CZ309378B6 - Probiotic preparation for poultry and its use - Google Patents
Probiotic preparation for poultry and its use Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309378B6 CZ309378B6 CZ2021199A CZ2021199A CZ309378B6 CZ 309378 B6 CZ309378 B6 CZ 309378B6 CZ 2021199 A CZ2021199 A CZ 2021199A CZ 2021199 A CZ2021199 A CZ 2021199A CZ 309378 B6 CZ309378 B6 CZ 309378B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- chickens
- bacteria
- poultry
- probiotic
- probiotic preparation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
- A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Birds (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Probiotický přípravek pro drůbež a jeho použitíProbiotic preparation for poultry and its use
Oblast technikyField of technology
Předkládaný vynález poskytuje probiotický přípravek pro zlepšení fýziologických a imunitních vlastností trávicího traktu drůbeže Gallus gallus prostřednictvím osídlení směsí probiotických baktérií.The present invention provides a probiotic preparation for improving the physiological and immune properties of the digestive tract of Gallus gallus poultry through the settlement of a mixture of probiotic bacteria.
Dosavadní stav technikyCurrent state of the art
Střevní mikroflóra podstatným způsobem ovlivňuje a charakterizuje zdravotní stav hostitele. Střevní mikroflóra každého jedince se sestává z přibližně 1000 různých bakteriálních druhů a asi desetkrát více různých bakteriálních klonů a izolátů. Střevní mikroflóra teplokrevných zvířat se sestává zejména z baktérií náležících mezi Gram pozitivní Firmicutes a Gram negativní Bacteroidetes. Minoritní baktérie kolonizující trávicí trakt pochází z kmenů Proteobacteria a Actinobacteria. U hrabavé drůbeže se jako probiotické preparáty nejčastěji používají laktobacily (patří mezi Firmicutes') a bifidobaktérie (patří mezi Actinobacteria). Experimenty původců tohoto vynálezu však ukazují, že podání čistých kultur laktobacilů nebo Actinobacteria jednodenním kuřatům nevede k jejich usídlení v trávicím traktu kuřat. Identifikovat jiné baktérie schopné účinně kolonizovat trávicí trakt drůbeže mezi desítkami tisíc variant je však velmi složitý úkol a prostá znalost baktérií přítomných ve střevní mikroflóře drůbeže nebo lidí neposkytuje vůbec žádnou užitečnou informaci ohledně jejich vhodnosti pro osídlování trávicího traktu kuřat v prvních dnech života. V případě studia střevní mikroflóry kúra domácího se navíc různí autoři uchylují ke studiu střevní mikroflóry v prvních týdnech života přibližně odpovídající délce výkrmu brojlerů (cca 35 dnů). To je však značně problematický a zavádějící přístup poskytující výsledky velmi diskutabilní kvality. Důvod pro toto tvrzení je, že kuřata se líhnou v líhních, bez kontaktu s dospělou slepicí a jejich počáteční mikroflóra pochází výlučně z prostředí. Střevní mikroflóra mladých kuřat proto není vůbec reprezentativní pro kúra domácího a mikrobiální kultivací z trávicího traktu brojlerů se v naprosté většině případů získají bakteriální kultury nevhodné pro použití jako probiotika, včetně např. laktobacilů. Evoluce naopak selektovala kuřata tak, aby se hned v prvních hodinách po vylíhnutí v hnízdě osídlily mikroflórou matky. Nerespektování této skutečnosti při selekci nových probiotických kmenů vede k zcela mylným konceptům a závěrům. Nadto je jasné, že slepice nepředává kuřatům jednu jedinou baktérii a v souladu s tím, experimentální podání jednotlivých bakteriálních kultur nechrání kuřata před infekcí salmonelami nebo zvýšenými úhyny v prvních dnech života. Pokud některé studie tvrdí opak, neuvádí kriticky vyhodnocené výsledky, což lze snadno doložit reálným stavem v chovech drůbeže. V těch se pro nefunkčnost stávajících jednodruhových probiotik používají antibiotika s veškerými nežádoucími důsledky.Intestinal microflora significantly influences and characterizes the health status of the host. The intestinal microflora of each individual consists of approximately 1000 different bacterial species and about ten times more different bacterial clones and isolates. The intestinal microflora of warm-blooded animals mainly consists of bacteria belonging to the Gram-positive Firmicutes and Gram-negative Bacteroidetes. The minority bacteria colonizing the digestive tract come from the Proteobacteria and Actinobacteria phyla. Lactobacilli (belonging to Firmicutes') and bifidobacteria (belonging to Actinobacteria) are most often used as probiotic preparations in ruminant poultry. However, the experiments of the inventors of this invention show that the administration of pure cultures of lactobacilli or Actinobacteria to one-day-old chickens does not lead to their settlement in the digestive tract of the chickens. However, identifying other bacteria capable of effectively colonizing the digestive tract of poultry among tens of thousands of variants is a very complex task, and simple knowledge of the bacteria present in the intestinal microflora of poultry or humans does not provide any useful information at all regarding their suitability for colonizing the digestive tract of chickens in the first days of life. In the case of the study of the intestinal microflora of domestic chickens, various authors also resort to the study of the intestinal microflora in the first weeks of life approximately corresponding to the length of broiler fattening (approx. 35 days). However, this is a highly problematic and misleading approach providing results of highly questionable quality. The reason for this statement is that chickens are hatched in hatcheries, without contact with an adult hen, and their initial microflora comes exclusively from the environment. The intestinal microflora of young chickens is therefore not at all representative of the domestic diet, and microbial cultivation from the digestive tract of broilers in the vast majority of cases yields bacterial cultures unsuitable for use as probiotics, including, for example, lactobacilli. Evolution, on the other hand, selected chickens so that they were colonized by the mother's microflora in the first hours after hatching. Ignoring this fact when selecting new probiotic strains leads to completely wrong concepts and conclusions. Furthermore, it is clear that the hen does not transmit a single bacterium to the chicks, and accordingly, experimental administration of individual bacterial cultures does not protect the chicks from salmonella infection or increased mortality in the first days of life. If some studies claim the opposite, they do not report critically evaluated results, which can be easily substantiated by the real situation in poultry farms. In those, due to the non-functionality of the existing single-species probiotics, antibiotics are used with all the undesirable consequences.
Naopak panuje shoda, že podání komplexní mikroflóry kuřatům, např. extraktem trusu dospělých slepic vede k jejich okamžité ochraně před infekcí salmonelami, zcela v souladu se skutečností, že takové experimenty mimikují přirozený přenos komplexní mikroflóry mezi slepicí a kuřetem. Tato varianta ovšem naráží na legislativní opatření, protože se tímto způsobem mohou přenášet i nezjištěná infekční agens bakteriálního, virového nebo protozoámího původu. Je tedy známo, že jednotlivé baktérie nezvyšují zásadním způsobem odolnost kuřat proti salmonelám, zatímco komplexní mikroflóra, která má ale omezené použití, před salmonelami chrání. Řešení ochrany trávicího traktu tedy existuje, ale není jasné, zdaje nutné podat vždy všech 1000 baktérií současně s rizikem nekontrolovaného přenosu i nežádoucích baktérií, anebo zda lze ochranu redukovat na menší počet baktérií. A pokud by bylo možné redukovat počet baktérií, není jasné, které baktérie z tisíců různých vybrat do účinného, ale současně z pohledu reálné produkce co nejjednoduššího preparátu.On the contrary, there is a consensus that the administration of complex microflora to chickens, e.g. by an extract of adult hen feces, leads to their immediate protection against salmonella infection, completely in accordance with the fact that such experiments mimic the natural transfer of complex microflora between hen and chicken. However, this variant runs into legislative measures, because undetected infectious agents of bacterial, viral or protozoan origin can also be transmitted in this way. Thus, it is known that individual bacteria do not significantly increase the resistance of chickens against salmonella, while the complex microflora, which is of limited use, protects against salmonella. So there is a solution to protect the digestive tract, but it is not clear whether it is necessary to administer all 1000 bacteria at the same time with the risk of uncontrolled transfer of unwanted bacteria, or whether the protection can be reduced to a smaller number of bacteria. And if it were possible to reduce the number of bacteria, it is not clear which bacteria out of thousands of different ones to choose for the effective, but at the same time from the point of view of realistic production of the simplest possible preparation.
- 1 CZ 309378 B6- 1 CZ 309378 B6
Předkládaný vynález proto předkládá výstup, probiotický přípravek, který vyhovuje výše uvedeným požadavkům. Obsahuje více než jednu baktérii, ale přesto má relativně jednoduché složení, které je technicky realizovatelné. Přitom zajistí efektivní osídlení trávicího traktu drůbeže od prvních dnů života, sníží přítomnost nežádoucích bakterií v trávicím traktu kuřat a ochrání kuřata před salmonelovou infekcí.The present invention therefore presents an output, a probiotic preparation that meets the above requirements. It contains more than one bacterium, but still has a relatively simple composition that is technically feasible. At the same time, it ensures effective settlement of the digestive tract of poultry from the first days of life, reduces the presence of unwanted bacteria in the digestive tract of chickens and protects chickens from salmonella infection.
Podstata vynálezuThe essence of the invention
V rámci předkládaného vynálezu bylo studováno více než 500 různých baktérií, které původci vynálezu postupně izolovali z trávicího traktu kuřat v čistých kulturách a stanovili u nich kompletní sekvenci genomu. Z nich jen malá část účinně kolonizovala trávicí trakt drůbeže. Klíčovým zjištěním bylo, že mezi baktériemi schopnými kolonizovat trávicí trakt kuřat po jednorázové aplikaci nebyl jediný zástupce rodů Lactobacillus, Enterococcus nebo Bacillus, které se dosud v chovech drůbeže používají jako probiotika. Předkládaná probiotická směs je svým složení zcela unikátní a odlišná od jakéhokoliv jiného produktu.As part of the present invention, more than 500 different bacteria were studied, which the inventors gradually isolated from the digestive tract of chickens in pure cultures and determined their complete genome sequence. Of these, only a small part effectively colonized the digestive tract of poultry. The key finding was that among the bacteria capable of colonizing the digestive tract of chickens after a single application, there was not a single representative of the genera Lactobacillus, Enterococcus or Bacillus, which are still used as probiotics in poultry farms. The presented probiotic mixture is completely unique in its composition and different from any other product.
Po identifikaci baktérií schopných účinné kolonizace trávicího traktu kuřat v dalším kroku původci vynálezu redukovali počet bakteriálních druhů vhodných do směsi identifikací takových baktérií, které jsou specifické pro drůbež. Tato úvaha dosud nebyla při přípravě probiotik pro drůbež používána. Toho bylo dosaženo porovnáním střevní mikroflóry kúra domácího, prasete domácího a člověka. Tato analýza ukázala, že z řádu Lactobacillales nebo čeledí Lachnospiraceae, Ruminococcaceae nebo Enterobacteriaceae se stejné druhy často vyskytují u všech tří hostitelů. Baktérie z těchto taxonomických jednotek jsou tedy původem z prostředí a nejsou vhodné jako hostitel-adaptovaná probiotika ve smyslu této přihlášky vynálezu. Uvedené zjištění potvrdila analýza střevní mikroflóry sedmidenních kuřat, která se sestávala zejména ze zástupců Lachnospiraceae, Ruminococcaceae nebo Enterobacteriaceae. Protože však tato kuřata nikdy nebyla v kontaktu s dospělou slepicí, baktérie v jejich trávicím traktu musely pocházet výlučně z prostředí. Další experimenty pak ukázaly, že jako vhodné baktérie pro zcela nový typ probiotik pro použití u kúra domácího se jevili zástupci čeledí Veillonellaceae, Prevotellaceae nebo Bacteroidaceae. Ze zástupců těchto taxonů byla připravena probiotická směs, která je předmětem této přihlášky vynálezu.After identifying bacteria capable of efficient colonization of the digestive tract of chickens, in the next step the inventors reduced the number of bacterial species suitable for the mixture by identifying such bacteria that are specific for poultry. This consideration has not yet been used in the preparation of probiotics for poultry. This was achieved by comparing the intestinal microflora of the domestic pig, domestic pig and human. This analysis showed that from the order Lactobacillales or the families Lachnospiraceae, Ruminococcaceae or Enterobacteriaceae, the same species are often found in all three hosts. Bacteria from these taxonomic units are therefore of environmental origin and are not suitable as host-adapted probiotics in the sense of this application of the invention. The aforementioned findings were confirmed by the analysis of the intestinal microflora of seven-day-old chickens, which mainly consisted of representatives of Lachnospiraceae, Ruminococcaceae or Enterobacteriaceae. However, since these chickens had never been in contact with an adult hen, the bacteria in their digestive tracts must have come exclusively from the environment. Further experiments then showed that representatives of the families Veillonellaceae, Prevotellaceae or Bacteroidaceae appeared to be suitable bacteria for a completely new type of probiotics for use in home remedies. A probiotic mixture was prepared from representatives of these taxa, which is the subject of this application.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy probiotická směs vhodná pro podání kuřatům, která obsahuje jako účinnou složku baktérie Bacteroides caecicola, Bacteroides caecigallinarum, Megasphaera sp. a Mediterranea sp. Takto je poskytnuta přesně definovaná, bezpečná, snadno kultivovatelná a podatelná probiotická směs, vhodná pro masné i nosné linie drůbeže, která se sestává z baktérií striktně adaptovaných na kúra domácího, které ve vysoké účinnosti a dlouhodobě kolonizují trávicí trakt po jednorázové aplikaci. Všechny čtyři baktérie lze kultivovat současně, což významně zjednodušuje jejich průmyslovou přípravu. Probiotická směs je vhodná zejména pro podávání první den života drůbeže, ale lze ji podat i v pozdějších dnech.The subject of the present invention is therefore a probiotic mixture suitable for administration to chickens, which contains as an active ingredient the bacteria Bacteroides caecicola, Bacteroides caecigallinarum, Megasphaera sp. and Mediterranea sp. In this way, a precisely defined, safe, easily cultivated and administered probiotic mixture is provided, suitable for both meat and carrier lines of poultry, which consists of bacteria strictly adapted to the treatment of domestic animals, which colonize the digestive tract with high efficiency and long-term after a single application. All four bacteria can be cultured simultaneously, which greatly simplifies their industrial preparation. The probiotic mixture is particularly suitable for administration on the first day of the poultry's life, but it can also be administered in later days.
Probiotická směs podle vynálezu má oproti všem podobným, doposud připraveným produktům, tyto technické výhody:The probiotic mixture according to the invention has the following technical advantages compared to all similar products prepared so far:
- Obsažené baktérie jsou adaptované na kuře a nevyskytují se ve střevní mikroflóře člověka nebo prasat.- The bacteria contained are adapted to chicken and do not occur in the intestinal microflora of humans or pigs.
- Všechny čtyři baktérie patří za předpokladu dodržení anaerobní kultivace mezi in vitro snadno kultivovatelné.- All four bacteria are easy to cultivate in vitro, provided anaerobic cultivation is followed.
- Všechny čtyři baktérie lze souběžně fermentovat, protože mají podobné růstové rychlosti. Žádná z těchto baktérií tedy ve směsi nepřeroste ostatní.- All four bacteria can be fermented simultaneously because they have similar growth rates. Therefore, none of these bacteria will outgrow the others in the mixture.
- Všechny baktérie lze kultivovat v médiu bez přídavku jakýchkoli produktů živočišného původu.- All bacteria can be cultured in a medium without the addition of any animal products.
-2CZ 309378 B6-2CZ 309378 B6
- Všechny baktérie výhodného provedení byly celogenomově sekvenovány a bylo ověřeno, že ani jedna z nich nemá v genomu horizontálně přenositelné geny pro rezistence k antibiotikům.- All the bacteria of the preferred embodiment were whole-genome sequenced and it was verified that not one of them has horizontally transferable antibiotic resistance genes in the genome.
- Baktérie ze směsi účinně osídlují trávicí trakt drůbeže po jednorázové aplikaci, a to tak odlišné genetické linie jako je masná linie Ross nebo nosná linie ISA Brown.- The bacteria from the mixture effectively colonize the digestive tract of poultry after a single application, and such different genetic lines as the meat line Ross or the carrier line ISA Brown.
- Po aplikaci všechny čtyři baktérie kolonizují trávicí trakt nejméně po dobu 35 dnů.- After application, all four bacteria colonize the digestive tract for at least 35 days.
- Po aplikaci jednodenním kuřatům a infekci Salmonella Enteritidis probiotická směs zvyšuje odolnost kuřat před salmonelami.- After application to one-day-old chickens and Salmonella Enteritidis infection, the probiotic mixture increases the chickens' resistance to salmonella.
- U ošetřených kuřat se v menší míře vyskytují patogenní nebo oportunně patogenní baktérie původem z prostředí, jako je Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Proteus vulgaris, Clostridiumperfringens nebo Clostridium difficile.- Pathogenic or opportunistically pathogenic bacteria of environmental origin, such as Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Proteus vulgaris, Clostridium perfringens or Clostridium difficile, occur to a lesser extent in treated chickens.
- V reálných hejnech aplikace směsi snižuje úhyny až na úroveň srovnatelnou s výkrmem (odchovem) kuřat za použití antibiotik. Aplikací probiotické směsi tak lze nahradit použití antibiotik v produkci drůbeže.- In real flocks, the application of the mixture reduces deaths to a level comparable to the fattening (rearing) of chickens using antibiotics. The use of antibiotics in poultry production can thus be replaced by the application of a probiotic mixture.
Probiotickou směs podle vynálezu lze podávat kuřatům kdykoliv v průběhu života. Nej výhodnější je však její podání kuřatům bezprostředně po vylíhnutí. Směs je proto určena zejména k aplikaci jednodenním kuřatům v líhních nebo bezprostředně po naskladnění kuřat na farmu, to je ve věku 1 až 5 dnů, výhodněji 1 až 3 dnů.The probiotic mixture according to the invention can be administered to chickens at any time during their life. However, it is most advantageous to give it to the chicks immediately after hatching. The mixture is therefore intended especially for application to one-day-old chicks in hatcheries or immediately after the chicks are stored on the farm, that is at the age of 1 to 5 days, more preferably 1 to 3 days.
Směs lze podávat v pitné vodě nebo krmivu. Pro dosažení homogenního pokrytí celého hejna je však nejvhodnější sprejová aplikace v líhni. Probiotická směs byla otestována jako zcela bezpečná po sprejové aplikaci.The mixture can be given in drinking water or feed. However, to achieve homogeneous coverage of the entire flock, spray application in the hatchery is most suitable. The probiotic mixture has been tested to be completely safe after spray application.
Předmětem předkládaného vynálezu je také krmivo obsahující probiotickou směs podle vynálezu.The subject of the present invention is also a feed containing a probiotic mixture according to the invention.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále formulace pro sprejovou aplikaci obsahující probiotickou směs podle vynálezu a alespoň jedno potravinářsky přijatelné rozpouštědlo.The subject of the present invention is also a formulation for spray application containing a probiotic mixture according to the invention and at least one food acceptable solvent.
Při testování bylo zjištěno, že po orálním podání jednodenním kuřatům tvoří baktérie z probiotické směsi více než 25 % z celkové střevní mikroflóry u sedmidenních kuřat a okolo 50 % z celkové střevní mikroflóry u kuřat 29. den života, což je v podstatě délka života brojlerů ve výkrmu. Ve střevní mikroflóře kontrolních kuřat, kterým nebyla probiotická směs podávána, se baktérie probiotické směsi nenacházely. Baktérie z probiotické směsi ze střevní mikroflóry vytlačily baktérie, které mohou způsobovat záněty a nežádoucí fyziologické stavy, jako je E. coli, Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens nebo Clostridium difficile. Probiotická směs podle vynálezu při testování nevykazovala žádné negativní vlastnosti, a naopak chránila kuřata před experimentální infekcí Salmonella Enteritidis, a to jak při orální čelenži, tak i po čelenži s využitím modelu „seeder bird“. U osídlených kuřat navíc klesal podíl E. coli na 1 až 2 % z celkové mikroflóry, signifikantně méně než u kontrolních neosídlených kuřat, u kterých se podíl E. coli na celkové mikroflóře pohyboval v desítkách procent. Předkládaná probiotická směs je proto velmi vhodná pro použití jako probiotický preparát u kuřat, který účinně zlepšuje zdravotní stav a fýziologické vlastnosti kuřat bez nežádoucích vedlejších účinků a omezuje tak potřebu použití antibiotik.During testing, it was found that after oral administration to one-day-old chickens, the bacteria from the probiotic mixture made up more than 25% of the total intestinal microflora in seven-day-old chickens and around 50% of the total intestinal microflora in chickens on the 29th day of life, which is essentially the life span of broilers in fattening. The bacteria of the probiotic mixture were not found in the intestinal microflora of the control chickens that were not given the probiotic mixture. The bacteria from the probiotic mixture displaced the bacteria from the intestinal microflora that can cause inflammation and undesirable physiological conditions, such as E. coli, Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens or Clostridium difficile. The probiotic mixture according to the invention did not show any negative properties when tested and, on the contrary, protected chickens from experimental Salmonella Enteritidis infection, both during oral challenge and after challenge using the "seeder bird" model. Moreover, in settled chickens, the share of E. coli decreased to 1 to 2% of the total microflora, significantly less than in the control non-settled chickens, in which the share of E. coli in the total microflora was in the tens of percent. The presented probiotic mixture is therefore very suitable for use as a probiotic preparation in chickens, which effectively improves the health and physiological characteristics of chickens without unwanted side effects and thus reduces the need for the use of antibiotics.
Ve výhodném provedení se probiotická směs sestává z bakterií Bacteroides caecicola CCM 9131, Bacteroides caecigallinarum CCM 9132, Megasphaera sp. CCM 9129 a Mediterranea sp. CCM 9130. Tyto bakteriální kmeny jsou uloženy v České sbírce mikroorganismů (CCM), adresa: Kamenice 5/budova A25, 625 00 Brno, Czech Republic.In a preferred embodiment, the probiotic mixture consists of the bacteria Bacteroides caecicola CCM 9131, Bacteroides caecigallinarum CCM 9132, Megasphaera sp. CCM 9129 and Mediterranea sp. CCM 9130. These bacterial strains are deposited in the Czech Collection of Microorganisms (CCM), address: Kamenice 5/building A25, 625 00 Brno, Czech Republic.
Přípravek je s výhodou formulován pro orální nebo sprejové podání, a obsahuje tedy kapalný nosič na bázi vody. Kapalným nosičem může být voda, fyziologický roztok nebo růstové médium pro baktérie. Růstové médium pro pomnožení a fermentaci neobsahuje žádné ingredience živočišného původů a sestává se pouze z peptonu ze sójových bobů (enzymatický digestát), kyselého hydrolyzátu sójových proteinů a kvasnicového extraktu.The preparation is preferably formulated for oral or spray administration, and thus contains a water-based liquid carrier. The liquid carrier can be water, saline or growth medium for bacteria. The growth medium for multiplication and fermentation does not contain any ingredients of animal origin and consists only of soybean peptone (enzymatic digest), acid hydrolyzate of soy proteins and yeast extract.
Probiotický přípravek s výhodou obsahuje alespoň 107 CFU na mililitr tekutého produktu každé ze čtyř obsažených baktérií. Předmětem předkládaného vynálezu je tedy probiotický přípravek obsahující baktérie pro použití jako probiotický preparát pro léčebné či preventivní zlepšení imunity a/nebo fyziologických vlastností střevního traktu drůbeže Gallus gallus. Zlepšení imunity a/nebo fyziologických vlastností s výhodou zahrnuje prevenci infekcí trávicího traktu drůbeže patogeny, zejména patogeny E. coli a/nebo Salmonella, anebo Proteus vulgaris,The probiotic preparation preferably contains at least 10 7 CFU per milliliter of liquid product of each of the four bacteria contained. The subject of the present invention is therefore a probiotic preparation containing bacteria for use as a probiotic preparation for therapeutic or preventive improvement of immunity and/or physiological properties of the intestinal tract of Gallus gallus poultry. The improvement of immunity and/or physiological properties preferably includes the prevention of infections of the digestive tract of poultry by pathogens, especially E. coli and/or Salmonella pathogens, or Proteus vulgaris,
Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens a Clostridium difficile. Dále je předmětem předkládaného vynálezu použití probiotického přípravku pro neléčebné zlepšení fyziologických vlastností střevního traktu drůbeže Gallus gallus.Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens and Clostridium difficile. Furthermore, the subject of the present invention is the use of a probiotic preparation for the non-therapeutic improvement of the physiological properties of the intestinal tract of Gallus gallus poultry.
Přípravek je možno podávat jednorázově v jedné jednotkové dávce nebo opakovaně v několika jednotkových dávkách rozložených v čase. S výhodou se však poprvé podává sprej ováním v dolíhni den před transportem nebo sprejováním kuřat při třídění před transportem na farmu. Třetí dávku je možné distribuovat kuřatům po naskladnění na farmu orálně, a to jak pitnou vodou, tak jako příměs do krmivá.The preparation can be administered once in one unit dose or repeatedly in several unit doses spread over time. However, it is preferably administered for the first time by spraying in the brooder the day before transport or by spraying the chickens during sorting before transport to the farm. The third dose can be distributed to the chickens orally after being stored on the farm, both in drinking water and as an additive to feed.
Objasnění výkresůClarification of drawings
Obrázek 1. Výskyt hostitelsky adaptovaných a všeobecně přítomných členů střevní mikroflóry u člověka, prasete a drůbeže. Horní panel, šedá barva, počet druhů v daném taxonu, které se vyskytují u více než jednoho hostitele. Černá, šachovnice a šrafování, počet druhů, které se daného taxonu vyskytují pouze u kuřete, člověka, resp. prasete. Spodní panel, procentuální zastoupení daného taxonu vmikroflóře sedmidenních kuřat. Pří vývoji probiotické směsi pro kuřata jsme striktně vybírali z baktérií adaptovaných na kuře.Figure 1. Occurrence of host-adapted and universally present members of the intestinal microflora in humans, pigs and poultry. Top panel, grey, number of species in a given taxon that occur on more than one host. Black, checkerboard and hatching, number of species that occur only in the chicken, human, or pig Lower panel, percentage representation of a given taxon in the microflora of seven-day-old chickens. When developing the probiotic mixture for chickens, we strictly selected bacteria adapted to chicken.
Obrázek 2. Grafy znázorňují počty salmonel ve slepém střevě kuřat 4, 14 a 21 dní po infekci. U každé skupiny je uveden i věk kuřat ve dnech. S. Enteritidis byla kvantifikována kultivačně (panel A) nebo pomocí real-time PCR (Panel B). Hvězdičkou jsou označeny signifikantní rozdíly (t-test, p<0,05), kdy nižší počty salmonel byly vždy zaznamenány u kuřat ošetřených probiotickou směsí.Figure 2. Graphs show Salmonella counts in the caecum of chickens 4, 14 and 21 days post-infection. The age of the chickens in days is given for each group. S. Enteritidis was quantified by culture (Panel A) or by real-time PCR (Panel B). Significant differences (t-test, p<0.05) are marked with an asterisk, where lower numbers of salmonella were always recorded in chickens treated with the probiotic mixture.
Obrázek 3. Schopnost probiotické směsi zvyšovat odolnost kuřat před spontánním osídlením E. coli z prostředí. Hvězdičkou jsou označeny signifikantní rozdíly (t-test, p<0,05), kdy nižší počty E. coli byly vždy zaznamenány u kuřat ošetřených probiotickou směsí.Figure 3. The ability of a probiotic mixture to increase the resistance of chickens to spontaneous E. coli colonization from the environment. Significant differences (t-test, p<0.05) are marked with an asterisk, where lower numbers of E. coli were always recorded in chickens treated with the probiotic mixture.
Obrázek 4. Vliv podání probiotické směsi pitnou vodou po naskladnění na úhyny po celou dobu výkrmu brojlerů. Černé čtverečky, úhyny ve třech hejnech, ve kterých byla podávána antibiotika. Šedé kroužky, úhyny v hejnech s probiotickou směsí. Bílé trojúhelníky, úhyny v hejnech bez antibiotik a bez probiotické směsi.Figure 4. Effect of administration of probiotic mixture in drinking water after storage on mortality throughout broiler fattening period. Black squares, deaths in three flocks in which antibiotics were administered. Gray circles, deaths in flocks with probiotic mixture. White triangles, deaths in flocks without antibiotics and without probiotic mixture.
Obrázek 5. Vliv podání probiotik sprejováním v dolíhni na úhyny po celou dobu výkrmu brojlerů. Čtverečky, úhyny v hejnu, ve kterém byla podávána antibiotika. Kroužky, úhyny v hejnu ošetřeném probiotickou směsí.Figure 5. Effect of administration of probiotics by spraying in the brooder on deaths throughout broiler fattening. Squares, deaths in the flock in which antibiotics were administered. Rings, deaths in a flock treated with a probiotic mixture.
-4CZ 309378 B6-4CZ 309378 B6
Příklady uskutečnění vynálezuExamples of implementation of the invention
Příklad 1: Identifikace a izolace vhodných bakteriálních druhů specifických pro mikroflóru kuřatExample 1: Identification and isolation of suitable bacterial species specific to the microflora of chickens
Při návrhu nových probiotik je klíčové selektovat z bakteriálních druhů adaptovaných na daného hostitele a vyhnout se sdíleným druhům, jejichž původ je nejasný. Při návrhu nových probiotik jsme porovnali bakteriální druhy vyskytující se u člověka, prasete a kúra domácího, a zaměřili se jen na druhy, které jsou přísně hostitelsky adaptované na kuře. Porozumění a plné uvědomění si všech důsledků této skutečnosti je pro návrh nových generací probiotik klíčové. Baktérie adaptované pro kuře jsme vybírali z čeledí Veillonellaceae, Prevotellaceae a Bacteroidaceae (obr. 1). Na druhy z těchto čeledí jsme zaměřili následnou kultivaci, která byla prováděna z obsahů slepých střev dospělých slepic naředěných ve sterilním ředicím roztoku (0,1 g síran hořečnatý heptahydrát, 0,2 g monobazický fosforečnan draselný, 0,2 g chlorid draselný, 1,15 g dibazický fosforečnan sodný, 3,0 g chlorid sodný, 1,0 g thioglykolát sodný, 0,5 g /.-cystein. 1000 ml destilovaná voda, pH 7,5 při 25 °C). Jednotlivá ředění byla vyseta na Wilkins-Chalgren (WCHA) agar a inkubace probíhala v anaerobní atmosféře sestávající se z 10 % CO2, 5 % H2 a 85 % N2 při 37 °C po dobu 72 hodin. Z narostlých kolonií byl alikvot resuspendován v 1,0 ml BHI bujónu s 10% glycerolem a zamražen při -70 °C pro další použití. Z jiného alikvotu byla izolována DNA, která byla využita pro stanovení kompletní sekvence bakteriální DNA a následnou druhovou identifikaci. Bacteroides caecigallinarum a Mediterranea sp. patří mezi Gram negativní baktérie čeledi Bacteroidaceae. Konečným produktem jejich metabolismu je acetát, propionát a sukcinát. Bacteroides caecicola patří mezi Gram negativní baktérie čeledi Prevotellaceae a konečným produktem jeho metabolismu je acetát, propionát a sukcinát. Megasphaera sp. náleží do čeledi Veillonellaceae, která fýlogeneticky patří do kmene Firmicutes. Megasphaera sp. je butyrát produkující baktérie. Se znalostí celogenomové sekvence byly identifikovány geny specifické pro každou z uvedených baktérií a na ně byly zacíleny Sybr Green real time PCR pro detekci a kvantifikaci v libovolném typu vzorků, zejména však trusu ošetřených kuřat s využitím následujících specifických primerů:When designing new probiotics, it is crucial to select from host-adapted bacterial species and avoid shared species whose origins are unclear. When designing new probiotics, we compared bacterial species found in humans, pigs and chickens, and focused only on species that are strictly host-adapted to chicken. Understanding and fully realizing all the consequences of this fact is crucial for the design of new generations of probiotics. We selected bacteria adapted for chicken from the families Veillonellaceae, Prevotellaceae and Bacteroidaceae (Fig. 1). We focused on species from these families in subsequent cultivation, which was carried out from the contents of the caecum of adult hens diluted in a sterile dilution solution (0.1 g magnesium sulfate heptahydrate, 0.2 g monobasic potassium phosphate, 0.2 g potassium chloride, 1, 15 g dibasic sodium phosphate, 3.0 g sodium chloride, 1.0 g sodium thioglycolate, 0.5 g /.-cysteine. 1000 ml distilled water, pH 7.5 at 25 °C). Individual dilutions were plated on Wilkins-Chalgren (WCHA) agar and incubated in an anaerobic atmosphere consisting of 10% CO2, 5% H2, and 85% N2 at 37°C for 72 hours. An aliquot of grown colonies was resuspended in 1.0 ml BHI broth with 10% glycerol and frozen at -70°C for further use. DNA was isolated from another aliquot, which was used to determine the complete bacterial DNA sequence and subsequent species identification. Bacteroides caecigallinarum and Mediterranea sp. belongs to the Gram-negative bacteria of the Bacteroidaceae family. The end product of their metabolism is acetate, propionate and succinate. Bacteroides caecicola belongs to the Gram negative bacteria of the Prevotellaceae family and the end product of its metabolism is acetate, propionate and succinate. Megasphaera sp. belongs to the Veillonellaceae family, which phylogenetically belongs to the Firmicutes tribe. Megasphaera sp. is a butyrate producing bacteria. With the knowledge of the whole-genome sequence, genes specific to each of the mentioned bacteria were identified and targeted by Sybr Green real time PCR for detection and quantification in any type of sample, but especially the feces of treated chickens, using the following specific primers:
Jednotlivé izolované kmeny bakterií byly charakterizovány i podle sekvence genu pro 16S rRNA. Taje pro jednotlivé izoláty baktérií používané v dalších testech následující:Individual isolated bacterial strains were also characterized according to the sequence of the 16S rRNA gene. Taje for individual isolates of bacteria used in further tests the following:
Bacteroides caecicola CCM 9131Bacteroides caecicola CCM 9131
ATTTTACAATGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCTACAGGCTTAAC ACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGTATCTGGCTTGCCAGATACGATGGCGACCGGC GCACGGGTGAGTAACGCGTATCCAACCTGCCCCGTACACGGGGATAGCCTTCCGAA AGGGAGATTAATACCCGATGATGTCAGGAGTTCGCATGTAAACCTGACTAAAGTTAT TACGGTACGGGAGGGGGGTGCGTTCCATTAGGTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACC TAGCCGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGAC ACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGCCGGGAG GCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTTTT ATGCGGGATTAACGTGAGGTACGTGTACCTTCTTGCAGGTACCGCATGAATAAGCAT CGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAGGCGTTATCCGGATATTTTACAATGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCTACAGGCTTAAC ACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGTATCTGGCTTGCCAGATACGATGGCGACCGGC GCACGGGTGAGTAACGCGTATCCAACCTGCCCCGTACACGGGGATAGCCTTCCGAA AGGGAGATTAATACCCGATGATGTCAGGAGTTCGCATGTAAACCTGACTAAAGTTAT TACGGTACGGGAGGGGGGTGCGTTCCATTAGGTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACC TAGCCGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGAC ACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGCCGGGAG GCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTTTT ATGCGGGATTAACGTGAGGTACGTGTACCTTCTTGCAGGTACCGCATGAATAAGCAT CGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAGGCGTTATCCGGAT
-5CZ 309378 B6-5CZ 309378 B6
TTATTGGGTTTAAAGGGAGCGCAGACGGCATGTCAAGTCAGCTGTGAAAGTTCGGGG CTCAACCTTGGAATTGCAGTTGAAACTGGCGTGCTTGAGTTCGGTCGAGGCAGGCGG AATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACCCCGATTGCGAAGG CAGCTTGCCAGGCCTGGACTGACGTTGAGGCTCGAAGGTGCGGGTATCGAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCGCACGGTAAACGATGGATACTCGCTGTCGGCGATACAC GGTCGGCGGCCAAGCGAAAGCGTTAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACG GTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAA TTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAACTGTGCCTGACTGCCTCAGAG ATGGGGCTTCCAGCAATGGCAGGCATGGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG CCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCCTCCCGCCAGTTGCCAT CAGGTAAAGCTGGGCACTCTGGGGGCACTGCCACCGCAAGGTGTGAGGAAGGTGGG GATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGG AGGTCACAGAGGGCTGCTACCCGGCGACGGGACGCCAATCCCCAAACCCTCCCTCA GTACGGACTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGC ATCAGCCACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCC ATGAAAGCCGGCGGTGCCTGAAGTGCGTAACCGCAAGGGGCGCCCTAGGGTAAAGC CGGTGATTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAAC AC (SEQ ID NO. 9)TTATTGGGTTTAAAGGGAGCGCAGACGGCATGTCAAGTCAGCTGTGAAAGTTCGGGG CTCAACCTTGGAATTGCAGTTGAAACTGGCGTGCTTGAGTTCGGTCGAGGCAGGCGG AATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACCCCGATTGCGAAGG CAGCTTGCCAGGCCTGGACTGACGTTGAGGCTCGAAGGTGCGGGTATCGAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCGCACGGTAAACGATGGATACTCGCTGTCGGCGATACAC GGTCGGCGGCCAAGCGAAAGCGTTAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACG GTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAA TTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAACTGTGCCTGACTGCCTCAGAG ATGGGGCTTCCAGCAATGGCAGGCATGGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG CCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCCTCCCGCCAGTTGCCAT CAGGTAAAGCTGGGCACTCTGGGGGCACTGCCACCGCAAGGTGTGAGGAAGGTGGG GATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGG AGGTCACAGAGGGCTGCTACCCGGCGACGGGACGCCAATCCCCAAACCCTCCCTCA GTACGGACTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGC ATCAGCCACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCC ATGAAAGCCGGCGGTGCCTGAAGTGCGTAACCGCAAGGGGCGCCCTAGGGTAAAGC CGGTGATTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAAC AC (SEQ ID NO. 9)
Bacteroides caecigallinarum CCM 9132Bacteroides caecigallinarum CCM 9132
ATTTTACAATGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCTACAGGCTTAAC ACATGCAAGTCGAGGGGCAGCGGGAAGGAAGCTTGCTGAAATTGCCGGCGACCGGC GCACGGGTGAGTAACGCGTATCCAACCTTCCGTTTACTCAGGGATAGCCTTTCGAAA GAAAGATTAATACCTGATAGTATGGTAAGATTGCATGATAGTACCATTAAAGATTCA TCGGTAAACGATGGGGATGCGTTCCATTAGGTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTA GCCTACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACAC GGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCGAGCC TGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGAAGGTTCTATGGATTGTAAACTTCTTTTAT AAGGGAATAAAGTGCTTTACGTGTAGAGTTTTGTATGTACCTTATGAATAAGCATCG GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCGAGCGTTATCCGGATTT ATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGACGGGATGTTAAGTCAGCTGTGAAAGTTTGGGGCT CAACCTTAAAATTGCAGTTGAAACTGGCGTTCTTGAGTGCGGTAGAGGCAGGCGGAA TTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCAATTGCGAAGGCA GCTTGCTGGAGCGTAACTGACGTTGATGCTCGAAAGTGTGGGTATCAAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACACGGTAAACGATGGATACTCGCTGTTGGCGATATACGGT CAGCGGCCAAGCGAAAGCATTAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTG AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTC GATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTATGCATGAATGATCTGGAGACA GATCAGCCGCAAGGCATGTATGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTG AGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTTCTGCCAGTTACTAACAGGC AATGCTGAGGACTCTGGCGGTACTGCCATCGTAAGATGTGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGGGGGTA CAGAAGGCAGCTTACCGGCGACGGTTGGCCAATCCCGAAAGCCCCTCTCAGTTCGGA CTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCC ACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAAAG CCGGGAGTACCTGAAGTGCGTAACCGCAAGGAGCGCCCTAGGGTAACACTGGTAAT TGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAACAC (SEQ ID NO. 10)ATTTTACAATGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCTACAGGCTTAAC ACATGCAAGTCGAGGGGCAGCGGGAAGGAAGCTTGCTGAAATTGCCGGCGACCGGC GCACGGGTGAGTAACGCGTATCCAACCTTCCGTTTACTCAGGGATAGCCTTTCGAAA GAAAGATTAATACCTGATAGTATGGTAAGATTGCATGATAGTACCATTAAAGATTCA TCGGTAAACGATGGGGATGCGTTCCATTAGGTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTA GCCTACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACAC GGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCGAGCC TGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGAAGGTTCTATGGATTGTAAACTTCTTTTAT AAGGGAATAAAGTGCTTTACGTGTAGAGTTTTGTATGTACCTTATGAATAAGCATCG GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCGAGCGTTATCCGGATTT ATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGACGGGATGTTAAGTCAGCTGTGAAAGTTTGGGGCT CAACCTTAAAATTGCAGTTGAAACTGGCGTTCTTGAGTGCGGTAGAGGCAGGCGGAA TTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCAATTGCGAAGGCA GCTTGCTGGAGCGTAACTGACGTTGATGCTCGAAAGTGTGGGTATCAAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACACGGTAAACGATGGATACTCGCTGTTGGCGATATACGGT CAGCGGCCAAGCGAAAGCATTAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTG AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTC GATGATACGCGAGGAACCT TACCCGGGCTTAAATTATGCATGAATGATCTGGAGACA GATCAGCCGCAAGGCATGTATGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTG AGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTTCTGCCAGTTACTAACAGGC AATGCTGAGGACTCTGGCGGTACTGCCATCGTAAGATGTGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGGGGGTA CAGAAGGCAGCTTACCGGCGACGGTTGGCCAATCCCGAAAGCCCCTCTCAGTTCGGA CTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCC ACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAAAG CCGGGAGTACCTGAAGTGCGTAACCGCAAGGAGCGCCCTAGGGTAACACTGGTAAT TGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAACAC (SEQ ID NO. 10)
Megasphaera sp. CCM 9129Megasphaera sp. CCM 9129
TATCATGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACAT GCAAGTCGAACGGGAGGACATGGGAAGCTTGCTTCCTATGGACTCTAGTGGCAAAC GGGTGAGTAACGCGTAAGCAACCTGCCCTCCGGATGGGGACAACAGCTGGAAACGGTATCATGGAGAGTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACAT GCAAGTCGAACGGGAGGACATGGGAAGCTTGCTTCCTATGGACTCTAGTGGCAAAC GGGTGAGTAACGCGTAAGCAACCTGCCCTCCGGATGGGGGACAAACAGCTGGAAACGG
-6CZ 309378 B6-6CZ 309378 B6
CTGCTAATACCGAATACGTTTCCACTGCCGCATGGCAGTGGGAAGAAAGGTGGCCTC TGAATATGCTACCGCCGGGGGAGGGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAA CGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGG AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTCCGCAAT GGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGAAGACGGCCTTCGGGTTGTAA AGCTCTGTTATACGGGACGAACGGCTAGTGTGCCAATACCACATTAGAATGACGGTA CCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG GCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGGTTTCATAAGTCT GTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACGGAAACTGTGAGACTGGAGT GTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAG GAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCTGAGGCGCGAAAG CCAGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGATA CTAGGTGTAGGGGGTATCGACCCCTCCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCG CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGCCTTGA CATTGAGTGCTATCCTCAGAGATGAGGAGTTCTTCTTCGGAAGACGCGAAAACAGGT GGTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG CGCAACCCCTATCTTCTGTTGCCAGCGCGTCATGGCGGGGACTCAGGAGAGACTGCC GCAGACAATGCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGGCT TGGGCTACACACGTACTACAATGGCTCTTAATAGAGGGAAGCGAAGGAGCGATCCG GAGCAAACCCCAAAAACAGAGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACCCGCCTGCA TGAAGCAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGG GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCATTCACACCCGAAGCCGGTGAG GTAACCTTACGGAGCCAGCCGTCGAAGGTGGGGGCGATGATTGGGGTGAAGTCGTA ACAAGGTAGCCGTATCG (SEQ ID NO. 11)CTGCTAATACCGAATACGTTTCCACTGCCGCATGGCAGTGGGAAGAAAGGTGGCCTC TGAATATGCTACCGCCGGGGGAGGGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAA CGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGG AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTCCGCAAT GGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGAAGACGGCCTTCGGGTTGTAA AGCTCTGTTATACGGGACGAACGGCTAGTGTGCCAATACCACATTAGAATGACGGTA CCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG GCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGGTTTCATAAGTCT GTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACGGAAACTGTGAGACTGGAGT GTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAG GAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCTGAGGCGCGAAAG CCAGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGATA CTAGGTGTAGGGGGTATCGACCCCTCCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCG CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGCCTTGA CATTGAGTGCTATCCTCAGAGATGAGGAGTTCTTCTTCGGAAGACGCGAAAACAGGT GGTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG CGCAACCCCTATCTTCTGTTGCC AGCGCGTCCATGGCGGGGACTCAGGAGAGACTGCC GCAGACAATGCGGAGGAAGGCGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGGCT TGGGCTCACACGTACTACAATGGCTCTAATAGAGGGAAGCGAAAGGAGCGATCCG GAGCAAACCCCAAAACAGAGGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACCCGCCTGCA TGAAGCAGGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGG GCCTTGTACACACCCGCGTCACACCACGAAGTCATTCACCCCGAAGCCGGTGAGGAAGGTGAACCGGTGAAGGGGTGAAGGGGTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG. 11)
Mediterranea sp. CCM 9130Mediterranea sp. CCM 9130
ACTTTTACAATGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCTACAGGCTTAA CACATGCAAGTCGAGGGGCAGCGGGATTGTAGCAATACAATTGCCGGCGACCGGCG CACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTTCCGGTTACTCGGGGATAGCCTTTCGAAAG AAAGATTAATACCCGATAGTATAAGATTTCCGCATGGTTTTCTTATTAAAGATTCATC GGTAACCGATGGGGATGCGTTCCATTAGATAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTAGT CGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGG TCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTG AACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAC GGGAATAACATCATCCACGTGTGGGTGTCTGCATGTACCGTATGAATAAGCATCGGC TAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCGAGCGTTATCCGGATTTAT TGGGTTTAAAGGGAGCGTAGACGGGTCCTTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTCA ACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGGGGACCTTGAGTGCGGCAGAGGCAGGCGGAAT TCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTGCGAAGGCAG CTTGCTGGACCGTAACTGACGTTGATGCTCGAAAGTGCGGGTATCAAACAGGATTAG ATACCCTGGTAGTCCGCACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTGGCGATATACTGCC AGCGGCCAAGCGAAAGCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGA AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCG ATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAACTGCAGCGGAATGGCGTGGAAACA TGTCAGCGAGCAATCGCCGCTGTGGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCG TGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTACCGATAGTTGCCATCAG GTAACGCTGGGGACTCTATCGGGACTGCCGTCGTAAGATGTGAGGAAGGTGGGGAT GACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGGGGG TACAGCAGGCCGCTACCGGGCGACCGGATGCCAATCCCTAAAACCCCTCTCAGTTCG GACTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAG CCACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAA AGCCGGGGGTACCTGAAGTGCGTAACCGCAAGGAGCGCCCTAGGGTAAAACTGGTGACTTTTACAATGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCTACAGGCTTAA CACATGCAAGTCGAGGGGCAGCGGGATTGTAGCAATACAATTGCCGGCGACCGGCG CACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTTCCGGTTACTCGGGGATAGCCTTTCGAAAG AAAGATTAATACCCGATAGTATAAGATTTCCGCATGGTTTTCTTATTAAAGATTCATC GGTAACCGATGGGGATGCGTTCCATTAGATAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTAGT CGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGG TCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTG AACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAC GGGAATAACATCATCCACGTGTGGGTGTCTGCATGTACCGTATGAATAAGCATCGGC TAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCGAGCGTTATCCGGATTTAT TGGGTTTAAAGGGAGCGTAGACGGGTCCTTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTCA ACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGGGGACCTTGAGTGCGGCAGAGGCAGGCGGAAT TCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTGCGAAGGCAG CTTGCTGGACCGTAACTGACGTTGATGCTCGAAAGTGCGGGTATCAAACAGGATTAG ATACCCTGGTAGTCCGCACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTGGCGATATACTGCC AGCGGCCAAGCGAAAGCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGA AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCG ATGATACGCGAGGAACCTT ACCCGGGCTTGAACTGCAGCGGAATGGCGTGGAAACA TGTCAGCGAGCAATCGCCGCTGTGGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCG TGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTACCGATAGTTGCCATCAG GTAACGCTGGGGACTCTATCGGGACTGCCGTCGTAAGATGTGAGGAAGGTGGGGAT GACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGGGGG TACAGCAGGCCGCTACCGGGCGACCGGATGCCAATCCCTAAAACCCCTCTCAGTTCG GACTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAG CCACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAA AGCCGGGGGTACCTGAAGTGCGTAACCGCAAGGAGCGCCCTAGGGTAAAACTGGTG
-7 CZ 309378 B6-7 CZ 309378 B6
ATTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAACACCTC CTTTCT (SEQ ID NO. 12)ATTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAACACCTC CTTTCT (SEQ ID NO. 12)
Příklad 2: Příprava probiotické směsiExample 2: Preparation of a probiotic mixture
Jednotlivé čisté kultury výše uvedených izolátů se skladují vBHI médiu s 10% glycerolem při -70 °C. Při pomnožení se jednotlivé kultury vysejí na WCHA agar a kultivují se 36 hodin při 37 °C v anaerobní atmosféře. Poté se jednotlivé kultury samostatně resuspendují v 5 ml BHI média s 10% glycerolem do ODeoonm = 1, což odpovídá 1 x 109 CFU/ml. Následně se pětimililitrové objemy smíchají a rozplní do jednomililitrových master inokulí. V případě přípravy probiotické směsi se 1 ml master inokula použije k zaočkování tří litrů kultivační půdy a inkubuje se anaerobně v médiu bez živočišných proteinů (Pepton ze sójových bobů (enzymatický digestát), kyselý hydrolyzát sójového proteinu, kvasnicový extrakt) při 37 °C po dobu 24 hodin. Výsledná koncentrace směsného fermentátu dosahuje hodnot 1 x 109 CFU/ml. Vzhledem k procentuálnímu zastoupení jednotlivých baktérií (tab. 1) se jejich počty pohybovaly v rozmezí od 3,2 x 107 CFU/ml pro Bacteroides caecigallinarum až do 4,9 x 108 CFU/ml pro Bacteroides caecicola.Individual pure cultures of the above isolates are stored in BHI medium with 10% glycerol at -70°C. When multiplying, individual cultures are sown on WCHA agar and cultured for 36 hours at 37°C in an anaerobic atmosphere. The individual cultures are then individually resuspended in 5 ml of BHI medium with 10% glycerol to ODeoonm = 1, which corresponds to 1 x 10 9 CFU/ml. Subsequently, the five-milliliter volumes are mixed and diluted into one-milliliter master inocula. In the case of the preparation of a probiotic mixture, 1 ml of the master inoculum is used to inoculate three liters of culture medium and incubated anaerobically in a medium without animal proteins (Soybean peptone (enzymatic digest), acid hydrolyzate of soy protein, yeast extract) at 37 °C for 24 hours. The resulting concentration of the mixed fermentate reaches values of 1 x 10 9 CFU/ml. Considering the percentage representation of individual bacteria (table 1), their numbers ranged from 3.2 x 10 7 CFU/ml for Bacteroides caecigallinarum to 4.9 x 10 8 CFU/ml for Bacteroides caecicola.
Tabulka 1. Procentuální zastoupení baktérií probiotické směsi po společné fermentaci. Pro průmyslovou fermentaci je důležité, aby baktérie ve směsi měly podobnou růstovou rychlost. Kombinace 4 vybraných baktérií tuto podmínku splnila. Baktérie byly ve směsi zamrazeny jako master seed při -70 °C. Jednotlivá master inokula byla použita pro zaočkování živného média a po 24 hodinové fermentaci byly stanoveny poměry jednotlivých baktérií pomocí kvantitativní real time PCR. Vybrané baktérie rostou podobnou rychlostí a lze je s výhodou kultivovat současně.Table 1. Percentage representation of bacteria of the probiotic mixture after co-fermentation. For industrial fermentation, it is important that the bacteria in the mixture have a similar growth rate. The combination of 4 selected bacteria fulfilled this condition. The bacteria were frozen in the mixture as master seed at -70°C. Individual master inoculums were used to inoculate the nutrient medium, and after 24 hours of fermentation, the ratios of individual bacteria were determined using quantitative real time PCR. The selected bacteria grow at a similar rate and can advantageously be cultured simultaneously.
Příklad 3: Schopnost baktérií z probiotické směsi dlouhodobě kolonizovat slepé střevo drůbeže po jednorázové orální aplikaciExample 3: Ability of bacteria from a probiotic mixture to long-term colonize the cecum of poultry after a single oral application
Kuřata masné nebo nosné linie se první den života orálně inokulovala v 0,1 ml probiotické směsi, která obsahovala minimálně 107 CFU/ml každé ze čtyř baktérií a týden po osídlení se stanovilo zastoupení probiotických kultur ve slepém střevě kuřat sekvenováním V3 a V4 variabilní oblasti genu pro 16S rRNA (Vídenská et al., Succession and replacement of bacterial populations in the caecum of egg laying hens over their whole life. PLoS One 2014;9:el 15142). (Tab. 2). V opakovaném pokusu se kuřata nosné linie utratila ve věku 8, 12, 22 a 29 dní (Tab. 3) a bylo stanoveno složení bakteriální mikroflóry sekvenováním V3 a V4 variabilní oblasti genu pro 16S rRNA.Broiler or carrier chickens were orally inoculated on the first day of life with 0.1 ml of a probiotic mixture that contained a minimum of 10 7 CFU/ml of each of the four bacteria, and one week after settlement the presence of probiotic cultures in the caecum of chickens was determined by sequencing the V3 and V4 variable regions gene for 16S rRNA (Vídenská et al., Succession and replacement of bacterial populations in the caecum of egg laying hens over their whole life. PLoS One 2014;9:el 15142). (Table 2). In a repeated experiment, chickens of the carrier line were killed at the age of 8, 12, 22 and 29 days (Tab. 3) and the composition of the bacterial microflora was determined by sequencing the V3 and V4 variable region of the 16S rRNA gene.
Tabulka 2. Procentuální zastoupení baktérií probiotické směsi po osídlení jednodenních kuřat masného nebo nosného typu. Aby vytipovaná probiotická směs chránila drůbež univerzálně, ověřili jsme kolonizační schopnosti u dvou odlišných linií, u masné linie Ross a nosné linie ISA Brown. Jednodenní kuřata masné a nosné linie byla orálně osídlena probiotickou směsí a jejich přítomnost ve slepém střevě byla stanovena o týden později. Probiotická směs úspěšně osídlovala obě geneticky krajně odlišné linie.Table 2. Percentage representation of bacteria of the probiotic mixture after settlement of one-day-old chickens of meat or laying type. In order for the selected probiotic mixture to protect poultry universally, we verified the colonization abilities of two different lines, the meat line Ross and the carrier line ISA Brown. One-day-old broiler and carrier chickens were orally colonized with a probiotic mixture and their presence in the caecum was determined one week later. The probiotic mixture successfully colonized both genetically extremely different lines.
-8CZ 309378 B6-8CZ 309378 B6
Tabulka 3. Procentuální zastoupení jednotlivých baktérií z probiotické směsi ve slepém střevě kuřat. Probiotická směs byla podána kuřatům linie ISA Brown první den života a procentuální zastoupení jednotlivých baktérií z probiotické směsi na celkové mikroflóře slepého střeva bylo stanoveno sekvenováním části genu pro 16S rRNA 8., 12., 22. a 29. den života.Table 3. Percentage representation of individual bacteria from the probiotic mixture in the caecum of chickens. The probiotic mixture was administered to chickens of the ISA Brown line on the first day of life, and the percentage representation of individual bacteria from the probiotic mixture on the total caecal microflora was determined by sequencing part of the 16S rRNA gene on the 8th, 12th, 22nd and 29th days of life.
Kontrolní kuřata Osídlená kuřataControl chickens Settled chickens
Příklad 4: Průkaz nepatogenní povahy baktérií v probiotické směsiExample 4: Demonstration of the non-pathogenic nature of the bacteria in the probiotic mixture
Pět kuřat bylo první den života osídleno probiotickou směsí. Dalších pět neosídlených kuřat bylo použito jako negativní kontrola. Po sedmi dnech byla kuřata utracena a byly odebrány vzorky tkáně slepého střeva, ze kterých byla izolovaná RNA s využitím RNeasy Mini kitu podle instrukcí výrobce (Qiagen). Ta byla přepsána do cDNA s využitím oligo(dT) primerů. Získaná cDNA byla využita pro kvantifikaci exprese genu pro matrix metalloproteinase 7 (MMP7) a avidin (AVD) pomocí SybrGreen real time PCR, jejichž zvýšená exprese by indikovala nežádoucí zánětlivou odpověď kuřat na podávaná probiotika. Exprese těchto genů byla normalizována na průměrnou expresi genů GAPDH, UB a TBP (jak je popsáno např. v PV 2015-753 nebo v publikaci Varmuzova et al., Immune protection of chickens conferred by a vaccine consisting of attenuated strains of Salmonella Enteritidis, Typhimurium and Infantis. Vet Res 2016;47:94). Mezi kontrolní a osídlenou skupinou nebyl zaznamenán signifikantní rozdíl v expresi AVD nebo MMP7. Osídlení slepého střeva vysokými počty baktérií z probiotické směsi proto nevyvolává zánět ve střevě a nemá negativní vliv na funkci střevního traktu (tab. 4). Probiotická směs tedy prokazatelně nevyvolávala negativní zánětlivou reakci a sestává se ze skutečně nepatogenních, komensálních baktérií.Five chickens were populated with a probiotic mixture on the first day of life. Another five unpopulated chicks were used as a negative control. After seven days, chickens were sacrificed and cecal tissue samples were collected from which RNA was isolated using the RNeasy Mini kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen). This was transcribed into cDNA using oligo(dT) primers. The obtained cDNA was used to quantify the expression of the gene for matrix metalloproteinase 7 (MMP7) and avidin (AVD) using SybrGreen real time PCR, the increased expression of which would indicate an undesirable inflammatory response of the chickens to the administered probiotics. The expression of these genes was normalized to the average expression of the GAPDH, UB and TBP genes (as described e.g. in PV 2015-753 or in the publication of Varmuzova et al., Immune protection of chickens conferred by a vaccine consisting of attenuated strains of Salmonella Enteritidis, Typhimurium and Infantis.Vet Res 2016;47:94). No significant difference in AVD or MMP7 expression was noted between the control and populated groups. Colonization of the cecum with high numbers of bacteria from the probiotic mixture therefore does not cause inflammation in the intestine and does not have a negative effect on the function of the intestinal tract (Table 4). Thus, the probiotic mixture was proven not to cause a negative inflammatory reaction and consists of truly non-pathogenic, commensal bacteria.
Tabulka 4. Exprese znaků zánětu (AVD - avidin a MMP7 - matrix metalloproteinase 7) ve slepém střevě kontrolních kuřat a kuřat osídlených probiotickou směsí. Tabulka ukazuje průměrnou expresi AVD a MMP7 ve slepém střevě pěti osmidenních kuřat z kontrolní a pěti osmidenních kuřat z experimentální skupiny po osídlení probiotickou směsí první den života. Osídlení slepého střeva probiotickou směsí nevyvolalo zánětlivou reakci.Table 4. Expression of signs of inflammation (AVD - avidin and MMP7 - matrix metalloproteinase 7) in the caecum of control chickens and chickens populated with a probiotic mixture. The table shows the average expression of AVD and MMP7 in the cecum of five eight-day-old chickens from the control and five eight-day-old chickens from the experimental group after colonization with the probiotic mixture on the first day of life. Colonization of the cecum with a probiotic mixture did not induce an inflammatory reaction.
Kontrola ProbiotikaProbiotic control
Příklad 5: Schopnost probiotické směsi zvyšovat odolnost kuřat před experimentální infekcí Salmonella EnteritidisExample 5: The ability of a probiotic mixture to increase the resistance of chickens to experimental infection with Salmonella Enteritidis
-9CZ 309378 B6-9CZ 309378 B6
Probiotická směs byla orálně podána jednodenním kuřatům linie ISA Brown. O týden později, tedy ve věku 8 dní, bylo patnáct kontrolních kuřat neosídlených probiotickou směsí a 15 kuřat osídlených probiotickou směsí orálně čelenžováno divokým kmenem Salmonella Enteritidis (107 CFU v 0,1 ml). K dalším dvěma kontrolním, resp. osídleným, skupinám sestávajícím se z 15 kuřat bylo přidáno jedno řádně označené kuře, které bylo orálně infikováno Salmonella Enteritidis (infekce s využitím seeder bird). Kuřata byla utrácena 4, 14 a 21 dní po čelenži, přičemž ve skupinách se seeder bird zůstalo toto kuře ve skupině po celou dobu experimentu a bylo utraceno až 21. den po infekci. Počty salmonel byly stanoveny jak kultivačně po desítkovém ředění obsahu slepých střev a výsevu na XLD agar, tak i pomocí Salmonella-speciňcké kvantitativní real-time PCR. Osídlení kuřat probiotickou směsí snižovalo počty salmonel ve slepém střevě jak po orální čelenži, tak i ve skupině kuřat infikovaných kontaktem (seeder bird) (obr. 2).The probiotic mixture was orally administered to day-old chicks of the ISA Brown line. One week later, at the age of 8 days, fifteen control chickens not colonized with the probiotic mixture and 15 chickens colonized with the probiotic mixture were orally challenged with a wild strain of Salmonella Enteritidis (10 7 CFU in 0.1 ml). For the next two control or stocked, groups consisting of 15 chickens were added with one properly marked chicken that was orally infected with Salmonella Enteritidis (seeder bird infection). Chickens were sacrificed at 4, 14 and 21 days post-challenge, whereas in the seeder bird groups, this chicken remained in the group for the duration of the experiment and was not sacrificed until day 21 post-infection. Salmonella numbers were determined both by culture after ten-fold dilution of cecal contents and seeding on XLD agar, as well as by means of Salmonella-specific quantitative real-time PCR. Colonization of chickens with a probiotic mixture reduced the numbers of Salmonella in the cecum both after oral challenge and in the group of chickens infected by contact (seeder bird) (Fig. 2).
Příklad 6: Snížení zastoupení E. co li v mikroflóře slepého střevaExample 6: Reducing the representation of E. co li in the caecal microflora
Jednodenní kuřata linie ISA Brown byla první den života orálně inokulována 0,1 ml probiotické směsi, která obsahovala 107 CFU každé ze čtyř baktérií. Kuřata byla utracena ve věku 8, 12, 22 a 29 dní a bylo stanoveno složení bakteriální mikroflóry ve slepém střevě sekvenováním V3 a V4 variabilní oblasti genu pro 16S rRNA (Vídenská et al., Succession and replacement of bacterial populations in the caecum of egg laying hens over their whole life. PUoS One 2014;9:ell5142). S využitím znalosti sekvence genů pro 16S rRNA jsme byli schopni stanovit zastoupení E. coli ve vyšetřených vzorcích. Zatímco u kontrolních kuřat ve věku 8 a 12 dní tvořila E. coli 35 a 65 % z celkové mikroflóry, u kuřat osídlených probiotickou směsí tvořila E. coli pouze 1 až 2 % z celkové mikroflóry (obr. 3). Aplikace probiotické směsi tedy snižovala procentuální zastoupení E. coli zejména v prvních dvou týdnech života. Stejně jako u E. coli, probiotická směs snižovala zastoupení Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens nebo Clostridium difficile ve střevní mikroflóře ošetřených kuřat.Day-old chickens of the ISA Brown line were orally inoculated on the first day of life with 0.1 ml of a probiotic mixture containing 10 7 CFU of each of the four bacteria. The chickens were sacrificed at the age of 8, 12, 22 and 29 days and the composition of the bacterial microflora in the caecum was determined by sequencing the V3 and V4 variable region of the 16S rRNA gene (Vídenská et al., Succession and replacement of bacterial populations in the caecum of egg laying hens over their whole life. PUoS One 2014;9:ell5142). Using knowledge of the 16S rRNA gene sequence, we were able to determine the presence of E. coli in the examined samples. While in control chickens at the age of 8 and 12 days, E. coli constituted 35 and 65% of the total microflora, in chickens populated with the probiotic mixture, E. coli constituted only 1 to 2% of the total microflora (Fig. 3). The application of the probiotic mixture therefore reduced the percentage of E. coli, especially in the first two weeks of life. As with E. coli, the probiotic mixture reduced the representation of Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens or Clostridium difficile in the intestinal microflora of treated chickens.
Příklad 7: Snížení úhynů v komerčních hejnech po orálním podání probiotické směsi kuřatům po naskladnění na farmuExample 7: Reduction of mortality in commercial flocks after oral administration of a probiotic mixture to chickens after stocking on the farm
Kuřatům masné linie ve věku jednoho dne byla bezprostředně po naskladnění podána probiotická směs pitnou vodou anebo jako příměs do krmivá. Jedno hejno se sestávalo z 18 000 kuřat a kuřata v kontrolních hejnech byla v prvních třech dnech života ošetřena antibiotiky, anebo zůstala bez jakéhokoliv ošetření. Administrace probiotické směsi po naskladnění kuřat vedla ke snížení úhynů ve srovnání se zcela neošetřenými hejny, ale nevedla k dosažení úrovně úhynů jako v hejnech ošetřených antibiotiky (obr. 4).Broiler chickens at the age of one day were given a probiotic mixture in drinking water or as an additive to feed immediately after storage. One flock consisted of 18,000 chickens, and chickens in control flocks were treated with antibiotics for the first three days of life or were left without any treatment. Administration of the probiotic mixture after the chicks were stocked resulted in a reduction in mortality compared to completely untreated flocks, but did not reach the levels of mortality seen in antibiotic-treated flocks (Fig. 4).
Příklad 8: Snížení úhynů v komerčních hejnech po sprejové aplikaci probiotické směsi kuřatům v dolíhni před naskladněním na farmuExample 8: Reduction of mortality in commercial flocks after spray application of a probiotic mixture to broiler chickens before stocking to the farm
Kuřata masné linie byla v dolíhni, tedy ve věku nižším než 24 hodin života, ošetřena sprej ováním probiotickou směsí. Kontrolní kuřata nebyla v dolíhni ošetřena a po naskladnění na farmu jim byla v prvních třech dnech života podána antibiotika pitnou vodou. Jedno hejno se sestávalo z 42 000 kuřat. Administrace probiotické směsi sprejováním v dolíhni vedla ke snížení úhynů na úroveň srovnatelnou s úhyny v hejnu ošetřeném antibiotiky (obr. 5). Podání sprejováním v dolíhni vede k časnějšímu a homogennějšímu osídlení všech kuřat v hejnu a je preferovaným způsobem podání probiotické směsi.Chickens of the meat line were treated by spraying with a probiotic mixture at the age of less than 24 hours of life. Control chickens were not treated in the hatchery and were given antibiotics in the drinking water for the first three days of life after being stocked on the farm. One flock consisted of 42,000 chickens. Administration of the probiotic mixture by spraying in the litter led to a reduction in mortality to a level comparable to mortality in the antibiotic-treated flock (Fig. 5). Administration by spraying in the brooder leads to earlier and more homogeneous settlement of all chickens in the flock and is the preferred method of administration of the probiotic mixture.
ZávěryConclusions
Probiotická směs účinně osídluje slepé střevo kuřat od prvního dne života a po jednorázové administraci přetrvává ve slepém střevě minimálně do 29. dne života, což je téměř délka života u masných typů drůbeže ve výkrmu (porážka se obvykle provádí mezi 32. až 35. dnem života). Probiotická směs nemá žádné negativní účinky, po jejím podání nebyly zaznamenány žádné úhyny a nedošlo ani ke stimulaci zánětu ve slepém střevě. Probiotická směs naopak chrání kuřata předThe probiotic mixture effectively colonizes the caecum of chickens from the first day of life and after a single administration remains in the caecum until at least the 29th day of life, which is almost the life span of meat-type poultry in fattening (slaughter is usually carried out between the 32nd and 35th day of life ). The probiotic mixture has no negative effects, no deaths were recorded after its administration and there was no stimulation of inflammation in the appendix. The probiotic mixture, on the other hand, protects the chickens from
-10 CZ 309378 B6 infekcí baktérií Salmonella Enterítídís a snižuje počty E. coli, Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens nebo Clostridium difficile ve střevní mikroflóře. Proto se dá s výhodou použít jako probiotický preparát u kuřat.-10 CZ 309378 B6 infection with Salmonella Enteritis bacteria and reduces the numbers of E. coli, Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens or Clostridium difficile in the intestinal microflora. Therefore, it can be advantageously used as a probiotic preparation for chickens.
Claims (10)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021199A CZ309378B6 (en) | 2021-04-20 | 2021-04-20 | Probiotic preparation for poultry and its use |
| PCT/CZ2022/050031 WO2022223063A1 (en) | 2021-04-20 | 2022-03-22 | Probiotic product and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021199A CZ309378B6 (en) | 2021-04-20 | 2021-04-20 | Probiotic preparation for poultry and its use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2021199A3 CZ2021199A3 (en) | 2022-10-19 |
| CZ309378B6 true CZ309378B6 (en) | 2022-10-19 |
Family
ID=83601208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2021199A CZ309378B6 (en) | 2021-04-20 | 2021-04-20 | Probiotic preparation for poultry and its use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309378B6 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103750027A (en) * | 2013-12-30 | 2014-04-30 | 何贻峰 | Chicken feed |
| CN104711210A (en) * | 2015-02-12 | 2015-06-17 | 青岛九和宜生生物科技有限公司 | Probiotics for improving slaughter performance and growing performance of chickens and application method of probiotics |
| CZ308101B6 (en) * | 2018-09-11 | 2020-01-02 | Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i. | Probiotic strain Bacteroides dorei CAPM 6631 for use in improving the physiological properties of the gastrointestinal tract of poultry Gallus gallus |
-
2021
- 2021-04-20 CZ CZ2021199A patent/CZ309378B6/en unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103750027A (en) * | 2013-12-30 | 2014-04-30 | 何贻峰 | Chicken feed |
| CN104711210A (en) * | 2015-02-12 | 2015-06-17 | 青岛九和宜生生物科技有限公司 | Probiotics for improving slaughter performance and growing performance of chickens and application method of probiotics |
| CZ308101B6 (en) * | 2018-09-11 | 2020-01-02 | Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i. | Probiotic strain Bacteroides dorei CAPM 6631 for use in improving the physiological properties of the gastrointestinal tract of poultry Gallus gallus |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BELKACEM, Behira et al. Probiotic potential of thermotolerants Lactobacilli isolated from chicken gastrointestinal digestive and their use as poultry feed. World Applied Sciences Journal, 2009, Vol. 7, No. 8, p. 951-957, ISSN 1818-4952 * |
| HUSAIN Dirayah. R. et al. Evaluation of bacteria from Gallus domesticus as a potential probiotic in broiler chicks: effects on growth performance and feed conversion ratio, International Journal of Poultry Science. 2017, Vol. 16, p. 43–49, ISSN 1682-8356 * |
| KUBASOVÁ, Tereza et al. Gut anaerobes capable of chicken caecum colonisation. Microorganisms, 2019, Vol. 7, No. 12, ISSN 2076-2607 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2021199A3 (en) | 2022-10-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Prevention of Escherichia coli infection in broiler chickens with Lactobacillus plantarum B1 | |
| García-Hernández et al. | Isolation, characterization and evaluation of probiotic lactic acid bacteria for potential use in animal production | |
| Apata | Antibiotic resistance in poultry | |
| Sørum et al. | Resistance to antibiotics in the normal flora of animals | |
| Olnood et al. | Novel probiotics: Their effects on growth performance, gut development, microbial community and activity of broiler chickens | |
| Zhang et al. | Effects of Clostridium butyricum on growth performance, immune function, and cecal microflora in broiler chickens challenged with Escherichia coli K88 | |
| Cao et al. | Effects of a probiotic, Enterococcus faecium, on growth performance, intestinal morphology, immune response, and cecal microflora in broiler chickens challenged with Escherichia coli K88 | |
| Guo et al. | Effects of long-term Bacillus subtilis CGMCC 1.921 supplementation on performance, egg quality, and fecal and cecal microbiota of laying hens | |
| Smith | A review of avian probiotics | |
| Revolledo et al. | Prevention of Salmonella Typhimurium colonization and organ invasion by combination treatment in broiler chicks | |
| RU2665815C2 (en) | Probiotic and prebiotic compositions | |
| RU2741836C2 (en) | Probiotic and prebiotic compositions | |
| Rahimi et al. | Effect of direct-fed microbials on performance and Clostridium perfringens colonization of turkey poults | |
| Zhang et al. | Effect of a potential probiotics Lactococcus garvieae B301 on the growth performance, immune parameters and caecum microflora of broiler chickens | |
| Apata | The emergence of antibiotics resistance and utilization of probiotics for poultry production | |
| US5252329A (en) | Bacterial preparation for use in poultry | |
| US6010695A (en) | Saccharomyces boulardii treatment to diminish campylobacter and salmonella in poultry | |
| Suganuma et al. | Effect of dietary direct-fed microbial and yeast cell walls on cecal digesta microbiota of layer chicks inoculated with nalidixic acid resistant Salmonella Enteritidis | |
| CN115666604A (en) | Methods of treating or preventing infections | |
| CZ309378B6 (en) | Probiotic preparation for poultry and its use | |
| CZ35185U1 (en) | Probiotic preparation for poultry | |
| Carvalho et al. | Defined and undefined commercial probiotics cultures in the prevention of Salmonella Enteritidis in broilers | |
| WO2022223063A1 (en) | Probiotic product and use thereof | |
| Takahashi et al. | Quantitative real‐time PCR monitoring of Escherichia coli and Clostridium perfringens with oral administration of Lactobacillus plantarum strain Lq80 to weaning piglets | |
| CZ36678U1 (en) | Complex probiotic preparation from anaerobes of the digestive tract for poultry |