CZ309743B6 - A method of producing an extract from Pythium oligandrum for suppressing the growth of skin melanoma cells, an extract that can be prepared using this method and its use - Google Patents
A method of producing an extract from Pythium oligandrum for suppressing the growth of skin melanoma cells, an extract that can be prepared using this method and its use Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309743B6 CZ309743B6 CZ2021-564A CZ2021564A CZ309743B6 CZ 309743 B6 CZ309743 B6 CZ 309743B6 CZ 2021564 A CZ2021564 A CZ 2021564A CZ 309743 B6 CZ309743 B6 CZ 309743B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- extract
- supercritical
- polar solvent
- pythium oligandrum
- range
- Prior art date
Links
- 241000131360 Pythium oligandrum Species 0.000 title claims abstract description 66
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 title description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 6
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 5
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 3
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 101000682328 Bacillus subtilis (strain 168) 50S ribosomal protein L18 Proteins 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- WWNNZCOKKKDOPX-UHFFFAOYSA-N N-methylnicotinate Chemical compound C[N+]1=CC=CC(C([O-])=O)=C1 WWNNZCOKKKDOPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 3
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 3
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 3
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 3
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000233639 Pythium Species 0.000 description 2
- 241000606507 Talaromyces pinophilus Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- WGLRJONCGNNMKL-VOTSOKGWSA-N 3-o-methylfunicone Chemical compound COC(=O)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1C(=O)C1=COC(\C=C\C)=C(OC)C1=O WGLRJONCGNNMKL-VOTSOKGWSA-N 0.000 description 1
- WGLRJONCGNNMKL-UHFFFAOYSA-N 3-o-methylfunicone Natural products COC(=O)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1C(=O)C1=COC(C=CC)=C(OC)C1=O WGLRJONCGNNMKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFWGABANNQMHMZ-UHFFFAOYSA-N 8-acetoxy-7-acetyl-6,7,7a,8-tetrahydro-5H-benzo[g][1,3]dioxolo[4',5':4,5]benzo[1,2,3-de]quinoline Natural products CC=C1C(CC(=O)OCCC=2C=C(O)C(O)=CC=2)C(C(=O)OC)=COC1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O RFWGABANNQMHMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000206761 Bacillariophyta Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKVGJQVJNQRJPO-UHFFFAOYSA-N Demethyloleuropein Natural products O1C=C(C(O)=O)C(CC(=O)OCCC=2C=C(O)C(O)=CC=2)C(=CC)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HKVGJQVJNQRJPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002064 Dental Plaque Diseases 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000612166 Lysimachia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 235000007413 Nigella arvensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000090896 Nigella sativa Species 0.000 description 1
- 235000016698 Nigella sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 235000002725 Olea europaea Nutrition 0.000 description 1
- RFWGABANNQMHMZ-HYYSZPHDSA-N Oleuropein Chemical group O([C@@H]1OC=C([C@H](C1=CC)CC(=O)OCCC=1C=C(O)C(O)=CC=1)C(=O)OC)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RFWGABANNQMHMZ-HYYSZPHDSA-N 0.000 description 1
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 1
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 description 1
- 241001416980 Paecilomyces hepiali Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 description 1
- 241000233616 Phytophthora capsici Species 0.000 description 1
- 241000222350 Pleurotus Species 0.000 description 1
- 235000006521 Pleurotus eryngii var ferulae Nutrition 0.000 description 1
- 244000088486 Pleurotus eryngii var. ferulae Species 0.000 description 1
- 241000039796 Pythia Species 0.000 description 1
- 241000918585 Pythium aphanidermatum Species 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000944 Soxhlet extraction Methods 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000002734 clay mineral Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012259 ether extract Substances 0.000 description 1
- MAUQAXOHCVNUMX-BUHFOSPRSA-N ethyl (e)-7-[2-cyclopropyl-4-(4-fluorophenyl)quinolin-3-yl]-3,5-dihydroxyhept-6-enoate Chemical compound CCOC(=O)CC(O)CC(O)\C=C\C1=C(C2CC2)N=C2C=CC=CC2=C1C1=CC=C(F)C=C1 MAUQAXOHCVNUMX-BUHFOSPRSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 230000028564 filamentous growth Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- -1 liquid paraffin Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000013152 negative regulation of cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- RFWGABANNQMHMZ-CARRXEGNSA-N oleuropein Natural products COC(=O)C1=CO[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]2O)C(=CC)[C@H]1CC(=O)OCCc3ccc(O)c(O)c3 RFWGABANNQMHMZ-CARRXEGNSA-N 0.000 description 1
- 235000011576 oleuropein Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008470 skin growth Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/35—Extraction with lipophilic solvents, e.g. Hexane or petrol ether
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/37—Extraction at elevated pressure or temperature, e.g. pressurized solvent extraction [PSE], supercritical carbon dioxide extraction or subcritical water extraction
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
- A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Botany (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Description
Způsob výroby extraktu z Pythium oligandrum pro potlačení růstu buněk kožního melanomu, extrakt připravitelný tímto způsobem a jeho použitíA method of producing an extract from Pythium oligandrum for suppressing the growth of skin melanoma cells, an extract that can be prepared by this method and its use
Oblast technikyField of technology
Vynález se týká prostředků, získaných extrakcí z Pythium oligandrum s působením proti růstu buněk lidského kožního melanomu a způsobu výroby uvedených extraktů.The invention relates to means obtained by extractions from Pythium oligandrum with an effect against the growth of human skin melanoma cells and to the method of production of said extracts.
Dosavadní stav technikyCurrent state of the art
Kožní melanom je rozšířené onemocnění, které se musí často řešit i chirurgicky. Celosvětově výskyt melanomu stoupá. V roce 2020 bylo jen v Kanadě diagnostikováno 8000 nových případů a 1300 úmrtí. Ze všech typů rakoviny kůže je u melanomu nejvyšší pravděpodobnost metastáz se špatnou prognózou vyléčení. Přípravky pro potlačení růstu rakovinných buněk jsou většinou syntetické s velmi negativním vlivem i na zdravé kožní buňky.Cutaneous melanoma is a widespread disease that often has to be treated surgically. The incidence of melanoma is increasing worldwide. In 2020, 8,000 new cases and 1,300 deaths were diagnosed in Canada alone. Of all types of skin cancer, melanoma has the highest probability of metastases with a poor prognosis. Preparations for suppressing the growth of cancer cells are mostly synthetic with a very negative effect on healthy skin cells as well.
Naproti tomu přípravky na bázi extraktů z přírodních materiálů jsou tvořeny převážně směsí biologicky aktivních látek získaných různým extrakčním způsobem (například: extrakce pomocí organických rozpouštědel, vodní destilace, macerování ve vodě). Tyto přípravky mají, oproti syntetickým přípravkům, výhodu v tom, že obsahují směs biologicky aktivních látek, která působí synergicky. Při extrakci se vychází obvykle z rostlin, takže jejich sběr případně vypěstování, sklizeň a sušení probíhá v ročních cyklech a kvalita extraktu je závislá i na počasí.In contrast, preparations based on extracts from natural materials are mainly made up of a mixture of biologically active substances obtained by various extraction methods (for example: extraction using organic solvents, water distillation, maceration in water). Compared to synthetic preparations, these preparations have the advantage that they contain a mixture of biologically active substances that act synergistically. Extraction is usually based on plants, so their collection or growing, harvesting and drying take place in annual cycles, and the quality of the extract also depends on the weather.
Je popsána celá řada rostlinných extraktů, u kterých bylo zjištěno působení proti buňkám kožního melanomu. Komerčně dostupný je například extrakt ze suchých listů olivovníku, DOLE, jehož hlavní účinnou složkou je oleuropein. Látky působící proti kožnímu melanomu byly nalezeny i v metanolovém extraktu z omanu pravého, a v extraktu z Nigella Glandulfera Freyn. Látky působící účinněji proti kožnímu melanomu, než proti buňkám lidského fibroblastu byly izolovány z rostliny Lysimachia thyrs'flora. Řada látek selektivně působících proti buňkám rakoviny kůže byla izolována z mořských hub. 3-O-methalfunicone, metabolit houby Penicillium pinophilum, inhiboval růst buněk lidského melanomu (Baroni A., A. De Luca, A. De Filippis, M. Petrazzuolo, L. Manente, R. Nicoletti, M. A. TufanoJ and E. Buommino: 3-O-methylfunicone, a metabolite of Penicillium pinophilum, inhibits proliferation of human melanoma cells by causing G2+ M arrest and inducing apoptosis. Cell Prolif. 2009, 42, 541-553). Protinádorové působení extraktu z mycelia houby Paecilomyces hepaiali popisují Jiang lei et al. (Jiang L., H.Y.Bao, M.Yang, Antitumor aktivity of a petroleum ether extrakt from Paecilomyces hepiali mycelim, Acta Edulis Fungi 17(4) (2010) 58-60, https://doi.org/10.3969ij.issn. 1005-9873.2010.04.016) a působení ethanolového extraktu z houby Pleurotus feruale proti buňkám melanomu ukázali Wang W. et al. (Wang W., Kaixu Chen, Qing Liu, Nathan Johnston, Zhenghai Ma, Fuchun Zhang, Xiufen Zheng: Suppression of Tumor Growth by Pleurotus ferulae Ethanol Extract through Induction of Cell Apoptosis, and Inhibition of Cell Proliferation and Migration. PLUS One, July 2014, V 9 (7), e102673). Řada látek s protirakovinnými účinky byla získána i z vláknitých mikroorganismů, jak popsali Bladt T.T. et. al (Bladt T T, Jens Christian Frisvad, Peter Boldsen Knudsen and Thomas Ostenfeld Larsen: Anticancer and Antifungal Compounds from Aspergillus, Penicillium and Other Filamentous Fungi. Molecules 2013, 18, 11338-11376; doi:10.3390/molecules180911338). Čínská patentová přihláška CN 106831908 A popisuje sloučeninu extrahovanou z fermentačního louhu Streptomycetes IIR21, která vykazovala inhibiční aktivitu proti bakteriím, patogenním houbám a rakovinným buňkám. Protinádorová aktivita byla prokázána i u e-1,3/1,6-glukanů izolovaných z Phythophora species (Kraus J., W. Blaschelc, M. Schlitz and G. Franz: Antitumor Activity of Cell Wall e-1,3/1,6-Glucans from Phytophthora Species. Planta Med. 58 (1992) 39).A number of plant extracts have been described that have been found to be active against skin melanoma cells. Commercially available, for example, is an extract from the dry leaves of the olive tree, DOLE, whose main active ingredient is oleuropein. Substances acting against cutaneous melanoma were also found in the methanolic extract of the true oman and in the extract of Nigella Glandulfera Freyn. Substances acting more effectively against skin melanoma than against human fibroblast cells were isolated from the plant Lysimachia thyrs'flora. A number of substances selectively acting against skin cancer cells have been isolated from marine sponges. 3-O-methalfunicone, a metabolite of the fungus Penicillium pinophilum, inhibited the growth of human melanoma cells (Baroni A., A. De Luca, A. De Filippis, M. Petrazzuolo, L. Manente, R. Nicoletti, M. A. TufanoJ and E. Buommino: 3-O-methylfunicone, a metabolite of Penicillium pinophilum, inhibits proliferation of human melanoma cells by causing G2+ M arrest and inducing apoptosis. Cell Prolif. 2009, 42, 541-553). The antitumor activity of an extract from the mycelium of the fungus Paecilomyces hepaiali is described by Jiang lei et al. (Jiang L., H.Y.Bao, M.Yang, Antitumor activity of a petroleum ether extract from Paecilomyces hepiali mycelim, Acta Edulis Fungi 17(4) (2010) 58-60, https://doi.org/10.3969ij.issn .1005-9873.2010.04.016) and the action of the ethanolic extract of Pleurotus feruale against melanoma cells was shown by Wang W. et al. (Wang W., Kaixu Chen, Qing Liu, Nathan Johnston, Zhenghai Ma, Fuchun Zhang, Xiufen Zheng: Suppression of Tumor Growth by Pleurotus ferulae Ethanol Extract through Induction of Cell Apoptosis, and Inhibition of Cell Proliferation and Migration. PLUS One, July 2014, V 9 (7), e102673). A number of substances with anticancer effects have also been obtained from filamentous microorganisms, as described by Bladt T.T. etc. al (Bladt T T, Jens Christian Frisvad, Peter Boldsen Knudsen and Thomas Ostenfeld Larsen: Anticancer and Antifungal Compounds from Aspergillus, Penicillium and Other Filamentous Fungi. Molecules 2013, 18, 11338-11376; doi:10.3390/molecules180911338). Chinese patent application CN 106831908 A describes a compound extracted from the fermentation broth of Streptomycetes IIR21 that exhibited inhibitory activity against bacteria, pathogenic fungi and cancer cells. Antitumor activity was also demonstrated in e-1,3/1,6-glucans isolated from Phythophora species (Kraus J., W. Blaschelc, M. Schlitz and G. Franz: Antitumor Activity of Cell Wall e-1,3/1, 6-Glucans from Phytophthora Species. Planta Med. 58 (1992) 39).
Pythium oligandrum patří mezi oomycety, které se podobají svým vláknitým růstem houbám, ale jsou klasifikovány jako řasy a rozsivky. Pythium oligandrum je parazitický mikroorganismus,Pythium oligandrum is among the oomycetes, which resemble fungi in their filamentous growth, but are classified as algae and diatoms. Pythium oligandrum is a parasitic microorganism,
- 1 CZ 309743 B6 vyskytující se v nízké koncentraci na mnoha místech v přírodě, který hubí plísně ve svém okolí. Tato jeho vlastnost se využívá zejména při ochraně rostlin proti plísňovým chorobám (US 2013/0035230 A1, US 5961971/1999) a šířeji jako hlavní součást protiplísňových přípravků (EP 2496088 A1 a WO 2018001392 A1). Pythium oligandrum v České republice vyrábí firma Biopreparáty s.r.o., která ho dodává na trh ve formě prostředků na ochranu proti plísním ať už rostlinných porostů, obilí nebo ovoce, zeleniny nebo při zmírňování obtíží plísňového onemocnění kůže a nehtů (www.biopreparaty.eu). Neškodnost Pythium oligandrum pro lidský organismus tak byla prokázána nejen při zkouškách přípravků při jejich uvádění na trh ale již více než desetiletou praxí při jejich užívání.- 1 CZ 309743 B6 occurring in low concentration in many places in nature, which kills fungi in its surroundings. This property is used in particular for the protection of plants against fungal diseases (US 2013/0035230 A1, US 5961971/1999) and more broadly as the main component of antifungal preparations (EP 2496088 A1 and WO 2018001392 A1). Pythium oligandrum is produced in the Czech Republic by the company Biopreparaty s.r.o., which supplies it to the market in the form of means for protection against fungi, whether for plant growth, grain or fruit, vegetables, or for alleviating the difficulties of fungal diseases of the skin and nails (www.biopreparaty.eu). The harmlessness of Pythium oligandrum for the human organism has been proven not only during tests of preparations when they are placed on the market, but also through more than ten years of practice in their use.
Enzymatický potenciál Pythium oligandrum přesahuje možnosti pouhého antimykotického přípravku a jsou popsány postupy na přípravu proteáz pocházejících z Pythium oligandrum připravené technologii syntetických genů. Tyto proteázy by měly mít výhodné vlastnosti při odstraňování zubního plaku a orálního biofilmu. Pythium oligandrum produkuje oligandriny, které patří do skupiny elicitinů, malých proteinů, s aktivitou podobnou sterolům. Extrakce a izolace oligandrinů je náročný proces, který byl popsán (Takenaka, S. and Kawasaki, S. (1994) Characterization of alanine-rich, hydroxyproline-containing cell wall proteins and their application for identifying Pythium species. Physiol. Mol. Plant Pathol. 45, 249-261; Takenaka S., Nakamura Y., Kono T., Sekiguchi H., Masunaka Y. and Takahashi H., MOLECULAR PLANT PATHOLOGY (2006) 7(5), 325-339.)). V poslední době byla popsána příprava oligandrinů i pomocí DNA klonování (Kun Yang, Xiaohua Dong, Jialu Li, Yi Wang, Yang Cheng, Ying Zhai , Xiaobo Li, Lihui Wei, Maofeng Jing and Daolong Dou: Type 2 Nep1-Like Proteins from the Biocontrol Oomycete Pythium oligandrum Suppress Phytophthora capsici Infection in Solanaceous Plants- J. Fungi 2021, 7, 496).The enzymatic potential of Pythium oligandrum exceeds the capabilities of a simple antifungal preparation, and procedures for the preparation of proteases derived from Pythium oligandrum prepared by synthetic gene technology are described. These proteases should have beneficial properties in removing dental plaque and oral biofilm. Pythium oligandrum produces oligandrins, which belong to the group of elicitins, small proteins with activity similar to sterols. The extraction and isolation of oligandrins is a challenging process that has been described (Takenaka, S. and Kawasaki, S. (1994) Characterization of alanine-rich, hydroxyproline-containing cell wall proteins and their application for identifying Pythium species. Physiol. Mol. Plant Pathol . 45, 249-261; Takenaka S., Nakamura Y., Kono T., Sekiguchi H., Masunaka Y. and Takahashi H., MOLECULAR PLANT PATHOLOGY (2006) 7(5), 325-339.)). Recently, the preparation of oligandrins has also been described using DNA cloning (Kun Yang, Xiaohua Dong, Jialu Li, Yi Wang, Yang Cheng, Ying Zhai , Xiaobo Li, Lihui Wei, Maofeng Jing and Daolong Dou: Type 2 Nep1-Like Proteins from the Biocontrol Oomycete Pythium oligandrum Suppress Phytophthora capsici Infection in Solanaceous Plants - J. Fungi 2021, 7, 496).
Byla popsána zvýšená resistence rostlin proti infekcím např. Bonnet P. Eva Bourdon, Michel Ponchet, Jean-Pierre Blein and Pierre Ricci Acquired resistance triggered by elicitins in tobacco and other plants European Journal of Plant Pathology 102:181-192, 1996.Increased resistance of plants against infections has been described, e.g. Bonnet P. Eva Bourdon, Michel Ponchet, Jean-Pierre Blein and Pierre Ricci Acquired resistance triggered by elicitins in tobacco and other plants European Journal of Plant Pathology 102:181-192, 1996.
V patentové literatuře lze nalézt řadu patentů, které se týkají Pythia. Jedná se o ochranu rostlin před škodlivými kmeny jako je Pythium aphanidermatum a izolace a příprava Pythium oligandrum a jeho použití pro ochranu rostlin a rostlinných produktů a při léčení plísňových infekcí kůže.A number of patents related to Pythia can be found in the patent literature. These are the protection of plants against harmful strains such as Pythium aphanidermatum and the isolation and preparation of Pythium oligandrum and its use for the protection of plants and plant products and in the treatment of fungal infections of the skin.
Působením Pythium oligandrum na zmenšení rakovinného nádoru se zabývá pouze čínská patentová přihláška CN 105524842 A, která popisuje izolaci Pythium oligandrum z půdy v chráněné horské oblasti, vypěstování na Petriho misce, fermentaci oligosacharidů přítomných v Pythiu v baňce a aplikaci mykoplasmat těchto fermentujících bakterií v koncentracích 750 až 1000 mg/kg na nádorové myší buňky H22, ve fyziologickém roztoku. Po aplikaci těchto fermentujících bakterií na nádor došlo k inhibici růstu nádoru podobně jako při aplikaci 20 mg/kg cyklofosfamidu.The effect of Pythium oligandrum on cancer tumor reduction is only dealt with in Chinese patent application CN 105524842 A, which describes the isolation of Pythium oligandrum from soil in a protected mountain area, cultivation in a petri dish, fermentation of oligosaccharides present in Pythium in a flask, and application of mycoplasmas of these fermenting bacteria at concentrations of 750 up to 1000 mg/kg on mouse H22 tumor cells, in physiological solution. After application of these fermenting bacteria to the tumor, tumor growth was inhibited similar to application of 20 mg/kg cyclophosphamide.
V současném stavu techniky chybí protinádorový přípravek na bázi Pythium oligandrum, který by bylo možné vyrobit v průmyslovém měřítku, bez složité izolace Pythium oligandrum z čínských horských oblastí, a který by byl účinnější než dosud popsané přípravky.The current state of the art lacks an antitumor preparation based on Pythium oligandrum, which could be produced on an industrial scale, without the complicated isolation of Pythium oligandrum from the Chinese mountain regions, and which would be more effective than the preparations described so far.
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Výše uvedené problémy řeší přípravek podle tohoto vynálezu. Na rozdíl od CN 105524842 A, který vychází z Pythium oligandrum izolovaného z půdy v chráněné horské oblasti, a je nutná jeho laboratorní kultivace, fermentace přítomných oligosacharidů a aplikace mykoplasmat těchto fermentujících bakterií, je výchozím materiálem předkládaného vynálezu průmyslově vyráběné Pythium oligandrum, přičemž v kontrastu s aplikací mykoplasmat (CN 105524842 A) je na nádorové buňky aplikován extrakt z Pythium oligandrum. Přípravek na potlačení růstu kožníhoThe above-mentioned problems are solved by the preparation according to the present invention. Unlike CN 105524842 A, which is based on Pythium oligandrum isolated from soil in a protected mountain area, and requires its laboratory cultivation, fermentation of the present oligosaccharides and application of mycoplasmas of these fermenting bacteria, the starting material of the present invention is industrially produced Pythium oligandrum, while in contrast with the application of mycoplasmas (CN 105524842 A), an extract from Pythium oligandrum is applied to tumor cells. A preparation for suppressing skin growth
- 2 CZ 309743 B6 melanomu podle tohoto vynálezu tak může být vyráběn a aplikován s daleko lepší přesností a reprodukovatelností.- 2 CZ 309743 B6 melanoma according to this invention can thus be produced and applied with much better accuracy and reproducibility.
Při hodnocení přípravků s působením proti nádorovým buňkám je významným ukazatelem rozdíl toxického účinku proti buňkám zdravým a proti buňkám nádorovým. Tento rozdíl je zvláště významný v případě povrchové aplikace na kůži. Oproti vnitřnímu užívání, při aplikaci přípravku nedochází k přímému styku s buňkami jiných orgánů. Hodnota IC50, která udává koncentraci testované látky inhibující růst populace z 50 % vyjádřená v μg/ml, by pro účinný přípravek měla být pro nádorové buňky výrazně nižší než IC50 pro buňky zdravé.When evaluating preparations with an action against tumor cells, a significant indicator is the difference in the toxic effect against healthy cells and against tumor cells. This difference is particularly significant in the case of surface application to the skin. Unlike internal use, when applying the product there is no direct contact with cells of other organs. The IC50 value, which indicates the concentration of the test substance inhibiting population growth from 50% expressed in μg/ml, should be significantly lower for tumor cells than the IC50 for healthy cells for an effective preparation.
Předkládaný vynález se týká přípravku pro léčbu kožního melanomu, jehož získání spočívá v dvoufázovém postupu, při kterém se nejprve pomocí nepolárního rozpouštědla odstraní v tucích rozpustné (nepolární) látky z průmyslově vyráběného Pythium oligandrum a v následujícím kroku se z této, o nepolární složky ochuzené suroviny, získají účinné látky extrakcí polární kapalinou.The present invention relates to a preparation for the treatment of skin melanoma, the preparation of which consists in a two-phase procedure, in which first, with the help of a non-polar solvent, fat-soluble (non-polar) substances are removed from industrially produced Pythium oligandrum, and in the following step, this raw material, depleted of non-polar components, is , obtain active substances by extraction with a polar liquid.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy způsob výroby extraktu z Pythium oligandrum, který obsahuje následující kroky:The subject of the present invention is therefore a method of producing an extract from Pythium oligandrum, which includes the following steps:
i) krok kapalinové extrakce Pythium oligandrum nepolárním rozpouštědlem za vzniku výluhu obsahujícího nepolární složky a rafinátu;i) a step of liquid extraction of Pythium oligandrum with a non-polar solvent to form a leachate containing non-polar components and a raffinate;
ii) krok extrakce rafinátu z kroku i) polárním rozpouštědlem za vzniku extraktu, obsahujícího účinné látky pro léčbu kožního melanomu.ii) step of extracting the raffinate from step i) with a polar solvent to form an extract containing active substances for the treatment of skin melanoma.
Pythium oligandrum je komerčně dostupné, pro extrakci lze jako výchozí surovinu použít jeho mykoplazma, lyofilizované Pythium oligandrum (lyofilizovaná kterákoli jeho část ve všech jeho životních stadiích jako jsou zoospory, sporangia, falgelly a hyfy, a dále Pythium oligandrum včetně lyofilizovaných zbytků živných látek a nosičů jako je agar, alginát, chitosan, dřevo a další). Pythium oligandrum lze izolovat z přírody, rostlin nebo dřeva zasažených plísní. Pythium oligandrum, houbě podobný eukariotní mikroorganismus v laboratoři naroste s výhodou na agaru V8 při teplotě 30 °C a 1 atm (0,1 MPa) za 4 dny. Popis průmyslové výroby Pythium oligandrum je uveden např. v Československém patentu 213659 (PV 4462-78), nebo US patentu 5194258, či US patentové přihlášce 2013/0035230 A1 nebo v mezinárodní přihlášce WO 2018/001392 A1. Extrakt z Pythium oligandrum a jeho účinky proti kožnímu melanomu není vázán na specifický způsob výroby Pythium oligandrum.Pythium oligandrum is commercially available, its mycoplasma, lyophilized Pythium oligandrum (lyophilized any part of it in all its life stages such as zoospores, sporangia, falgels and hyphae, as well as Pythium oligandrum including lyophilized residues of nutrients and carriers) can be used as starting raw material for extraction such as agar, alginate, chitosan, wood and others). Pythium oligandrum can be isolated from nature, plants or wood affected by fungi. Pythium oligandrum, a fungus-like eukaryotic microorganism, grows preferably on V8 agar in the laboratory at 30 °C and 1 atm (0.1 MPa) in 4 days. The description of the industrial production of Pythium oligandrum is given, for example, in Czechoslovak patent 213659 (PV 4462-78), or US patent 5194258, or US patent application 2013/0035230 A1 or in international application WO 2018/001392 A1. Pythium oligandrum extract and its effects against skin melanoma are not tied to a specific production method of Pythium oligandrum.
Výsledný extrakt z kroku ii) obsahuje 60 až 80 % hmotn. vodorozpustných složek, například aminokyseliny, cukry, laktát, glycerol, zbytek polárního rozpouštědla z kroku ii), betain, cholin, uracil, trigonellin, a 20 až 40 % hmotn. složek, které nejsou ve vodě rozpustné, například různé druhy mastných kyselin a sterolů. Za vodorozpustnou složku extraktu je považována ta část extraktu, která je oddělena 3x opakovaným vytřepáním extraktu do destilované vody (pH 7) při teplotě 25 °C a tlaku 1 atm (0,1 MPa), přičemž objem destilované vody použité při každém kroku vytřepání je nejméně 20x vyšší než objem extraktu z kroku ii).The resulting extract from step ii) contains 60 to 80% by weight. water-soluble components, for example amino acids, sugars, lactate, glycerol, the remainder of the polar solvent from step ii), betaine, choline, uracil, trigonelline, and 20 to 40% by weight. components that are not soluble in water, for example various types of fatty acids and sterols. The water-soluble component of the extract is considered to be the part of the extract that is separated by repeatedly shaking the extract into distilled water (pH 7) at a temperature of 25 °C and a pressure of 1 atm (0.1 MPa), while the volume of distilled water used in each shaking step is at least 20x higher than the volume of the extract from step ii).
V jednom provedení může po kroku ii) následovat krok iii) odstranění ve vodě rozpustných složek z extraktu z kroku ii). Toto odstranění vodorozpustných složek lze provést například extrakcí produktu kroku ii) do vody. Ve vodě nerozpustný zbytek extraktu obsahuje směs účinných látek pro léčbu kožního melanomu. Tento zbytek extraktu může být dále zakoncentrován, s výhodou pomocí kapalné chromatografie, například HPLC.In one embodiment, step ii) may be followed by step iii) to remove water-soluble components from the extract from step ii). This removal of water-soluble components can be done, for example, by extracting the product of step ii) into water. The water-insoluble residue of the extract contains a mixture of active substances for the treatment of skin melanoma. This rest of the extract can be further concentrated, preferably by means of liquid chromatography, for example HPLC.
Pro krok i) mohou být použity jako nepolární rozpouštědla uhlovodíky, s výhodou hexan, pentan, cyklohexan, nebo superkritický CO2 (dále scCO2). Použití scCO2 je ekologičtější, protože není potřeba tolik rozpouštědel, které je třeba následně odpařit.For step i), hydrocarbons can be used as non-polar solvents, preferably hexane, pentane, cyclohexane, or supercritical CO2 (hereinafter scCO2). The use of scCO2 is more environmentally friendly because there is no need for so many solvents to be evaporated afterwards.
- 3 CZ 309743 B6- 3 CZ 309743 B6
Jako polární rozpouštědlo v kroku ii) mohou sloužit alkoholy, ketony, s výhodou ethanol, methanol, isopropanol, aceton nebo jejich směsi, popřípadě směsi těchto rozpouštědel se scCO2.Alcohols, ketones, preferably ethanol, methanol, isopropanol, acetone or mixtures thereof, or mixtures of these solvents with scCO2 can serve as a polar solvent in step ii).
K odstranění nepolárních látek v kroku i) se mohou použít známé postupy kapalinové extrakce (laboratorní i průmyslově využívané), mezi které patří extrakce v Soxhletově přístroji nebo macerace kapalným rozpouštědlem, a mohou být prováděny za studena i za horka a za různých tlaků (za běžného, sníženého i vysokého tlaku). Tyto metody jsou odborníkovi v oboru dobře známé.To remove non-polar substances in step i), known liquid extraction procedures (both laboratory and industrial) can be used, including Soxhlet extraction or maceration with a liquid solvent, and can be carried out cold or hot and under different pressures (at ordinary , reduced and high pressure). These methods are well known to those skilled in the art.
Ve výhodném provedení se extrakce provede scCO2. Výhodou extrakce scCO2 je vysoká selektivita a úspora energie, protože není potřeba odpařovat velká množství kapalných rozpouštědel. V produktu extrakce scCO2 navíc nezůstávají nežádoucí stopy toxických látek.In a preferred embodiment, the extraction is performed with scCO2. The advantage of scCO2 extraction is high selectivity and energy saving, as there is no need to evaporate large amounts of liquid solvents. In addition, no unwanted traces of toxic substances remain in the scCO2 extraction product.
Odstranění nepolárních látek z Pythium oligandrum podle tohoto vynálezu není omezeno na uvedený výčet postupů a přístrojů.The removal of non-polar substances from Pythium oligandrum according to the present invention is not limited to the listed methods and apparatus.
K extrakci polárním rozpouštědlem v kroku ii) lze, stejně jako v kroku i), použít odborníkovi známé postupy kapalinové extrakce (laboratorní i průmyslově využívané), mezi které patří extrakce v Soxhletově přístroji nebo macerace kapalným rozpouštědlem, a mohou být prováděny za studena i za horka a za různých tlaků (za běžného, sníženého i vysokého tlaku).For the extraction with a polar solvent in step ii), as in step i), liquid extraction procedures (both laboratory and industrial) known to a person skilled in the art can be used, which include extraction in a Soxhlet apparatus or maceration with a liquid solvent, and can be carried out cold or at heat and under different pressures (normal, reduced and high pressure).
Polární rozpouštědla jsou s výhodou vybraná ze skupiny zahrnující polární kapaliny, jako jsou alkoholy, ketony a jejich směsi, s výhodou vybrané ze skupiny zahrnující aceton, ethanol, methanol, isopropanol a jejich směsi, popřípadě jejich směsi se scCO2.Polar solvents are preferably selected from the group including polar liquids, such as alcohols, ketones and their mixtures, preferably selected from the group including acetone, ethanol, methanol, isopropanol and their mixtures, or their mixtures with scCO2.
Ve výhodném provedení se extrakce v kroku ii) provede směsí scCO2 a polárního rozpouštědla, vybraného ze skupiny zahrnující alkoholy, ketony a jejich směsi, s výhodou vybraného ze skupiny zahrnující aceton, ethanol, methanol, isopropanol a jejich směsi. Výhodněji je koncentrace polárního rozpouštědla v scCO2 v rozmezí od 5 do 25 % hmotn.In a preferred embodiment, the extraction in step ii) is performed with a mixture of scCO2 and a polar solvent selected from the group including alcohols, ketones and their mixtures, preferably selected from the group including acetone, ethanol, methanol, isopropanol and their mixtures. More preferably, the concentration of the polar solvent in scCO2 is in the range of 5 to 25% by weight.
V jednom provedení se superkritická extrakce scCO2 provádí ve vysokotlaké aparatuře. Do vysokotlaké kolony se vloží vstupní surovina obsahující Pythium oligandrum (obsah Pythium oligandrum ve výchozí surovině je v rozmezí od 10 do 100 % hmotn., například je výchozí surovinou komerčně dostupný přípravek na hubení plísní POLYVERSUM) mezi vrstvy skleněných kuliček, které se od materiálu oddělí tenkou vrstvou skelné vaty a slouží k rozložení toku rozpouštědla, kterým je v první fázi scCO2 (superkritický CO2), po průřezu kolony. Uzavřená a utěsněná kolona je vložena do boxu vyhřívaného horkovzdušným ventilátorem a připojena k aparatuře kapilárami z nerezové oceli. Po vytemperování na teplotu v rozmezí od 32 do 80 °C (hodnota v blízkosti kritického bodu CO2 a teplota, kdy může docházet k tepelné degradaci účinných složek), se kolona natlakuje oxidem uhličitým z tlakové bomby pomocí vysokotlakého čerpadla a nechá se 15 minut ustálit. S výhodou je tlak v aparatuře v rozmezí od 12 do 70 MPa, výhodněji 30 MPa. Tím dojde k extrakci nepolárních složek do scCO2. Složky rozpustné v scCO2 jsou vedeny z kolony k expanznímu ventilu vyhřívanému na teplotu v rozmezí od 60 do 100 °C, aby se zabránilo jeho zamrzání při prudkém poklesu tlaku. Extrakt je jímán do separátoru umístěného pod expanzním ventilem, pomocí kterého se nastaví průtok CO2. Plynný oxid uhličitý je odváděn do atmosféry přes plynoměr, kterým se měří průtok a celkové proteklé množství plynného oxidu uhličitého. Tímto způsobem se z materiálu při vysoké hustotě scCO2 (alespoň 270 kg/m3, s výhodou v rozmezí od 270 do 1120 kg/m3, výhodněji od 500 do 1120 kg/m3, ještě výhodněji 870 kg/m3) odstraní nepolární (lipofilní) složky (6,6 až 9,5 % hmotn., vztaženo k hmotnosti výchozí suroviny obsahující Pythium oligandrum) po protečení 70 až 90 g CO2/g výchozí suroviny, přičemž výchozí surovina může obsahovat od 10 do 100 % hmotn. lyofilizovaného Pythium oligandrum. Následně se extrakce zastaví.In one embodiment, supercritical scCO2 extraction is performed in high-pressure apparatus. In the high-pressure column, an input material containing Pythium oligandrum (the content of Pythium oligandrum in the starting material is in the range from 10 to 100% by weight, for example, the starting material is the commercially available fungicide POLYVERSUM) between layers of glass beads, which are separated from the material with a thin layer of glass wool and serves to distribute the flow of the solvent, which in the first stage is scCO2 (supercritical CO2), along the cross-section of the column. The closed and sealed column is placed in a box heated by a hot air fan and connected to the apparatus by stainless steel capillaries. After tempering to a temperature ranging from 32 to 80 °C (a value close to the critical point of CO2 and the temperature at which thermal degradation of the active ingredients can occur), the column is pressurized with carbon dioxide from a pressure bomb using a high-pressure pump and allowed to settle for 15 minutes. Advantageously, the pressure in the apparatus is in the range from 12 to 70 MPa, more preferably 30 MPa. This will extract non-polar components into scCO2. The components soluble in scCO2 are led from the column to an expansion valve heated to a temperature ranging from 60 to 100 °C to prevent it from freezing during a sharp drop in pressure. The extract is collected in a separator located below the expansion valve, which is used to set the CO2 flow. Carbon dioxide gas is discharged into the atmosphere via a gas meter, which measures the flow rate and the total amount of carbon dioxide gas passed. In this way, non-polar (lipophilic) components are removed from the material at a high scCO2 density (at least 270 kg/m3, preferably in the range from 270 to 1120 kg/m3, more preferably from 500 to 1120 kg/m3, even more preferably 870 kg/m3) (6.6 to 9.5% by weight, based on the weight of the starting material containing Pythium oligandrum) after passing through 70 to 90 g of CO2/g of starting material, whereby the starting material may contain from 10 to 100% by weight. of freeze-dried Pythium oligandrum. Subsequently, the extraction stops.
Materiál ochuzený o nepolární látky (rafinát) se následně v kroku ii) podrobí extrakci polárním rozpouštědlem, definovaným výše. Ve výhodném provedení je polárním rozpouštědlem směsThe material depleted of non-polar substances (raffinate) is then subjected to extraction with a polar solvent, defined above, in step ii). In a preferred embodiment, the polar solvent is a mixture
- 4 CZ 309743 B6 scCO2 a polární kapaliny, vybrané ze skupiny zahrnující ketony, s výhodou aceton, a alkoholy, s výhodou ethanol, methanol, isopropanol nebo jejich směsi. Výhodněji je koncentrace polární kapaliny v scCO2 v rozmezí od 5 do 25 % hmotn. Extrakce účinné frakce v kroku ii) probíhá s výhodou za stejných podmínek jako s čistým scCO2, jak bylo popsáno výše, s tím, že je k scCO2 před vstupem do kolony s materiálem přidávána polární kapalina čerpaná vysokotlakým kapalinovým čerpadlem ze zásobní láhve tak, aby bylo dosaženo požadované koncentrace polárního rozpouštědla v scCO2, s výhodou v rozmezí od 5 do 25 % hmotn. Do separátoru se jímá roztok extraktu a použitého kapalného rozpouštědla, které je následně odpařeno. Po protečení cca 100 g CO2/g rafinátu z kroku i) se získá účinná frakce s výtěžkem 2 až 10 % hmotn., vztaženo na hmotnost rafinátu, vstupujícího do kroku ii).- 4 CZ 309743 B6 scCO2 and polar liquids, selected from the group including ketones, preferably acetone, and alcohols, preferably ethanol, methanol, isopropanol or their mixtures. More preferably, the concentration of the polar liquid in scCO2 is in the range of 5 to 25% by weight. Extraction of the active fraction in step ii) preferably takes place under the same conditions as with pure scCO2 as described above, with the addition of a polar liquid pumped by a high-pressure liquid pump from a storage bottle to the scCO2 before entering the material column so that the required concentration of the polar solvent in scCO2 is achieved, preferably in the range from 5 to 25 wt.%. A solution of the extract and the used liquid solvent is collected in the separator, which is then evaporated. After passing through about 100 g CO2/g raffinate from step i), an effective fraction is obtained with a yield of 2 to 10% by weight, based on the weight of the raffinate entering step ii).
Extrakt získaný z kroku ii), skládající se z 60 až 80 % hmotn. ve vodě rozpustných složek a z 20až 40 % hmotn. složek ve vodě nerozpustných, prokazoval významně vyšší toxicitu pro buňky lidského kožního melanomu (BL16) než pro buňky lidských fibroblastů (HDF). IC50 pro buňky BL16 se pohyboval v rozmezí od 20 do 40 μg/ml a pro buňky HDF v rozmezí od 140 do 180 μg/ml. Při analýze ve vodě rozpustné části se ukázalo, že obsahuje 37 % hmotn. aminokyselin, 28 % hmotn. cukrů, 10 % hmotn. laktátu, 12 % hmotn. glycerolu, 8 % hmotn. použité polární kapaliny (etanolu), 5 % hmotn. betainu a dále cholin, uracil a trigonellin v množství pod 1 % hmotn.The extract obtained from step ii), consisting of 60 to 80 wt.% of water-soluble components and from 20 to 40 wt.% of water-insoluble components, showed significantly higher toxicity to human cutaneous melanoma (BL16) cells than to human fibroblast (HDF) cells. The IC50 for BL16 cells ranged from 20 to 40 μg/ml and for HDF cells from 140 to 180 μg/ml. When analyzing the water-soluble part, it turned out to contain 37% by weight. amino acids, 28 wt.% sugars, 10% wt. of lactate, 12 wt.% glycerol, 8 wt.% used polar liquid (ethanol), 5 wt.% betaine and also choline, uracil and trigonelline in an amount below 1% by weight.
Ve vodě nerozpustná část je širokou směsí látek zahrnujících především různé druhy mastných kyselin a sterolů.The water-insoluble part is a broad mixture of substances including mainly various types of fatty acids and sterols.
V jednom provedení způsobu podle předkládaného vynálezu je nepolárním rozpouštědlem v kroku i) superkritický CO2, přičemž extrakce v kroku i) se provede při teplotě v rozmezí od 32 °C do 80 °C a hustotě superkritického CO2 v rozmezí od 270 do 1120 kg/m3, s výhodou je množství scCO2 v rozmezí od 70 do 90 g scCO2/g výchozí suroviny obsahující Pythium oligandrum.In one embodiment of the method according to the present invention, the non-polar solvent in step i) is supercritical CO2, whereby the extraction in step i) is carried out at a temperature in the range from 32°C to 80°C and a density of supercritical CO2 in the range from 270 to 1120 kg/m3 , the amount of scCO2 is preferably in the range from 70 to 90 g scCO2/g of starting raw material containing Pythium oligandrum.
V jednom provedení způsobu podle předkládaného vynálezu je polárním rozpouštědlem v kroku ii) směs alkoholu, ketonu nebo jejich směsi a scCO2, s výhodou je polárním rozpouštědlem směs ethanolu a scCO2, přičemž krok ii) proběhne při teplotě v rozmezí od 32 °C do 80 °C a tlaku v rozmezí od 12 do 70 MPa, a přičemž koncentrace polárního rozpouštědla v scCO2 je v rozmezí od 5 do 25 % hmotn. Výhodněji je množství superkritického CO2 v rozmezí od 100 do 200 g CO2/g rafinátu z kroku i).In one embodiment of the method according to the present invention, the polar solvent in step ii) is a mixture of alcohol, ketone or their mixture and scCO2, preferably the polar solvent is a mixture of ethanol and scCO2, whereby step ii) takes place at a temperature ranging from 32 °C to 80 °C C and pressure in the range from 12 to 70 MPa, and while the concentration of the polar solvent in scCO2 is in the range from 5 to 25 wt%. More preferably, the amount of supercritical CO2 is in the range from 100 to 200 g CO2/g raffinate from step i).
Po separaci ve vodě nerozpustného podílu volitelným krokem iii) popsaným výše a po jeho zakoncentrování kapalinovou chromatografií byl IC50 pro BL16 v rozmezí od 2 do 3 μg/ml a pro HDF v rozmezí od 20 do 24 μg/ml. Protinádorová účinnost extraktu se tedy cca desetinásobně zvýšila.After separation of the water-insoluble fraction by optional step iii) described above and concentration by liquid chromatography, the IC50 for BL16 was in the range of 2 to 3 μg/ml and for HDF in the range of 20 to 24 μg/ml. The antitumor effectiveness of the extract has thus increased approximately tenfold.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále extrakt z Pythium oligandrum, připravitelný způsobem popsaným výše.The subject of the present invention is also an extract from Pythium oligandrum, which can be prepared in the manner described above.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž farmaceutický přípravek, který obsahuje extrakt z Pythium oligandrum připravený výše uvedeným způsobem, a dále alespoň jednu farmaceuticky akceptovatelnou pomocnou látku. Farmaceuticky akceptovatelnou pomocnou látkou se rozumí například protimikrobní látky, stabilizátory, emulgátory, rozpouštědla, regulátory viskozity, kluzné látky. Vhodné pomocné látky jsou obzvláště voda, ethanol, glycerol, propylenglykol, mastné a éterické oleje, tekutý parafin, kapalné vosky atd. Ve výhodném provedení obsahuje farmaceutický přípravek alespoň 0,5 % hmotn. výše popsaného extraktu, výhodněji v rozmezí od 1 do 50 % hmotn. výše popsaného extraktu.The subject of the present invention is also a pharmaceutical preparation, which contains an extract from Pythium oligandrum prepared in the above-mentioned manner, as well as at least one pharmaceutically acceptable excipient. Pharmaceutically acceptable excipients include, for example, antimicrobial agents, stabilizers, emulsifiers, solvents, viscosity regulators, glidants. Suitable excipients are especially water, ethanol, glycerol, propylene glycol, fatty and essential oils, liquid paraffin, liquid waxes, etc. In a preferred embodiment, the pharmaceutical preparation contains at least 0.5% by weight. of the extract described above, more preferably in the range from 1 to 50 wt.%. of the extract described above.
Předmětem předkládaného vynálezu je také použití výše uvedeného extraktu z Pythium oligandrum a/nebo farmaceutického přípravku definovaného výše jako léčivo, s výhodou protinádorové léčivo, výhodněji použití jako léčivo pro topické aplikace, ještě výhodněji pro léčbu kožního melanomu.The subject of the present invention is also the use of the above extract from Pythium oligandrum and/or the pharmaceutical preparation defined above as a medicine, preferably an antitumor medicine, more preferably use as a medicine for topical applications, even more preferably for the treatment of skin melanoma.
- 5 CZ 309743 B6- 5 CZ 309743 B6
Aplikace přípravku podle tohoto vynálezu není omezena na buňky kožního melanomu a není omezena na aplikaci čistého přípravku.The application of the preparation according to the present invention is not limited to skin melanoma cells and is not limited to the application of the pure preparation.
Objasnění výkresuClarification of the drawing
Obr. 1: Schéma superkritické extrakce s následným přidáváním polární kapaliny, kde 1 je tlaková lahev s CO2, 2 pístové vysokotlaké čerpadlo CO2, 3 zásobní láhev s polární kapalinou, 4 pístové vysokotlaké kapalinové čerpadlo, 5 vysokotlaká kolona se vzorkem, 6 horkovzdušný box, 7 expanzní/mikrometrický ventil, 8 separátor a 9 bubnový plynoměr.Giant. 1: Schematic of supercritical extraction with subsequent addition of polar liquid, where 1 is a pressure cylinder with CO2, 2 piston high-pressure CO2 pump, 3 storage bottle with polar liquid, 4 piston high-pressure liquid pump, 5 high-pressure column with sample, 6 hot air box, 7 expansion /micrometric valve, 8 separator and 9 drum gas meter.
Příklady uskutečnění vynálezuExamples of implementation of the invention
Aparatura a způsob extrakceApparatus and method of extraction
Superkritická extrakce scCO2 byla prováděna ve vysokotlaké aparatuře, jejíž schéma je znázorněno na obr. 1. Do vysokotlaké kolony 5 se vloží surovina pro extrakci, například koncentrát Pythium oligandrum, mezi vrstvy skleněných kuliček, které se od materiálu oddělí tenkou vrstvou skelné vaty. Uzavřená a utěsněná kolona je vložena do boxu 6 vyhřívaného horkovzdušným ventilátorem a připojena k aparatuře kapilárami z nerezové oceli. Po vytemperování na požadovanou teplotu (s výhodou v rozmezí od 32 °C do 80 °C) se kolona natlakuje oxidem uhličitým z tlakové lahve 1 pomocí vysokotlakého čerpadla 2 a nechá se alespoň 15 minut ustálit. Složky rozpustné v scCO2 jsou vedeny z kolony k expanznímu ventilu 7 vyhřívanému na 60 až 100 °C. Extrakt je jímán do separátoru 8 umístěným pod expanzním ventilem 7, pomocí kterého se nastaví průtok CO2. Plynný oxid uhličitý je odváděn do atmosféry přes plynoměr 9, kterým se měří průtok a celkové proteklé množství plynného oxidu uhličitého.The supercritical scCO2 extraction was carried out in a high-pressure apparatus, the diagram of which is shown in Fig. 1. In the high-pressure column 5, the raw material for extraction, for example Pythium oligandrum concentrate, is placed between layers of glass beads, which are separated from the material by a thin layer of glass wool. The closed and sealed column is inserted into the box 6 heated by a hot air fan and connected to the apparatus by stainless steel capillaries. After tempering to the desired temperature (preferably in the range from 32°C to 80°C), the column is pressurized with carbon dioxide from the pressure bottle 1 using the high-pressure pump 2 and allowed to settle for at least 15 minutes. Components soluble in scCO2 are led from the column to the expansion valve 7 heated to 60 to 100 °C. The extract is collected in the separator 8 located under the expansion valve 7, which is used to set the CO2 flow. Carbon dioxide gas is discharged into the atmosphere through the gas meter 9, which measures the flow rate and the total amount of carbon dioxide gas passed through.
Materiál ochuzený o nepolární látky (rafinát) se následně podrobí extrakci scCO2 modifikovaným polární kapalinou (ketonem, alkoholem nebo jejich směsí). Extrakce probíhá za stejných podmínek jako s čistým scCO2 s tím, že je k scCO2 před vstupem do kolony s materiálem přidávána polární kapalina čerpaná vysokotlakým kapalinovým čerpadlem 4 ze zásobní láhve 3 tak, aby bylo dosaženo požadované koncentrace v scCO2 (5 až 25 % hmotn.). Do separátoru 8 se jímá roztok extraktu a použitého kapalného rozpouštědla, které je následně odpařeno.The material depleted of non-polar substances (raffinate) is subsequently subjected to scCO2 extraction with a modified polar liquid (ketone, alcohol or their mixture). The extraction takes place under the same conditions as with pure scCO2, with the fact that a polar liquid pumped by a high-pressure liquid pump 4 from the storage bottle 3 is added to the scCO2 before entering the column with the material, so that the required concentration in scCO2 (5 to 25% by weight) is reached. ). A solution of the extract and the used liquid solvent is collected in the separator 8, which is subsequently evaporated.
Příklad 1: Extrakce Pythium oligandrum pomocí scCO2 bez odstranění vodorozpustných složek z extraktuExample 1: Extraction of Pythium oligandrum with scCO2 without removing water-soluble components from the extract
Do vysokotlaké kolony 5 o objemu 24 ml (obr. 1) bylo vloženo 2 g koncentrátu Pythium oligandrum, obsahujícího 90 % hmotn. Pythium oligandrum v koncentrátu, poskytnutého firmou Biopreparáty a.s. (koncentrát Pythium oligandrum je účinnou látkou řady preparátů pro potlačení růstu plísní, vyráběných firmou Biopreparáty a.s. Postup jeho výroby je uveden např. ve WO 2018/001392 A1, str. 12, ř. 7 až 15.) mezi dvě vrstvy skleněných kuliček o průměru 2 mm. Kuličky byly odděleny od koncentrátu 2 mm skleněné vaty. Kolona 5 byla uzavřená a připojena k aparatuře kapilárami z nerezové oceli o průměru 1,58 mm a vložena do boxu 6, vyhřívaného horkovzdušným ventilátorem. Po vytemperování na teplotu 40 °C, byla kolona natlakována oxidem uhličitým z tlakové lahve 1 pomocí vysokotlakého čerpadla 2 na tlak 30 MPa a 15 minut probíhalo ustalování kolony. Složky rozpustné v scCO2 byly vedeny z kolony 5 k expanznímu ventilu 7 vyhřívanému na 60 °C. Extrakt byl jímán do separátoru 8 umístěného pod expanzním ventilem 7, pomocí kterého byl nastaven průtok CO2. Plynný oxid uhličitý byl odváděn do atmosféry přes plynoměr 9 pro měření proteklého plynného CO2. Dále probíhala extrakce za stejných podmínek jako s čistým scCO2 s tím, že byl k scCO2 před vstupem do kolony přidáván etanol čerpaný vysokotlakým kapalinovým čerpadlem 4 ze zásobní láhve 3 tak, až bylo dosaženo koncentrace ethanolu v scCO2 5 % hmotn. Do separátoru 8 byl jímán roztok extraktu a použitého2 g of Pythium oligandrum concentrate, containing 90% by weight, was placed in high-pressure column 5 with a volume of 24 ml (Fig. 1). Pythium oligandrum in a concentrate provided by the company Biopreparáty as (Pythium oligandrum concentrate is the active substance of a number of preparations for suppressing the growth of fungi, produced by the company Biopreparáty a.s. The procedure for its production is given, for example, in WO 2018/001392 A1, p. 12, lines 7 to 15 .) between two layers of glass beads with a diameter of 2 mm. The spheres were separated from the concentrate by 2 mm glass wool. Column 5 was closed and connected to the apparatus by stainless steel capillaries with a diameter of 1.58 mm and inserted into box 6, heated by a hot air fan. After tempering to a temperature of 40 °C, the column was pressurized with carbon dioxide from the pressure bottle 1 using a high-pressure pump 2 to a pressure of 30 MPa, and the column was stabilized for 15 minutes. Components soluble in scCO 2 were led from column 5 to expansion valve 7 heated to 60 °C. The extract was collected in the separator 8 located under the expansion valve 7, with the help of which the CO2 flow was set. Carbon dioxide gas was vented into the atmosphere via gas meter 9 to measure CO2 gas flow. Furthermore, the extraction took place under the same conditions as with pure scCO2, with the fact that ethanol pumped by a high-pressure liquid pump 4 from storage bottle 3 was added to the scCO2 before entering the column until a concentration of ethanol in scCO2 of 5% by weight was reached. A solution of the extract and used was collected in the separator 8
- 6 CZ 309743 B6 kapalného rozpouštědla. Po protečení 60 g CO2 (hustota scCO2 byla 870 kg/m3) byla získána účinná frakce s výtěžkem 2,7 % hmotn., vztaženo na původní hmotnost extrahovaného koncentrátu Pythium oligandrum.- 6 CZ 309743 B6 liquid solvent. After passing 60 g of CO2 (scCO2 density was 870 kg/m3), an effective fraction was obtained with a yield of 2.7% by weight, based on the original weight of the extracted Pythium oligandrum concentrate.
Tato frakce vykazovala IC50 pro nádorové buňky kožního melanomu BL16 23 pg/ml a pro buňky fibroblastu HDF 160 pg/ml. Cytotoxicita byla stanovena mikrodiluční metodou, přičemž jako rozpouštědlo byl použit dimethylsulfoxid. Mikrodiluční metoda je kvantitativní metoda při které je hodnota IC50 stanovována jako koncentrace látky (pg/ml) inhibující růst populace testovaných buněk z 50 %. Stručně: Buňky byly inkubovány s médiem a přídavkem zředěného extraktu v jamkách mikrotitrační destičky. Po 48 hodinách inkubace bylo médium odstraněno a buňky byly promyty fosfátovým pufrem. Pro určení viability bylo přidáno 100 pl resazurinového roztoku (0,03 mg/ml) po 3 hodinách inkubace při 37 °C, 5% CO2 a při 76% relativní vlhkosti byla změřena fluorescence při vlnových délkách excitace 560 nm a emise 590 nm (ex/em) čtečkou mikrodestiček. Uvedené hodnoty IC50 jsou průměrem ze 4 opakování.This fraction showed an IC50 for BL16 cutaneous melanoma tumor cells of 23 pg/ml and for HDF fibroblast cells of 160 pg/ml. Cytotoxicity was determined by the microdilution method using dimethyl sulfoxide as a solvent. The microdilution method is a quantitative method in which the IC50 value is determined as the concentration of the substance (pg/ml) inhibiting the growth of the tested cell population by 50%. Briefly: Cells were incubated with medium and the addition of diluted extract in the wells of a microtitre plate. After 48 hours of incubation, the medium was removed and the cells were washed with phosphate buffer. To determine viability, 100 µl of resazurin solution (0.03 mg/ml) was added after 3 hours of incubation at 37 °C, 5% CO2 and at 76% relative humidity, fluorescence was measured at excitation wavelengths of 560 nm and emission at 590 nm (ex /em) with a microplate reader. The IC50 values given are the average of 4 replicates.
Příklad 2: Extrakce Pythium oligandrum pomocí scCO2 s oddělením vodorozpustných složek z extraktuExample 2: Extraction of Pythium oligandrum using scCO2 with separation of water-soluble components from the extract
Do vysokotlakého kolony 5 o objemu 50 ml zařízení na obr. 1 bylo vloženo 10 g koncentrátu Pythium oligandrum, poskytnutého stejně jako v příkladu 1 firmou Biopreparáty a.s., a dále bylo postupováno, jak je uvedeno v příkladu 1. Ve druhé fázi extrakce byl k scCO2 před vstupem do kolony 5 přidáván ethanol čerpaný vysokotlakým kapalinovým čerpadlem 4 ze zásobní láhve 3 tak, až bylo dosaženo koncentrace ethanolu v scCO2 25 % hmotn. Do separátoru 8 byl jímán roztok extraktu a použitého kapalného rozpouštědla (ethanolu). Po protečení 105 g CO2 (hustota scCO2 byla 870 kg/m3) byla získána účinná frakce s výtěžkem 4,2 % hmotn., vztaženo na původní hmotnost extrahovaného koncentrátu Pythium oligandrum.In the high-pressure column 5 with a volume of 50 ml of the device in Fig. 1, 10 g of Pythium oligandrum concentrate, provided in the same way as in example 1 by the company Biopreparáty a.s., was placed, and the procedure was continued as indicated in example 1. In the second phase of extraction, scCO2 was before entering the column 5, ethanol pumped by the high-pressure liquid pump 4 from the storage bottle 3 was added until a concentration of ethanol in scCO2 of 25% by weight was reached. A solution of the extract and the used liquid solvent (ethanol) was collected in the separator 8. After passing 105 g of CO2 (scCO2 density was 870 kg/m3), an effective fraction was obtained with a yield of 4.2% by weight, based on the original weight of the extracted Pythium oligandrum concentrate.
Ze získaného extraktu byly odděleny složky rozpustné ve vodě tak že na 10 mg extraktu byl přidán 1 ml vody a homogenizován na ultrazvukové lázni. Odlitím byla oddělena část rozpustná ve vodě. Část ve vodě nerozpustná (20 % hmotn. extraktu (účinné frakce)) byla dále podrobena preparativní kapalinové chromatografii a rozdělena na 7 frakcí. Byla použita kolona: Agilent PLgel 10 pm 50 Á, 300 x 25 mm, Agilent Technologies, Inc., USA.Water-soluble components were separated from the obtained extract so that 1 ml of water was added to 10 mg of extract and homogenized in an ultrasonic bath. The water-soluble part was separated by casting. The water-insoluble part (20% by weight of the extract (effective fraction)) was further subjected to preparative liquid chromatography and divided into 7 fractions. Column used: Agilent PLgel 10 pm 50 Å, 300 x 25 mm, Agilent Technologies, Inc., USA.
HPLC: Streamline™ P2 Prep Pump, Watrex Praha, s.r.o.HPLC: Streamline™ P2 Prep Pump, Watrex Praha, s.r.o.
Streamline™ UV1 detektor, Watrex Praha, s.r.o.Streamline™ UV1 detector, Watrex Praha, s.r.o.
Manuální injektor MI1, Watrex Praha, s.r.o.Manual injector MI1, Watrex Praha, s.r.o.
Clarity Chromatography Software Clarity Lite 8.3, DataApex, ČR.Clarity Chromatography Software Clarity Lite 8.3, DataApex, Czech Republic.
Mobilní fáze: Acetonitril (Acetonitril >99,9 % HPLC gradient grade, Fisher Chemical), průtok: 8 ml/min, nástřik: 250 pl, při pokojové teplotě kolony. Detekce λ = 205 nm.Mobile phase: Acetonitrile (Acetonitrile >99.9% HPLC gradient grade, Fisher Chemical), flow rate: 8 ml/min, injection: 250 µl, at column room temperature. Detection λ = 205 nm.
Výtěžek biologicky účinné frakce byl 0,5 % hmotn. z celkového množství získaného extraktu.The yield of the biologically effective fraction was 0.5% by weight. from the total amount of extract obtained.
Tato frakce vykazovala IC50 pro nádorové buňky BL16 2,19 pg/ml a pro buňky fibroblastu HDF 22,6 pg/ml. Cytotoxicita byla stanovena mikrodiluční metodou tak, jak je uvedeno v příkladu 1.This fraction showed an IC50 for BL16 tumor cells of 2.19 pg/ml and for HDF fibroblast cells of 22.6 pg/ml. Cytotoxicity was determined by the microdilution method as described in Example 1.
Příklad 3: Extrakce Pythium oligandrum hexanem a isopropylalkoholemExample 3: Extraction of Pythium oligandrum with hexane and isopropyl alcohol
Do papírové patrony bylo naváženo 10 g koncentrátu Pythium oligandrum, získaného stejně jako v příkladech 1 a 2 od firmy Biopreparáty a.s., a patrona byla vložena do nástavce Soxhletova přístroje. Do 500 ml varné baňky bylo odměřeno 250 ml hexanu. Na horní část Soxhletova nástavce byl připevněn chladič a na dolní část byla napojena baňka s rozpouštědlem. Poté, co byla aparatura sestavena, byl spuštěn přívod vody do chladiče a bylo zapnuto topné hnízdo, které bylo umístěno pod varnou baňku. Po 6 hodinách varu bylo topné hnízdo vypnuto a extrakce nepolární frakce tak10 g of Pythium oligandrum concentrate, obtained as in examples 1 and 2 from the company Biopreparáty a.s., was weighed into the paper cartridge, and the cartridge was inserted into the Soxhlet apparatus attachment. 250 ml of hexane was measured into a 500 ml boiling flask. A cooler was attached to the upper part of the Soxhlet attachment and a solvent flask was connected to the lower part. After the apparatus was assembled, the water supply to the cooler was turned on and the heating nest, which was placed under the boiling flask, was turned on. After 6 hours of boiling, the heating nest was turned off, and the extraction of the non-polar fraction continued
- 7 CZ 309743 B6 byla ukončena. Po vychladnutí byla baňka s extraktem připojena na rotační vakuovou odparku a rozpouštědlo bylo odpařeno.- 7 CZ 309743 B6 was terminated. After cooling, the extract flask was attached to a rotary vacuum evaporator and the solvent was evaporated.
Následně byla k přístroji připojena nová varná baňka s 250 ml isopropylalkoholu a po 4 hodinách varu byla ukončena extrakce účinné frakce. Po vychladnutí byla baňka s extraktem připojena na rotační vakuovou odparku a rozpouštědlo bylo odpařeno. Výtěžek účinné frakce byl 4,0 % hmotn., vztaženo na původní hmotnost extrahovaného koncentrátu Pythium oligandrum.Subsequently, a new flask with 250 ml of isopropyl alcohol was connected to the device and after 4 hours of boiling, the extraction of the effective fraction was completed. After cooling, the extract flask was attached to a rotary vacuum evaporator and the solvent was evaporated. The yield of the effective fraction was 4.0% by weight, based on the original weight of the extracted Pythium oligandrum concentrate.
Tato frakce vykazovala IC50 pro nádorové buňky BL16 30,1 pg/ml a pro buňky fibroblastu HDF 220,6 pg/ml. Cytotoxicita byla stanovena mikrodiluční metodou stejným postupem, jak je uvedeno v příkladu 1.This fraction showed an IC50 for BL16 tumor cells of 30.1 pg/ml and for HDF fibroblast cells of 220.6 pg/ml. Cytotoxicity was determined by the microdilution method following the same procedure as in Example 1.
Příklad 4: Extrakce Pythium oligandrum z přípravku POLYVERSUM pomocí scCO2 bez odstranění vodorozpustných složek z extraktuExample 4: Extraction of Pythium oligandrum from POLYVERSUM with scCO2 without removing water-soluble components from the extract
Do vysokotlaké kolony 5 objemu 150 ml (obr. 1) bylo vloženo 40 g přípravku pro hubení plísní na rostlinách, POLYVERSUM, jehož účinnou složkou je Pythium oligandrum. Přípravek POLYVERSUM obsahuje kromě Pythium oligandrum zbytky růstového média a jílové minerály. Obsah Pythium oligandrum v přípravku je 10 % hmotn. Dále bylo postupováno tak, jak je popsáno v příkladu 1. Byla získána účinná frakce s výtěžkem 0,5 % hmotn., vztaženo na původní hmotnost extrahovaného přípravku POLYVERSUM obsahujícího Pythium oligandrum.40 g of the preparation for killing fungi on plants, POLYVERSUM, whose active ingredient is Pythium oligandrum, were placed in high-pressure column 5 with a volume of 150 ml (Fig. 1). In addition to Pythium oligandrum, the preparation POLYVERSUM contains growth medium residues and clay minerals. The content of Pythium oligandrum in the preparation is 10% by weight. Further, the procedure was as described in example 1. An effective fraction was obtained with a yield of 0.5% by weight, based on the original weight of the extracted POLYVERSUM preparation containing Pythium oligandrum.
Příklad 5: Extrakce Pythium oligandrum z lyofilizovaného agaru pomocí scCO2 bez odstranění vodorozpustných složek z extraktuExample 5: Extraction of Pythium oligandrum from lyophilized agar using scCO2 without removing water-soluble components from the extract
Do vysokotlaké kolony 5 objemu 24 ml (obr. 1) bylo vloženo 5 g lyofilizovaného agaru s napěstovaným Pythium oligandrum (Pythium oligandrum bylo pěstováno na 50 g kukuřičného agaru po dobu 5 dní). Dále bylo postupováno tak, jak je popsáno v příkladu 1. Byla získána účinná frakce s výtěžkem 1,5 % hmotn., vztaženo na původní hmotnost lyofilizovaného agaru.5 g of lyophilized agar with cultivated Pythium oligandrum (Pythium oligandrum was grown on 50 g of corn agar for 5 days) was placed in high-pressure column 5 with a volume of 24 ml (Fig. 1). Further, the procedure was as described in example 1. An effective fraction was obtained with a yield of 1.5% by weight, based on the original weight of the lyophilized agar.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-564A CZ309743B6 (en) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | A method of producing an extract from Pythium oligandrum for suppressing the growth of skin melanoma cells, an extract that can be prepared using this method and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-564A CZ309743B6 (en) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | A method of producing an extract from Pythium oligandrum for suppressing the growth of skin melanoma cells, an extract that can be prepared using this method and its use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2021564A3 CZ2021564A3 (en) | 2023-06-21 |
| CZ309743B6 true CZ309743B6 (en) | 2023-09-06 |
Family
ID=86766551
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2021-564A CZ309743B6 (en) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | A method of producing an extract from Pythium oligandrum for suppressing the growth of skin melanoma cells, an extract that can be prepared using this method and its use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309743B6 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013086A1 (en) * | 1991-01-24 | 1992-08-06 | Martek Corporation | Arachidonic acid and methods for the production and use thereof |
| CN105524842A (en) * | 2015-12-24 | 2016-04-27 | 内蒙古民族大学 | Application of Pythium oligandrum fermentation mycoplasma in antitumor |
| WO2018001392A1 (en) * | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. | Preparation with the viable mycoparasitic microorganism pythium oligandrum for the treatment of dermaphytoses and yeast infections on the skin and mucous membranes, method of determining the cell's viability of the microorganism pythium oligandrum and method of applying the preparation |
-
2021
- 2021-12-14 CZ CZ2021-564A patent/CZ309743B6/en unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013086A1 (en) * | 1991-01-24 | 1992-08-06 | Martek Corporation | Arachidonic acid and methods for the production and use thereof |
| CN105524842A (en) * | 2015-12-24 | 2016-04-27 | 内蒙古民族大学 | Application of Pythium oligandrum fermentation mycoplasma in antitumor |
| WO2018001392A1 (en) * | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. | Preparation with the viable mycoparasitic microorganism pythium oligandrum for the treatment of dermaphytoses and yeast infections on the skin and mucous membranes, method of determining the cell's viability of the microorganism pythium oligandrum and method of applying the preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2021564A3 (en) | 2023-06-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xu et al. | Cinnamaldehyde damaged the cell membrane of Alternaria alternata and induced the degradation of mycotoxins in vivo | |
| Masoko et al. | The diversity of antifungal compounds of six South African Terminalia species (Combretaceae) determined by bioautography | |
| Jeong et al. | Isolation and characterization of metabolites from Bacillus licheniformis MH48 with antifungal activity against plant pathogens | |
| Wu et al. | Antifungal efficacy of sixty essential oils and mechanism of oregano essential oil against Rhizoctonia solani | |
| Chatterjee et al. | Inhibition of biofilm-and hyphal-development, two virulent features of Candida albicans by secondary metabolites of an endophytic fungus Alternaria tenuissima having broad spectrum antifungal potential | |
| Izgu et al. | Inhibition of Penicillium digitatum and Penicillium italicum in vitro and in planta with Panomycocin, a novel exo-β-1, 3-glucanase isolated from Pichia anomala NCYC 434 | |
| Khanam et al. | Comparative analysis of prodigiosin isolated from endophyte Serratia marcescens | |
| JP4932737B2 (en) | Composition for spore sterilization of spore-type microorganism containing extract of serpentine | |
| Zhang et al. | Evaluation of Aspergillus aculeatus GC-09 for the biological control of citrus blue mold caused by Penicillium italicum | |
| Agrillo et al. | An alternative biocontrol agent of soil-borne phytopathogens: A new antifungal compound produced by a plant growth promoting bacterium isolated from North Algeria | |
| JP2009029788A (en) | Skin care composition for external use containing seawater-derived yeast culture | |
| CZ309743B6 (en) | A method of producing an extract from Pythium oligandrum for suppressing the growth of skin melanoma cells, an extract that can be prepared using this method and its use | |
| KR101394550B1 (en) | Anti-bacterial or Anti-inflammatory Composition Comprising Extracts from Flower of Rosa hybrida as Active Ingredient | |
| Sadri et al. | Quorum-sensing quenching compounds Allium sativum, Allium hirtifolium and Allium cepa: the probable quorum-sensing quenching compounds against Candida albicans | |
| US20100285054A1 (en) | Antimicrobial Composition Comprising Fungal Extract, Process for Producing Fungal Extract and Method for Protecting Organisms | |
| Tsivileva et al. | Vietnamese Ganoderma: growth, peculiarities, and low-molecular composition compared to European and Siberian strains | |
| Roat et al. | Isolation and screening of resveratrol producing endophytes from wild grape Cayratia trifolia | |
| JP2016056102A (en) | Keratin producing action-exhibiting curcumin derivative and production process therefor | |
| Amjad et al. | Potential activity of the Anthemis gayana leaves on fungi | |
| CN104893986B (en) | Dragonfly enterobacteriaceae Aspergillus terreus QT122 and its metabolite and application | |
| Omar et al. | Cytotoxicity activity of biotransformed ethyl p-methoxycinnamate by Aspergillus niger | |
| Doi et al. | Isolation and identification of endophytic fungi from the amazonian palm Oenocarpus bataua Mart | |
| CN1288163C (en) | Preparation process for compound of proto steroid soap oside and application thereof | |
| Fazio et al. | Culture studies on the mycobiont of Caloplaca erythrantha (Tuck.) Zahlbr.(Teloschistaceae): high production of major lichen secondary metabolites | |
| Eltawab et al. | Evaluation and Enhancement of Bioactive Compounds of Aspergillus terreus Endophyte Isolated from Neem by Gamma Irradiation |