová křivka Halomonas neptunia CCM 7107 v komplexním médiu s 0,5 g/1 kyseliny ferulové.

Obrázek 2: Biotransformační křivka přeměny kyseliny ferulové na kyselinu vanilinovou a 4vinylguajakol v závislosti na čase.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Biotransformace kyseliny ferulové s využitím submerzní kultury

Halofilní bakteriální kmen Halomonas neptunia CCM 7107 se kultivoval v aerobním prostředí v Erlenmeyerových baňkách při 30 °C za stálého míchání po dobu 24 hodin v komplexním médiu (počáteční pH 7,2) o složení:

Kvasničný extrakt	10 g/1
Pepton	5 g/1
Glukóza	ig/i
NaCl	81 g/1
MgSO4- 7 H2O	9,6 g/1
MgCl2 · 6 H2O	7 g/1
CaCl2 · 2 H2O	0,36 g/1
KC1	2 g/1
NaHCOs	0,06 g/1
NaBr	0,026 g/1
Destilovaná voda	1000 ml

Po 24hodinové kultivaci se kultura centrifugovala při 6000 rpm po dobu 5 minut a následně se rozsuspendovala v čerstvém komplexním médiu o stejném složení s přídavkem ferulové kyseliny. V určitých časových úsecích byly provedeny odběry a analýza vznikajících fenolických látek s přidanou hodnotou z ferulové kyseliny pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UVVis detektorem (HPLC-UV-Vis) za podmínek uvedených v tabulce 1.

-3 CZ 310469 B6

Tabulka 1: Parametry analýzy fenolických látek pomocí HPLC-UV-Vis.

Detektor	UV-Vis
Eluce	Gradient: Acetonitril: mobilní fáze (70:30)
Teplota	35 °C
Tlak	250 bar
Mobilní fáze a průtok	Acetonitril: 1% kyselina octová (15:85), 0,4 ml/min
Kolona	Kinetex® 2,6 pm EVO C18 100 Á (LC Column 150 x 4,6 mm)

Na počátku experimentu byla provedena optimalizace biotransformace ferulové kyseliny. Optimalizovány byly následující parametry: doba trvání a teplota biotransformačního procesu, koncentrace přítomného chloridu sodného (NaCl) v komplexním médiu a počáteční koncentrace ferulové kyseliny. Za optimální dobu biotransformace byl zvolen čas 72 hodin (viz tabulka 2) při teplotě 30 °C. Koncentrace ferulové kyseliny, při které byla H. neptunia schopna nej efektivnější biotransformace na látky s přidanou hodnotou, byla stanovena na 0,5 g/1 (viz tabulka 3). Posledním optimalizovaným parametrem byla koncentrace použitého NaCl, který vyžaduje vybraný bakteriální kmen ke svému přežití. Ze širokého rozmezí koncentrací solí byla jako nej lepší vybrána koncentrace 81 g/1, která navíc zabraňuje kontaminacím okolními mezofilními mikroorganismy. Za těchto podmínek následně probíhaly veškeré experimenty přeměny ferulové kyseliny na látky s přidanou hodnotou: 4-vinylguajakol, vanilovou kyselinu, vanilin a vanilyl alkohol.

Tabulka 2: Výběr optimální doby biotransformace kyseliny ferulové (*n. d. = nebylo detekováno).

Čas [h]	Ferulová kyselina [mg/1]	Vanilová kyselina [mg/1]	4-vinylguajakol [mg/1]
0	500,0 ±2,0	n. d.	n. d.
6	319,0 ±1,0	n. d.	n. d.
24	284,8 ±3,2	8,8 ±1,2	43,3 ±1,2
48	277,9 ±1,3	35,3 ±2,0	18,6 ±0,9
72	ΙΙΙΙΙΙβ^		14.2 ±0.7
78	4,5 ±0,3	308,5 ±1,8	n. d.
144	n. d.*	144,2 ±0,9	n. d.

Tabulka 3: Výběr optimální vstupní koncentrace ferulové kyseliny (po 72 hodinách).

	C (ferulová kyselina) [g/1]
0,3	lilii	0,6	0,8	1,0
Vanilová kyselina [mg/1]	85 ±5	120 ±4	26,9 ±0,8	48 ±2	2,8 ±0,1
Ferulová kyselina [mg/1]	6,3 ±0,4	2.8 lilii	167 ±11	194 ±13	246 ±15
4-vinylguajakol [mg/1]	n. d.	n. d.	n. d.	n. d.	208 ±21

V další fázi experimentu byla stanovena růstová křivka vybrané bakterie v komplexním médiu s ferulovou kyselinou pomocí spektrofotometrického měření optické hustoty bakteriální kultury při 630 nm a biotransformační křivka závislosti koncentrace fenolických látek na čase s využitím HPLC-UV-Vis. U růstové křivky lze na počátku pozorovat z naměřených dat exponenciální nárůst, kdy je pravděpodobné, že bakterie utilizovala uhlíkaté zdroje přítomné v komplexním kultivačním médiu. Následně přechází růstová křivka do stacionární fáze trvající do 48. hodiny. Od tohoto časového úseku je opět možné pozorovat růst a mírnou fluktuaci hodnot optické hustoty kultury'. Maximální hodnota optické hustoty (viz obrázek 1) byla naměřena v 72. hodině kultivace, což potvrzuje klíčový čas pro biotransformační proces z optimalizačních experimentů. Z naměřené růstové křivky lze usoudit, že bakterie v časovém úseku 48 až 72 hodin významně transformovala ferulovou kyselinu, kterou částečně metabolizovala, a především přeměnila na látky s vysokou přidanou hodnotou. Tento trend potvrzuje biotransformační křivka (viz obrázek 2), kdy lze za hlavní časový úsek biotransformace považovat 48 až 72 hodin, jelikož dochází k největší přeměně ferulové kyseliny (FA) na majoritní produkt: vanilovou kyselinu (~ 320 mg/L). Po 72. hodině byl pozorován pokles optické hustoty i koncentrace všech detekovaných analytů, následovaný druhou stacionární fází zakončenou fází odumírání bakteriálních buněk od 144. hodiny, ve které už není detekována ani ferulová kyselina. Úspěšnost konverze vstupní koncentrace FA na hlavní produkt VA v 72. hodině byla stanovena na téměř 79%, což činí bakterii Halomonas neptunia CCM 7107 velmi slibným kandidátem tohoto biotransformačního procesu.

Využití odpadních pšeničných otrub pro výrobu derivátů kyseliny ferulové

Ferulová kyselina se nachází v lignocelulózových materiálech jako součást ligninu a váže se esterovou vazbou na polysacharidy [34], které patří mezi odpadní lignocelulózové materiály produkované v enormním množství při zpracování obilovin mletím. Izolačním postupem spočívajícím v alkalické hydrolýze vázané kyseliny ferulové hydroxidem sodným [35] byl z materiálu získán kapalný hydrolyzát s obsahem ferulové kyseliny o koncentraci 640 ±20 mg/1. Získaný hydrolyzát byl následně využit ke kultivaci Halomonas neptunia CCM 7107 za optimalizovaných podmínek - viz výše. Kultivace probíhala dvěma způsoby: na neupraveném hydrolyzátu a na hydrolyzátu doplněném o složky komplexního média. U obou kultivací bylo na počátku upraveno pH na hodnotu 7,2, která je optimální pro růst vybrané bakterie.

Tabulka 4: Výsledné koncentrace vznikajících senzoricky a biologicky aktivních sloučenin z kultivace Halomonas neptunia CCM 7107 na neupraveném hydrolyzátu z pšeničných otrub.

	čas [h]
0	48	72	144
Ferulová kyselina [mg/1]	640 ±20	9,7 ±0,2	9,5 ±0,5	6,9 ±0,2
Vanilová kyselina [mg/1]	n. d.	2,8 ±0,2	3,4 ±0,4	2,8 ±0,1
Vanilin [mg/1]	n. d.	4,9 ±0,1	4,4 ±0,8	5,5 ±0,5
4-vinylguajakol [mg/1]	n. d.	n. d.	160 ±20	n. d.

Na neupraveném izolátu (viz tabulka 4) bylo získáno majoritní množství 4-vinylguajakolu po 72 hodinách kultivace (160 ±20 mg/L) a minoritně byly detekovány i další fenolické sloučeniny vznikající biotransformací z ferulové kyseliny (vanilová kyselina a vanilin). Úspěšnost konverze ferulové kyseliny na 4-vinylguajakol byla v tomto případě kolem 33 %. Již po 48 hodinách byla téměř veškerá ferulová kyselina spotřebována a lze předpokládat, že ji bakterie využila jako zdroj uhlíku pro metabolické a energetické pochody.

-5 CZ 310469 B6

Tabulka 5: Výsledné koncentrace vznikajících senzoricky aktivních sloučenin z kultivace na hydrolyzátů z pšeničných otrub doplněném o složky komplexního média.

	čas [h]
0	48	72	144
Ferulová kyselina [mg/1]	640 ±20	200 ±16	n. d.	4±1
Vanilová kyselina [mg/1]	n. d.	n. d.	Illllllll	n. d.
Vanilin [mg/1]	n. d.	n. d.	n. d.	n. d.
4-vinylguajakol [mg/1]	n. d.	160 ±20	170 ±30	150 ±10

Výsledky z kultivace na hydrolyzátů doplněného o složky komplexního média (viz Tabulka 5) byly ještě úspěšnější. Kromě 4-vinylguajakolu, kterého bylo opět detekováno nejvyšší množství v 72. hodině (170 ±30 mg/1), byla naměřena také vysoká koncentrace vanilové kyseliny v 72. hodině (92 ±1 mg/1).

Je pravděpodobné, že v případě kultivace na neupraveném hydrolyzátů bakterie spotřebovávala primárně ferulovou kyselinu pro zajištění svých energetických a metabolických procesů. Zatímco u kultivace na hydrolyzátů doplněném o komplexní médium byly pravděpodobně využity bakterií z počátku složky komplexního média, což potvrzuje i vysoká koncentrace ferulové kyseliny po 48 hodinách (u neupraveného izolátu byla ferulová kyselina v tomto čase detekována v minoritním množství). Po 72 hodinách následovala také úspěšná konverze na vanilovou kyselinu (úspěšnost byla stanovena na téměř 17 %), čímž byl optimální čas biotransformace opět potvrzen.

Ze získaných výsledků lze odvodit pravděpodobnou metabolickou cestu přeměny ferulové kyseliny. Na začátku biotransformace dochází ke vzniku většího množství 4-vinylguajakolu v porovnání s vanilovou kyselinu, pravděpodobně neoxidativní dekarboxylací. Dalším krokem by mohla teoreticky být spontánní přeměna 4-vinylguajakolu na vanilin, kdy byla v některých případech detekována pouze minoritní množství tohoto analytu. Tento mechanismus není ovšem doposud popsán a je tedy stále zkoumán [36], Z vanilinu je možné následně oxidační či redukční reakcí získat další dva produkty. Redukcí dochází ke vzniku vanilyl alkoholu a oxidací je možné získat klíčový produkt tohoto procesu - vanilovou kyselinu.

Výše popsaná pravděpodobná metabolická dráha přeměny ferulové kyseliny na další látky koreluje s provedenými experimenty. Při kratších časových úsecích byl majoritně detekován 4vinylguajakol v porovnání s vanilovou kyselinou. Stejných výsledků bylo docíleno i při využití vyšších vstupních koncentrací ferulové kyseliny. Vanilová kyselina ve vysokých koncentracích vzniká, využije-li se delších časových úseků popsaných výše a nižších koncentrací vstupní ferulové kyseliny.

Průmyslová využitelnost

Významnou výhodou procesu je halofilní charakter dané mikrobiální kultury, který umožňuje realizovat biotechnologický proces za vysoké osmotické síly prostředí, která ve svém důsledku významně snižuje riziko kontaminace a snižuje nároky na striktně aseptické vedení biotransformační reakce. Z naměřených výsledků je patrné, že tento postup má obrovský potenciál být zaveden do správně fungujícího modelu v oblasti biotechnologií.

Literatura:

[1] MATHEW, Sindhu a T. Emilia ABRAHAM. Bioconversions of Ferulic Acid, an Hydroxycinnamic Acid. Critical Reviews in Microbiology. 2008, 32(3), 115-125. ISSN 1040841X. Dostupné z: doi: 10.1080/10408410600709628;

[2] BURANOV, Anvar U. a G. MAZZA. Extraction and purification of ferulic acid from flax shives, wheat and com bran by alkaline hydrolysis and pressurised solvents. Food Chemistry. 2009, 115(4), 1542-1548. ISSN 03088146. Dostupné z: doi: 10.1016/j.foodchem.2009.01.059;

[3] SIBHATU, Hagos Kalu, S. ANURADHA JABASINGH, Abubeker YIMAM a Shegaw AHMED. Ferulic acid production from brewery spent grains, an agro-industrial waste. LWT. 2021, 135. ISSN 00236438. Dostupné z: doi: 10.1016/j.lwt.2020.110009;

[4] TANG, Pei Ling a Osman HASSAN. Bioconversion of ferulic acid attained from pineapple peels and pineapple crown leaves into vanillic acid and vanillin by Aspergillus niger 1-1472. BMC Chemistry. 2020, 14(1). ISSN 2661-801X. Dostupné z: doi:10.1186/sl3065-020-0663-y;

[5] MUSSATTO, S.I., G. DRAGONE a EC. ROBERTO. Ferulic and p-coumaric acids extraction by alkaline hydrolysis of brewer's spent grain. Industrial Crops and Products. 2007, 25(2), 231-237. ISSN 09266690. Dostupné z: doi: 10.1016/j.indcrop.2006.11.001;

[6] MARTáU, Gheorghe Adrian, Lavinia-Florina CáLINOIU a Dan Cristian VODNAR. Biovanillin: Towards a sustainable industrial production. 2021, 109, 579-592. ISSN 09242244. Dostupné z: doi: 10.1016/j .tifs.2021.01.059;

[7] INGOLE, Ashwini, Megha P KADAM, Aishwarya P. DALU et al. A Review of the Pharmacological Characteristics of Vanillic Acid. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 2021, 11(2-), 200-204. ISSN 2250-1177. Dostupné z: doi: 10.22270/jddt.vl 1Í2-S.4823;

[8] ZHANG, Chaoqun, Samy A. MADBOULY a Michael R. KESSLER. Renewable Polymers Prepared from Vanillin and Its Derivatives. Macromolecular Chemistry and Physics. 2015, 216(17), 1816-1822. ISSN 10221352. Dostupné z: doi:10.1002/macp.201500194;

[9] HUANG, Z, L DOSTAL a J P ROSAZZA. Microbial transformations of ferulic acid by Saccharomyces cerevisiae and Pseudomonas fluorescens. Applied and Environmental Microbiology. 1993, 59(7), 2244-2250. ISSN 0099-2240. Dostupné z:

doi: 10.1128/aem.59.7.2244-2250.1993;

[10] BETTIO, Giulia, Luiza Caroline ZARDO, Carlos Augusto ROSA a Marco Antonio ZACHIA AYUB. Bioconversion of ferulic acid into aroma compounds by newly isolated yeast strains of the Latin American biodiversity. Biotechnology Progress. 2021, 37(1). ISSN 87567938. Dostupné z: doi:10.1002/btpr.3067;

[11] CHEN, Pong, Lei YAN, Zhengrong WU et al. A microbial transformation using Bacillus subtilis B7-S to produce natural vanillin from ferulic acid. Scientific Reports. 2016, 6(1). ISSN 2045-2322. Dostupné z: doi: 10.1038/srep20400;

[12] CHAI, Li-yuan, Huan ZHANG, Wei-chun YANG, Yong-hua ZHU, Zhi-hui YANG, Yu ZHENG a Yue-hui CHEN. Biodegradation of ferulic acid by a newly isolated strain of Cupriavidus sp. B-8. Journal of Central South University. 2013, 20(7), 1964-1970. ISSN 20952899. Dostupné z: doi: 10.1007/sl 1771-013-1696-3;

[13] YAMADA, Mamoru, Yukiyoshi OKADA, Toyokazu YOSHIDA a Tom NAGASAWA.

-7 CZ 310469 B6

Biotransformation of isoeugenol to vanillin by Pseudomonas putida IE27 cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 2007, 73(5), 1025-1030. ISSN 0175-7598. Dostupné z: doi: 10.1007/s00253-006-0569-l;

[14] GHOSH, Shashwati, Ashish SACHAN, Sukanta Kumar SEN a Adinpunya MITRA. Microbial transformation of ferulic acid to vanillic acid by Streptomyces sannanensis MTCC 6637. 2007, 34(2), 131-138. ISSN 1367-5435. Dostupné z: doi: 10.1007/sl0295-006-0177-l;

[15] MUHEIM, A. a K. LERCH. Towards a high-yield bioconversion of ferulic acid to vanillin. Applied Microbiology and Biotechnology. 1999, 51(4), 456-461. ISSN 0175-7598. Dostupné z: doi: 10.1007/s002530051416;

[16] MA, Xiao-kui a Andrew J. DAUGULIS. Effect of bioconversion conditions on vanillin production by Amycolatopsis sp. ATCC 39116 through an analysis of competing by-product formation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 2014, 37(5), 891-899. ISSN 1615-7591. Dostupné z: doi: 10.1007/s00449-013-1060-x;

[17] CHEN, Zhenya, Xiaolin SHEN, Jian WANG, Jia WANG, Ruihua ZHANG, Justin Forrest REY, Qipeng YUAN a Yajun YAN. Establishing an Artificial Pathway for De Novo Biosynthesis of Vanillyl Alcohol in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 2017, 6(9), 17841792. ISSN 2161-5063. Dostupné z: doi: 10.102l/acssynbio.7b00129;

[18] YOON, Sang-Hwal, Cui LI, Ju-Eun KIM et al. Production of Vanillin by Metabolically Engineered Escherichia coli. Biotechnology Letters. 2005, 27(22), 1829-1832. ISSN 0141-5492. Dostupné z: doi: 10.1007/sl0529-005-3561-4;

[19] YOON, S.-H., E.-G. LEE, A. DAS et al. Enhanced Vanillin Production from Recombinant E. coli Using NTG Mutagenesis and Adsorbent Resin. Biotechnology Progress. 2007, 0(0), 0-0. ISSN 8756-7938. Dostupné z: doi: 10.1021/bp070153r;

[20] LEE, Eun-Gyeong, Sang-Hwal YOON, Amitabha DAS et al. Directing vanillin production from ferulic acid by increased acetyl-CoA consumption in recombinant Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 2009, 102(1), 200-208. ISSN 00063592. Dostupné z: doi:10.1002/bit.22040;

[21] CHEN, Guo-Qiang a Xiao-Ran JIANG. Next generation industrial biotechnology based on extremophilic bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 2018, 50, 94-100. ISSN 09581669. Dostupné z: doi:10.1016/j.copbio.2017.11.016;

[22] YIN, Guoqiang a Jinxiang RUIJUAN. A method of it recombinating Halomonas and produces P (3HB-co-4HB) using its. Čína. CN110079489A;

[23] LLAMAS, Inmaculada, Ana del MORAL, Fernando MARTINEZ-CHECA, Yolanda ARCO, Soledad ARIAS a Emilia QUESADA. Halomonas maura is a physiologically versatile bacterium of both ecological and biotechnological interest. Antonie van Leeuwenhoek. 2006, 89(3-4), 395-403. ISSN 0003-6072. Dostupné z: doi: 10.1007/sl0482-005-9043-9;

[24] Halomonas strain WDG195-related alpha-amylases, and methods of use thereof. Čína. CN 102388131B;

[25] FATOLLAHI, Parvaneh, Mina GHASEMI, Fatemeh YAZDIAN a Akram SADEGHI. Ectoine production in bioreactor by Halomonas elongata DSM2581: Using MWCNT and Fe-nanoparticle. Biotechnology Progress. 2021, 37(1). ISSN 8756-7938. Dostupné z: doi:10.1002/btpr.3073;

-8CZ 310469 B6

[26] Method for producing oxaloacetate using Halomonas. Japonsko. JP 6827242 B2;

[27] Method for producing 3-hydroxybutyric acid using Halomonas bacteria. Japonsko. JP 6384861 B2;

[28] A kind of method of new Halomonas and production tetrahydropyrimidine thereof. Čína. CN 103451137B;

[29] A novel halophilic halomonas sp. having an excellent digestive effect of organic material, a soil conditioner for the reclaimed land using said strain and a method for plant growth-promoting thereof. Jižní Korea. KR 100817708 Bl;

[30] Halomonas capable of degrading polyaromatic hydrocarbon and application thereof. Čína. CN 101838616B;

[31]HADDADI, Azam a Mahmoud SHAVANDI. Biodegradation of phenol in hypersaline conditions by Halomonas sp. strain PH2-2 isolated from saline soil. 2013, 85, 29-34. ISSN 09648305. Dostupné z: doi: 10.1016/j.ibiod.2013.06.005;

[32] ABDELKAFI, Slim, Sami SAYADI, Zouhaier Ben ALI GAM, Laurence CASALOT a Marc LABAT. Bioconversion of ferulic acid to vanillic acid by Halomonas elongata isolated from table-olive fermentation. FEMS Microbiology Letters. 2006, 262(1), 115-120. ISSN 03781097. Dostupné z: doi: 10.1111/j. 1574-6968.2006.0038 Lx;

[33] ABDELKAFI, Slim, Marc LABAT, Zouhaier Ben Ali GAM, Jean LORQUIN, Laurence CASALOT a Sami SAYADI. Optimized conditions for the synthesis of vanillic acid under hypersaline conditions by Halomonas elongata DSM 258IT resting cells. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2008, 24(5), 675-680. ISSN 0959-3993. Dostupné z: doi: 10.1007/sl 1274-007-9523-3;

[34] DE OLIVEIRA, Dyoni Matias, Aline FINGER-TEIXEIRA, Thatiane RODRIGUES MOTA et al. Ferulic acid: a key component in grass lignocellulose recalcitrance to hydrolysis. Plant Biotechnology Journal. 2015, 13(9), 1224-1232. ISSN 14677644. Dostupné z:

doi: 10.1111/pbi. 12292;

[35] NABELEK, Jakub. Vývoj a validace postupu pro izolaci kyseliny ferulové z pšeničných otrub. Brno, 2020. Diplomová práce. Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. Ustav chemie potravin a biotechnologií. Vedoucí práce Jaromír Pořízka;

[36] GALADIMA, Ahmed Ibrahim, Madihah Md SALLEH, Huszalina HUSSIN et al. Biovanillin: production concepts and prevention of side product formation. Biomass Conversion and Biorefinery. 2020, 10(2), 589-609. ISSN 2190-6815. Dostupné z: doi:10.1007/sl3399-01900418-0.

Claims (4)

1. Použití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107k produkci metabolitů kyseliny ferulové, kdy kultura bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 se kultivuje 24 h v aerobním prostředí při 30 °C za stálého míchání v komplexním médiu při počátečním pH 7,2 a/nebo v kapalném hydrolyzátu získaném z odpadních pšeničných otrub a následně se kultura bakteriálního kmene kultivuje v přítomnosti kyseliny ferulové 48 až 72 h za stálého míchání při 30 °C za vzniku vanilové kyseliny a/nebo 4-vinylguajakolu.

2. Použití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 podle nároku 1, kdy kultura bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 se kultivuje v aerobním prostředí při 30 °C za stálého míchání v komplexním médiu při počátečním pH 7,2, následně se zcentrifuguje a sediment se rozsuspenduje se v komplexním médiu obsahujícím NaCl v koncentraci 81 g/1 s přídavkem ferulové kyseliny v množství 0,5 g/1 a kultivuje se 48 až 72 h za stálého míchání při 30 °C za vzniku vanilové kyseliny a 4-vinylguajakolu.

3. Použití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 podle nároku 1, kdy kultura bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 se kultivuje v kapalném hydrolyzátu získaném z odpadních pšeničných otrub s obsahem ferulové kyseliny v aerobním prostředí při 30 °C za stálého míchání při počátečním pH 7,2 po dobu 48 až 72 hodin za vzniku 4-vinylguajakolu.

4. Použití halofilního bakteriálního kmene Halomonas neptunia CCM 7107 podle nároku 3, kdy kapalný hydrolyzát dále obsahuje přídavek komplexního média, přičemž se po kultivaci získá kromě 4-vinylguajakolu také vanilová kyselina.