CZ309204B6

CZ309204B6 - Collagen composite for controlled release of active substances and preparing it

Info

Publication number: CZ309204B6
Application number: CZ202155A
Authority: CZ
Inventors: Tomáš Grus; Tomáš doc. MUDr Grus; Tomáš Suchý; Tomáš Ing Suchý; Monika Šupová; Monika Ing Šupová; Hynek CHLUP; Hynek Ing Chlup; Jan Hartinger; Jan PharmDr. Hartinger
Original assignee: Všeobecná fakultní nemocnice v Praze; Ústav Struktury A Mechaniky Hornin Av Čr, V.V.I.; České vysoké učení technické v Praze
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2022-05-18
Also published as: CZ202155A3

Abstract

The invention relates to a collagen composite which comprises at least one layer of highly porous collagen foam and at least one layer of collagen nanofibres which is capable of controlled local release of active substances. Furthermore, the solution is a method of preparing the collagen composite.

Description

Kolagenní kompozit pro řízené uvolňování aktivních látek a způsob jeho přípravyCollagen composite for controlled release of active substances and method of its preparation

Oblast technikyField of technology

Předmětem vynálezu je kolagenní kompozit, v němž se střídá alespoň jedna vrstva vysoce porézní, degradovatelné kolagenní pěny s hemostatickými účinky s alespoň jednou vrstvou kolagenních vláken, a který je schopen řízeného lokálního uvolňování aktivních látek, například antibiotik, pro použití formou krytí ran v chirurgii, ortopedii, traumatologii a plastické chirurgii. Předmětem vynálezu je i způsob přípravy kolagenního kompozitu.The present invention relates to a collagen composite in which at least one layer of highly porous, degradable collagen foam with hemostatic effects alternates with at least one layer of collagen fibers and which is capable of controlled local release of active substances, e.g. antibiotics, for use in wound dressings. orthopedics, traumatology and plastic surgery. The invention also relates to a process for the preparation of a collagen composite.

Dosavadní stav technikyState of the art

Krvácení na větších plochách při chirurgických zákrocích je poměrně častým a velmi závažným problémem a v krajních případech může znamenat i ohrožení života pacienta. Dalším závažným problémem je proniknutí infekce do organismu. Při postoperační administraci antibiotik nastává problém systémového zatížení organismu, často nedostatečného průniku do operační rány a v určitých případech může dojít i k systémové toxicitě.Bleeding on larger areas during surgery is a relatively common and very serious problem and in extreme cases can be a threat to the patient's life. Another serious problem is the penetration of the infection into the body. During postoperative administration of antibiotics, there is a problem of systemic load on the body, often insufficient penetration into the surgical wound and in some cases systemic toxicity can occur.

Jedním z řešení je použití lokálně antiseptického neadhezivního materiálu. Mimo podstatnou lokálně antiseptickou fúnkci může mít tento materiál současně také lokálně hemostatické a anestetické vlastnosti.One solution is to use a locally antiseptic non-adhesive material. In addition to substantial local antiseptic function, this material may also have local hemostatic and anesthetic properties at the same time.

Kolageny izolované z tkání velkých savců jako kráva, prase nebo kůň jsou hojně využívány v biomateriálovém inženýrství. Jejich nevýhodou jsou potenciální alergické reakce, kterými trpí 3 až 4 % populace. Řešení se nabízí v použití rybího kolagenu, který vykazuje excelentní biokompatibilitu. Izolace kolagenu z kůže ryb navíc nepředstavuje takové riziko přenosu různých chorob, jako v případě extrakce z vepřové nebo hovězí kůže (BSE, PrPSc). Rybí kolagen vykazuje nižší reprodukovatelnost, co se týče jeho strukturních vlastností, v porovnání s kolageny izolovanými z velkých savců. Tento nedostatek je možné odstranit jeho chemickým síťováním pomocí sloučenin na bázi karboimidů, které jsou v chemii kolagenu běžně používány. Podmínky síťování ovlivňují výslednou míru zesítění kolagenního materiálu, což má ve výsledku velký vliv na jeho nasákavost a degradační vlastnosti ve fýziologickém prostředí. Síťovaný kolagen dobře odolává ionizujícímu záření, což umožňuje jeho sterilizaci běžně užívanými dávkami 25 kGy. Pomocí lyofilizačního procesuje možné dále vytvořit trojrozměrný materiál s danou porozitou.Collagens isolated from the tissues of large mammals such as cow, pig or horse are widely used in biomaterial engineering. Their disadvantage is the potential allergic reactions that afflict 3 to 4% of the population. The solution is offered in the use of fish collagen, which shows excellent biocompatibility. In addition, the isolation of collagen from fish skin does not pose such a risk of transmitting various diseases as in the case of pig or bovine skin extraction (BSE, PrPSc). Fish collagen shows lower reproducibility in terms of its structural properties compared to collagens isolated from large mammals. This deficiency can be overcome by chemically crosslinking it with carboimide-based compounds commonly used in collagen chemistry. The crosslinking conditions affect the resulting degree of crosslinking of the collagen material, which in turn has a great influence on its absorbency and degradation properties in the physiological environment. Cross-linked collagen resists ionizing radiation well, which allows it to be sterilized with commonly used doses of 25 kGy. Using a lyophilization process, it is possible to further create a three-dimensional material with a given porosity.

Kolagenní materiál je možné připravit rovněž ve formě nanovlákenných vrstev pomocí elektrostatického zvlákňování. Jejich obrovskou výhodou je velký aktivní povrch, který dokáže efektivně navázat velká množství chemických agens a zároveň je pozitivním faktorem pro adhezi, proliferaci a růst buněk.The collagen material can also be prepared in the form of nanofiber layers by electrostatic spinning. Their huge advantage is the large active surface, which can effectively bind large amounts of chemical agents and is also a positive factor for cell adhesion, proliferation and growth.

Takto připravené materiály se obecně velmi osvědčily jako nosiče léčiv s řízenou elucí. Léčivo je možné do kolagenu inkorporovat přímo do roztoku před danými procesy zpracování nebo dodatečnou impregnací hotového materiálu pomocí rozpouštědla, které jednak nedegraduje strukturu kolagenu a zároveň je schopno rozpustit požadované léčivo. Dodatečná impregnace se osvědčila jako nejefektivnější způsob, jelikož nedochází k předčasnému uvolňování léčiva během zpracování kolagenního materiálu.The materials thus prepared have generally proved very useful as controlled elution drug carriers. The drug can be incorporated into the collagen directly into the solution before the given processing processes or by additional impregnation of the finished material with a solvent which, on the one hand, does not degrade the collagen structure and is able to dissolve the desired drug. Additional impregnation has proven to be the most effective method, as there is no premature drug release during collagen material processing.

Možnost zpracovávat kolagen do různých výsledných forem (vrstvy, pěny apod.), jeho snadná a ekonomická dostupnost (odpadní materiál v potravinářství) spolu s jeho biokompatibilními a zároveň hemokoagulačními vlastnostmi jej činí jako optimálního kandidáta pro využití v hemostatických pěnách pro krytí operačních a pooperačních ran.The ability to process collagen into various final forms (layers, foams, etc.), its easy and economical availability (waste material in the food industry) together with its biocompatible and hemocoagulating properties make it an optimal candidate for use in hemostatic foams to cover surgical and postoperative wounds. .

- 1 CZ 309204 B6- 1 CZ 309204 B6

Nejčastěji používaným antibiotikem v kolagenních lékových formách je gentamicin. V klinické praxi našly tyto přípravky využití především ve stomatologii, břišní chirurgii a traumatologii. V poslední době se objevují také klinické studie z oblasti kardiochirurgie, které potvrzují efektivitu tohoto přístupu v prevenci pooperačních infekcí. Existují rovněž studie zabývající se využitím kolagenní matrice s tetracyklinem a metronidazolem v dentální chirurgii. Za účelem terapie periodontitidy jsou používány kolagenní matrice uvolňující chlorhexidin v dutině ústní. V naprosté většině studií a klinicky používaných výrobků je základní matricí kolagen savčí (bovinní, nebo koňský). Vzácně je kromě savčího kolagenu za tímto účelem využíván i kolagen z mořských ryb - pouze pro aplikaci chlorhexidinu ve stomatologii. Dále jsou dostupná in vitro data a data ze zvířecích experimentů pro ciprofloxacin. Z uvedeného vyplývá, že rybí kolagen, a to kolagen z mořských, nikoli sladkovodních ryb, je klinicky využíván jako matrice pro uvolňování léčiv zcela okrajově pouze pro terapii periodontitidy chlorhexidinem. Není používán pro léčbu antibiotiky. Další zajímavou možností, která není v současné době dostupná, by bylo použití vankomycinu v kolagenové pěně. V klinické praxi je vankomycin používán převážně v lokální léčbě fraktur - byly použity vankomycinem impregnované korálky a kostní alografty v kombinaci s cementem obsahujícím aminoglykosidy při náhradě kyčelního kloubu. Vankomycinem impregnované kolagenní pěny studovány nebyly. Vzhledem k tomu, že vankomycin, stejně jako aminoglykosidy nedostatečně penetruje do tkání je systémová aplikace k terapii infekcí pooperačních ran problematická. Lokální aplikace s postupným uvolňováním by v případě tohoto antibiotika byla obzvláště vhodná, neboť na rozdíl od aminoglykosidů je jeho účinnost závislá nejenom na výši dosažených koncentrací, ale také na době, kdy koncentrace přesahuje MIC. Hodnota nejlépe korelující s klinickou odezvou při systémové terapii infekcí Staphylococcus aureus je AUC/MIC. Pokud by kolagenní lékové formy zajistily dlouhodobě adekvátní lokální koncentrace vankomycinu v ráně, bylo by možné tímto způsobem upustit od systémového použití dalších záložních antibiotik (ceftarolinu, linezolidu) a jejich šetření pro závažnější infekce.The most commonly used antibiotic in collagen dosage forms is gentamicin. In clinical practice, these products have found use primarily in dentistry, abdominal surgery and traumatology. Recently, clinical studies in the field of cardiac surgery have also appeared, which confirm the effectiveness of this approach in the prevention of postoperative infections. There are also studies on the use of collagen matrix with tetracycline and metronidazole in dental surgery. Collagen matrices releasing chlorhexidine in the oral cavity are used to treat periodontitis. In the vast majority of studies and clinically used products, the basic matrix is mammalian collagen (bovine or equine). In addition to mammalian collagen, marine fish collagen is rarely used for this purpose - only for the application of chlorhexidine in dentistry. In vitro and animal experiment data for ciprofloxacin are also available. It follows that fish collagen, namely collagen from marine and not freshwater fish, is used clinically as a drug release matrix only marginally for the treatment of periodontitis with chlorhexidine. It is not used to treat antibiotics. Another interesting option that is not currently available would be the use of vancomycin in collagen foam. In clinical practice, vancomycin is used mainly in the local treatment of fractures - vancomycin-impregnated beads and bone allografts have been used in combination with cement containing aminoglycosides to replace the hip joint. Vancomycin impregnated collagen foams have not been studied. Due to the fact that vancomycin, like aminoglycosides, insufficiently penetrates the tissues, systemic application for the treatment of postoperative wound infections is problematic. Topical release topical application would be particularly suitable for this antibiotic because, unlike aminoglycosides, its efficacy depends not only on the concentration achieved, but also on the time when the concentration exceeds the MIC. The value best correlated with clinical response in systemic therapy of Staphylococcus aureus infections is AUC / MIC. If collagen dosage forms ensured long-term adequate local concentrations of vancomycin in the wound, it would be possible in this way to abandon the systemic use of other backup antibiotics (ceftaroline, linezolid) and their investigation for more serious infections.

Lokální aplikace je vhodná především pro antibiotika s nízkou distribucí do tkání, čemuž odpovídají aminoglykosidy, vankoymcin a nitrofurantoin. Nově umisťujeme tyto látky do kolagenní matrice z kolagenu sladkovodních ryb, což je lehce dostupný materiál s nižší imunogenitou, než kolagen získávaný ze savců. Dosahujeme různé míry retardace podle povahy antibiotika, např. rychlé uvolnění a dosažení vysokých koncentrací u gentamicinu, nebo naopak pozvolné uvolňování vankomycinu - tyto charakteristiky odpovídají rozdílnému mechanizmu účinku antibiotik a rozdílným cílovým farmakokinetickým parametrům (koncentračně x časově závislá antibiotika).Topical application is especially suitable for antibiotics with low tissue distribution, which correspond to aminoglycosides, vancoymcin and nitrofurantoin. We are newly placing these substances in the collagen matrix of freshwater fish collagen, which is an easily available material with lower immunogenicity than collagen obtained from mammals. We achieve different levels of retardation depending on the nature of the antibiotic, eg rapid release and high concentrations of gentamicin, or slow release of vancomycin - these characteristics correspond to different mechanisms of antibiotics and different target pharmacokinetic parameters (concentration x time dependent antibiotics).

Mezi další nevýhody stávajících materiálů na bázi kolagenu je obtížná manipulace, protože tyto materiály ve styku s tělním prostředím ztrácejí soudržnost a při manipulaci mají tendenci se trhat a rozpadat.Other disadvantages of existing collagen-based materials are difficult to handle because these materials lose contact with the body and tend to tear and disintegrate when handled.

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Nevýhody hemostatických krycích materiálů na bázi kolagenu do značené míry překonává kolagenní kompozit, který obsahuje porézní kolagenní pěnu. Tento kolagenní kompozit obsahuje kolagen typu I, který je uspořádán do alespoň dvou vrstev, přičemž jednou vrstvou je vrstva vysoce porézní pěny a druhou vrstvou je nanovlákenná vrstva, přičemž vrstva vysoce porézní pěny má otevřenou porozitu v rozmezí 70 až 90 %, s výhodou 80 % až 90 %, a střední hodnotu velikosti pórů 50 až 200 pm, kde alespoň 50 % objemu pórů je tvořeno póry o velikosti nad 80 pm, a přičemž průměr vláken je v rozmezí 100 až 350 nm. Nanovlákenná vrstva má s výhodou tloušťku v rozmezí 0,2 až 0,5 mm. Ve výhodném provedení je kolagenní kompozit uspořádán do více než dvou vrstev, s výhodou do alespoň pěti vrstev, kde se pravidelně střídají vrstva vysoce porézní pěny s nanovlákennou vrstvou. Objemové množství všech nanovlákenných vrstev je v rozmezí 20 až 60 %. Kolagenní kompozit může dále obsahovat alespoň jednu aktivní látku, přičemž poměr kolagenu k celkovému množství aktivních látek v kolagenním kompozitu je 40 až 70 % hmota, kolagenu na 30 až 60 % hmota, aktivních látek. Aktivní látka je s výhodou vybrána ze skupinyThe disadvantages of collagen-based hemostatic covering materials are greatly overcome by the collagen composite, which contains a porous collagen foam. This collagen composite comprises type I collagen which is arranged in at least two layers, one layer being a highly porous foam layer and the other layer being a nanofiber layer, the highly porous foam layer having an open porosity in the range of 70 to 90%, preferably 80% to 90%, and a mean pore size of 50 to 200 μm, wherein at least 50% of the pore volume consists of pores larger than 80 μm, and wherein the fiber diameter is in the range of 100 to 350 nm. The nanofiber layer preferably has a thickness in the range of 0.2 to 0.5 mm. In a preferred embodiment, the collagen composite is arranged in more than two layers, preferably in at least five layers, where a layer of highly porous foam alternates regularly with a nanofiber layer. The volume of all nanofiber layers is in the range of 20 to 60%. The collagen composite may further comprise at least one active substance, wherein the ratio of collagen to total active substances in the collagen composite is 40 to 70% by weight, collagen to 30 to 60% by weight, of active substances. The active substance is preferably selected from the group

-2CZ 309204 B6 zahrnující antibiotikum, anestetikum, antiagregans, antivirotikum, nebo jejich směs, s výhodou je to antibiotikum nebo směs antibiotik, například vybrané ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin.Comprising an antibiotic, anesthetic, antiplatelet agent, antiviral agent, or a mixture thereof, preferably an antibiotic or a mixture of antibiotics, for example selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin.

Vysoce porézní pěnou je degradovatelná kolagenní pěna pro řízené uvolňování aktivních látek, která obsahuje kolagen typu I a má otevřenou porozitu v rozmezí 70 až 90 % a střední hodnotu velikosti pórů 50 až 200 pm, kde alespoň 50 % objemu pórů je tvořeno póry o velikosti nad 80 pm. S výhodou pochází kolagen z kůže sladkovodních ryb, kde jsou imunitní reakce výrazně menší než u kolagenu savčího původu, zejména z tkání velkých savců. Pěna může být dále impregnovaná alespoň jednou aktivní látkou, která se uspořádá do pórů pěny, přičemž poměr kolagenu k celkovému množství aktivních látek v kolagenní pěně je 40 až 70 % hmota, kolagenu na 30 až 60 % hmota, aktivních látek. Aktivní látka je s výhodou vybrána ze skupiny zahrnující antibiotikum, anestetikum, antiagregans, antivirotikum, nebo jejich směs, s výhodou antibiotikum, například vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich směs. Pěna má s výhodou tloušťku v rozmezí 0,5 až 5 cm, například 1 cm.Highly porous foam is a degradable collagen foam for controlled release of active substances, which contains type I collagen and has an open porosity in the range of 70 to 90% and a mean pore size of 50 to 200 μm, where at least 50% of the pore volume consists of pores larger than 80 pm. Preferably, the collagen is derived from the skin of freshwater fish, where the immune responses are significantly lower than that of collagen of mammalian origin, especially from the tissues of large mammals. The foam may be further impregnated with at least one active substance which is arranged in the pores of the foam, the ratio of collagen to total active substances in the collagen foam being 40 to 70% by weight, collagen to 30 to 60% by weight, of active substances. The active substance is preferably selected from the group consisting of antibiotic, anesthetic, antiplatelet agent, antiviral agent, or a mixture thereof, preferably an antibiotic, for example vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, or a mixture thereof. The foam preferably has a thickness in the range of 0.5 to 5 cm, for example 1 cm.

Dalším podstatným přínosem kompozitu je také skutečnost, že umožňuje deponovat do nanostrukturovaného a mikrostrukturovaného povrchu s velkým specifickým povrchem a dostatečnou otevřenou porozitou biologicky aktivní látky podle očekávaného rozsahu poranění nebo poškození před operací, ale také podle uvážení operatéra i během operace, a to impregnací kolagenní pěny např. do roztoku antibiotik. Zároveň resorbovatelný materiál umožňuje jeho postupné bezpečné vstřebávání do okolní tkáně, a tím i postupné účinné uvolňování v něm deponovaných biologicky aktivních látek. Zároveň se ale kompozit podle technického řešení oproti stavu techniky díky tomu, že se netrhá a nerozpadá, vyznačuje snazší manipulací a možností repozice.Another significant benefit of the composite is that it allows deposition in a nanostructured and microstructured surface with a large specific surface area and sufficient open porosity of the biologically active substance according to the expected extent of injury or damage before surgery, but also at the surgeon's discretion during surgery. eg into an antibiotic solution. At the same time, the resorbable material enables its gradual safe absorption into the surrounding tissue, and thus the gradual effective release of biologically active substances deposited in it. At the same time, however, the composite, according to the technical solution, is characterized by easier handling and the possibility of reduction due to the fact that it does not tear or disintegrate.

Kolagenem typu I je ve všech provedeních vynálezu s výhodou kolagen izolovaný z kůže sladkovodních ryb, například z kůže kapra obecného.In all embodiments of the invention, the type I collagen is preferably collagen isolated from the skin of freshwater fish, for example from carp skin.

Vysoce porézní pěna se vyznačuje řízeným rozpadem, řízenou porozitou a schopností řízeného uvolňování aktivních látek, zejména antibiotik. Tato kolagenová pěna má vysokou míru otevřené porozity 70 až 90 % obj., velikost pórů v rozmezí 50 až 200 pm a je navržená tak, aby vykazovala udržitelné lokální uvolňování aktivních látek, jejichž celkové množství je 30 až 60 % hmota. Řízeného uvolňování aktivních látek, například antibiotik, a řízeného rozpadu kolagenové pěny je dosaženo vytvářením optimálního množství příčných vazeb v molekule kolagenu při její přípravě, a to buď fyzikálně, např. ozařováním, nebo chemicky, s výhodou aplikací N-(3dimethylaminopropyl)-A-ethylkarbodiimid hydrochloridu (EDC) a A-hydroxysukcinimidu (NHS). Rozpad nezesíťované vysoce porézní pěny bez nebo s aktivními látkami, například s antibiotiky, lze předpokládat v řádu 2 až 7 dnů. Pěna síťovaná po dobu 2 hodin se rozpadne do 2 týdnů. Pěna síťovaná po dobu 3 hodin se rozpadne do 4 týdnů. Pěna síťovaná po dobu 4 hodin se rozpadne do 6 týdnů. Tyto údaje se týkají pěny, která vychází ze způsobu přípravy při použití 1 % hmota, disperze kolagenu. Při použití jiné výchozí koncentrace se mohou doby rozpadu lišit, ale odborník je zjistí rutinním experimentováním.Highly porous foam is characterized by controlled disintegration, controlled porosity and the ability to release active substances, especially antibiotics. This collagen foam has a high open porosity rate of 70 to 90% by volume, a pore size in the range of 50 to 200 μm and is designed to have a sustainable local release of active substances, the total amount of which is 30 to 60% by weight. Controlled release of active substances, such as antibiotics, and controlled disintegration of collagen foam is achieved by creating optimal amounts of cross-links in the collagen molecule during its preparation, either physically, eg by irradiation, or chemically, preferably by application of N- (3-dimethylaminopropyl) -A- ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The disintegration of non-crosslinked highly porous foam without or with active substances, for example with antibiotics, can be expected in the order of 2 to 7 days. The foam crosslinked for 2 hours disintegrates within 2 weeks. The foam crosslinked for 3 hours disintegrates within 4 weeks. The foam crosslinked for 4 hours disintegrates within 6 weeks. These data relate to the foam which is based on the method of preparation using a 1% by weight, collagen dispersion. When using a different starting concentration, the disintegration times may vary, but will be determined by one skilled in the art by routine experimentation.

Doba řízeného rozpadu, kterou lze vybrat na základě požadované doby aplikace pěny, následně ovlivňuje dobu řízeného uvolňování aktivních látek, například antibiotik (viz příklady 2 až 4). U pěny (při použití 1% hmota, disperze kolagenu při přípravě) zesíťované po dobu 2 hodin dochází k uvolňování antibiotik do deseti dnů. U pěny zesíťované po dobu 3 hodin dochází k uvolnění antibiotik do patnácti dnů. U pěny zesíťované po dobu 4 hodin dochází k uvolnění antibiotik do dvaceti dnů.The controlled disintegration time, which can be selected based on the desired foam application time, subsequently affects the controlled release time of active substances, such as antibiotics (see Examples 2 to 4). The foam (using 1% by weight, collagen dispersion in the preparation) crosslinked for 2 hours releases antibiotics within ten days. The foam crosslinked for 3 hours releases antibiotics within fifteen days. The foam crosslinked for 4 hours releases antibiotics within twenty days.

Při preventivním použití pěny s antibiotiky se s výhodou použije pěna s dobou rozpadu maximálně do dvou týdnů a s uvolňováním antibiotik maximálně do deseti dnů s výhodou čtyř dnů. V případech rizika vzniku zánětu, v potenciálně infekčním terénu (např. operace v třísle, v blízkosti genitálu, nebo laparoskopické odstranění žlučníku či slepého střeva) se s výhodou použije pěna sIn the preventive use of foam with antibiotics, a foam with a disintegration time of up to two weeks and with a release of antibiotics of up to ten days, preferably four days, is preferably used. In cases of risk of inflammation, in potentially infectious terrain (eg groin surgery, near the genitals, or laparoscopic removal of the gallbladder or appendix), foam with

-3 CZ 309204 B6 dobou rozpadu maximálně čtyři týdny a s uvolňováním antibiotik maximálně do patnácti dnů, s výhodou deseti dnů. V případech infekce způsobené přítomností protetického materiálu, kde je vysoké riziko infekce, se s výhodou použije pěna s dobou rozpadu maximálně do osmi týdnů s výhodou šesti týdnů a s dobou uvolňování antibiotik po dobu maximálně padesáti dnů s výhodou dvaceti dnů dle citlivosti na vykultivované infekční agens.-3 CZ 309204 B6 with a disintegration period of up to four weeks and with the release of antibiotics up to a maximum of fifteen days, preferably ten days. In cases of infection caused by the presence of prosthetic material, where there is a high risk of infection, a foam with a disintegration time of up to eight weeks, preferably six weeks and an antibiotic release time of up to fifty days, preferably twenty days according to susceptibility to cultured infectious agents is preferably used.

Požadované porozity je dosaženo jednak koncentrací disperze kolagenu, z níž se pěna připravuje, a jednak teplotou zamražení výsledné pěny před lyofilizací a následnou impregnací aktivní látkou. Čím koncentrovanější je disperze kolagenu, tím menší póry vznikají, a čím nižší je teplota zamražení, tím menší póry vznikají.The required porosity is achieved both by the concentration of the collagen dispersion from which the foam is prepared and by the freezing point of the resulting foam before lyophilization and subsequent impregnation with the active substance. The more concentrated the collagen dispersion, the smaller the pores, and the lower the freezing temperature, the smaller the pores.

Základním přínosem tohoto vynálezu je skutečnost, že použitý kolagen izolovaný z kůže sladkovodních ryb má hemostatické účinky a jeho aplikace není spojená s rizikem alergické reakce nebo jiné nežádoucí imunitní odezvy organizmu. Dalším podstatným přínosem tohoto vynálezu je skutečnost, že umožňuje deponovat do mikrostrukturovaného povrchu s velkým specifickým povrchem a dostatečnou otevřenou porozitou biologicky aktivní látky podle očekávaného rozsahu poranění nebo poškození před operací, ale také podle uvážení operatéra i během operace, a to impregnací kolagenní pěny, např. v roztoku antibiotik. Zároveň resorbovatelný materiál umožňuje jeho postupné bezpečné vstřebávání do okolní tkáně, a tím i postupné účinné uvolňování v něm deponovaných biologicky aktivních látek.The main benefit of the present invention is that the collagen used isolated from the skin of freshwater fish has hemostatic effects and its application is not associated with a risk of an allergic reaction or other adverse immune response. Another significant benefit of the present invention is that it allows the deposition of a biologically active substance in a microstructured surface with a large specific surface area and sufficient open porosity according to the expected extent of injury or damage before surgery, but also at the discretion of the surgeon. in antibiotic solution. At the same time, the resorbable material enables its gradual safe absorption into the surrounding tissue, and thus the gradual effective release of biologically active substances deposited in it.

Při přípravě samotné vysoce porézní kolagenové pěny se postupuje tak, že se odvážené množství kolagenu smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 0,1 až 3 % hmotn., s výhodou 0,5 až 1 % hmotn. kolagenu, kde se kolagen nechá nabobtnat při teplotě 5 až 15 °C po dobu 1 až 3 hodin. Výsledná disperze je po homogenizaci zamražena při -60 až -90 °C po dobu 3 až 8 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita kolagenové pěny je po lyofilizací s výhodou zvýšena chemickým síťováním pomocí EDC a NHS, načež se pěna opět zamrazí na -15 až -30 °C po dobu 5 až 7 hodin a lyofilizuje. Pro zajištění řízeného uvolňování aktivní látky do těla je posledním krokem přípravy impregnace pěny roztokem na bázi alkoholu obsahujícím odvážené množství aktivních látek, například antibiotik, která jsou s výhodou vybrána ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich kombinace tak, aby jejich výsledné množství v roztoku bylo 30 až 60 % hmotn. Impregnovaná pěna se poté může použít v této formě, nebo může být zamražena a lyofilizována. Alternativně může být impregnace vybranými aktivními látkami uskutečněna teprve před aplikací pěny, pro což se použije vodný roztok aktivních látek nebo se aktivní látky smísí s fýziologickým roztokem a pěna se aplikuje ihned, nebo až po odpaření kapalné fáze, tedy po dosažení konstantní hmotnosti pěny. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 40 až 70 % hmotn. a 30 až 60 % hmotn. aktivních látek.In the preparation of the highly porous collagen foam alone, the weighed amount of collagen is mixed with deionized water in a concentration of 0.1 to 3% by weight, preferably 0.5 to 1% by weight. collagen, where the collagen is allowed to swell at a temperature of 5 to 15 ° C for 1 to 3 hours. The resulting dispersion is frozen at -60 to -90 ° C for 3 to 8 hours after homogenization and lyophilized to constant weight. After lyophilization, the stability of the collagen foam is preferably increased by chemical crosslinking with EDC and NHS, after which the foam is re-frozen at -15 to -30 ° C for 5 to 7 hours and lyophilized. To ensure controlled release of the active substance into the body, the final step in preparing the foam is to impregnate an alcohol-based solution containing a weighed amount of active substances, e.g. antibiotics, which are preferably selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin the final amount in solution was 30 to 60% by weight. The impregnated foam can then be used in this form, or it can be frozen and lyophilized. Alternatively, the impregnation with the selected active substances can be carried out only before the application of the foam, for which an aqueous active substance solution is used or the active substances are mixed with saline and the foam is applied immediately or after the liquid phase has evaporated. In this way, a foam is obtained with a final amount of collagen of 40 to 70% by weight. and 30 to 60 wt. active substances.

Při přípravě nanostrukturované vysoce porézní kompozitní kolagenní pěny se postupuje tak, že se nejprve připraví nanovlákenná vrstva, a to například způsobem popsaným v české přihlášce vynálezu PV 2016-656. Vrstva se s výhodou připraví elektrostatickým zvlákňováním, konkrétně tak, že se kolagen typu I a polyethylenoxid o viskozitně střední molekulové hmotnosti v rozmezí 400 000 až 900 000 v poměru polyethylenoxidu ku kolagenu v rozmezí 0,05 až 0,11 smíchá s fosfátovým pufrem pro získání koncentrace 5 až 11 hmotn. % kolagenu ve směsi, vzniklá směs se vystaví teplotě v rozmezí 32 až 42 °C po dobu alespoň 60 hodin, načež se homogenizuje míšením za současného přidávání ethanolu v konečném objemovém poměru fosfátového pufru ku ethanolu 1:1 až 1:2, následně se směs elektrostaticky zvlákňuje za vzniku nanovlákenné vrstvy, která se následně promyje fýziologickým roztokem nebo fosfátovým pufrem a poté vodou a usuší se. Stabilita této vrstvy je před promytím s výhodou zvýšena fýzikálním či chemickým síťováním, např. máčením v 95 % hmotn. roztoku alkoholu ve vodě s přídavkem EDC a NHS, kde množství EDC na 1 g zvlákněného kolagenu je alespoň 0,625 g amnožství NHS na 1 g zvlákněného kolagenu je alespoň 0,156 g, a kde množství 95%hm. roztoku alkoholu ve vodě je alespoň 140 ml na 1 g zvlákněného kolagenu. Následně se vrstva promyje, čímž se z ní vymyje pomocný polymerIn the preparation of nanostructured highly porous composite collagen foam, the procedure is first that a nanofiber layer is prepared, for example, in the manner described in the Czech patent application PV 2016-656. The layer is preferably prepared by electrostatic spinning, in particular by mixing type I collagen and polyethylene oxide with a viscosity average molecular weight in the range of 400,000 to 900,000 in a polyethylene oxide to collagen ratio in the range of 0.05 to 0.11 to mix phosphate buffer to obtain concentration 5 to 11 wt. % collagen in the mixture, the resulting mixture is exposed to a temperature in the range of 32 to 42 ° C for at least 60 hours, then homogenized by stirring while adding ethanol in a final volume ratio of phosphate buffer to ethanol of 1: 1 to 1: 2, then the mixture is electrostatically spun to form a nanofiber layer, which is then washed with saline or phosphate buffer and then with water and dried. The stability of this layer is preferably increased by physical or chemical crosslinking before washing, e.g. by soaking in 95% by weight. of a solution of alcohol in water with the addition of EDC and NHS, where the amount of EDC per 1 g of spun collagen is at least 0.625 g and the amount of NHS per 1 g of spun collagen is at least 0.156 g, and where the amount of 95 wt. solution of alcohol in water is at least 140 ml per 1 g of spun collagen. Subsequently, the layer is washed, thereby washing out the auxiliary polymer

-4CZ 309204 B6 polyethylenoxid, zamrazí se na teplotu -60 až -90 °C po dobu 3 až 8 hodin a lyofilizuje. Tloušťka zvlákněné vrstvy je s výhodou v rozmezí 0,2 až 0,5 mm.-4GB 309204 B6 polyethylene oxide, frozen at -60 to -90 ° C for 3 to 8 hours and lyophilized. The thickness of the spun layer is preferably in the range of 0.2 to 0.5 mm.

V dalším krokuje zvlákněná vrstva ponechána v 0,1 až 3 % hmotn. disperzi kolagenu po dobu 1 až 3 hodin při teplotě 15 až 25 °C a po jejím prosycení následuje zamražení na teplotu -60 až 90 °C po dobu 3 až 8 hodin a lyofilizace do dosažení konstantní hmotnosti, za vzniku kompozitní kolagenní pěny. Stabilita kolagenové kompozitní pěny je po lyofilizaci s výhodou zvýšena chemickým síťováním, například chemicky pomocí EDC a NHS. Konečné objemové množství kolagenové nanovlákenné vrstvy v kompozitu je 20 až 60 %.In the next step, the spun layer is left in 0.1 to 3% by weight. collagen dispersion for 1 to 3 hours at 15 to 25 ° C and saturation followed by freezing at -60 to 90 ° C for 3 to 8 hours and lyophilization until constant weight, to form a composite collagen foam. The stability of the collagen composite foam after lyophilization is preferably increased by chemical crosslinking, for example chemically using EDC and NHS. The final volume amount of the collagen nanofiber layer in the composite is 20 to 60%.

V případě více než dvou vrstev se nejprve připraví nanovlákenná vrstva a zesíťuje se. Potom se dvě nebo více těchto zesíťovaných nanovlákenných vrstev položí přes sebe a vloží se do disperze kolagenu, kde se máčí až do prosycení vrstev disperzí. Následuje zamražení a lyofilizace do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita takto získané kolagenové kompozitní pěny je po lyofilizaci s výhodou zvýšena chemickým síťováním pomocí EDC a NHS. Konečné objemové množství kolagenové nanovlákenné vrstvy v kompozitu je 20 až 60 %.In the case of more than two layers, a nanofiber layer is first prepared and crosslinked. Then, two or more of these crosslinked nanofiber layers are laid on top of each other and placed in a collagen dispersion, where they are soaked until the layers are saturated with the dispersion. This is followed by freezing and lyophilization until a constant weight is reached. The stability of the collagen composite foam thus obtained is preferably increased after lyophilization by chemical crosslinking using EDC and NHS. The final volume amount of the collagen nanofiber layer in the composite is 20 to 60%.

Ve výhodném provedení je posledním krokem přípravy impregnace kompozitu roztokem na bázi alkoholu obsahujícím odvážené množství aktivních látek, například antibiotik, s výhodou vybraných ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich kombinace tak, aby jejich výsledné množství bylo 30 až 60 % hmotn. Impregnovaný kompozit může být poté zamražen a lyofilizován. Alternativně může být impregnace vybranými aktivními látkami uskutečněna teprve před aplikací kompozitu, pro což se použije vodný roztok aktivních látek nebo se aktivní látky smísí s fyziologickým roztokem a kompozit se aplikuje ihned, nebo až po odpaření kapalné fáze, tedy po dosažení konstantní hmotnosti kompozitu.In a preferred embodiment, the final step in preparing the impregnation of the composite is an alcohol-based solution containing a weighed amount of active ingredients, e.g. antibiotics, preferably selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, or a combination thereof. wt. The impregnated composite can then be frozen and lyophilized. Alternatively, the impregnation with the selected active substances can be carried out only before the application of the composite, for which an aqueous active substance solution is used or the active substances are mixed with saline and the composite is applied immediately or after the liquid phase has evaporated.

Podobně jako u vysoce porézní pěny, čím kratší je doba síťování, tím rychlejší je rozpad kompozitu a tím kratší je i doba uvolňování antibiotik.As with highly porous foam, the shorter the crosslinking time, the faster the composite will disintegrate and the shorter the antibiotic release time.

Kompozitní kolagenová pěna je vhodná především pro použití v chirurgii, ortopedii, v oblasti krytí ran, léčby bércových vředů apod. Zejména je vhodné její použití v případech známého zánětu nebo vysokého rizika infekce, kdy se pěna impregnovaná aktivními látkami použije pro léčbu zánětu/infekce a cílené dodání aktivních látek, například antibiotik. Kompozitní pěna poskytuje díky nanovláknům velký aktivní povrch, kde dochází k větší vazbě aktivních látek, většímu kontaktu s tělním prostředím, a tím i k rychlým, vysokým a dlouhodobým dávkám uvolňovaných aktivních látek.Composite collagen foam is especially suitable for use in surgery, orthopedics, wound dressings, treatment of shin ulcers, etc. It is especially suitable for use in cases of known inflammation or high risk of infection, when the foam impregnated with active substances is used to treat inflammation / infection and targeted delivery of active substances, such as antibiotics. Thanks to nanofibers, the composite foam provides a large active surface, where there is a greater binding of active substances, greater contact with the body environment, and thus fast, high and long-term doses of released active substances.

Vysoce porézní pěna a kompozit podle vynálezu mají následující výhody:The highly porous foam and composite of the invention have the following advantages:

- programovatelný (řízený) rozpad pěny- programmable (controlled) foam decomposition

- programovatelné (řízené) uvolňování aktivních látek- programmable (controlled) release of active substances

- elastická paměť, ohybová tuhost- elastic memory, bending stiffness

- snazší manipulace s pěnou, možnost repozice (netrhá se, nerozpadá se)- easier handling of foam, possibility of reduction (does not tear, does not disintegrate)

- snížené riziko alergické reakce nebo jiné nežádoucí imunitní odezvy organizmu.- a reduced risk of an allergic reaction or other adverse immune response.

Kolagenová pěna podle vynálezu se s výhodou použije zejména preventivně, s cílem rychlého uvolňování aktivních látek.The collagen foam according to the invention is preferably used in particular preventively, in order to rapidly release the active substances.

Objasnění výkresůClarification of drawings

Obr. 1 znázorňuje kolagenovou pěnu připravenou z 1% hmotn. disperze kolagenu bez antibiotik (vlevo: lOOnásobné zvětšení, uprostřed: 500násobné zvětšení) a po impregnaci gentamicinem (zcela vpravo, 2000násobné zvětšení).Giant. 1 shows a collagen foam prepared from 1% by weight. collagen dispersion without antibiotics (left: 100-fold magnification, middle: 500-fold magnification) and after gentamicin impregnation (far right, 2000-fold magnification).

-5CZ 309204 B6-5CZ 309204 B6

Obr. 2 znázorňuje sendvičovou kolagenovou pěnu s málo porézním jádrem, připraveným z 5 % hmota, disperze kolagenu, a s vysoce porézními okrajovými částmi, připravenými z 1 % hmota, disperze kolagenu, příprava dle příkladu 11. Zcela vpravo je snímek rozhraní přechodu mezi jádrem a okrajem.Giant. 2 shows a sandwich collagen foam with a low porous core prepared from a 5% by weight collagen dispersion and with highly porous edges prepared from a 1% by weight collagen dispersion, prepared according to Example 11. On the far right is an image of the transition interface between the core and the edge.

Obr. 3 znázorňuje graf závislosti smluvního napětí na deformaci pro samotnou porézní pěnu, samotné tuhé jádro a pro sendvičovou pěnu (příprava dle příkladu 11). Z grafu je patrná několikanásobně zvýšená odolnost vůči deformaci u sendvičové pěny oproti samotné pěně.Giant. 3 shows a graph of contract stress versus deformation for porous foam alone, rigid core alone, and sandwich foam (preparation according to Example 11). The graph shows a several times higher resistance to deformation of the sandwich foam compared to the foam itself.

Obr. 4 znázorňuje nanostrukturovanou vysoce porézní kompozitní pěnu připravenou prosycením pěti nanovlákenných vrstev 1 % hmota, disperzí kolagenu. Snímek uprostřed ilustruje přechod mezi vlákny a porézní strukturou pěny. Snímek zcela vpravo ukazuje detail prosycení nanovlákenné vrstvy disperzí.Giant. 4 shows a nanostructured highly porous composite foam prepared by impregnating five nanofiber layers with 1% by weight of a collagen dispersion. The image in the middle illustrates the transition between the fibers and the porous structure of the foam. The image on the far right shows the detail of the impregnation of the nanofiber layer with dispersions.

Příklady uskutečnění vynálezuExamples of embodiments of the invention

DefiniceDefinition

Kolagenová pěna v kontextu tohoto vynálezu je synonymem pro pojem „kolagenová houba“, tedy porézní materiál na bázi kolagenu.Collagen foam in the context of the present invention is synonymous with the term "collagen sponge", i.e. a porous collagen-based material.

Pod pojmem „otevřená porozita“, resp. „otevřené póry“ se rozumí prostor, který komunikuje s povrchem výrobku, tedy se zevním prostředím. Může jít o jednotlivé póry propojené s povrchem, ale i o vzájemně propojené póry, z nichž alespoň jeden navíc komunikuje i s povrchem výrobku.Under the term "open porosity", resp. "Open pores" means the space that communicates with the surface of the product, ie the external environment. These can be individual pores connected to the surface, but also interconnected pores, at least one of which also communicates with the surface of the product.

Pod pojmem „uzavřená porozita“, resp. „uzavřené póry“ se rozumí tzv. osamocené póry, neboli póry, které nejsou propojeny s vnějším povrchem výrobku.Under the term "closed porosity", resp. "Closed pores" means so-called solitary pores, or pores that are not connected to the outer surface of the product.

Výraz vysoce porézní v kontextu tohoto vynálezu jsou ty pěny, které mají otevřenou porozita v rozmezí 70 % až 90 %, s výhodou 80 % až 90 %, a velikost pórů v rozmezí 50 až 200 pm, přičemž alespoň 50 % objemu pórů je tvořeno póry o velikosti nad 80 pm, s výhodou nad 100 pm.The term highly porous in the context of the present invention is those foams which have an open porosity in the range of 70% to 90%, preferably 80% to 90%, and a pore size in the range of 50 to 200 μm, at least 50% of the pore volume being pores with a size above 80 μm, preferably above 100 μm.

Výraz málo porézní v kontextu tohoto vynálezu jsou ty pěny, které mají otevřenou porozita v rozmezí 70 % až 90 % a velikost pórů v rozmezí 20 až 80 pm, přičemž alespoň 50 % objemu pórů je tvořeno póry o velikosti pod 50 pm.The term low porosity in the context of the present invention is those foams which have an open porosity in the range of 70% to 90% and a pore size in the range of 20 to 80 μm, with at least 50% of the pore volume being pore sizes below 50 μm.

Příklad 1 - vysoce porézní pěnaExample 1 - highly porous foam

Při přípravě vysoce porézní kolagenové pěny se obecně postupuje tak, že se odvážené množství kolagenu, s výhodou izolovaného z kůže sladkovodních ryb, například z kapra obecného, smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 0,1 až 3 % hmota., s výhodou 0,5 až 1 % hmota, kolagenu. Po nabobtnání kolagenu při teplotě 5-15 °C po dobu 1-3 hodin je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 1 až 20 minut při 5 až 15 000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 15 až 25 °C. Výsledná disperze je poté dávkována do forem, zamražena při teplotě -60 až -90 °C po dobu 3 až 8 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita kolagenové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 25 až 40 °C, s výhodou při 37 °C, po dobu 2 až 4 hodin. Na 1 g kolagenu připadá 0,5-1,5 g EDC a 0,125 až 0,750 g NHS smísené se 140 až 160 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 0,5 až 1,5 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -15 až -30 °C po dobu 5 až 7 hodin a lyofilizována. Posledním krokem přípravy je impregnace pěny 95 % hmota, roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství antibiotika vybraných ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich kombinace tak, aby jejich výsledné množství bylo 60 % hmota. Impregnovaná pěna může být poté zamražena na -60In preparing a highly porous collagen foam, a weighed amount of collagen, preferably isolated from freshwater fish skin, such as common carp, is generally mixed with deionized water at a concentration of 0.1 to 3% by weight, preferably 0.5%. up to 1% by weight of collagen. After swelling of the collagen at 5-15 ° C for 1-3 hours, the mixture is homogenized twice for 1 to 20 minutes at 5 to 15,000 rpm with a 20 minute delay at 15 to 25 ° C. The resulting dispersion is then metered into molds, frozen at -60 to -90 ° C for 3 to 8 hours and lyophilized to constant weight. The stability of the collagen foam is increased after lyophilization by soaking in a solution of 95% w / w, ethanol and water with EDC and NHS at 25 to 40 ° C, preferably at 37 ° C, for 2 to 4 hours. 0.5-1.5 g of EDC and 0.125 to 0.750 g of NHS mixed with 140-160 ml of 95% by weight ethanol-water solution per 1 g of collagen. After collagen crosslinking, the foam is washed with 0.5 to 1.5 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -15 to -30 ° C for 5 to 7 hours and lyophilized. The final step in the preparation is to impregnate the foam with 95% by weight, an ethanol-water solution containing a weighed amount of an antibiotic selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, or a combination thereof so that the final amount is 60% by weight. The impregnated foam can then be frozen at -60

-6CZ 309204 B6 až -90 °C, lyofilizována a nařezána na potřebné rozměry. Pěna může být také impregnována vybranými antibiotiky teprve před její aplikací, pro což se použije vodný roztok antibiotik nebo se antibiotika smísí s fyziologickým roztokem. Následně se pěna aplikuje buď nasáknutá impregnačním roztokem, nebo suchá, tedy až po odpaření kapalné fáze z pěny. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 40 % hmota, a 60 % hmota, antibiotik.-6GB 309204 B6 to -90 ° C, lyophilized and cut to size. The foam may also be impregnated with selected antibiotics prior to application, using an aqueous solution of antibiotics or mixing the antibiotics with saline. Subsequently, the foam is applied either soaked in the impregnation solution or dry, ie only after the liquid phase has evaporated from the foam. In this way, a foam is obtained with a final amount of collagen of 40% by weight, and 60% by weight, of antibiotics.

Příklad 2 - vysoce porézní pěnaExample 2 - Highly porous foam

Odvážené množství kolagenu se smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 1 % hmota, kolagenu. Po nabobtnání kolagenu při teplotě 10 °C po dobu 2 hodin je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 10 minut při 10 000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 20 °C. Výsledná disperze je poté dávkována do forem, zamražena při teplotě -70 °C po dobu 6 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita kolagenové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 30 °C po dobu 2 hodin. Na 1 g kolagenu se použil 1 g EDC a 0,250 g NHS smísené se 150 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 1 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -20 °C po dobu 6 hodin a lyofilizována. Posledním krokem přípravy je impregnace pěny 95 % hmota, roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství gentamicinu tak, aby jeho výsledné množství v roztoku bylo 45 % hmota. Impregnovaná pěna se pak zamrazí na -70 °C, lyofílizuje a nařeže na potřebné rozměry. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 55 % hmota, a 45 % hmota, antibiotika.A weighed amount of collagen is mixed with deionized water at a concentration of 1% by weight of collagen. After swelling of the collagen at 10 ° C for 2 hours, the mixture is homogenized twice for 10 minutes at 10,000 rpm with a 20 minute delay at 20 ° C. The resulting dispersion is then metered into molds, frozen at -70 ° C for 6 hours and lyophilized to constant weight. The stability of the collagen foam is increased after lyophilization by soaking in a solution of 95% by weight, ethanol and water with EDC and NHS at 30 ° C for 2 hours. 1 g of EDC and 0.250 g of NHS mixed with 150 ml of 95% by weight ethanol-water solution were used per 1 g of collagen. After collagen crosslinking, the foam is washed with 1 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -20 ° C for 6 hours and lyophilized. The last step of the preparation is the impregnation of the foam with 95% by weight, a solution of ethanol with water containing a weighed amount of gentamicin so that its final amount in the solution is 45% by weight. The impregnated foam is then frozen at -70 ° C, lyophilized and cut to size. In this way, a foam is obtained with a final collagen content of 55% by weight, and 45% by weight, of antibiotics.

Příklad 3 - vysoce porézní pěnaExample 3 - Highly porous foam

Postupuje se stejně jako v příkladu 2, ale doba síťování je 3 hodiny.The procedure is the same as in Example 2, but the networking time is 3 hours.

Příklad 4 - vysoce porézní pěnaExample 4 - Highly porous foam

Postupuje se stejně jako v příkladu 2, ale doba síťování je 4 hodiny.The procedure is the same as in Example 2, but the networking time is 4 hours.

Příklad 5 - vysoce porézní pěnaExample 5 - highly porous foam

Postupuje se jako v příkladu 2 s výjimkou posledního kroku přípravy, tj. impregnace pěny roztokem obsahujícím aktivní látku. Pěna se zamrazí na -70 °C, lyofílizuje a nařeže na potřebné rozměry. Tímto postupem je získána pěna sestávající z čistého kolagenu.The procedure is as in Example 2, except for the last preparation step, i.e. impregnation of the foam with a solution containing the active substance. The foam is frozen at -70 ° C, lyophilized and cut to size. In this way, a foam consisting of pure collagen is obtained.

Příklad 6 - vysoce porézní pěnaExample 6 - highly porous foam

Odvážené množství kolagenu se smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 1,5 % hmota, kolagenu. Po nabobtnání kolagenu při teplotě 15 °C po dobu 1 hodiny je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 15 minut při 8000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 15 °C. Výsledná disperze je poté dávkována do forem, zamražena při teplotě -80 °C po dobu 4 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita kolagenové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 25 °C po dobu 3 hodin. Na 1 g kolagenu se použilo 0,7 g EDC a 0,2 g NHS smísené se 140 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 0,8 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -30 °C po dobu 5 hodin a lyofilizována. Posledním krokem přípravy je impregnace pěny 95 % hmota, roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství vankomycinu tak, aby jeho výsledné množství v roztoku bylo 45 % hmota. Impregnovaná pěna se pak zamrazí na 80 °C, lyofílizuje a nařeže na potřebné rozměry. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 55 % hmota, a 45 % hmota, antibiotika.A weighed amount of collagen is mixed with deionized water at a concentration of 1.5% by weight of collagen. After swelling of the collagen at 15 ° C for 1 hour, the mixture is homogenized twice for 15 minutes at 8000 rpm with a 20 minute delay at 15 ° C. The resulting dispersion is then metered into molds, frozen at -80 ° C for 4 hours and lyophilized to constant weight. The stability of the collagen foam is increased after lyophilization by soaking in a solution of 95% by weight, ethanol and water with EDC and NHS at 25 ° C for 3 hours. 0.7 g of EDC and 0.2 g of NHS mixed with 140 ml of 95% by weight ethanol-water solution were used per 1 g of collagen. After collagen crosslinking, the foam is washed with 0.8 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -30 ° C for 5 hours and lyophilized. The last step of the preparation is the impregnation of the foam with 95% by weight, a solution of ethanol with water containing a weighed amount of vancomycin so that its final amount in the solution is 45% by weight. The impregnated foam is then frozen at 80 ° C, lyophilized and cut to size. In this way, a foam is obtained with a final collagen content of 55% by weight, and 45% by weight, of antibiotics.

-7 CZ 309204 B6-7 CZ 309204 B6

Příklad 7 - vysoce porézní pěnaExample 7 - highly porous foam

Odvážené množství kolagenu se smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 3 % hmoto, kolagenu. Po nabobtnání kolagenu při teplotě 12 °C po dobu 2,5 hodin je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 20 minut při 15 000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 25 °C. Výsledná disperze je poté dávkována do forem, zamražena při teplotě -90 °C po dobu 3 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita kolagenové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 40 °C po dobu 2 hodin. Na 1 g kolagenu se použilo 1,4 g EDC a 0,7 g NHS smísené se 160 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 1,5 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -30 °C po dobu 5 hodin a lyofilizována. Posledním krokem přípravy je impregnace pěny 95 % hmota, roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství směsi vankomycinu a gentamicinu v poměru 1:1 tak, aby jejich výsledné množství bylo 30 % hmota. Impregnovaná pěna je poté zamražena na -90 °C, lyofilizována a nařezána na potřebné rozměry. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 70 % hmota, a 30 % hmota, antibiotik.A weighed amount of collagen is mixed with deionized water at a concentration of 3% by weight of collagen. After swelling of the collagen at 12 ° C for 2.5 hours, the mixture is homogenized twice for 20 minutes at 15,000 rpm with a 20 minute delay at 25 ° C. The resulting dispersion is then metered into molds, frozen at -90 ° C for 3 hours and lyophilized to constant weight. The stability of the collagen foam is increased after lyophilization by soaking in a solution of 95% by weight, ethanol and water with EDC and NHS at 40 ° C for 2 hours. 1.4 g of EDC and 0.7 g of NHS mixed with 160 ml of 95% by weight ethanol-water solution were used per 1 g of collagen. After collagen crosslinking, the foam is washed with 1.5 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -30 ° C for 5 hours and lyophilized. The last step of the preparation is the impregnation of the foam with 95% by weight, a solution of ethanol with water containing a weighed amount of a mixture of vancomycin and gentamicin in a ratio of 1: 1 so that their final amount is 30% by weight. The impregnated foam is then frozen at -90 ° C, lyophilized and cut to size. In this way, a foam is obtained with a final amount of collagen of 70% by weight, and 30% by weight, of antibiotics.

Příklad 8 - vysoce porézní pěnaExample 8 - highly porous foam

Odvážené množství kolagenu se smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 0,5 % hmota, kolagenu. Po nabobtnání kolagenu při teplotě 15 °C po dobu 3 hodin je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 20 minut při 5000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 25 °C. Výsledná disperze je poté dávkována do forem, zamražena při teplotě -60 °C po dobu 8 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita kolagenové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 25 °C po dobu 4 hodin. Na 1 g kolagenu se použilo 1,2 g EDC a 0,7 g NHS smísené se 160 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 0,5 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -15 °C po dobu 7 hodin a lyofilizována. Posledním krokem přípravy je impregnace pěny 95 % hmota, roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství směsi vankomycinu, gentamicinu a nitrofurantoinu v poměru 1:1:1 tak, aby jejich výsledné množství bylo 3 0 % hmota. Impregnovaná pěna j e poté zamražena na -60 °C, lyofilizována a nařezána na potřebné rozměry. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 70 % hmota, a 30 % hmota, antibiotik.A weighed amount of collagen is mixed with deionized water at a concentration of 0.5% by weight of collagen. After swelling of the collagen at 15 ° C for 3 hours, the mixture is homogenized twice for 20 minutes at 5000 rpm with a 20 minute delay at 25 ° C. The resulting dispersion is then metered into molds, frozen at -60 ° C for 8 hours and lyophilized to constant weight. The stability of the collagen foam is increased after lyophilization by soaking in a solution of 95% by weight, ethanol and water with EDC and NHS at 25 ° C for 4 hours. 1.2 g of EDC and 0.7 g of NHS mixed with 160 ml of 95% by weight ethanol-water solution were used per 1 g of collagen. After collagen crosslinking, the foam is washed with 0.5 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -15 ° C for 7 hours and lyophilized. The last step of the preparation is the impregnation of the foam with 95% by weight, a solution of ethanol with water containing a weighed amount of a mixture of vancomycin, gentamicin and nitrofurantoin in a ratio of 1: 1: 1 so that their final amount is 30% by weight. The impregnated foam is then frozen at -60 ° C, lyophilized and cut to size. In this way, a foam is obtained with a final amount of collagen of 70% by weight, and 30% by weight, of antibiotics.

Příklad 9 - vysoce porézní pěnaExample 9 - highly porous foam

Maximální doby rozpadu kolagenové pěny a maximální doby uvolňování aktivních látek (zde antibiotik)Maximum disintegration times of collagen foam and maximum release times of active substances (here antibiotics)

Tab. 1 Dosažená maximální doba rozpadu kolagenové pěny při použití EDC v koncentraci 0,5 až 1,5 g (na 1 g kolagenu) podle použité teploty a doby expozice v síťovacím systému 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou EDC a NHS. NHS je k EDC v hmotnostním poměru 1:4. Základní parametry postupu jsou dle příkladu 2.Tab. 1 Achieved maximum decay time of collagen foam using EDC at a concentration of 0.5 to 1.5 g (per 1 g of collagen) depending on the temperature used and the exposure time in the crosslinking system 95% by weight, ethanol solution with water EDC and NHS. NHS is EDC in a weight ratio of 1: 4. The basic parameters of the procedure are according to example 2.

dosažená maximální doba degradace the maximum degradation time reached doba síťotání při teplotě 15-25°C crosslinking time at 15-25 ° C doba síťování při teplotě 30-40°C crosslinking time at 30-40 ° C maximální doba uvolňování antibiotik maximum antibiotic release time 2 týdny 2 weeks 6 hodin 6 hours 2 hodiny 2 hours 10 dnů 10 days 4 týdny 4 weeks 9 hodin 9 hours 3 hodiny 3 hours 15 dnů 15 days 6 týdnů 6 weeks 12 hodin 12 hours 4 hodiny 4 o'clock 20 dnů 20 days

-8CZ 309204 B6-8CZ 309204 B6

Příklad 10 - sendvičová kolagenová pěnaExample 10 - sandwich collagen foam

Při přípravě sendvičové kolagenové pěny se obecně postupuje tak, že se odvážené množství kolagenu, s výhodou izolovaného z kůže sladkovodních ryb, například z kapra obecného, smísí s deionizovanou vodou, po nabobtnání kolagenu při teplotě 5 až 15 °C po dobu 1 až 3 hodin je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 1 až 20 minut při 5 až 15 000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 15 až 25 °C. Koncentrace kolagenové disperze pro přípravu jádra je 4 až 8 % hmota. Koncentrace pro přípravu okrajových částí je 0,1 až 3 % hmota., s výhodou 0,1 až 1 % hmota. V prvním krokuje výsledná 4 až 8 % hmota, disperze dávkována do forem, zamražena při teplotě -60 až -90 °C po dobu 3 až 8 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti. Ve druhém kroku je tuhé jádro impregnováno 0,1 až 3% hmota, disperzí kolagenu ve formě a takto ponecháno 1-3 hodiny při teplotě 15 až 25 °C, zamraženo při teplotě -60 až -90 °C po dobu 3 až 8 hodin a lyofilizováno do dosažení konstantní hmotnosti, za získání sendvičové kolagenové pěny s málo porézním jádrem a vysoce porézními okrajovými vrstvami. Stabilita kolagenové sendvičové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 25 až 40 °C, s výhodou 30 až 40 °C, nejvýhodněji při 37 °C po dobu 2 až 4 hodin. Na 1 g kolagenu pňpadá 0,5-1,5 g EDC a 0,125 až 0,750 g NHS smísené se 140 až 160 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 0,5 až 1,5 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -15 až -30 °C po dobu 5 až 7 hodin a lyofilizována. Konečné objemové množství málo porézního jádra v sendvičové pěně je 40 až 60 %. Posledním krokem přípravy podle výhodného provedení je impregnace sendvičové pěny 95 % hmota, roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství aktivních látek, například antibiotik vybraných ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich kombinace tak, aby jejich výsledné množství bylo 30 až 60 % hmota. Impregnovaná pěna může být poté zamražena a lyofilizována. Sendvičová pěna může být také impregnována vybranými antibiotiky teprve před její aplikací, pro což se použije vodný roztok antibiotik nebo se antibiotika smísí s fýziologickým roztokem a pěna se aplikuje po jejich odpaření, tedy po dosažení konstantní hmotnosti pěny. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 40 až 60 % hmota, a 40 až 60 % hmota, antibiotik.In preparing a collagen sandwich foam, a weighed amount of collagen, preferably isolated from freshwater fish skin, such as common carp, is mixed with deionized water after the collagen has swelled at 5 to 15 ° C for 1 to 3 hours. the mixture is homogenized twice for 1 to 20 minutes at 5 to 15,000 rpm with a 20 minute delay at 15 to 25 ° C. The concentration of the collagen dispersion for the preparation of the core is 4 to 8% by weight. The concentration for the preparation of the edge portions is 0.1 to 3% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight. In the first step, the resulting 4 to 8% mass, the dispersion is dosed into molds, frozen at -60 to -90 ° C for 3 to 8 hours and lyophilized until a constant weight is reached. In the second step, the solid core is impregnated with 0.1 to 3% by weight, collagen dispersion in the mold and thus left for 1-3 hours at 15 to 25 ° C, frozen at -60 to -90 ° C for 3 to 8 hours and lyophilized to constant weight, to obtain a collagen sandwich foam with a low porous core and highly porous edge layers. The stability of the collagen sandwich foam is increased after lyophilization by dipping in a solution of 95% w / w, ethanol and water with EDC and NHS at 25 to 40 ° C, preferably 30 to 40 ° C, most preferably at 37 ° C for 2 to 4 hours. 0.5-1.5 g of EDC and 0.125 to 0.750 g of NHS mixed with 140-160 ml of a 95% by weight solution of ethanol and water per 1 g of collagen. After collagen crosslinking, the foam is washed with 0.5 to 1.5 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -15 to -30 ° C for 5 to 7 hours and lyophilized. The final volume amount of the low porous core in the sandwich foam is 40 to 60%. The final preparation step according to the preferred embodiment is to impregnate the sandwich foam with 95% by weight, a solution of ethanol with water containing a weighed amount of active substances, for example antibiotics selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin or 60% by weight. The impregnated foam can then be frozen and lyophilized. The sandwich foam can also be impregnated with selected antibiotics only before its application, for which an aqueous solution of antibiotics is used or the antibiotics are mixed with a physiological solution and the foam is applied after their evaporation, i.e. after reaching a constant weight of the foam. In this way, a foam is obtained with a final amount of collagen of 40 to 60% by weight, and 40 to 60% by weight, of antibiotics.

Příklad 11 - sendvičová kolagenová pěnaExample 11 - sandwich collagen foam

Při přípravě sendvičové kolagenové pěny se postupuje tak, že se odvážené množství kolagenu smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 5 % hmota, kolagenu, po nabobtnání kolagenu při teplotě 10 °C po dobu 2 hodin je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 10 minut při 10 000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 20 °C. Výsledná 5% hmota, disperze je dávkována do forem, zamražena při teplotě -80 °C po dobu 6 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti, za vzniku tuhého, málo porézního jádra. Ve druhém kroku je tuhé jádro impregnováno 1% hmota, disperzí kolagenu ve formě, přičemž objemový poměr obou disperzí (disperze pro přípravu jádra a disperze pro přípravu okrajových částí) je 1:1, a takto je ponecháno 2 hodiny při teplotě 20 °C, zamraženo při teplotě -80 °C po dobu 6 hodin a lyofilizováno do dosažení konstantní hmotnosti za získání sendvičové pěny sestávající z málo porézního jádra a vysoce porézních okrajových vrstev. Stabilita kolagenové sendvičové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Na 1 g kolagenu se použil 1 g EDC a 0,250 g NHS smísené se 150 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 1 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -20 °C po dobu 6 hodin a lyofilizována. Konečné objemové množství málo porézního jádra v sendvičové pěně je 50 %. Posledním krokem přípravy je impregnace sendvičové pěny 95 % hmota, roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství antibiotik vybraných ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich kombinace tak, aby jejich výsledné množství bylo 45 % hmota. Impregnovaná pěna může být poté zamražena a lyofilizována. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 55 % hmota, a 45 % hmota, antibiotik.To prepare a sandwich collagen foam, a weighed amount of collagen is mixed with deionized water at a concentration of 5% by weight of collagen, and after the collagen has swelled at 10 ° C for 2 hours, the mixture is homogenized twice for 10 minutes at 10,000 rpm. / min with a 20 minute delay at 20 ° C. The resulting 5% by weight dispersion is dosed into molds, frozen at -80 ° C for 6 hours and lyophilized to constant weight to form a solid, low porous core. In the second step, the solid core is impregnated with 1% by weight of the collagen dispersion in the mold, the volume ratio of the two dispersions (dispersion for core preparation and dispersion for edge preparation) being 1: 1, and thus left at 20 ° C for 2 hours. frozen at -80 ° C for 6 hours and lyophilized to constant weight to obtain a sandwich foam consisting of a low porous core and highly porous edge layers. The stability of the collagen sandwich foam is increased after lyophilization by soaking in a solution of 95% by weight, ethanol and water with EDC and NHS at 37 ° C for 2 hours. 1 g of EDC and 0.250 g of NHS mixed with 150 ml of 95% by weight ethanol-water solution were used per 1 g of collagen. After collagen crosslinking, the foam is washed with 1 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -20 ° C for 6 hours and lyophilized. The final volume of the low porous core in the sandwich foam is 50%. The final step in the preparation is to impregnate the sandwich foam with 95% by weight, an ethanol-water solution containing a weighed amount of antibiotics selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, or a combination thereof so that the final amount is 45% by weight. The impregnated foam can then be frozen and lyophilized. In this way, a foam is obtained with a final collagen content of 55% by weight, and 45% by weight, of antibiotics.

-9CZ 309204 B6-9CZ 309204 B6

Příklad 12 - sendvičová kolagenová pěnaExample 12 - sandwich collagen foam

Postupuje se stejně jako v příkladu 11, ale doba síťování je 3 hodiny.The procedure is the same as in Example 11, but the networking time is 3 hours.

Příklad 13 - sendvičová kolagenová pěnaExample 13 - sandwich collagen foam

Postupuje se stejně jako v příkladu 11, ale doba síťování je 4 hodiny.The procedure is the same as in Example 11, but the networking time is 4 hours.

Příklad 14 - sendvičová kolagenová pěnaExample 14 - sandwich collagen foam

Postupuje se jako v příkladu lis výjimkou posledního kroku přípravy, tj. pěna se neimpregnuje roztokem obsahujícím aktivní látku. Pěna se zamrazí na -70 °C, lyofílizuje a nařeže na potřebné rozměry. Tímto postupem je získána sendvičová pěna sestávající z čistého kolagenu.The procedure is as in the press example, except for the last preparation step, i.e. the foam is not impregnated with a solution containing the active substance. The foam is frozen at -70 ° C, lyophilized and cut to size. In this way, a sandwich foam consisting of pure collagen is obtained.

Příklad 15 - sendvičová kolagenová pěnaExample 15 - sandwich collagen foam

Odvážené množství kolagenu se smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 4 % hmotn., po nabobtnání kolagenu při teplotě 15 °C po dobu 1 hodiny je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 15 minut při 8000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 15 °C. V prvním krokuje výsledná 4% hmotn. disperze dávkována do forem, zamražena při teplotě -75 °C po dobu 4 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti, za získání tuhého jádra. Ve druhém krokuje tuhé jádro impregnováno 0,6% hmotn. disperzí kolagenu ve formě, přičemž poměr disperze pro přípravu jádra k disperzi pro přípravu okrajových vrstev je 2:3, a takto ponecháno 1 hodinu při teplotě 25 °C, zamraženo při teplotě -75 °C po dobu 4 hodin a lyofilizováno do dosažení konstantní hmotnosti za získání sendvičové pěny sestávající z málo porézního jádra a vysoce porézních okrajových vrstev. Stabilita kolagenové sendvičové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmotn. ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 37 °C po dobu 3 hodin. Na 1 g kolagenu se použilo 0,7 g EDC a 0,2 g NHS smísené se 140 ml 95 % hmotn. roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 0,8 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -30 °C po dobu 5 hodin a lyofilizována. Konečné objemové množství málo porézního jádra v sendvičové pěně je 40 %. Posledním krokem přípravy je impregnace sendvičové pěny 95 % hmotn. roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství antibiotik vybraných ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich kombinace tak, aby jejich výsledné množství bylo 30 % hmotn. Impregnovaná pěna může být poté zamražena a lyofilizována. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 70 % hmotn. a 30 % hmotn. antibiotik.The weighed amount of collagen is mixed with deionized water at a concentration of 4% by weight, after the collagen has swelled at 15 ° C for 1 hour, the mixture is homogenized twice for 15 minutes at 8000 rpm with a 20-minute delay at 15 ° C. In the first step, the resulting 4 wt. the dispersion is dosed into molds, frozen at -75 ° C for 4 hours and lyophilized to constant weight to give a solid core. In the second step, the solid core is impregnated with 0.6 wt. collagen dispersion in the mold, wherein the ratio of core preparation dispersion to edge preparation dispersion is 2: 3, and thus left for 1 hour at 25 ° C, frozen at -75 ° C for 4 hours and lyophilized to constant weight. to obtain a sandwich foam consisting of a low porous core and highly porous edge layers. The stability of the collagen sandwich foam is increased after lyophilization by dipping in a solution of 95% by weight. ethanol and water with EDC and NHS at 37 ° C for 3 hours. 0.7 g of EDC and 0.2 g of NHS mixed with 140 ml of 95% by weight were used per 1 g of collagen. ethanol-water solution. After collagen crosslinking, the foam is washed with 0.8 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -30 ° C for 5 hours and lyophilized. The final volume of the low porous core in the sandwich foam is 40%. The last step of the preparation is the impregnation of the sandwich foam with 95% by weight. a solution of ethanol with water containing a weighed amount of antibiotics selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, or a combination thereof so that their final amount is 30% by weight. The impregnated foam can then be frozen and lyophilized. In this way, a foam is obtained with a final amount of collagen of 70% by weight. and 30 wt. antibiotic.

Příklad 16 - sendvičová kolagenová pěnaExample 16 - sandwich collagen foam

Odvážené množství kolagenu se smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 7 % hmotn., po nabobtnání kolagenu při teplotě 12 °C po dobu 2,5 hodin je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 20 minut při 15 000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 25 °C. V prvním kroku je výsledná 7% hmotn. disperze dávkována do forem, zamražena při teplotě -85 °C po dobu 3 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti, za získání tuhého jádra. Ve druhém krokuje tuhé jádro impregnováno 1% hmotn. disperzí kolagenu ve formě (poměr disperze pro přípravu jádra k disperzi pro přípravu okrajových vrstev je 3:2) a takto ponecháno 2,5 hodiny při teplotě 25 °C, zamraženo při teplotě -85 °C po dobu 3 hodin a lyofilizováno do dosažení konstantní hmotnosti za získání sendvičové pěny sestávající z málo porézního jádra a vysoce porézních okrajových vrstev. Stabilita kolagenové sendvičové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmotn. ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 37 °C po dobu 3 hodin. Na 1 g kolagenu se použilo 1,4 g EDC a 0,7 g NHS smísené se 160 ml 95 % hmotn. roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 1,5 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -30 °C po dobu 5 hodin aThe weighed amount of collagen is mixed with deionized water at a concentration of 7% by weight, after the collagen has swelled at 12 ° C for 2.5 hours, the mixture is homogenized twice for 20 minutes at 15,000 rpm with a 20 minute delay at 25 ° C. ° C. In the first step, the resulting 7 wt. the dispersion is dosed into molds, frozen at -85 ° C for 3 hours and lyophilized to constant weight to give a solid core. In the second step, the solid core is impregnated with 1% by weight. collagen dispersion in the mold (ratio of dispersion for core preparation to dispersion for edge preparation is 3: 2) and thus left for 2.5 hours at 25 ° C, frozen at -85 ° C for 3 hours and lyophilized until constant weight to obtain a sandwich foam consisting of a low porous core and highly porous edge layers. The stability of the collagen sandwich foam is increased after lyophilization by dipping in a solution of 95% by weight. ethanol and water with EDC and NHS at 37 ° C for 3 hours. 1.4 g of EDC and 0.7 g of NHS mixed with 160 ml of 95% by weight were used per 1 g of collagen. ethanol-water solution. After collagen crosslinking, the foam is washed with 1.5 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -30 ° C for 5 hours and

-10 CZ 309204 B6 lyofilizována. Konečné objemové množství málo porézního jádra v sendvičové pěně je 60 %. Posledním krokem přípravy je impregnace sendvičové pěny 95% hmotn. roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství antibiotik vybraných ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich kombinace tak, aby jejich výsledné množství bylo 30 % hmotn. Impregnovaná pěna může být poté zamražena a lyofilizována. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 70 % hmotn. a 30 % hmotn. antibiotik.-10 CZ 309204 B6 lyophilized. The final volume of the low porous core in the sandwich foam is 60%. The last step of the preparation is the impregnation of the sandwich foam with 95% by weight. a solution of ethanol with water containing a weighed amount of antibiotics selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, or a combination thereof so that their final amount is 30% by weight. The impregnated foam can then be frozen and lyophilized. In this way, a foam is obtained with a final amount of collagen of 70% by weight. and 30 wt. antibiotic.

Příklad 17 - sendvičová kolagenová pěnaExample 17 - sandwich collagen foam

Odvážené množství kolagenu se smísí s deionizovanou vodou v koncentraci 8 % hmotn., po nabobtnání kolagenu při teplotě 20 °C po dobu 3 hodin je směs dvojnásobně homogenizována po dobu 20 minut při 6000 ot/min s 20 minutovou prodlevou při teplotě 25 °C. V prvním kroku je výsledná 8% hmotn. disperze dávkována do forem, zamražena při teplotě -80 °C po dobu 3 hodin a lyofilizována do dosažení konstantní hmotnosti, za získání tuhého jádra. Ve druhém krokuje tuhé jádro impregnováno 1,5% hmotn. disperzí kolagenu ve formě (poměr disperze pro přípravu jádra k disperzi pro přípravu okrajových vrstev je 7:3) a takto ponecháno 2 hodiny při teplotě 25 °C, zamraženo při teplotě -80 °C po dobu 3 hodin a lyofilizováno do dosažení konstantní hmotnosti za získání sendvičové pěny sestávající z málo porézního jádra a vysoce porézních okrajových vrstev. Stabilita kolagenové sendvičové pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmotn. ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Na 1 g kolagenu se použilo 1,4 g EDC a 0,35 g NHS smísené se 160 ml 95 % hmotn. roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 1,5 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -30 °C po dobu 5 hodin a lyofilizována. Konečné objemové množství málo porézního jádra v sendvičové pěně je 70 %. Posledním krokem přípravy je impregnace sendvičové pěny 95 % hmotn. roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství antibiotik vybraných ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich kombinace tak, aby jejich výsledné množství bylo 30 % hmotn. Impregnovaná pěna může být poté zamražena a lyofilizována. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 70 % hmotn. a 30 % hmotn. antibiotik.The weighed amount of collagen is mixed with deionized water at a concentration of 8% by weight, after the collagen has swelled at 20 ° C for 3 hours, the mixture is homogenized twice for 20 minutes at 6000 rpm with a 20 minute delay at 25 ° C. In the first step, the resulting 8 wt. the dispersion is dosed into molds, frozen at -80 ° C for 3 hours and lyophilized to constant weight to give a solid core. In the second step, the solid core is impregnated with 1.5 wt. collagen dispersion in the mold (the ratio of the dispersion for the preparation of the core to the dispersion for the preparation of the edge layers is 7: 3) and thus left for 2 hours at 25 ° C, frozen at -80 ° C for 3 hours and lyophilized to constant weight. obtaining a sandwich foam consisting of a low porous core and highly porous edge layers. The stability of the collagen sandwich foam is increased after lyophilization by dipping in a solution of 95% by weight. ethanol and water with EDC and NHS at 37 ° C for 2 hours. 1.4 g of EDC and 0.35 g of NHS mixed with 160 ml of 95% by weight were used per 1 g of collagen. ethanol-water solution. After collagen crosslinking, the foam is washed with 1.5 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -30 ° C for 5 hours and lyophilized. The final volume of the low porous core in the sandwich foam is 70%. The last step of the preparation is the impregnation of the sandwich foam with 95% by weight. a solution of ethanol with water containing a weighed amount of antibiotics selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, or a combination thereof so that their final amount is 30% by weight. The impregnated foam can then be frozen and lyophilized. In this way, a foam is obtained with a final amount of collagen of 70% by weight. and 30 wt. antibiotic.

Příklad 18 - sendvičová kolagenová pěnaExample 18 - sandwich collagen foam

V tabulce 2 jsou dosažené maximální doby rozpadu sendvičové kolagenové pěny a maximální doby uvolňování antibiotik, doba a teplota síťování, přičemž příprava sendvičové pěny se provedla dle příkladu 11 s proměnnými konečnými objemovými množstvími málo porézního jádra v sendvičové pěně 40 %, 50 %, 60 %, tj. s proměnnými poměry výchozích disperzí (2:3, 1:1, 3:2).Table 2 shows the maximum disintegration times of the sandwich collagen foam and the maximum antibiotic release times, crosslinking time and temperature, the preparation of the sandwich foam being carried out according to Example 11 with variable final volumetric core volumes in the sandwich foam 40%, 50%, 60% , i.e. with variable ratios of starting dispersions (2: 3, 1: 1, 3: 2).

Tab. 2Tab. 2

objemový podíl jádra core volume fraction doba síťování při teplotě 15 až crosslinking time at 15 to doba síťování při teplotě 30 až llllllilillillllllli crosslinking time at a temperature of 30 to 11 dosažená maximální doba degradace the maximum degradation time reached maximální doba uvolňování antibiotik maximum antibiotic release time 40% 40% 6 hodin 6 hours 2 hodiny 2 hours 4 týdny 4 weeks 21 dnů 21 days 9 hodin 9 hours 3 hodiny 3 hours 6 týdnů 6 weeks 25 dnů 25 days 12 hodin 12 hours 4 hodiny 4 o'clock 8 týdnů 8 weeks 30 dnů 30 days 50% 50% 6 hodin 6 hours 2 hodinv 2 hours 5 tvdnv 5 tvdnv 31 dnu 31 days 9 hodin 9 hours 3 hodinv 3 hours 7 tvdnv 7 tvdnv 35 dnu 35 days 12 hodin 12 hours 4 hodinv 4 hours 9 tvdnu 9 weeks 40 dnu 40 days 60% 60% 6 hodin 6 hours 2 hodiny 2 hours 6 týdny 6 weeks 41 dnů 41 days 9 hodin 9 hours 3 hodiny 3 hours 8 týdny 8 weeks 45 dnů 45 days 12 hodin 12 hours 4 hodiny 4 o'clock 10 týdnů 10 weeks 50 dnů 50 days

-11 CZ 309204 B6-11 CZ 309204 B6

Příklad 19 - kompozitní kolagenní pěnaExample 19 - composite collagen foam

Při přípravě nanostrukturované vysoce porézní kompozitní kolagenní pěny se obecně postupuje tak, že je nejprve připravena nanovlákenná kolagenová vrstva, a to elektrostatickým zvlákňo váním 5 až 11 % hmota., s výhodou 6 až 10 % hmota, roztoku kolagenu s obsahem polyethylen oxidu (PEO; Mr 400 000 až 900 000) v poměru PEO ku kolagenu v rozmezí 0,05 až 0,11, fosfátového pufru a ethanolu (1:1 až 1:2 objemově). Zvlákňování probíhá v elektrostatickém poli 200 až 300kV.m^-1 s dávkováním 100 až 200 μΐ/min a teplotě ne vyšší než 37 °C. Stabilita vrstvy je zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC aNHS při teplotě 25 až 40 °C, s výhodou 37 °C po dobu 2 až 4 hodin. Na 1 g kolagenu připadá 0,5 až 1,5 g EDC a 0,125 až 0,750 g NHS smísené se 140 až 160 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je vrstva promývána 0,5 až 1,5 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě. Při tomto procesu dojde k vyplavení pomocného polymeru. Dále je vrstva zamražena na -15 až -30 °C po dobu 5 až 7 hodin a lyofilizována. V dalším kroku je zvlákněná vrstva, resp. několik přes sebe položených vrstev, ponecháno v 0,1 až 3 % hmota, disperzi kolagenu po dobu 1 až 3 hodin při teplotě 15 až 25 °C. Za těchto podmínek dojde k prosycení zvlákněné vrstvy/zvlákněných vrstev kolagenovou disperzí, po čemž následuje zamražení na teplotu -60 až -90 °C po dobu 3 až 8 hodin a lyofílizace do dosažení konstantní hmotnosti, za získání kolagenové kompozitní pěny. Stabilita kolagenové kompozitní pěny je po lyofilizaci zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 25 až 40 °C po dobu 2 až 4 hodin. Na 1 g kolagenu připadá 0,5 až 1,5 g EDC a 0,125 až 0,750 g NHS smísené se 140 až 160 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 0,5 až 1,5 M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -15 až -30 °C po dobu 5 až 7 hodin a lyofilizována. Konečné objemové množství kolagenové nanovlákenné vrstvy v kompozitu je 20 až 60 %. Posledním, volitelným krokem přípravy je impregnace kompozitní pěny 95 % hmota, roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství aktivních látek, například antibiotik, s výhodou vybraných ze skupiny zahrnující vankomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, nebo jejich kombinace tak, aby jejich výsledné množství bylo 30 až 60 % hmota. Impregnovaná pěna může být poté zamražena a lyofilizována. Impregnace vybranými antibiotiky může být uskutečněna teprve před její aplikací, pro což se použije vodný roztok antibiotik nebo se antibiotika smísí s fýziologickým roztokem a pěna se aplikuje po jejich odpaření, tedy po dosažení konstantní hmotnosti pěny. Tímto postupem je získána pěna s výsledným množstvím kolagenu 40 až 70 % hmota, a 30 až 60 % hmota, antibiotik.In preparing a nanostructured highly porous composite collagen foam, the nanofiber collagen layer is generally prepared by electrostatic spinning with 5 to 11% by weight, preferably 6 to 10% by weight, of a collagen solution containing polyethylene oxide (PEO; Mr 400,000 to 900,000) in a PEO to collagen ratio in the range of 0.05 to 0.11, phosphate buffer and ethanol (1: 1 to 1: 2 by volume). Spinning takes place in an electrostatic field of 200 to 300 kV.m ^-1 with a dosage of 100 to 200 μΐ / min and a temperature of not more than 37 ° C. The stability of the layer is increased by soaking in a solution of 95% w / w, ethanol and water with EDC and NHS at 25 to 40 ° C, preferably 37 ° C for 2 to 4 hours. 0.5 to 1.5 g of EDC and 0.125 to 0.750 g of NHS mixed with 140 to 160 ml of 95% by weight ethanol-water solution per 1 g of collagen. After collagen crosslinking, the layer is washed with 0.5 to 1.5 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water. In this process, the auxiliary polymer is washed out. Next, the layer is frozen at -15 to -30 ° C for 5 to 7 hours and lyophilized. In the next step, the spun layer, resp. several superimposed layers, left in 0.1 to 3% by weight, of collagen dispersion for 1 to 3 hours at a temperature of 15 to 25 ° C. Under these conditions, the spun layer (s) is impregnated with the collagen dispersion, followed by freezing at -60 to -90 ° C for 3 to 8 hours and lyophilizing to constant weight to obtain a collagen composite foam. The stability of the collagen composite foam is increased after lyophilization by soaking in a solution of 95% by weight, ethanol and water with EDC and NHS at 25 to 40 ° C for 2 to 4 hours. 0.5 to 1.5 g of EDC and 0.125 to 0.750 g of NHS mixed with 140 to 160 ml of 95% by weight ethanol-water solution per 1 g of collagen. After collagen crosslinking, the foam is washed with 0.5 to 1.5 M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -15 to -30 ° C for 5 to 7 hours and lyophilized. The final volume amount of the collagen nanofiber layer in the composite is 20 to 60%. The last, optional preparation step is to impregnate the composite foam with 95% by weight, a solution of ethanol with water containing a weighed amount of active substances, e.g. antibiotics, preferably selected from the group consisting of vancomycin, gentamicin, rifampicin, nitrofurantoin, or a combination thereof. 30 to 60% by weight. The impregnated foam can then be frozen and lyophilized. The impregnation with selected antibiotics can be carried out only before its application, for which an aqueous solution of antibiotics is used or the antibiotics are mixed with physiological saline and the foam is applied after their evaporation, i.e. after reaching a constant weight of foam. In this way, a foam is obtained with a final amount of collagen of 40 to 70% by weight, and 30 to 60% by weight, of antibiotics.

Příklad 20 - kompozitní kolagenní pěnaExample 20 - composite collagen foam

Při přípravě nanostrukturované vysoce porézní kompozitní kolagenní pěny se postupuje tak, že se nejprve připraví nanovlákenná kolagenová vrstva elektrostatickým zvlákňováním 8% hmota, roztoku kolagenu s fosfátovým pufrem a ethanolem (1:1 objemově), do kterého je přidán polyethylenoxid v hmotnostním poměru 0,08 ku kolagenu (Mr 700 000). Zvlákňování probíhá v elektrostatickém poli 270 kV.m¹, dávkování 150 pl.min¹ a při teplotě 25 °C. Stabilita vrstvy je zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Na 1 g kolagenu připadá 1 g EDC a 0,250 g NHS smísené se 150 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je vrstva promývána IM hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě. Při tomto procesu dojde k vyplavení pomocného polymeru. Dále je vrstva zamražena na -25 °C po dobu 6 hodin a lyofilizována. V dalším kroku je zvlákněná vrstva ponechána v 1 % hmota, disperzi kolagenu po dobu 2 hodin při teplotě 25 °C. Za těchto podmínek dojde k prosycení zvlákněné vrstvy kolagenovou disperzí, po čemž následuje zamražení na teplotu -80 °C po dobu 5 hodin a lyofílizace do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita kolagenové kompozitní pěny je po lyofilizaci opět zvýšena máčením v roztoku 95 % hmota, ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Na 1 g kolagenu připadá 1 g EDC a 0,250 g NHS smísené se 150 ml 95 % hmota, roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána IM hydrogenIn the preparation of nanostructured highly porous composite collagen foam, the nanofiber collagen layer is first prepared by electrostatic spinning of 8% by weight, collagen solution with phosphate buffer and ethanol (1: 1 by volume), to which polyethylene oxide is added in a weight ratio of 0.08 to collagen (Mr 700,000). Spinning takes place in an electrostatic field of 270 kV.m ¹ , dosing of 150 pl.min ¹ and at a temperature of 25 ° C. The stability of the layer is increased by soaking in a solution of 95% w / w, ethanol and water with EDC and NHS at 37 ° C for 2 hours. 1 g of collagen accounts for 1 g of EDC and 0.250 g of NHS mixed with 150 ml of 95% by weight ethanol-water solution. After collagen crosslinking, the layer is washed with 1M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water. In this process, the auxiliary polymer is washed out. Next, the layer is frozen at -25 ° C for 6 hours and lyophilized. In the next step, the spun layer is left in a 1% by weight, collagen dispersion for 2 hours at 25 ° C. Under these conditions, the spun layer is saturated with collagen dispersion, followed by freezing at -80 ° C for 5 hours and lyophilization until constant weight is reached. After lyophilization, the stability of the collagen composite foam is again increased by soaking in a solution of 95% by weight, ethanol and water with EDC and NHS at 37 ° C for 2 hours. 1 g of collagen accounts for 1 g of EDC and 0.250 g of NHS mixed with 150 ml of 95% by weight ethanol-water solution. After collagen crosslinking, the foam is washed with 1M hydrogen

-12 CZ 309204 B6 fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -25 °C po dobu 6 hodin a lyofilizována. Objemový poměr vlákenné vrstvy a disperze je 2:3, a proto i objemový poměr vlákenné vrstvy a pěny ve výsledném kompozitu je 2:3, tj. konečné objemové množství kolagenové nanovlákenné vrstvy v kompozitu je 40 %. Posledním krokem přípravy je impregnace kompozitní pěny 95 % hmotn. roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství vankomycinu tak, aby jeho výsledné množství bylo 45 % hmotn. Impregnovaný kompozit se poté zamrazí na -25 °C po dobu 6 hodin a lyofilizuje. Tímto postupem je získána kompozitní pěna s výsledným množstvím kolagenu 55 % hmotn. a 45 % hmotn. antibiotik.Disodium phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -25 ° C for 6 hours and lyophilized. The volume ratio of fiber layer and dispersion is 2: 3, and therefore the volume ratio of fiber layer and foam in the resulting composite is 2: 3, i.e. the final volume amount of collagen nanofiber layer in the composite is 40%. The last step of the preparation is the impregnation of the composite foam 95% by weight. a solution of ethanol with water containing a weighed amount of vancomycin so that its final amount is 45% by weight. The impregnated composite is then frozen at -25 ° C for 6 hours and lyophilized. In this way, a composite foam is obtained with a final amount of collagen of 55% by weight. and 45 wt. antibiotic.

Příklad 21 - kompozitní kolagenní pěnaExample 21 - composite collagen foam

Při přípravě nanostrukturované vysoce porézní kompozitní kolagenní pěny se postupuje tak, že se nejprve připraví nanovlákenná kolagenová vrstva jako v příkladu 20. Stabilizace, zamražení a lyofilizace se provede také jako v příkladu 2. Výsledná vrstva se nařeže na menší díly, například 5 x 10 cm, které se položí na sebe (5 nanovlákenných vrstev leží na sobě) a vloží se do 1% hmotn. disperze kolagenu na dobu 2 hodin při teplotě 25 °C. Za těchto podmínek dojde k prosycení zvlákněných vrstev kolagenovou disperzí, po čemž následuje zamražení na teplotu -70 °C po dobu 6 hodin a lyofilizace do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita kolagenové kompozitní pěny je po lyofilizaci opět zvýšena máčením v roztoku 95 % hmotn. ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Na 1 g kolagenu připadá 1 g EDC a 0,250 g NHS smísené se 150 ml 95% hmotn. roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána IM hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -25 °C po dobu 6 hodin a lyofilizována. Objemový poměr všech vlákenných vrstev k disperzi je 2:3, a proto i objemový poměr vlákenných vrstev a pěny ve výsledném kompozitu je 2:3, tj. konečné objemové množství kolagenových nanovlákenných vrstev v kompozitu je 40 %. Posledním krokem přípravy je impregnace kompozitní pěny 95% hmotn. roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství směsi vankomycinu a gentamicinu tak, aby jejich výsledné množství bylo 30 % hmotn. Impregnovaný kompozit se poté zamrazí na -25 °C po dobu 6 hodin a lyofilizuje. Tímto postupem je získána kompozitní pěna s výsledným množstvím kolagenu 70 % hmotn. a 30 % hmotn. antibiotik.In the preparation of a nanostructured highly porous composite collagen foam, the nanofiber collagen layer is first prepared as in Example 20. Stabilization, freezing and lyophilization are also performed as in Example 2. The resulting layer is cut into smaller pieces, e.g. 5 x 10 cm , which are placed on top of each other (5 nanofiber layers lie on top of each other) and inserted up to 1 wt. collagen dispersion for 2 hours at 25 ° C. Under these conditions, the spun layers are saturated with collagen dispersion, followed by freezing at -70 ° C for 6 hours and lyophilization to constant weight. After lyophilization, the stability of the collagen composite foam is again increased by dipping in a 95% by weight solution. ethanol and water with EDC and NHS at 37 ° C for 2 hours. 1 g of collagen contains 1 g of EDC and 0.250 g of NHS mixed with 150 ml of 95% by weight. ethanol-water solution. After collagen crosslinking, the foam is washed with 1M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -25 ° C for 6 hours and lyophilized. The volume ratio of all fiber layers to dispersion is 2: 3, and therefore the volume ratio of fiber layers and foam in the resulting composite is 2: 3, ie the final volume amount of collagen nanofiber layers in the composite is 40%. The last step of the preparation is the impregnation of the composite foam 95% by weight. a solution of ethanol with water containing a weighed amount of a mixture of vancomycin and gentamicin so that their final amount is 30% by weight. The impregnated composite is then frozen at -25 ° C for 6 hours and lyophilized. In this way, a composite foam is obtained with a final amount of collagen of 70% by weight. and 30 wt. antibiotic.

Příklad 22 - kompozitní kolagenní pěnaExample 22 - Composite collagen foam

Postupuje se stejně jako v příkladu 20, ale doba každého síťování (stabilizace) je 3 hodiny.The procedure is the same as in Example 20, but the time for each crosslinking (stabilization) is 3 hours.

Příklad 23 - kompozitní kolagenní pěnaExample 23 - Composite collagen foam

Postupuje se stejně jako v příkladu 20, ale doba každého síťování (stabilizace) je 4 hodiny.The procedure is the same as in Example 20, but the time for each crosslinking (stabilization) is 4 hours.

Příklad 24 - kompozitní kolagenní pěnaExample 24 - Composite collagen foam

Při přípravě nanostrukturované vysoce porézní kompozitní kolagenní pěny se postupuje tak, že se nejprve připraví nanovlákenná kolagenová vrstva jako v příkladu 20. Stabilizace, zamražení a lyofilizace se provede také jako v příkladu 20. Následně se šest takto připravených vrstev položí na sebe a vloží se do 0,8 % hmotn. disperze kolagenu na dobu 3 hodin při teplotě 20 °C. Za těchto podmínek dojde k prosycení nanovlákenných vrstev kolagenovou disperzí, po čemž následuje zamražení na teplotu -80 °C po dobu 4 hodin a lyofilizace do dosažení konstantní hmotnosti. Stabilita kolagenové kompozitní pěny je po lyofilizaci opět zvýšena máčením v roztoku 95% hmotn. ethanolu a vody s EDC a NHS při teplotě 30 °C po dobu 3 hodin. Na 1 g kolagenu připadá 1,40 g EDC a 0,350 g NHS smísené se 150 ml 95 % hmotn. roztoku ethanolu s vodou. Po zesíťování kolagenu je pěna promývána 1,2M hydrogen fosforečnanem disodným po dobu alespoň 30 minut a dále promyta alespoň 20 minut v destilované vodě, zamražena na -30 °C po dobu 6 hodin a lyofilizována. Objemový poměr všech vlákenných vrstev k disperzi je 1:4, a proto i objemový poměr vlákenných vrstev a pěny ve výsledném kompozitu je 1:4, tj. konečné objemové množstvíIn the preparation of a nanostructured highly porous composite collagen foam, the nanofiber collagen layer is first prepared as in Example 20. Stabilization, freezing and lyophilization are also carried out as in Example 20. Subsequently, the six layers thus prepared are stacked and placed in 0.8 wt. collagen dispersion for 3 hours at 20 ° C. Under these conditions, the nanofiber layers are saturated with collagen dispersion, followed by freezing at -80 ° C for 4 hours and lyophilization until a constant weight is reached. After lyophilization, the stability of the collagen composite foam is again increased by dipping in a 95% by weight solution. ethanol and water with EDC and NHS at 30 ° C for 3 hours. 1.40 g of EDC and 0.350 g of NHS mixed with 150 ml of 95% by weight per 1 g of collagen. ethanol-water solution. After collagen crosslinking, the foam is washed with 1.2M disodium hydrogen phosphate for at least 30 minutes and further washed for at least 20 minutes in distilled water, frozen at -30 ° C for 6 hours and lyophilized. The volume ratio of all fiber layers to dispersion is 1: 4, and therefore the volume ratio of fiber layers and foam in the resulting composite is 1: 4, ie the final volume amount

-13 CZ 309204 B6 kolagenových nanovlákenných vrstev v kompozitu je 20 %. Posledním krokem přípravy je impregnace kompozitní pěny 95% hmoto, roztokem ethanolu s vodou obsahujícím odvážené množství gentamicinu tak, aby jeho výsledné množství bylo 50 % hmota. Impregnovaný kompozit se poté zamrazí na -25 °C po dobu 6 hodin a lyofilizuje. Tímto postupem je získána kompozitní pěna s výsledným množstvím kolagenu 50 % hmota, a 50 % hmota, antibiotik.-13 CZ 309204 B6 collagen nanofiber layers in the composite is 20%. The last step of the preparation is the impregnation of the composite foam with 95% by weight, a solution of ethanol with water containing a weighed amount of gentamicin so that its final amount is 50% by weight. The impregnated composite is then frozen at -25 ° C for 6 hours and lyophilized. In this way, a composite foam is obtained with a final collagen content of 50% by weight, and 50% by weight, of antibiotics.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Degradovatelné kolagenní pěny s hemostatickými účinky, s řízenou dobou degradace a s řízeným lokálním uvolňováním antibiotik podle tohoto užitného vzoru lze využít v humánní a veterinární medicíně, zejména v chirurgii, ortopedii, traumatologii a plastické chirurgii. Použití samotné pěny je vhodné v případech, kdy se jedná o potenciálně infekční terén, například hrozí riziko vzniku infekce při operaci nebo ošetření otevřené rány nebo vředu. V některých případech lze použít jen samotné kolagenové krytí díky jeho hemokoagulačním účinkům. Přídavek aktivních látek, například antibiotik pak slouží jako rychlá, krátkodobá prevence. Rychlejší je i doba rozpadu. Sendvičové kolagenní pěny s málo porézním jádrem a vysoce porézními okrajovými vrstvami s hemostatickými účinky, s řízenou dobou degradace a s řízeným lokálním uvolňováním antibiotik podle tohoto užitného vzoru lze využít v humánní a veterinární medicíně, zejména v chirurgii, ortopedii, krytí ran, léčbě bércových vředů, traumatologii a plastické chirurgii. Vhodná je zejména u méně rozsáhlých zánětů nebo v potenciálně infekčním terénu, tedy tam, kde je zapotřebí nejprve rychlé uvolnění optimální dávky aktivní látky, a následně dlouhodobější účinek aktivní látky, díky kterému se zamezí opětovnému vzniku zánětu. Nanostruktarované vysoce porézní kompozitní kolagenní pěny s hemostatickými účinky, s řízenou dobou degradace a s řízeným lokálním uvolňováním antibiotik podle tohoto užitného vzoru lze využít v humánní a veterinární medicíně, zejména v chirurgii, ortopedii, traumatologii a plastické chirurgii. Kompozitní kolagenová pěna impregnovaná antibiotiky je vhodná zejména pro použití při vysokém riziku infekce, přičemž se vyznačuje rychlým a dlouhodobým uvolňováním antibiotik.Degradable collagen foams with hemostatic effects, with a controlled degradation time and with a controlled local release of antibiotics according to this utility model can be used in human and veterinary medicine, especially in surgery, orthopedics, traumatology and plastic surgery. The use of the foam itself is suitable in cases where the terrain is potentially infectious, for example, there is a risk of infection during surgery or treatment of an open wound or ulcer. In some cases, only the collagen coating alone can be used due to its hemocoagulating effects. The addition of active substances, such as antibiotics, then serves as a quick, short-term prevention. The disintegration time is also faster. Collagen sandwich foams with a low porous core and highly porous marginal layers with hemostatic effects, controlled degradation time and controlled local release of antibiotics according to this utility model can be used in human and veterinary medicine, especially in surgery, orthopedics, wound dressings, treatment of shin ulcers, traumatology and plastic surgery. It is particularly suitable for less extensive inflammations or in potentially infectious terrain, ie where a rapid release of the optimal dose of active substance is required first, followed by a longer-lasting effect of the active substance, thus preventing recurrence of inflammation. Nanostructured highly porous composite collagen foams with hemostatic effects, controlled degradation time and controlled local release of antibiotics according to this utility model can be used in human and veterinary medicine, especially in surgery, orthopedics, traumatology and plastic surgery. Antibiotic-impregnated composite collagen foam is particularly suitable for use at high risk of infection, and is characterized by rapid and sustained release of antibiotics.

Claims

PATENT CLAIMS

Collagen composite for controlled release of active substances, characterized in that it comprises at least one layer of highly porous foam which contains type I collagen and has an open porosity in the range of 70 to 90% and a mean pore size of 50 to 200 μm, wherein at least 50% by volume of the pores have a pore size above 80 μm, and at least one nanofiber collagen layer, where the fiber diameter of the nanofiber layer is in the range of 100 to 350 nm.

Collagen composite according to claim 1, characterized in that the highly porous layer has an open porosity in the range of 80 to 90% and / or that the composite is arranged in more than two layers, all nanofiber layers together constituting 20 to 60% by volume. with respect to the total volume of the composite.

Collagen composite according to claim 1 or 2, characterized in that the composite is arranged in at least five layers, where a layer of highly porous foam alternates regularly with a nanofiber layer, all nanofiber layers together forming 20 to 60% by volume relative to the total. composite volume.

Collagen composite according to any one of the preceding claims 1 to 3, characterized in that it further comprises at least one active substance and that the weight ratio of collagen to the total amount of active substances in the collagen foam is in the range of 2: 3 to 7: 3.

Process for the preparation of a collagen composite as defined in claim 1, characterized in that a nanofiber collagen layer is first prepared by electrostatic spinning, stabilized by chemical crosslinking, then washed, frozen at -60 to -90 ° C for 3 to 8 hours and lyophilized, then the nanofibrous collagen layer is left in 0.1 to 3 wt. collagen dispersion for 1 to 3 hours at 15 to 25 ° C, then frozen at -60 to -90 ° C for 3 to 8 hours and lyophilized to form a collagen composite foam, which is then stabilized by physical or chemical crosslinking , after which it is washed, frozen and lyophilized.

The preparation method according to claim 5, a collagen composite as defined in claim 2, characterized in that a nanofiber collagen layer is first prepared by electrostatic spinning, which is stabilized by chemical crosslinking, then washed, frozen at -60 to -90 ° C after for 3 to 8 hours and lyophilized, then two or more of the thus prepared nanofiber layers laid on top of each other are left in 0.1 to 3% by weight. collagen dispersion for 1 to 3 hours at 15 to 25 ° C, then frozen at -60 to -90 ° C for 3 to 8 hours and lyophilized to form a collagen composite foam, which is then stabilized by physical or chemical crosslinking , after which it is washed, frozen and lyophilized.

Process for the preparation of a collagen composite according to Claim 5 or 6, characterized in that the crosslinking is chemical and is carried out by dipping the foam in a 95% strength by weight solution. ethanol and water with N- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide at 25-40 ° C for 2-4 hours.

Process for the preparation of a collagen composite according to Claim 7, characterized in that the amount of N- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride is 0.5 to 1.5 g per 1 g of collagen and the amount of A-hydroxysuccinimide is 0.125 to 0.750 g.

The preparation method according to claim 5 of a collagen composite as defined in claim 4, characterized in that the composite is impregnated with 95% by weight after the last lyophilization. ethanol solution with water

Containing one or more active substances, preferably selected from the group consisting of an antibiotic, an anesthetic, an antiplatelet agent, an antiviral agent, or a mixture thereof, preferably an antibiotic.