CZ309953B6 - Flow-through system for the formation and cultivation of cell clusters - Google Patents
Flow-through system for the formation and cultivation of cell clusters Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309953B6 CZ309953B6 CZ2022-442A CZ2022442A CZ309953B6 CZ 309953 B6 CZ309953 B6 CZ 309953B6 CZ 2022442 A CZ2022442 A CZ 2022442A CZ 309953 B6 CZ309953 B6 CZ 309953B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- channel
- reservoir
- cultivator
- inlet
- height
- Prior art date
Links
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 238000006880 cross-coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 22
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 abstract 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 description 32
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 28
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 25
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- HHBBIOLEJRWIGU-UHFFFAOYSA-N 4-ethoxy-1,1,1,2,2,3,3,4,5,6,6,6-dodecafluoro-5-(trifluoromethyl)hexane Chemical compound CCOC(F)(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F HHBBIOLEJRWIGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000011960 computer-aided design Methods 0.000 description 2
- 238000004720 dielectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000012835 hanging drop method Methods 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- -1 poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- OXBLVCZKDOZZOJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dihydrothiophene Chemical compound C1CC=CS1 OXBLVCZKDOZZOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRJRKPMIRMSBNK-UHFFFAOYSA-N 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctan-1-ol Chemical compound OCCC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F GRJRKPMIRMSBNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002236 cellular spheroid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- QVFWZNCVPCJQOP-UHFFFAOYSA-N chloralodol Chemical compound CC(O)(C)CC(C)OC(O)C(Cl)(Cl)Cl QVFWZNCVPCJQOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- XPBBUZJBQWWFFJ-UHFFFAOYSA-N fluorosilane Chemical compound [SiH3]F XPBBUZJBQWWFFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005486 microgravity Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000007626 photothermal therapy Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000005487 simulated microgravity Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/22—Transparent or translucent parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/44—Multiple separable units; Modules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Other Liquid Machine Or Engine Such As Wave Power Use (AREA)
- Hydroponics (AREA)
Abstract
Description
Průtokový systém pro tvorbu a kultivaci buněčných shlukůA flow system for the formation and cultivation of cell clusters
Oblast technikyField of technology
Tradiční buněčné kultury jsou realizovány na povrchu plastových nádob, ve kterých jsou buňky přichycené ke dnu nádoby a rostou téměř v monovrstvě, tedy v 2D uspořádání. Tato platforma pro buněčné kultivace nemůže poskytovat reálné podmínky, které mají buňky žijící ve skutečné tkáni. Současným trendem v mnoha oborech využívající buněčné kultury k různým studiím jsou třírozměrné buněčné kultury. Velký význam mají třírozměrné buněčné shluky kulovitého nebo diskovitého tvaru tvořené zejména nádorovými buňkami, které nazýváme sféroidy. Sféroidy se využívají zejména jako in vitro modely živých nádorů. Vzhledem k velikosti sféroidů, jejichž průměr je několik desítek až stovek mikrometrů, je možno k jejich úspěšnému formování využívat i mikrozařízení, tzv. mikro- nebo milifluidní systémy. Velkou obecnou výhodou mikrozařízení je, že umožňují lepší manipulaci s mikroobjekty a vytvářejí vhodnější mikroprostředí pro buněčné kultury. Výhodou mikrozařízení pro experimentální aplikace je také možnost jejich segmentace do částí určených pro různé, vzájemně oddělitelné, experimentální úkony nebo možnost paralelizace zvolených experimentálních kroků. Mikrozařízení se také úspěšně testují a komerčně využívají v oblastech výzkumu rakoviny nebo vývoje a testování léčiv s využitím sféroidů.Traditional cell cultures are realized on the surface of plastic containers, in which the cells are attached to the bottom of the container and grow almost in a monolayer, i.e. in a 2D arrangement. This cell culture platform cannot provide the real conditions that cells living in real tissue have. The current trend in many fields using cell cultures for various studies is three-dimensional cell cultures. Of great importance are three-dimensional cell clusters of a spherical or disc-shaped shape, formed mainly by tumor cells, which we call spheroids. Spheroids are mainly used as in vitro models of living tumors. Due to the size of the spheroids, the diameter of which is several tens to hundreds of micrometers, it is possible to use microdevices, so-called micro- or millifluidic systems, for their successful formation. A major general advantage of microdevices is that they allow better manipulation of microobjects and create a more suitable microenvironment for cell cultures. The advantage of microdevices for experimental applications is also the possibility of their segmentation into parts intended for different, mutually separable, experimental tasks or the possibility of parallelizing selected experimental steps. Microdevices are also successfully tested and commercially used in the fields of cancer research or drug development and testing using spheroids.
Dosavadní stav technikyCurrent state of the art
Metod pro vytvoření 3D buněčných kultur existuje poměrně mnoho, přičemž každá má své výhody i nevýhody. K nejjednodušším patří metoda formace sféroidů v peletu, tzv. pellet culture (LI, Jingting, Fan HE a Ming PEI, Creation of an in vitro microenvironment to enhance human fetal synovium-derived stem cell chondrogenesis, Cell and Tissue Research, 2011, 345(3), 357 až 365, ISSN 0302-766X, doi: 10.1007/s00441-011-1212-8), (JAHN, K, RG RICHARDS, CW ARCHER a MJ STODDART, Pellet culture model for human primary osteoblasts. European Cells and Materials, 2010, 20, 149 až 161, doi:10.22203/eCM.v020al3). Spočívá v centrifúgaci buněk ve zkumavce, čímž se buňky nahromadí na dně a maximalizuje se tak možnost přilnutí k sobě. Metoda je rychlá, snadná a je skrz ní možné získat poměrně velké shluky. Nicméně neumožňuje masovou tvorbu, tj. v průmyslovém měřítku, ani pozorovat proces tvorby sféroidů. Také může snadno dojít k poškození buněk vlivem odstředivých sil při centrifúgaci. Další metodou je formace shluků za pomocí stálého míchání, tzv. spinner culture (CASTANEDA, F. a R. K. Η. ΚΙΝΝΕ, Short exposure to millimolar concentrations of ethanol induces apoptotic cell death in multicellular HepG2 spheroids, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2000, 126(6), 305 až 310, ISSN 0171-5216, doi: 10.1007/s004320050348), (LIN, Ruei-Zhen a Hwan-You CHANG, Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal, 2008, 3(9 až 10), 1172 až 1184, ISSN 18606768, doi: 10.1002/biot.200700228). Při této metodě je buněčná suspenze míchána konstantní rychlostí, která podporuje srážky jednotlivých buněk, čímž postupně dochází k jejich shlukování a formaci sféroidů. Výhodou této metody je dobrá přístupnost živin dalších látek pro formující se sféroidy díky rychlé obměně prostředí mícháním. Tato metoda je také využitelná v průmyslu ve velkém měřítku. Nevýhodou je opět nemožnost pozorování formace shluků a také riziko rozpadu již zformovaných shluků u méně soudržných buněk a při velkých rychlostech míchání i poškození jednotlivých buněk. Obdobnou, avšak sofistikovanější metodou je formace 3D kultur pomocí rotující nádoby (INGRAM, M., G. B. TECHY, R. SAROUFEEM, O. YAZAN, K. S. NARAYAN, T. J. GOODWIN a G. F. SPAULDING, Three-dimensional growth patterns of various human tumor cell lines in simulated microgravity of a NASA bioreactor, In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 1997, 33(6), 459 až 466, ISSN 1071-2690, doi:10.1007/sll626-997-0064-8). V tomto případě se vytváří umělé prostředí mikrogravitace a buňky jsou konstantně udržovány v suspenzi ve volném pádu. Postupně se shlukují a s rostoucí velikostí shluků se přidává na rychlosti rotace, aby se stále udržely suspendované. VýhodouThere are quite a few methods for creating 3D cell cultures, each with its own advantages and disadvantages. Among the simplest is the method of forming spheroids in a pellet, the so-called pellet culture (LI, Jingting, Fan HE and Ming PEI, Creation of an in vitro microenvironment to enhance human fetal synovium-derived stem cell chondrogenesis, Cell and Tissue Research, 2011, 345( 3), 357 to 365, ISSN 0302-766X, doi: 10.1007/s00441-011-1212-8), (JAHN, K, RG RICHARDS, CW ARCHER and MJ STODDART, Pellet culture model for human primary osteoblasts. European Cells and Materials, 2010, 20, 149-161, doi:10.22203/eCM.v020al3). It consists of centrifuging the cells in a test tube, which causes the cells to accumulate at the bottom and thus maximize the possibility of sticking together. The method is fast, easy and it is possible to obtain relatively large clusters through it. However, it does not allow for mass production, i.e. on an industrial scale, or to observe the process of spheroid formation. Cells can also easily be damaged by centrifugal forces during centrifugation. Another method is the formation of clusters with the help of constant mixing, the so-called spinner culture (CASTANEDA, F. and R.K. Η. ΚΙΝΝΕ, Short exposure to millimolar concentrations of ethanol induces apoptotic cell death in multicellular HepG2 spheroids, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2000 , 126(6), 305 to 310, ISSN 0171-5216, doi: 10.1007/s004320050348), (LIN, Ruei-Zhen and Hwan-You CHANG, Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal, 2008, 3(9 to 10), 1172 to 1184, ISSN 18606768, doi: 10.1002/biot.200700228). In this method, the cell suspension is stirred at a constant speed, which promotes the collision of individual cells, which gradually leads to their clustering and the formation of spheroids. The advantage of this method is the good accessibility of the nutrients of other substances to the forming spheroids due to the rapid change of the environment by mixing. This method is also usable in industry on a large scale. The disadvantage is again the impossibility of observing the formation of clusters, as well as the risk of disintegration of already formed clusters in less cohesive cells and, at high mixing speeds, as well as damage to individual cells. A similar but more sophisticated method is the formation of 3D cultures using a rotating vessel (INGRAM, M., G.B. TECHY, R. SAROUFEEM, O. YAZAN, K.S. NARAYAN, T.J. GOODWIN and G.F. SPAULDING, Three-dimensional growth patterns of various human tumor cell lines in simulated microgravity of a NASA bioreactor, In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 1997, 33(6), 459 to 466, ISSN 1071-2690, doi:10.1007/sll626-997-0064-8). In this case, an artificial environment of microgravity is created and the cells are constantly kept in suspension in free fall. They gradually clump together, and as the clumps grow in size, the speed of rotation is added to keep them still suspended. Advantage
- 1 CZ 309953 B6 oproti předchozí metodě je mnohem menší rychlost rotace, čímž se eliminuje riziko poškození buněk a jejich shluků. Rovněž je zde snadná obměna média a přidávání dalších látek, s možností automatizace. Nevýhodou je nemožnost pozorování shluků a nejednotnost jejich velikosti. Další možností je formace sféroidů metodou visících kapek, tzv. hanging drop (KELM, Jens M., Nicholas E. TIMMINS, Catherine J. BROWN, Martin FUSSENEGGER a Lars K. NIELSEN, Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 83(2), 173 až 180, ISSN 00063592, doi: 10.1002/bit. 10655), (TIMMINS, Nicholas E. a Lars K. NIELSEN, Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method, In: HAUSER, Hansjórg a Martin FUSSENEGGER, ed. Tissue Engineering, Totowa, NJ: Humana Press, 2007, 2007, s. 141 až 151. Methods in Molecular Medicine™, ISBN 978-1-58829-756-3, doi: 10.1007/978-1-59745443-8 8). Nejběžnější provedení této metody spočívá v nanesení malých kapek s buněčnou suspenzí na povrch, který se následně otočí o 180 stupňů a kapky vlivem povrchové energie zůstanou zavěšené na povrchu. Buňky v každé kapce sedimentují a ve spodní části kapek utvoří sféroid. Výhodou u této metody je možnost kombinace více buněčných kultur ve specifickém poměru a také uniformita utvořených sféroidů, jejichž velikost lze regulovat koncentrací použitých buněčných suspenzí. Nevýhodou je obtížná výměna média či přidávání dalších látek během kultivace a také není snadné pozorovat tvorbu sféroidů, ačkoli na rozdíl od prvních dvou zmíněných metod to už alespoň je možné. Další velmi rozšířená metoda formace sféroidů spočívá ve využití neprilnavých povrchů, v angličtině označována obvykle jako liquid overlay (Enmon RM Jr, O'Connor KC, Lacks DJ, Schwartz DK, Dotson RS, Dynamics of spheroid self-assembly in liquid-overlay culture of DU 145 human prostate cancer cells. Biotechnol Bioeng, 2001 Mar 20;72(6):579 až 591, PMID: 11460249), (LANDRY, L, D. BERNIER, C. OUELLET, R. GOYETTE a N. MARCEAU, Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities, The Journal of Cell Biology, 1985, 101(3), 914 až 923, ISSN 0021-9525, doi: 10.1083/jcb. 101.3.914). Pokud povrch neumožní buňkám přilnout, začnou se shlukovat a spojovat mezi sebou a utvoří tak 3D kultury. Nejběžnější povrch s takovouto vlastností je agaróza či polyakrylamid. Využívají se také uměle vytvořené polymery, například póly (2-hydroxyethylmethakrylát) (poly-HEMA). Výhodou této metody je možnost dobře pozorovat vznik sféroidů. Nevýhodou je nejednotnost velikosti a tvaru sféroidů. 3D buněčné kultury je také možné utvořit pomocí externích sil, které zakoncentrují buňky v suspenzi do dostatečné blízkosti, aby se začaly spojovat. Lze využít např. elektrické pole - dielektroforéza (SEBASTIAN, Anil, Anne-Marie BUCKLE a Gerard H. MARKX, Tissue engineering with electric fields: Immobilization of mammalian cells in multilayer aggregates using dielectrophoresis, Biotechnology and Bioengineering, 2007, 98(3), 694 až 700, ISSN 00063592, doi: 10.1002/bit.21416) či magnetické pole, kdy se buňky shlukují kolem magnetických jader, tvořených nanočásticemi, a je možné do určité míry regulovat i tvar utvořených shluků (JAFARI, Javad, Xiao-lian HAN, Jason PALMER, Phong A. TRAN a Andrea J. O’CONNOR, Remote Control in Formation of 3D Multicellular Assemblies Using Magnetic Forces, ACS Biomaterials Science & Engineering. 2019, 5(5), 2532 až 2542, ISSN 2373-9878, doi:10.1021/acsbiomaterials.9b00297), nebo ultrazvukové vlny jako ultrazvukovou past (LIU, Jian, Larisa A. KUZNETSOVA, Gareth O. EDWARDS, Jinsheng XU, Mingwen MA, Wendy M. PURCELL, Simon K. JACKSON a W. Terence COAKLEY, Functional three-dimensional HepG2 aggregate cultures generated from an ultrasound trap: Comparison with HepG2 spheroids, Journal of Cellular Biochemistry. 2007, 102(5), 1180 až 1189, ISSN 07302312, doi:10.1002/jcb.21345). Obecnou nevýhodou u těchto metod je, že použité externí síly mohou mít na buňky nežádoucí účinky. Rovněž může dojít k rozpadu shluků poté, co použité externí síly přestanou působit.- 1 CZ 309953 B6 compared to the previous method, the speed of rotation is much lower, which eliminates the risk of damaging cells and their clusters. It is also easy to change the medium and add other substances, with the possibility of automation. The disadvantage is the impossibility of observing clusters and the non-uniformity of their size. Another possibility is the formation of spheroids by the hanging drop method (KELM, Jens M., Nicholas E. TIMMINS, Catherine J. BROWN, Martin FUSSENEGGER and Lars K. NIELSEN, Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 83(2), 173 to 180, ISSN 00063592, doi: 10.1002/bit. 10655), (TIMMINS, Nicholas E. and Lars K. NIELSEN, Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method, In: HAUSER, Hansjórg and Martin FUSSENEGGER, ed. Tissue Engineering, Totowa, NJ: Humana Press, 2007, 2007, pp. 141 to 151. Methods in Molecular Medicine™, ISBN 978-1-58829- 756-3, doi: 10.1007/978-1-59745443-8 8). The most common implementation of this method consists in applying small droplets with a cell suspension to a surface, which is then turned 180 degrees and the droplets remain suspended on the surface due to surface energy. The cells in each droplet sediment and form a spheroid at the bottom of the droplet. The advantage of this method is the possibility of combining several cell cultures in a specific ratio, as well as the uniformity of the formed spheroids, the size of which can be regulated by the concentration of the cell suspensions used. The disadvantage is that it is difficult to change the medium or add other substances during cultivation, and it is also not easy to observe the formation of spheroids, although unlike the first two methods mentioned, this is at least possible. Another widespread method of spheroid formation consists in the use of non-adherent surfaces, usually referred to in English as liquid overlay (Enmon RM Jr, O'Connor KC, Lacks DJ, Schwartz DK, Dotson RS, Dynamics of spheroid self-assembly in liquid-overlay culture of DU 145 human prostate cancer cells. Biotechnol Bioeng, 2001 Mar 20;72(6):579 to 591, PMID: 11460249), (LANDRY, L, D. BERNIER, C. OUELLET, R. GOYETTE and N. MARCEAU, Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities, The Journal of Cell Biology, 1985, 101(3), 914 to 923, ISSN 0021-9525, doi: 10.1083/jcb.101.3.914 ). If the surface does not allow the cells to adhere, they start to clump together and join together to form 3D cultures. The most common surface with such a property is agarose or polyacrylamide. Man-made polymers such as poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA) are also used. The advantage of this method is the ability to observe the formation of spheroids well. The disadvantage is the non-uniformity of the size and shape of the spheroids. It is also possible to form 3D cell cultures using external forces that concentrate the cells in suspension close enough for them to start joining. An electric field - dielectrophoresis can be used, for example (SEBASTIAN, Anil, Anne-Marie BUCKLE and Gerard H. MARKX, Tissue engineering with electric fields: Immobilization of mammalian cells in multilayer aggregates using dielectrophoresis, Biotechnology and Bioengineering, 2007, 98(3), 694 to 700, ISSN 00063592, doi: 10.1002/bit.21416) or a magnetic field, when cells cluster around magnetic cores formed by nanoparticles, and it is possible to regulate to a certain extent the shape of the clusters formed (JAFARI, Javad, Xiao-lian HAN , Jason PALMER, Phong A. TRAN and Andrea J. O'CONNOR, Remote Control in Formation of 3D Multicellular Assemblies Using Magnetic Forces, ACS Biomaterials Science & Engineering. 2019, 5(5), 2532 to 2542, ISSN 2373-9878, doi:10.1021/acsbiomaterials.9b00297), or ultrasound waves as an ultrasound trap (LIU, Jian, Larisa A. KUZNETSOVA, Gareth O. EDWARDS, Jinsheng XU, Mingwen MA, Wendy M. PURCELL, Simon K. JACKSON, and W. Terence COAKLEY , Functional three-dimensional HepG2 aggregate cultures generated from an ultrasound trap: Comparison with HepG2 spheroids, Journal of Cellular Biochemistry. 2007, 102(5), 1180 to 1189, ISSN 07302312, doi:10.1002/jcb.21345). A general disadvantage of these methods is that the applied external forces can have unwanted effects on the cells. Clusters may also disintegrate after the applied external forces are no longer applied.
Dnes rychle se rozšiřující metodou tvorby 3D kultur jsou mikrofluidní systémy. Můžeme je rozdělit na jednofázové, které využívají neprilnavých povrchů, kde se sféroidy formují v jamkách s možností konstantní obnovy média. Výhodou zde je dobrá kontrola nad koncentracemi látek v médiu a možnost pozorování vzniku sféroidů (OKUYAMA, Tomoaki, Hironori YAMAZOE, Naoto MOCHIZUKI, Ali KHADEMHOSSEINI, Hiroaki SUZUKI a Junji FUKUDA, Preparation of arrays of cell spheroids and spheroid-monolayer cocultures within a microfluidicToday, microfluidic systems are a rapidly expanding method of creating 3D cultures. We can divide them into single-phase, which use non-stick surfaces, where spheroids are formed in wells with the possibility of constant renewal of the medium. The advantage here is good control over the concentrations of substances in the medium and the possibility of observing the formation of spheroids (OKUYAMA, Tomoaki, Hironori YAMAZOE, Naoto MOCHIZUKI, Ali KHADEMHOSSEINI, Hiroaki SUZUKI and Junji FUKUDA, Preparation of arrays of cell spheroids and spheroid-monolayer cocultures within a microfluidic
-2CZ 309953 B6 device, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 110(5), 572 až 576, ISSN 13891723, doi:10.1016/j.jbiosc.2010.05.013). Druhým řešením je tzv. droplet, tj. kapičková, mikrofluidika, což jsou dvoufázové mikrofluidní systémy, sem patří také předložené řešení, které využívají izolace buněčné suspenze ve vodní fázi do oddělených malých kapiček, emulgovaných v druhé, nemísitelné fázi, tvořené obvykle různými typy olejů (KWAK, Bongseop, Yoohwan LEE, Jaehun LEE, Sungwon LEE a Jiseok LIM, Mass fabrication of uniform sized 3D tumor spheroid using high-throughput microfluidic systém, Journal of Controlled Release, 2018, 275, 201 až 207, ISSN 01683659, doi: 10.1016/j jconrel.2018.02.029), (TOMASI, Raphaěl F.-X., Sébastien SART, Tiphaine CHAMPETIER a Charles N. BAROUD, Individual Control and Quantification of 3D Spheroids in a High-Density Microfluidic Droplet Array, Cell Reports, 2020, 31(8), ISSN 22111247, doi: 10.1016/j.celrep.2020.107670), (LEE, Jong Min, Ji Wook CHOI, Christian D. AHRBERG, Hyung Woo CHOI, Jang Ho HA, Seok Gyu MUN, Sung Joon MO a Bong Geun CHUNG, Generation of tumor spheroids using a droplet-based microfluidic device for photothermal therapy, Microsystems & Nanoengineering, 2020, 6(1), ISSN 2055-7434, doi:10.1038/s41378-020-0167-x). Výhodou této techniky je zejména jednotnost velikosti vzniklých sféroidů, rychlost jejich tvorby, včetně možnosti automatizace a dobrá pozorovatelnost vzniku sféroidů. Nevýhodou je omezená životnost sféroidů v kapičkách, vzhledem k omezenému množství živin a obecně obtížná obměna látek v těchto kapičkách. S droplet mikrofluidikou se také mohou kombinovat techniky vytvářející podpůrnou strukturu pro buňky, tzv. scaffold, kdy se přidávají prekurzory různých hydrogelů, např. alginát, dextran atd., do kapiček vodní fáze, ve kterých se hydrogel následně zesíťuje a kapička si tak udrží svůj tvar, zatímco jí mohou prorůst buňky ze suspenze. Tato technika může být použita i bez olejové fáze (DE LORA, Jacqueline A., Frank A. FENCL, Aidira D.Y. MACIAS GONZALEZ, Alireza BANDEGI, Reza FOUDAZI, Gabriel P. LOPEZ, Andrew P. SHREVE a Nick J. CARROLL, Oil-Free Acoustofluidic Droplet Generation for Multicellular Tumor Spheroid Culture, ACS Applied Bio Materials, 2019, 2(9), 4097 až 4105, ISSN 2576-6422, doi: 10.1021/acsabm.9b00617). Výhodou je možnost tvorby atypických tvarů a složitějších struktur 3D buněčných útvarů, např. jádro a slupka sféroidů z jiných druhů buněk (SUN, Qi, Say Hwa TAN, Qiushui CHEN, Rui RAN, Yue HUI, Dong CHEN a Chun-Xia ZHAO, Microfluidic Formation of Coculture Tumor Spheroids with Stromal Cells As a Novel 3D Tumor Model for Drug Testing, ACS Biomaterials Science & Engineering, 2018, 4(12), 4425 až 4433, ISSN 2373-9878, doi:10.1021/acsbiomaterials.8b00904).-2CZ 309953 B6 device, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 110(5), 572 to 576, ISSN 13891723, doi:10.1016/j.jbiosc.2010.05.013). The second solution is the so-called droplet, i.e. droplet, microfluidics, which are two-phase microfluidic systems, this also includes the presented solution, which uses the isolation of the cell suspension in the water phase into separate small droplets, emulsified in the second, immiscible phase, usually formed by different types of oils (KWAK, Bongseop, Yoohwan LEE, Jaehun LEE, Sungwon LEE and Jiseok LIM, Mass fabrication of uniform sized 3D tumor spheroid using high-throughput microfluidic system, Journal of Controlled Release, 2018, 275, 201 to 207, ISSN 01683659, doi: 10.1016/j jconrel.2018.02.029), (TOMASI, Raphaěl F.-X., Sébastien SART, Tiphaine CHAMPETIER and Charles N. BAROUD, Individual Control and Quantification of 3D Spheroids in a High-Density Microfluidic Droplet Array, Cell Reports, 2020, 31(8), ISSN 22111247, doi: 10.1016/j.celrep.2020.107670), (LEE, Jong Min, Ji Wook CHOI, Christian D. AHRBERG, Hyung Woo CHOI, Jang Ho HA, Seok Gyu MUN, Sung Joon MO and Bong Geun CHUNG, Generation of tumor spheroids using a droplet-based microfluidic device for photothermal therapy, Microsystems & Nanoengineering, 2020, 6(1), ISSN 2055-7434, doi:10.1038/s41378-020-0167-x). The advantage of this technique is, in particular, the uniformity of the size of the spheroids formed, the speed of their formation, including the possibility of automation, and good observability of the formation of spheroids. The disadvantage is the limited lifetime of the spheroids in the droplets, due to the limited amount of nutrients and the generally difficult exchange of substances in these droplets. Droplet microfluidics can also be combined with techniques that create a supporting structure for cells, the so-called scaffold, when precursors of various hydrogels, e.g. alginate, dextran, etc., are added to the droplets of the water phase, in which the hydrogel is subsequently cross-linked and the droplet thus maintains its shape, while cells from the suspension can grow through it. This technique can also be used without an oil phase (DE LORA, Jacqueline A., Frank A. FENCL, Aidira D.Y. MACIAS GONZALEZ, Alireza BANDEGI, Reza FOUDAZI, Gabriel P. LOPEZ, Andrew P. SHREVE and Nick J. CARROLL, Oil- Free Acoustofluidic Droplet Generation for Multicellular Tumor Spheroid Culture, ACS Applied Bio Materials, 2019, 2(9), 4097 to 4105, ISSN 2576-6422, doi: 10.1021/acsabm.9b00617). The advantage is the possibility of creating atypical shapes and more complex structures of 3D cell formations, e.g. core and shell of spheroids from other types of cells (SUN, Qi, Say Hwa TAN, Qiushui CHEN, Rui RAN, Yue HUI, Dong CHEN and Chun-Xia ZHAO, Microfluidic Formation of Coculture Tumor Spheroids with Stromal Cells As a Novel 3D Tumor Model for Drug Testing, ACS Biomaterials Science & Engineering, 2018, 4(12), 4425 to 4433, ISSN 2373-9878, doi:10.1021/acsbiomaterials.8b00904).
Prozatím existuje velmi málo řešení v oblasti 3D buněčných kultur, která by obsahovala více fúnkčních částí v jednom zařízení, tzv. Lab-on-chip, které je schopné provádět celý proces od tvorby 3D buněčných kultur až po jejich záchyt a dlouhodobé kultivace přímo uvnitř systému. Takovýto typ zařízení je přínosný z hlediska úspory práce a času, jelikož odpadají některé jinak potřebné kroky externí manipulace s těmito buněčnými kulturami, jako je centrifugace, pipetování apod. Rovněž existuje málo řešení, která umožňují kultivovat 3D buněčné shluky v průtočném režimu. Takováto zařízení mohou být užitečná pro studium chování např. nádorových sféroidů a přináší možnost automatizace, zejména obnova média/testovaných látek, přidávání dalších látek apod., při dlouhodobých kultivačních experimentech.For now, there are very few solutions in the field of 3D cell cultures that contain multiple functional parts in one device, the so-called Lab-on-chip, which is able to perform the entire process from the creation of 3D cell cultures to their capture and long-term cultivation directly inside the system . This type of device is beneficial in terms of labor and time saving, as some otherwise necessary steps of external handling of these cell cultures, such as centrifugation, pipetting, etc., are omitted. Also, there are few solutions that allow culturing 3D cell clusters in flow mode. Such devices can be useful for studying the behavior of e.g. tumor spheroids and bring the possibility of automation, especially renewal of medium/test substances, addition of other substances, etc., during long-term cultivation experiments.
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Výše uvedené nedostatky jsou do značné míry odstraněny průtokovým systémem pro tvorbu a kultivaci buněčných shluků podle tohoto vynálezu. Jeho podstatou je to, že obsahuje v jednom tělese generátor, rezervoár a kultivátor. Generátor je ve tvaru oválné dráhy opatřené na jednom vrcholu oválu v ose symetrie vstupním portem se vstupním kanálkem pro olejovou fázi a na opačném vrcholu oválu druhým vstupním portem a druhým vstupním kanálkem pro vodní fázi, na který ve směru toku vodní fáze navazuje přes křížovou spojku výstupní kanálek generátoru připojený k rezervoáru. Rezervoár je ve tvaru eliptického válce s hlavní osou ve směru přítoku z generátoru, který je na druhém konci ve směru hlavní osy opatřen druhým výstupním kanálkem a ve směru vedlejší osy levým postranním kanálkem s třetím vstupním portem a pravým postranním kanálkem se čtvrtým vstupním portem. K druhému výstupnímu kanálku je připojenThe above-mentioned shortcomings are largely eliminated by the flow system for the formation and cultivation of cell clusters according to the present invention. Its essence is that it contains a generator, reservoir and cultivator in one body. The generator is in the shape of an oval track equipped at one top of the oval in the axis of symmetry with an input port with an input channel for the oil phase and on the opposite top of the oval with a second input port and a second input channel for the water phase, which is connected in the direction of flow of the water phase via a cross coupling to the output generator channel connected to the reservoir. The reservoir is in the shape of an elliptical cylinder with the main axis in the direction of the inflow from the generator, which is provided with a second outlet channel at the other end in the direction of the main axis and a left side channel with a third inlet port and a right side channel with a fourth inlet port in the direction of the minor axis. It is connected to the second output channel
-3 CZ 309953 B6 propojovací větví kultivátor ve tvaru kvádru o délce v rozsahu od 30 do 70 mm, šířce v rozsahu od 4 do 10 mm a výšce identické s výškou propojovací větve. Kultivační část podélně rozděluje kultivátor na vstupní podélný kanál a výstupní podélný kanál. Vstupní podélný kanál je opatřen třetím vstupním kanálkem kultivátoru s pátým vstupním portem. Výstupní podélný kanál je opatřen třetím výstupním kanálkem s třetím výstupním portem.-3 CZ 309953 B6 connecting branch cultivator in the shape of a cuboid with a length in the range from 30 to 70 mm, a width in the range from 4 to 10 mm and a height identical to the height of the connecting branch. The cultivation part longitudinally divides the cultivator into an input longitudinal channel and an output longitudinal channel. The inlet longitudinal channel is equipped with a third inlet channel of the cultivator with a fifth inlet port. The output longitudinal channel is provided with a third output channel with a third output port.
Vstupní kanálek pro olejovou fázi má délku od 1 do 10 mm a symetricky se rozvětvuje v kolmém směru na dvě větve oválu, které se následně po vzdálenosti od 2 do 20 mm otáčejí do navzájem rovnoběžného směru a po dalších 5 až 25 mm se otáčejí opačným směrem, než při prvním otočení a jsou symetricky spojeny v místě křížové spojky, ke které je připojen druhý vstupní kanálek pro vodní fázi o délce od 2 do 20 mm, který ústí do středu místa, kde se znovu spojují větve vstupního kanálku pro olejovou fázi. V tomto místě je ve směru toku vodní fáze napojen výstupní kanálek generátoru dlouhý 5 až 20 mm spojený s rezervoárem. Druhý vstupní kanálek pro vodní fázi má nižší výšku než větve vstupního kanálku pro olejovou fázi.The inlet channel for the oil phase has a length of 1 to 10 mm and branches symmetrically in the perpendicular direction into two branches of the oval, which then turn in a direction parallel to each other after a distance of 2 to 20 mm and turn in the opposite direction after another 5 to 25 mm , than in the first rotation and are symmetrically connected at the cross-connector to which a second inlet channel for the water phase of length from 2 to 20 mm is connected, which opens in the center of the place where the branches of the inlet channel for the oil phase are connected again. In this place, a 5 to 20 mm long outlet channel of the generator connected to the reservoir is connected in the direction of the flow of the water phase. The second inlet channel for the water phase has a lower height than the branches of the inlet channel for the oil phase.
Rezervoár má s výhodou tvar eliptického válce s hlavní poloosou ve směru přítoku z generátoru, přičemž délka hlavní poloosy je v rozmezí od 10 do 30 mm, délka vedlejší poloosy je v rozmezí od 2,5 do 10 mm a výška válce je od 800 pm do 2 mm.The reservoir preferably has the shape of an elliptical cylinder with the major semi-axis in the direction of the inflow from the generator, the length of the major semi-axis being in the range of 10 to 30 mm, the length of the minor semi-axis being in the range of 2.5 to 10 mm, and the height of the cylinder being from 800 pm to 2 mm.
Výška výstupního kanálku generátoru propojujícího generátor s rezervoárem a druhého výstupního kanálku rezervoáru odvádějící kapalinu z rezervoáru je s výhodou nižší než výška rezervoáru a výška levého postranního kanálku a pravého postranního kanálku je rovna, nebo menší než polovina výšky eliptického válce tvořícího rezervoár.The height of the outlet channel of the generator connecting the generator to the reservoir and the second outlet channel of the reservoir draining liquid from the reservoir is preferably lower than the height of the reservoir, and the height of the left side channel and the right side channel is equal to or less than half the height of the elliptical cylinder forming the reservoir.
Levý postranní kanálek a pravý postranní kanálek jsou ve výhodném provedení před vstupem do rezervoáru rozvětveny alespoň na dvě sudé větve, které jsou od sebe stejně vzdáleny a na konci větvení rovnoměrně pokrývají celou stranu rezervoáru, ze které se do něj napojují.In an advantageous embodiment, the left side channel and the right side channel are branched into at least two even branches before entering the reservoir, which are equidistant from each other and at the end of the branching evenly cover the entire side of the reservoir from which they connect to it.
Konečné rozvětvení jednoho z levých postranních kanálků nebo pravých postranních kanálků vstupuje do rezervoáru shora tak, že horní stěna těchto větví splývá s horní stěnou eliptického válce rezervoáru, a zároveň konečné rozvětvení druhého z levých postranních kanálků nebo pravých postranních kanálků vstupuje do rezervoáru zespod tak, že dno těchto větví splývá se dnem eliptického válce rezervoáru.The final branching of one of the left lateral canals or the right lateral canals enters the reservoir from above so that the upper wall of these branches merges with the upper wall of the elliptical cylinder of the reservoir, and at the same time the final branching of the other of the left lateral canals or the right lateral canals enters the reservoir from below so that the bottom of these branches merges with the bottom of the elliptical cylinder of the reservoir.
Větve levých postranních kanálků a pravých postranních kanálků můžou být u ústí do rezervoáru zúženy na šířku profilu 25 až 150 pm.The branches of the left side channels and the right side channels can be narrowed to a profile width of 25 to 150 pm at the mouth of the reservoir.
Horní stěna druhého výstupního kanálku s výhodou splývá s horní stěnou eliptického válce rezervoáru a druhý výstupní kanálek je ve výhodném provedení rozdělen na výstupní větev, která vede do druhého výstupního portu rezervoáru a propojovací větev, která vede do kultivátoru.The upper wall of the second outlet channel preferably merges with the upper wall of the elliptical cylinder of the reservoir, and the second outlet channel is preferably divided into an outlet branch that leads to the second outlet port of the reservoir and a connecting branch that leads to the cultivator.
Výška druhého výstupního kanálku rezervoáru je s výhodou nižší než rezervoár, dno eliptického válce reservoáru je mimo úrovně dna druhého výstupního kanálku a plynulé napojení dna eliptického válce se dnem druhého výstupního kanálku je realizováno stoupáním dna eliptického válce rezervoáru pod úhlem velikosti maximálně 45°, přičemž toto stoupání dna začíná v libovolném místě rezervoáru a končí v libovolném místě druhého výstupního kanálku rezervoáru. Boční stěna třetího vstupního kanálku kultivátoru může splývat s vnější stěnou vstupního podélného kanálu, přičemž výška třetího vstupního kanálku kultivátoru v oblasti ústí do kultivátoru je rovna výšce kultivátoru a boční stěna třetího výstupního kanálku kultivátoru splývá s vnější stěnou výstupního podélného kanálu, přičemž výška třetího výstupního kanálku kultivátoru je u jeho ústí rovna výšce kultivátoru. Vstupní podélný kanál je ve výhodném provedení na vnější straně kultivátoru zkosen tak, že se zužuje směrem k jeho konci, přičemž zkosení začíná v místě od začátku až od poloviny délky tohoto vstupního podélného kanálu a úhel zkosení je v rozsahu 1 až 20° a zároveň výstupní podélný kanál je na vnější straně kultivátoru zkosen tak, že se zužuje směrem k jeho začátku, přičemž zkosení začíná v místě odThe height of the second outlet channel of the reservoir is preferably lower than the reservoir, the bottom of the elliptical cylinder of the reservoir is outside the level of the bottom of the second outlet channel, and the smooth connection of the bottom of the elliptical cylinder with the bottom of the second outlet channel is realized by the rise of the bottom of the elliptical cylinder of the reservoir at an angle of maximum 45°, while this the rise of the bottom starts at any point of the reservoir and ends at any point of the second outlet channel of the reservoir. The side wall of the third input channel of the cultivator can merge with the outer wall of the longitudinal input channel, while the height of the third input channel of the cultivator in the region of the mouth into the cultivator is equal to the height of the cultivator, and the side wall of the third output channel of the cultivator merges with the external wall of the output longitudinal channel, while the height of the third output channel of the cultivator is equal to the height of the cultivator at its mouth. In an advantageous embodiment, the inlet longitudinal channel is beveled on the outside of the cultivator in such a way that it narrows towards its end, while the beveling starts at the point from the beginning to the middle of the length of this inlet longitudinal channel and the bevel angle is in the range of 1 to 20°, and at the same time the output the longitudinal channel is chamfered on the outside of the cultivator so as to taper towards its beginning, the chamfer starting at a point from
-4CZ 309953 B6 konce až od poloviny délky tohoto výstupního podélného kanálu a úhel zkosení jev rozsahu 1 až 20°.-4CZ 309953 B6 ends up to half the length of this output longitudinal channel and the bevel angle is in the range of 1 to 20°.
Kultivační část kultivátoru se s výhodou nachází po celé délce kultivátoru a je tvořena mikrokanálky, které svírají s delší stranou vstupního podélného kanálu před jejím zkosením úhel o velikosti minimálně 90°, přičemž šířka mikrokanálků se pohybuje v rozsahu od 50 do 500 pm, jejich délka má hodnotu minimálně 1 mm a jejich výška se pohybuje v rozsahu od 25 pm až do hodnoty výšky kultivátoru a výšky jednotlivých mikrokanálků se zároveň liší tak, že jsou mikrokanálky z obou konců kultivační části směrem k jejímu prostředku uspořádány od nejnižších k nejvyšším, přičemž výška mikrokanálků se ve směru jeho délky mění a výškou mikrokanálků se rozumí nejmenší vzdálenost jeho horní stěny od jeho dna. Součástí každého mikrokanálků v kultivační části kultivátoru může být zúžená část, v jejíž nejužším místě je mikrokanálek zúžen až o 90 % své šířky a tato zúžená část je umístěna v libovolném místě délky mikrokanálků. Prostor mezi zúžením a ústím mikrokanálků do vstupního podélného kanálu vymezuje oblast pro záchyt sféroidu, jejíž tvar je jiný, než tvar mikrokanálků mezi zúžením a jeho ústím do výstupního podélného kanálu.The cultivator part of the cultivator is preferably located along the entire length of the cultivator and consists of microchannels that form an angle of at least 90° with the longer side of the inlet longitudinal channel before it is beveled, while the width of the microchannels ranges from 50 to 500 pm, their length has a value of at least 1 mm and their height ranges from 25 pm up to the value of the height of the cultivator and the height of the individual microchannels also differs in that the microchannels from both ends of the cultivation part towards its center are arranged from the lowest to the highest, while the height of the microchannels varies in the direction of its length, and the height of the microchannels means the smallest distance between its upper wall and its bottom. Each of the microchannels in the cultivation part of the cultivator can include a narrowed part, in the narrowest point of which the microchannel is narrowed by up to 90% of its width, and this narrowed part is located at any point along the length of the microchannels. The space between the narrowing and the mouth of the microchannels into the inlet longitudinal channel defines the area for capturing the spheroid, the shape of which is different from the shape of the microchannels between the narrowing and its mouth into the outlet longitudinal channel.
Předložené technické řešení popisuje průtokové mikrozařízení určené pro tvorbu trojrozměrných buněčných shluků kulovitého tvaru, tzv. sféroidů, metodou izolace buněk do oddělených kapiček v emulzi, s možností jejich následné separace a dlouhodobé kultivace nebo extrakce pro další laboratorní zpracování. Emulze je složena z vodní fáze, tj. médium pro růst a diferenciaci buněk, a olejem s vyšší hustotou, než má vodní fáze.The presented technical solution describes a flow microdevice intended for the formation of three-dimensional cell clusters of a spherical shape, so-called spheroids, by the method of isolating cells into separate droplets in an emulsion, with the possibility of their subsequent separation and long-term cultivation or extraction for further laboratory processing. An emulsion is composed of a water phase, i.e. a medium for cell growth and differentiation, and an oil with a higher density than the water phase.
Podstatou předloženého systému je specificky uzpůsobená geometrie vnitřních kanálků a prostorů pro kapaliny. Systém je rozdělen na tři fúnkční části: generátor, rezervoár a kultivátor, které jsou propojené dohromady v jednom tělese. Je navržený tak, aby byl v pracovní poloze orientován vodorovně a zajistilo se tak správné rozložení němí site Iných fází a buněčné hmoty uvnitř vodní fáze.The essence of the presented system is the specifically adapted geometry of internal channels and spaces for liquids. The system is divided into three functional parts: generator, reservoir and cultivator, which are connected together in one body. It is designed so that it is oriented horizontally in the working position and thus ensures the correct distribution of the silent sieve of Other Phases and cellular matter inside the water phase.
První část systému - generátor, je určena pro tvorbu disperze vody v oleji, případně i v jiné kapalině nemísitelné s vodou. Má vstupní port a kanálek pro vodní fázi a vstupní port a kanálek pro olejovou fázi. Tvorby disperze je dosaženo tak, že se vstupní kanálek pro olejovou fázi rozděluje na dvě symetrické větve, které se poté znovu spojují, a ve středu místa spoje tyto větve protíná vstupní kanálek pro vodní fázi, čímž vzniká křížová spojka, v angličtině je tento mechanismus označován jako cross-junction, ve které je proud vodní fáze, přicházející ze vstupního kanálku pro vodní fázi, přerušován olejovou fází, přicházející z větví vstupního kanálku pro olejovou fázi a vznikají tak pravidelné kapičky, přičemž různým nastavením velikosti průtoků olejové a vodní fáze lze dosáhnout různé velikosti kapiček a rychlosti jejich tvorby. Křížová spojka v předloženém systému má kanálek napojený na vstupní port pro vodní fázi, který je ve svém ústí do křížové spojky nižší, než postranní větve s olejovou fází a spojuje se s nimi tak, že ústí kanálku je umístěno uprostřed výšky větví s olejovou fází, čímž je zajištěno, že tvořící se kapka vody v oleji se může rozpínat do všech směrů, aniž by došlo k její deformaci kontaktem se stěnami kanálků za ústím do křížové spojky. Zamezením kontaktu kapky se stěnami se snižuje riziko nežádoucího smáčení povrchu vodní fází.The first part of the system - the generator - is intended for the creation of water dispersion in oil, or in another liquid immiscible with water. It has an inlet port and channel for the water phase and an inlet port and channel for the oil phase. The formation of the dispersion is achieved by dividing the inlet channel for the oil phase into two symmetrical branches, which are then joined again, and at the center of the junction these branches are crossed by the inlet channel for the water phase, which creates a cross coupling, in English this mechanism is called as a cross-junction, in which the flow of the water phase coming from the inlet channel for the water phase is interrupted by the oil phase coming from the branches of the inlet channel for the oil phase and thus regular droplets are formed, while different settings of the oil and water phase flow rates can be achieved droplet size and speed of their formation. The cross coupler in the presented system has a channel connected to the water phase inlet port, which at its mouth into the cross coupler is lower than the side branches with the oil phase and connects with them so that the mouth of the channel is located in the middle of the height of the branches with the oil phase, thereby ensuring that the forming droplet of water in the oil can expand in all directions without being deformed by contact with the walls of the channels beyond the mouth into the cross coupling. By preventing the contact of the drop with the walls, the risk of unwanted wetting of the surface with the water phase is reduced.
Kapičky vzniklé v generátoru následně putují výstupním kanálkem generátoru do druhé části systému, která primárně slouží jako rezervoár. Tento rezervoár má tvar eliptického válce s hlavní osou podstavy ve směru toku přicházejícího z generátoru a je vyšší než výstupní kanálek generátoru. Větší výškou rezervoáru oproti výstupnímu kanálku generátoru je dosaženo toho, že se v něm olejová fáze, tj. fáze s vyšší hustotou, drží na dně a nad ní se hromadí utvořené vodní kapičky s buněčnou suspenzí a je tak možné jej naplnit kapičkami disperzního podílu v jedné vrstvě, tzv. monovrstvě, přičemž pod nimi zůstává definovaná vrstva kapaliny tvořící disperzní prostředí. Buňky jsou izolovány v jednotlivých kapičkách a gravitací jsou taženy k jejich dnu. Shromážděním buněk na dně kapky dochází k přirozené tvorbě buněčného shluku sférického tvaru, sféroidu. V další fázi tohoto procesu dochází k tzv. zrání sféroidů a dle podmínek, jako jeThe droplets created in the generator subsequently travel through the output channel of the generator to the second part of the system, which primarily serves as a reservoir. This reservoir has the shape of an elliptical cylinder with the main axis of the base in the direction of the flow coming from the generator and is higher than the outlet channel of the generator. The higher height of the reservoir compared to the outlet channel of the generator ensures that the oil phase, i.e. the phase with a higher density, stays at the bottom and the formed water droplets with a cell suspension accumulate above it, and it is thus possible to fill it with droplets of the dispersion fraction in one layer, the so-called monolayer, while below them remains a defined layer of liquid forming the dispersion medium. Cells are isolated in individual droplets and are drawn to their bottom by gravity. The collection of cells at the bottom of the drop results in the natural formation of a spherical cell cluster, a spheroid. In the next phase of this process, the so-called maturation of spheroids takes place and according to conditions such as
-5CZ 309953 B6 typ buněk, typ média, aditiva média apod., tato fáze trvá cca 6 až 24 hodin. Poté se již tyto sféroidy chovají z mechanického pohledu jako celistvé kulové útvary a je možné s nimi tak dále manipulovat.-5CZ 309953 B6 cell type, media type, media additives, etc., this phase lasts approx. 6 to 24 hours. After that, these spheroids already behave from a mechanical point of view as integral spherical formations and it is possible to manipulate them further.
Do rezervoáru ze stran, tj. ve směru vedlejší osy podstavy rezervoáru, ústí postranní kanálky, jejichž výška je rovna maximálně polovině výšky rezervoáru, přičemž z jedné strany ústí tyto kanálky do rezervoáru tak, že jejich horní stěny splývají s horní stěnou rezervoáru a z druhé strany tak, že dna kanálků splývají se dnem rezervoáru. Tyto postranní kanálky mají specifické rozvětvení, které zajišťuje téměř stejně dlouhou dráhu pro tok kapaliny v každé větvi, přičemž koncové větve ústí do rezervoáru tak, aby rovnoměrně pokryly celou jeho stranu ve směru hlavní osy jeho podstavy. Výše popsanou geometrií postranních kanálků a rezervoáru je dosaženo toho, že při uzavření všech vstupů a výstupů systému, kromě těchto dvou postranních větví, dochází k proudění skrz rezervoár napříč ve směru vedlejší osy jeho podstavy, což zajišťuje efektivní průplach celého objemu rezervoáru. Tato vlastnost je důležitá pro účel cílené koalescence vodních kapiček nahromaděných v rezervoáru, kdy se provádí průplach rezervoáru roztokem destabilizačního činidla, například lH,lH,2H,2H-Perfluor-l-oktanol, rozpuštěný v olejové fázi HFE-7500, který způsobí koalescenci kapiček, přičemž nedojde k odplavení zformovaných sféroidů, protože odtoková větev je při tomto procesu ve spodní části rezervoáru, zatímco vodní fáze s buňkami se drží více nahoře, tj. nad olejovou fází, a navíc jsou větve postranních kanálků u svých ústí do rezervoáru zúženy tak, aby se do nich sféroidy nevešly. Tímto způsobem je možné převést nově zformované sféroidy v jednotlivých kapičkách do souvislé vodní fáze, držící se nad olejovou fází v rezervoáru. Umístění jedné větve kanálků v horní části a druhé větve ve spodní části také umožňuje selektivní vypuštění horní či spodní fáze, a to buďto vytlačením těžší fáze skrz spodní větev lehčí fází vstupující větví shora, nebo vytlačením lehčí fáze skrz horní větev těžší fází vstupující větví zespod. Tento způsob manipulace s fázemi s větší a menší hustotou je užitečný pro proces plnění rezervoáru kapičkami, při kterém se kapičky vodní fáze kumulují v jeho horní části a selektivně se vypouští olejová fáze skrz větve postranního kanálku vespod, díky čemuž lze plně pokrýt celou plochu rezervoáru kapičkami (monovrstvou), aniž by některé z kapiček během plnění mohly uniknout pryč.Lateral channels, the height of which is equal to at most half the height of the reservoir, open into the reservoir from the sides, i.e. in the direction of the minor axis of the base of the reservoir, while these channels open into the reservoir from one side so that their upper walls merge with the upper wall of the reservoir and from the other side so that the bottoms of the channels merge with the bottom of the reservoir. These lateral channels have a specific branching which ensures an almost equal length path for the flow of liquid in each branch, with the end branches opening into the reservoir so as to evenly cover its entire side in the direction of the main axis of its base. The above-described geometry of the lateral channels and the reservoir achieves that when all the inputs and outputs of the system are closed, except for these two lateral branches, flow occurs through the reservoir transversely in the direction of the minor axis of its base, which ensures effective flushing of the entire volume of the reservoir. This property is important for the purpose of targeted coalescence of water droplets accumulated in the reservoir, when the reservoir is flushed with a solution of a destabilizing agent, for example, 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol, dissolved in the oil phase of HFE-7500, which causes the droplets to coalesce. , while the formed spheroids are not washed away, since the outflow branch is in the lower part of the reservoir in this process, while the water phase with cells is kept higher up, i.e. above the oil phase, and in addition, the branches of the lateral channels are narrowed at their mouths into the reservoir so that so that the spheroids do not fit into them. In this way, it is possible to convert the newly formed spheroids in individual droplets into a continuous water phase, holding above the oil phase in the reservoir. The placement of one branch of the channels in the upper part and the other branch in the lower part also allows the selective release of the upper or lower phase, either by forcing the heavier phase through the lower branch by the lighter phase entering the branch from above, or by forcing the lighter phase through the upper branch by the heavier phase entering the branch from below. This method of handling the phases of higher and lower density is useful for the process of filling the reservoir with droplets, in which the droplets of the water phase accumulate at the top of the reservoir and the oil phase is selectively discharged through the branches of the lateral channel below, thanks to which the entire surface of the reservoir can be fully covered with droplets (monolayer) without any of the droplets escaping during filling.
Třetí část systému, označována jako kultivátor, je určena pro dlouhodobou kultivaci utvořených sféroidů, včetně možnosti průtoku kapalin skrz sféroidy během kultivace. Kultivátor muže být součástí celého mikrofluidního systému, propojenou s předchozími částmi pomocí kanálku uvnitř systému, nebo může být vyroben jako samostatně fúnkční modul. Kultivátor se vyznačuje schopností účinného záchytu jednotlivých sféroidů do samostatných kompartmentů a umožněním rovnoměrného průtoku kultivační kapaliny v době vodní fáze kolem všech zachycených sféroidů pomocí speciálně uzpůsobené geometrie kanálků. Kultivátor se dělí na tři oblasti: vstupní podélný kanál, kultivační část a výstupní podélný kanál. Skrz vstupní podélný kanál se do kultivátoru vpravují sféroidy a kultivační kapalina. Kultivační část obsahuje sérii mikrokanálků kolmých, nebo velmi zkosených vůči směru přítoku kapaliny do vstupního podélného kanálu, přičemž sféroidy skrz tyto mikrokanálky nemohou projít a zachycují se na jejich začátcích v oddělených kompartmentech, tj. žlábcích, kdy každý tento žlábek je propojen s jedním mikrokanálkem. Po uchycení jsou sféroidy efektivně kryty před opětovným odplavením, ke kterému by mohlo dojít vlivem proudu ve vstupním podélném kanálu. Výstupní podélný kanál pak slouží ke sběru kapaliny odtékající z mikrokanálků kultivační části.The third part of the system, referred to as the cultivator, is intended for long-term cultivation of the formed spheroids, including the possibility of liquid flow through the spheroids during cultivation. The cultivator can be a part of the entire microfluidic system, connected to the previous parts by means of a channel inside the system, or it can be made as an independently functional module. The cultivator is characterized by the ability to effectively trap individual spheroids in separate compartments and by enabling a uniform flow of the culture liquid during the water phase around all captured spheroids using a specially adapted channel geometry. The cultivator is divided into three areas: the inlet longitudinal channel, the cultivation part and the outlet longitudinal channel. The spheroids and cultivation liquid are introduced into the cultivator through the inlet longitudinal channel. The cultivation part contains a series of microchannels perpendicular to, or very inclined to, the direction of liquid inflow into the inlet longitudinal channel, while spheroids cannot pass through these microchannels and are captured at their beginnings in separate compartments, i.e. grooves, where each of these grooves is connected to one microchannel. Once attached, the spheroids are effectively shielded from re-flooding, which could occur due to the current in the inlet longitudinal channel. The outlet longitudinal channel then serves to collect the liquid flowing out of the microchannels of the cultivation part.
Mikrokanálky v kultivační části kultivátoru mají srovnatelný, +- 10 %, objemový průtok. Toho je dosaženo zvolenou geometrií, která zajišťuje zvýšení průtoku skrz mikrokanálky v prostřední části. Geometrie kultivátoru upravující hydrodynamiku se vyznačuje tím, že: za prvé, jednotlivé mikrokanálky mají odlišné průřezy, přičemž konkrétní mikrokanálky jsou selektivně zúženy, čímž se reguluje jejich odpor vůči toku tak, aby se hodnoty objemových průtoků kapaliny skrz všechny mikrokanálky co nejvíce přiblížily stejné hodnotě. Za druhé, vstupní podélný kanál se zužuje směrem ke konci kultivátoru, což snižuje průtok, se zvýšením odporu, skrz jeho koncovou část a zároveň výstupní podélný kanál se zužuje směrem k začátku kultivátoru, což snižuje průtok skrz jeho počáteční část.The microchannels in the cultivation part of the cultivator have a comparable, +- 10%, volume flow. This is achieved by the chosen geometry, which ensures an increase in flow through the microchannels in the middle part. The geometry of the hydrodynamics modifying cultivator is characterized by: first, the individual microchannels have different cross-sections, with specific microchannels being selectively narrowed, thereby regulating their resistance to flow so that the volume flow rates of liquid through all microchannels are as close as possible to the same value. Second, the inlet longitudinal channel narrows towards the end of the cultivator, which reduces the flow, with an increase in resistance, through its end part, and at the same time, the outlet longitudinal channel narrows towards the beginning of the cultivator, which reduces the flow through its initial part.
-6CZ 309953 B6-6CZ 309953 B6
Vstupní podélný kanál kultivátoru má oddělený vstup, skrz který se do něj vpravují sféroidy z rezervoáru a vstup, skrz který do něj proudí kapalina určená pro dlouhodobé kultivace. Vstup pro sféroidy se vyznačuje tím, že ústí do kultivátoru v oblasti blíže k mikrokanálkům kultivační části, což napomáhá jejich záchytu v počáteční oblasti kultivační části. Druhý vstup pro kultivační kapalinu je umístěn dále od mikrokanálků, než vstup pro sféroidy, tj. jeho boční stěna splývá s boční stěnou vstupního podélného kanálu orientovanou vně systém, díky čemuž se v případě přítoku kapaliny do kultivátoru tímto kanálkem zachovává srovnatelný průtok skrz všechny mikrokanálky. Srovnatelné hodnoty objemového průtoku kapaliny skrz všechny mikrokanálky umožňují dlouhodobé kultivace se stejnými podmínkami pro všechny uchycené sféroidy.The inlet longitudinal channel of the cultivator has a separate inlet through which the spheroids from the reservoir are fed into it and an inlet through which the liquid intended for long-term cultivation flows into it. The inlet for the spheroids is characterized by the fact that it opens into the cultivator in the area closer to the microchannels of the culture part, which helps their capture in the initial region of the culture part. The second inlet for the cultivation liquid is located further from the microchannels than the inlet for the spheroids, i.e. its side wall merges with the side wall of the inlet longitudinal channel oriented outside the system, thanks to which, in case of liquid inflow into the cultivator through this channel, a comparable flow through all microchannels is maintained. Comparable values of liquid volume flow through all microchannels enable long-term cultivations with the same conditions for all attached spheroids.
Integrace generátoru, rezervoáru a kultivátoru do jednoho fúnkčního celku umožňuje automatizovatelný proces tvorby a kultivace sféroidů v jednom zařízení, přičemž je možné provádět experimenty s testováním roztoků s různým obsahem aktivních látek na sféroidech, a to jak v průtokovém, tak v přerušovaném průtokovém nebo ve statickém režimu.The integration of the generator, reservoir and cultivator into one functional unit enables an automatable process of spheroid formation and cultivation in one device, while it is possible to perform experiments testing solutions with different contents of active substances on spheroids, both in flow, intermittent flow or static mode.
Objasnění výkresůClarification of drawings
Průtokový systém pro tvorbu a kultivaci buněčných shluků podle tohoto vynálezu bude popsán na konkrétním příkladu provedení s pomocí přiložených výkresů, kde na obr. 1 je zobrazeno schéma kompletní vnitřní struktury prostoru průtokového systému - mikrofluidního čipu. Na obr. 2 je zobrazen detail vnitřní struktury křížové spojky generátoru pro tvorbu disperze, detail napojení generátoru na rezervoár a detail postranních rozvětvených kanálků vedoucích do rezervoáru kapiček. Na obr. 3 je zobrazen detail konce rezervoáru se začínajícím stoupáním jeho dna napojující se na dno výstupního kanálku rezervoáru a rovněž detail postranních rozvětvených kanálků vedoucích do rezervoáru kapiček, v jeho druhé části. Na obr. 4A je zobrazen detail vnitřní struktury na začátku a na obr. 4B na konci kultivátoru s mikrokanálky a detail selektivního snížení výšky mikrokanálků v těchto krajních částech kultivátoru. Na obr. 5 je zobrazen detail jednoho mikrokanálků v kultivační části kultivátoru. Na obr. 6 jsou zobrazeny computer-aided design, tedy CAD modely, tj. modely v počítačem podporovaném projektování, jednotlivých dílů konkrétního technického řešení, kde na obr. 6Aa je rozhraní pro připojení konektorů, na obr. 6Ab je horní část mikrofluidního čipu, na obr. 6Ac je spodní část mikrofluidního čipu a na obr. 6Ad je podkladové sklíčko. Na obr. 6B je zobrazen CAD model zkompletovaného systému v pohledu shora.The flow system for the formation and cultivation of cell clusters according to the present invention will be described using a specific example of implementation with the help of the attached drawings, where Fig. 1 shows a diagram of the complete internal structure of the space of the flow system - microfluidic chip. Fig. 2 shows a detail of the internal structure of the cross coupling of the generator for the formation of dispersion, a detail of the connection of the generator to the reservoir and a detail of the side branched channels leading to the droplet reservoir. Fig. 3 shows a detail of the end of the reservoir with the starting rise of its bottom connecting to the bottom of the outlet channel of the reservoir, as well as a detail of the side branched channels leading to the droplet reservoir, in its second part. Fig. 4A shows a detail of the internal structure at the beginning and Fig. 4B at the end of the cultivator with microchannels and a detail of the selective reduction of the height of the microchannels in these extreme parts of the cultivator. Fig. 5 shows a detail of one of the microchannels in the cultivation part of the cultivator. Fig. 6 shows computer-aided design, i.e. CAD models, i.e. models in computer-aided design, of individual parts of a specific technical solution, where Fig. 6Aa shows the interface for connecting connectors, Fig. 6Ab shows the upper part of the microfluidic chip, in Fig. 6Ac is the lower part of the microfluidic chip and in Fig. 6Ad is the base slide. A top view CAD model of the completed system is shown in Fig. 6B.
Příklady uskutečnění vynálezuExamples of implementation of the invention
Příkladem konkrétního technického řešení je mikrofluidní systém, tj. čip vyrobený z polymeru OSTE+ (off-stoichiometry thiolene epoxy) pomocí soft-litografických technik. Systém z OSTE+ polymeru je průhledný a umožňuje pozorování buněk a sféroidů shora i zespod. Čip je zkompletován slepením dvou částí z OSTE+ polymeru, přičemž spodní část je umístěna na skleněném podkladu, viz obr. 6A a obr. 6B. Skleněný podklad není v kontaktu s kapalinami uvnitř, slouží pouze jako výztuž obou lepených částí. Čip obsahuje celkem sedm vstupů/výstupů umístěných na jeho horní straně: vstupní port 1 vstupního kanálku 2 generátoru pro olejovou fázi, druhý vstupní port 3 druhého vstupního kanálku 4 generátoru pro vodní fázi, třetí vstupní port 8 levého postranního kanálku 9 rezervoáru 7, čtvrtý vstupní port 10 pravého postranního kanálku 11 rezervoáru 7, druhý výstupní port 15 rezervoáru 7, pátý vstupní port 16 třetího vstupního kanálku 17 kultivátoru a třetí výstupní port 22 třetího výstupního kanálku 21 kultivátoru. Systém je opatřen rozhraními pro připojení standardních mikrofluidních konektorů. Tato rozhraní jsou vyrobená 3D tiskem z polymeru na bázi methakrylátu a přilepena ke všem vstupním a výstupním portům systému, viz obr. 6A a obr. 6B, pomocí UV lepidla, které po osvitu UV zářením velmi dobře přilne k materiálu OSTE+ i k methakrylátovému polymeru. Celý mikrofluidní čip, včetněAn example of a specific technical solution is a microfluidic system, i.e. a chip made of OSTE+ polymer (off-stoichiometry thiolene epoxy) using soft-lithographic techniques. The OSTE+ polymer system is transparent and allows observation of cells and spheroids from above and below. The chip is completed by gluing two parts of OSTE+ polymer, while the lower part is placed on a glass substrate, see Fig. 6A and Fig. 6B. The glass base is not in contact with the liquids inside, it serves only as a reinforcement of both glued parts. The chip contains a total of seven inputs/outputs located on its upper side: input port 1 of the input channel 2 of the oil phase generator, the second input port 3 of the second input channel 4 of the water phase generator, the third input port 8 of the left side channel 9 of the reservoir 7, the fourth input port port 10 of the right side channel 11 of the reservoir 7, the second output port 15 of the reservoir 7, the fifth input port 16 of the third input channel 17 of the cultivator and the third output port 22 of the third output channel 21 of the cultivator. The system is equipped with interfaces for connecting standard microfluidic connectors. These interfaces are 3D printed from a methacrylate-based polymer and glued to all input and output ports of the system, see Fig. 6A and Fig. 6B, using a UV adhesive that adheres very well to both the OSTE+ material and the methacrylate polymer after UV exposure. The entire microfluidic chip, incl
-7 CZ 309953 B6 rozhraní a lepidla, se vyznačuje dostatečnou chemickou odolností při čištění pomocí sonikace ve vodě, ethanolu, nebo isopropanolu. Rovněž lze použít detergenty, nebo roztok chlornanu sodného, jako je Savo, Domestos a jiné čisticí prostředky. Systém se dále vyznačuje tím, že je jeho vnitřní povrch modifikován pomocí fluorosilanového polymeru, který jej činí fluorofilním, tedy je velmi dobře smáčen fluorovanými oleji, jako je např. HFE-7500, používaný jako disperzní prostředí při experimentu. Tato povrchová modifikace je rovněž kompatibilní se zmíněnými metodami čištění.-7 CZ 309953 B6 interface and adhesives, is characterized by sufficient chemical resistance when cleaning using sonication in water, ethanol, or isopropanol. Detergents or sodium hypochlorite solution such as Savo, Domestos and other cleaning agents can also be used. The system is further characterized by the fact that its inner surface is modified with a fluorosilane polymer, which makes it fluorophilic, i.e. it is very well wetted by fluorinated oils, such as HFE-7500, used as a dispersion medium in the experiment. This surface modification is also compatible with the mentioned cleaning methods.
Cíp se vyznačuje tím, že se vstupní kanálek 2 pro olejovou fázi o čtvercovém průřezu s hranou 800 pm napojený na vstupní port 1 pro olejovou fázi rozděluje na dvě symetrické větve, které se poté opět spojují a v místě spoje se na ně z prostředku napojuje druhý vstupní kanálek 4 pro vodní fázi, napojený na druhý vstupní port 3 pro vodní fázi, přičemž tento druhý vstupní kanálek 4 má v místě napojení čtvercový průřez o hraně 200 pm. Na tyto tři spojující se kanálky se napojuje výstupní kanálek 6 generátoru o čtvercovém průřezu 800 pm, pokračující do rezervoáru 7 tvaru eliptického válce o výšce 1200 pm, s délkou hlavní osy 30 mm a délkou vedlejší osy 10 mm. Na tento rezervoár 7 jsou ze stran ve směru vedlejší osy napojené levé postranní kanálky 9 s třetími vstupními porty 8 a pravé postranní kanálky 11 se čtvrtými vstupními porty 11 a s rovnoměrným větvením, každý na osm větví, ústících do rezervoáru 7. Jednotlivé koncové větve jsou od sebe vzdálené 3,75 mm a do rezervoáru 7 začínají ústit ve vzdálenosti 1,875 mm od počátku jeho hlavní osy. Levé postranní kanálky 9 a pravé postranní kanálky 11 jsou vysoké 600 pm, což odpovídá polovině výšky rezervoáru. Koncové větve levého postranního kanálku 9 od směru přítoku kapaliny z výstupního kanálku 6 generátoru ústí do rezervoáru 7 tak, že jejich horní stěny splývají s horní stěnou rezervoáru 7 a koncové větve pravého postranního kanálku 11 ústí tak, že jejich dna splývají se dnem rezervoáru 7. Na druhé straně rezervoáru 7 ve směru hlavní osy, naproti výstupnímu kanálku 6 z generátoru je napojen druhý výstupní kanálek 12 rezervoáru 7, který má obdélníkový průřez o výšce 600 pm a šířce 1200 pm. Dno rezervoáru 7 stoupá směrem ke dnu tohoto druhého výstupního kanálku 12, přičemž stoupání dna začíná 1 mm od konce rezervoáru 7 ve směru hlavní osy a končí 2,5 mm směrem od začátku druhého výstupního kanálku 12, čímž na sebe dna rezervoáru 7 a druhého výstupního kanálku 12 plynule navazují, s výškou snižující se postupně z 1200 pm na 600 pm. Druhý výstupní kanálek 12 se dále rozděluje na dvě větve o stejném průřezu, přičemž první větev - výstupní větev 13 vede do druhého výstupního portu 15 rezervoáru 7 a druhá větev - propojovací větev 14 se stáčí a vede do kultivátoru. Před vstupem do kultivátoru je uprostřed kanálku malý sloupek o poloměru 100 pm, určený pro rozrušení případných shluků sféroidů. Výška kultivátoru je rovna 600 pm. Kromě zmíněné propojovací větve 14 z rezervoáru vede do kultivátoru ještě třetí vstupní kanálek 17 kultivátoru, napojený na pátý vstupní port 16. určený pro přítok kapaliny do kultivátoru při dlouhodobých kultivacích. Základní prostor kultivátoru je vymezen kvádrem o šířce 8 mm, délce 50,525 mm a výšce 600 pm. Kultivační část 19 kultivátoru jej dělí na vstupní podélný kanál 18, jehož výchozí šířka je 2,6 mm a výstupní podélný kanál 20, jehož výchozí šířka je rovněž 2,6 mm. Od vzdálenosti 10,525 mm od začátku vstupního podélného kanálu 18 a 10,525 mm od konce výstupního podélného kanálu 20 začíná z obou stran kvádru zkosení, které na svém konci snižuje šířku vstupního podélného kanálu 18 o 2 mm a výstupního podélného kanálu 20 o 2,6 mm. Uvnitř kultivační části 19 kultivátoru je celkem 84 mikrokanálků, dlouhých 2,3 mm a širokých 450 pm, s rozestupy 600 pm, přičemž tyto mikrokanálky obsahují zúženou část 23, jejíž nejužší část se nachází 0,5 mm od jejich začátku, směrem ke vstupnímu podélnému kanálu 18 a má šířku 120 pm. Oblasti mikrokanálků směrem ke vstupnímu podélnému kanálu 18. před jejich zúžením, tvoří oblast 24 v podobě žlábků pro záchyt sféroidů, přičemž stěny mikrokanálků v těchto žlábcích jsou zkoseny směrem ktoku ve vstupním podélném kanálu 18, což usnadňuje uchycení sféroidů. Výchozí výška mikrokanálků je 600 pm, ale vybrané mikrokanálky blíže k bočním stranám kultivátoru jsou selektivně zúženy, tj. sníženy, shora za účelem vyrovnání hodnot objemového průtoku skrz všechny mikrokanálky, přičemž toto snížení je v nich provedeno až za oblastí žlábků pro sféroidy a přechody jejich zúžených a nezúžených oblastní jsou zahlazeny tak, aby v nich nezůstala ostrá hrana, kde by se mohly uchytit vzduchové bubliny. Z kultivátoru následně vede třetí výstupní kanálek 21 kultivátoru, který má obdélníkový průřez 1200 pm x 600 pm a je napojený na třetí výstupní port 22.The tip is characterized by the fact that the inlet channel 2 for the oil phase with a square cross-section with an edge of 800 pm connected to the inlet port 1 for the oil phase is divided into two symmetrical branches, which are then connected again and at the point of connection, a second one is connected to them from the means inlet channel 4 for the water phase, connected to the second inlet port 3 for the water phase, this second inlet channel 4 having a square cross-section with an edge of 200 pm at the point of connection. The output channel 6 of the generator with a square cross-section of 800 µm is connected to these three connecting channels, continuing into the reservoir 7 of the shape of an elliptical cylinder with a height of 1200 µm, with a length of the main axis of 30 mm and a length of the minor axis of 10 mm. The left side channels 9 with the third inlet ports 8 and the right side channels 11 with the fourth inlet ports 11 and with uniform branching are connected to this reservoir 7 from the sides in the direction of the minor axis, each into eight branches, opening into the reservoir 7. The individual end branches are from 3.75 mm apart and begin to flow into reservoir 7 at a distance of 1.875 mm from the beginning of its main axis. The left side channels 9 and the right side channels 11 are 600 pm high, which corresponds to half the height of the reservoir. The end branches of the left side channel 9 from the direction of liquid inflow from the outlet channel 6 of the generator open into the reservoir 7 so that their upper walls merge with the upper wall of the reservoir 7, and the end branches of the right side channel 11 open so that their bottoms merge with the bottom of the reservoir 7. On the other side of the reservoir 7 in the direction of the main axis, opposite the outlet channel 6 from the generator, a second outlet channel 12 of the reservoir 7 is connected, which has a rectangular cross-section with a height of 600 pm and a width of 1200 pm. The bottom of the reservoir 7 rises towards the bottom of this second outlet channel 12, whereby the rise of the bottom starts 1 mm from the end of the reservoir 7 in the direction of the main axis and ends 2.5 mm away from the beginning of the second outlet channel 12, whereby the bottom of the reservoir 7 and the second outlet channel 12 continuously continues, with the height decreasing gradually from 1200 pm to 600 pm. The second outlet channel 12 is further divided into two branches of the same cross-section, while the first branch - outlet branch 13 leads to the second outlet port 15 of the reservoir 7 and the second branch - connecting branch 14 turns and leads to the cultivator. Before entering the cultivator, there is a small post with a radius of 100 pm in the middle of the channel, intended for breaking up possible clusters of spheroids. The height of the cultivator is equal to 600 pm. In addition to the mentioned connecting branch 14 from the reservoir, a third input channel 17 of the cultivator leads to the cultivator, connected to the fifth input port 16. intended for the inflow of liquid into the cultivator during long-term cultivations. The basic space of the cultivator is defined by a cuboid with a width of 8 mm, a length of 50.525 mm and a height of 600 pm. The cultivation part 19 of the cultivator divides it into an inlet longitudinal channel 18, whose initial width is 2.6 mm, and an output longitudinal channel 20, whose initial width is also 2.6 mm. From a distance of 10.525 mm from the beginning of the input longitudinal channel 18 and 10.525 mm from the end of the output longitudinal channel 20, a chamfering begins on both sides of the block, which at its end reduces the width of the input longitudinal channel 18 by 2 mm and the output longitudinal channel 20 by 2.6 mm. Inside the cultivation part 19 of the cultivator there are a total of 84 microchannels, 2.3 mm long and 450 µm wide, with a pitch of 600 µm, and these microchannels include a narrowed part 23, the narrowest part of which is located 0.5 mm from their beginning, towards the inlet longitudinal of channel 18 and has a width of 120 pm. The regions of the microchannels towards the inlet longitudinal channel 18. before their narrowing, form an area 24 in the form of grooves for the capture of spheroids, the walls of the microchannels in these grooves being beveled towards the flow in the inlet longitudinal channel 18, which facilitates the attachment of the spheroids. The initial height of the microchannels is 600 pm, but selected microchannels closer to the sides of the cultivator are selectively narrowed, i.e. reduced, from above in order to equalize the volume flow values through all microchannels, and this reduction is carried out in them beyond the area of the grooves for the spheroids and their transitions tapered and non-tapered areas are smoothed so that they do not have a sharp edge where air bubbles could catch. The third outlet channel 21 of the cultivator, which has a rectangular cross-section of 1200 pm x 600 pm and is connected to the third outlet port 22, then leads from the cultivator.
-8CZ 309953 B6-8CZ 309953 B6
Pro pozorování buněk a z nich utvořených sféroidů je potřeba zafixovat systém pod mikroskop. Rozměry systému jsou přizpůsobené na standardní sklíčko 75 x 50 mm, sloužící jako podklad čipu, a lze jej tak bez problému zafixovat pomocí běžných držáků k mikroskopům. Je také nutné udržovat vhodnou teplotu pro kultivaci buněk, tj. 37 °C, toho lze docílit např. použitím komerčně dostupného inkubačního boxu nainstalovaného na mikroskop. Před začátkem experimentu je vhodné vytemperovat všechny součásti a použité kapaliny na tuto teplotu, aby pak během experimentu již nedocházelo k teplotním výkyvům, které by mohly mít za důsledek tvorbu vzduchových bublin v kapalině uvnitř.To observe the cells and the spheroids formed from them, it is necessary to fix the system under a microscope. The dimensions of the system are adapted to a standard slide of 75 x 50 mm, which serves as the substrate of the chip, and it can thus be fixed without any problem using common holders for microscopes. It is also necessary to maintain a suitable temperature for cell culture, i.e. 37 °C, this can be achieved, for example, by using a commercially available incubation box installed on a microscope. Before starting the experiment, it is advisable to temper all the components and used liquids to this temperature, so that during the experiment there are no more temperature fluctuations that could result in the formation of air bubbles in the liquid inside.
Na obr. 6A jsou zobrazeny CAD modely jednotlivých dílů konkrétního technického řešení - a) rozhraní pro připojení konektorů (polymethyhnethakrylátový polymer), b) horní část mikrofluidního čipu (OSTE+ polymer), c) spodní část mikrofluidního čipu (OSTE+ polymer) a d) podkladové sklíčko 75 x 50 mm; obr. 6B zobrazuje CAD model zkompletovaného systému (pohled shora)Fig. 6A shows CAD models of individual parts of a specific technical solution - a) interface for connecting connectors (polymethyl methacrylate polymer), b) upper part of the microfluidic chip (OSTE+ polymer), c) lower part of the microfluidic chip (OSTE+ polymer) and d) base slide 75 x 50mm; Fig. 6B shows a CAD model of the completed system (top view)
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Předložené zařízení je možné využít ve farmaceutickém průmyslu při vývoji léčiv, k jejich testování na vytvořených buněčných shlucích. Výhodou předloženého řešení je možnost automatizace celého procesu tvorby sféroidů, včetně jejich dlouhodobé kultivace za různých experimentálních podmínek. Zařízení může být rovněž využito ve výzkumných ústavech a všude, kde se zkoumají vlastnosti 3D buněčných kultur.The presented device can be used in the pharmaceutical industry during the development of drugs, to test them on the created cell clusters. The advantage of the presented solution is the possibility of automating the entire process of spheroid formation, including their long-term cultivation under various experimental conditions. The device can also be used in research institutes and wherever the properties of 3D cell cultures are investigated.
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2022-442A CZ309953B6 (en) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | Flow-through system for the formation and cultivation of cell clusters |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2022-442A CZ309953B6 (en) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | Flow-through system for the formation and cultivation of cell clusters |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2022442A3 CZ2022442A3 (en) | 2024-02-28 |
| CZ309953B6 true CZ309953B6 (en) | 2024-02-28 |
Family
ID=89984006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2022-442A CZ309953B6 (en) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | Flow-through system for the formation and cultivation of cell clusters |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309953B6 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108949496A (en) * | 2017-05-18 | 2018-12-07 | 中国科学院大连化学物理研究所 | A kind of unicellular separation method based on drop micro-fluidic chip |
| US20190009274A1 (en) * | 2015-08-13 | 2019-01-10 | President And Fellows Of Harvard College | Microfluidic Devices And Systems For Cell Culture And/Or Assay |
| CN114181801A (en) * | 2021-11-22 | 2022-03-15 | 上海大学 | Method for constructing high-throughput cell mass model by droplet microfluidic gravity positioning |
| CN114632564A (en) * | 2022-04-20 | 2022-06-17 | 香港城市大学深圳研究院 | Integrated micro-fluidic chip and in-vitro treatment method for primary circulating tumor cells |
-
2022
- 2022-10-26 CZ CZ2022-442A patent/CZ309953B6/en unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20190009274A1 (en) * | 2015-08-13 | 2019-01-10 | President And Fellows Of Harvard College | Microfluidic Devices And Systems For Cell Culture And/Or Assay |
| CN108949496A (en) * | 2017-05-18 | 2018-12-07 | 中国科学院大连化学物理研究所 | A kind of unicellular separation method based on drop micro-fluidic chip |
| CN114181801A (en) * | 2021-11-22 | 2022-03-15 | 上海大学 | Method for constructing high-throughput cell mass model by droplet microfluidic gravity positioning |
| CN114632564A (en) * | 2022-04-20 | 2022-06-17 | 香港城市大学深圳研究院 | Integrated micro-fluidic chip and in-vitro treatment method for primary circulating tumor cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MASOOMEH TEHRANIROKH ET AL: "Microfluidic devices for cell cultivation and proliferation", BIOMICROFLUIDICS, vol. 7, no. 5, 29 October 2013 (2013-10-29), pages 1 - 32, ISSN: 1932-1058 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2022442A3 (en) | 2024-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230234061A1 (en) | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems | |
| US11618024B2 (en) | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems | |
| CN110004111B (en) | Preparation method of organoid sphere | |
| Luan et al. | Microfluidic systems for hydrodynamic trapping of cells and clusters | |
| CN112275336B (en) | Multi-channel integrated micro-fluidic chip and method for preparing monodisperse gel microspheres by using same in high throughput | |
| JP5490803B2 (en) | Hanging drop plate and method of using the hanging drop plate | |
| CA3109426A1 (en) | Particle-containing droplet systems with monodisperse fluid volumes | |
| Kim et al. | 3-Dimensional cell culture for on-chip differentiation of stem cells in embryoid body | |
| US20040259177A1 (en) | Three dimensional cell cultures in a microscale fluid handling system | |
| EP3142790B1 (en) | Method for handling fluid in a microfluidic device with channel plates | |
| Ding et al. | A modular 3D printed microfluidic system: a potential solution for continuous cell harvesting in large-scale bioprocessing | |
| Zhang et al. | One-step generation and purification of cell-encapsulated hydrogel microsphere with an easily assembled microfluidic device | |
| Kim et al. | Stable hydrodynamic trapping of hydrogel beads for on-chip differentiation analysis of encapsulated stem cells | |
| Puleo et al. | Applications of MEMS technologies in tissue engineering | |
| CZ309953B6 (en) | Flow-through system for the formation and cultivation of cell clusters | |
| CZ36686U1 (en) | A flow system for forming and cultivating cell clusters | |
| Badilescu et al. | Culturing cells for life: innovative approaches in macroscopic and microfluidic cultures, with an emphasis on stem cells | |
| CN112608848B (en) | Cell suspension culture unit suitable for space environment | |
| Zhang | Perfusion culture of mammalian cells in a microfluidic channel with a built-in pillar array | |
| WO2024072512A1 (en) | Methods and systems for functionalizing surfaces for microfluidic devices or other applications | |
| Kawada et al. | Microfluidic Approach to Cell Handling and Measurement | |
| Ke | Microfluidic-based cell assay for biomedical application | |
| NCRR | Cellular BioMEMS |