CZ308677B6

CZ308677B6 - Method of obtaining an astaxanthin-based phytocomplex from microalgae biomass

Info

Publication number: CZ308677B6
Application number: CZ2019799A
Authority: CZ
Inventors: José Carlos Cheel Horna; Horna José Carlos Cheel; Tereza Fábryová; Tereza Mgr Fábryová; Jiří Kopecký; Jiří Ing. Kopecký; Jiří Zubatý; Jiří Ing Zubatý; Pavel Hrouzek; Pavel RNDr. Hrouzek
Original assignee: AVEFLOR, a.s.; Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i.
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2021-02-10
Also published as: CZ2019799A3

Abstract

The invention relates to a new process for isolating and purifying a phytocomplex containing astaxanthin monoesters from the biomass of Haematococcus pluvialis microalgae by countercurrent shaking chromatography. First, an extraction two-phase solvent system is prepared from n-heptane-acetonitrile in a ratio of 1:1 (v / v), in the upper phase of which algal biomass is extracted. The resulting crude extract was dried and dissolved in the upper phase of an extraction two-phase solvent system to prepare a sample for injection into countercurrent shaking chromatography. The lower phase is the lower phase of the extraction two-phase solvent system and the stationary phase is the upper phase of the extraction two-phase solvent system. The sample for injection is applied to a countercurrent chromatography column to elute a phytocomplex containing astaxanthin monoesters, which is then isolated.

Description

Způsob získání fytokomplexu na bázi astaxantinu z biomasy mikrořasMethod for obtaining an astaxanthin-based phytocomplex from microalgae biomass

Oblast technikyField of technology

Vynález se týká oblasti mikrobiologie, konkrétně způsobu získání fytokomplexu na bázi astaxantinu z biomasy mikrořas.The invention relates to the field of microbiology, in particular to a process for obtaining an astaxanthin-based phytocomplex from microalgae biomass.

Dosavadní stav technikyPrior art

Astaxantin označovaný jako AXT patří do skupiny karotenoidů, systematickým názvem (3S,3'S)3,3'-dihydroxy-P,P-carotene-4,4'-dione, sumární vzorec C40H52O4, molámí hmotnost 596,84 g.rnol“¹, se strukturním vzorcem (3S, 3'S):Astaxanthin AXT designated as belonging to the group of carotenoids, systematic name (3S, 3'S) 3,3-dihydroxy-P, P-carotene-4,4'-dione, the molecular formula C40H52O4, Molar mass 596.84 g.rnol ^"1 , with structural formula (3S, 3'S):

Jako potravinářské barvivo má astaxantin označení E161, symbol CAS 472-61-7. V čisté formě je astaxantin červená krystalická látka, nerozpustná ve vodě, rozpustná v tucích a v nepolárních organických rozpouštědlech. Chemická syntéza «//-/ram-astaxantinu je velmi obtížná a časově náročná, neboť molekula astaxantinu obsahuje dvě centra chirality (C3, C3'), a proto mohou vzniknout tři optické izomery (3S,3'S; 3R,3'S a 3R,3'R).As a food coloring, astaxanthin has the designation E161, the symbol CAS 472-61-7. In pure form, astaxanthin is a red crystalline substance, insoluble in water, soluble in fats and in non-polar organic solvents. The chemical synthesis of N-astaxanthin is very difficult and time consuming, as the astaxanthin molecule contains two centers of chirality (C3, C3 '), and therefore three optical isomers (3S, 3'S; 3R, 3'S and 3R, 3 can be formed). 'R).

Technologie používané při výrobě astaxantinu se liší v závislosti na použitém zdroji. Syntetický astaxantin se vyrábí chemickou syntézou za použití Wittigovy nebo Grignardovy reakce. Přírodní zdroje astaxantinu zahrnují především řasy, kvasinky a další mikroorganismy. Pro komerční účely je v současnosti hlavním přírodním zdrojem astaxantinu zelená mikrořasa Haematococcus pluvialis. V menší míře jsou využívány další mikrořasy Chlorella zofingiensis, Scenedesmus sp., Pleurastrum sp., kvasinka Xanthophyllomyces dendrorhous (také nazývaná Phaffia rhodozyma), nebo bakterie Paracoccus carotinifaciens. Zásadní rozdíl ve složení astaxantinu získaného z různých zdrojů je v přítomnosti volného astaxantinu označovaného AXT nebo jeho esterifikovaných forem označovaných AXTe. Mikrořasy obsahují především monoestery astaxantinu označované AXTme a v menší míře také diestery astaxantinu označované AXTde v optimální konfiguraci 3S,3 'S, zatímco kvasinky a bakterie obsahují pouze volný astaxantin, navíc v méně příznivé konfiguraci 3R,3'R. Syntetický astaxantin je též pouze volný neesterifikovaný astaxantin obsahující směs optických izomerů (3S, 3S'), (3R, 3S'), a (3R, 3R) v poměru 1:2:1. Z těchto důvodů je možno volný astaxantin získaný synteticky nebo z kvasinek a bakterií využívat pouze v krmivářském průmyslu, především v oblasti akvakultur pro pigmentaci lososů, pstruhů a krevet. Zastoupení různých forem astaxantinu v zelené mikrořase Haematococcus pluvialis je v průměru tvořeno 70 % AXTme, 15 % AXTde a 5 % volného AXT a výhradně je ve formě stereoizomeru 3-S,3'-S. Toto je hlavní důvod, proč je astaxantin získaný z mikrořasy H. pluvialis využíván k přípravě výživových doplňků, jídla, nápojů, kosmetických přípravků a ve farmacii. Astaxantin získaný z mikrořasy H pluvialis je komerčně nabízen ve formě oleoresinu a prášku z biomasy. Ovšem oleoresin a prášek z biomasy získané z této mikrořasy jsou ve skutečnosti směsi, které obsahují volný AXT, AXTme a AXTde spolu s mnoha dalšími lipofilními sloučeninami, převážně acylglyceroly a jinými karotenoidy, z nichž některé vykazují výrazný pro-oxidační efekt.The technology used to make astaxanthin varies depending on the source used. Synthetic astaxanthin is produced by chemical synthesis using the Wittig or Grignard reaction. Natural sources of astaxanthin include mainly algae, yeast and other microorganisms. For commercial purposes, the main natural source of astaxanthin is currently the green microalga Haematococcus pluvialis. To a lesser extent, other microalgae Chlorella zofingiensis, Scenedesmus sp., Pleurastrum sp., The yeast Xanthophyllomyces dendrorhous (also called Phaffia rhodozyma), or the bacterium Paracoccus carotinifaciens are used. The main difference in the composition of astaxanthin obtained from different sources is in the presence of free astaxanthin called AXT or its esterified forms called AXTe. Microalgae contain mainly AXTme-designated astaxanthin monoesters and to a lesser extent AXTde-designated astaxanthin diesters in the optimal 3S, 3'S configuration, while yeast and bacteria contain only free astaxanthin, in addition to the less favorable 3R, 3'R configuration. Synthetic astaxanthin is also only free unesterified astaxanthin containing a 1: 2: 1 mixture of optical isomers (3S, 3S '), (3R, 3S'), and (3R, 3R). For these reasons, free astaxanthin obtained synthetically or from yeasts and bacteria can only be used in the feed industry, especially in the field of aquaculture for the pigmentation of salmon, trout and shrimp. The proportion of various forms of astaxanthin in the green microalgae Haematococcus pluvialis is on average 70% AXTme, 15% AXTde and 5% free AXT and is exclusively in the form of the stereoisomer 3-S, 3'-S. This is the main reason why astaxanthin obtained from the H. pluvialis microalgae is used in the preparation of nutritional supplements, food, beverages, cosmetics and in pharmacy. Astaxanthin obtained from the microalgae H pluvialis is commercially available in the form of oleoresin and biomass powder. However, oleoresin and biomass powder obtained from this microalgae are in fact mixtures which contain free AXT, AXTme and AXTde together with many other lipophilic compounds, mainly acylglycerols and other carotenoids, some of which show a significant pro-oxidant effect.

-1 CZ 308677 B6-1 CZ 308677 B6

V případě prášku z biomasy, celkový obsah astaxantinu je ještě nižší, a to 2 až 4 %. Stručně řečeno, astaxantin extrahovaný z mikrořas se získává v komplexní směsi, která může zahrnovat mnoho neznámých vedlejších produktů jejich metabolismu, proto není vhodné použití této směsi jako potravního doplňku, neboť nelze přesně charakterizovat její složení.In the case of biomass powder, the total astaxanthin content is even lower, at 2 to 4%. Briefly, astaxanthin extracted from microalgae is obtained in a complex mixture, which may include many unknown by-products of their metabolism, so it is not appropriate to use this mixture as a dietary supplement, as its composition cannot be precisely characterized.

Bylo prokázáno, že astaxantin má mnoho pozitivních účinků na lidské zdraví, mezi nej významnější biologické aktivity patří antioxidační aktivita a jeho protizánětlivé účinky. Všechny testy biologických aktivit však byly prováděny buď na volném astaxantinu, a to jak syntetickém, tak přírodním, nebo na surové směsi AXTe izolované z přírodních zdrojů. Bylo též prokázáno, že esterifikace zvyšuje stabilitu, hydrofobicitu, a tím rozpustnost v lipidech a lepší biologické účinky. Obecně se AXTe snadněji vstřebávají, a tím vykazují daleko vyšší biologickou účinnost než volný astaxantin. Neexistuje však žádná studie prováděná na izolovaných fytokomplexech čistých směsí AXTme ani AXTde. Nedávné farmakologické studie ukázaly, že astaxantin ve formě AXTe, vykazuje vyšší hepatoprotektivní a antioxidační účinky, má lepší vlastnosti při léčbě vředových onemocnění, vyšší účinnost v boji proti rakovině kůže a obecně vyšší dostupnost pro lidský organismus než volný astaxantin. Silné antioxidační vlastnosti AXTde se výrazněji projevují za hydrofobních podmínek, zatímco AXTme působí lépe v mírně hydrofílním prostředí. Obecně lze AXTe s výhodou používat jako bezpečné bioaktivní složky ve farmaceutických přípravcích, kosmetických přípravcích, konkrétně přípravcích pro péči o pokožku a proti stárnutí, peelingy, krémy a masky, a nutraceutických přípravcích pro své antioxidační vlastnosti. Astaxantin také pomáhá stimulovat kontinuální produkci kolagenu v kůži, který je zodpovědný za pevnost pokožky a její pružnost. Může také inhibovat melanogenezi asi o 40 %, zmenšuje stařecké skvrny, pihy a tmavé kruhy pod očima. Může se též využít k redukci vrásek, k hydrataci pokožky a rovněž i pro zvýšení její hladkosti a pevnosti. Klinické studie prokázaly pozitivní přínosy astaxantinu v oblasti kardiovaskulárního systému, očí a mozku a ochrany kůže před poškozením UV zářením. Další studie ukázaly zlepšení vytrvalosti a síly, ale i jiné oblasti použití pro sportovce. Mnohé epidemiologické studie prokázaly, že astaxantin významně redukuje riziko vzniku velmi širokého spektra chorob, jakými jsou různé druhy rakoviny, žaludeční vředy, onemocnění jater, diabetes, oxidační poškození očí a kůže UV světlem, infarkt nebo ischemická choroba srdeční a neurodegenerativní onemocnění. Význam astaxantinu spočívá především ve skutečnosti, že jeho antioxidační kapacita je mnohonásobně silnější než jiné sloučeniny, jako např. ^-karoten, vitamin E, zeaxantin, kanthaxantin nebo lutein. Na rozdíl od lykopenu, /?-karotenu a luteinu, astaxantin postrádá pro-oxidační účinek a chrání tak membránové struktury.Astaxanthin has been shown to have many positive effects on human health, the most important biological activities being antioxidant activity and its anti-inflammatory effects. However, all biological activity assays were performed on either free astaxanthin, both synthetic and natural, or on crude AXTe mixtures isolated from natural sources. Esterification has also been shown to increase stability, hydrophobicity, and thus lipid solubility and better biological effects. In general, AXTe are more easily absorbed, and thus show much higher biological activity than free astaxanthin. However, there is no study performed on isolated phytocomplexes of pure AXTme or AXTde mixtures. Recent pharmacological studies have shown that astaxanthin in the form of AXTe has higher hepatoprotective and antioxidant effects, better properties in the treatment of ulcers, higher efficacy in the fight against skin cancer and generally higher availability to the human body than free astaxanthin. The strong antioxidant properties of AXTde are more pronounced under hydrophobic conditions, while AXTme works better in a slightly hydrophilic environment. In general, AXTe can be advantageously used as safe bioactive ingredients in pharmaceutical preparations, cosmetic preparations, in particular skin care and anti-aging preparations, peelings, creams and masks, and nutraceutical preparations for their antioxidant properties. Astaxanthin also helps stimulate the continuous production of collagen in the skin, which is responsible for the firmness of the skin and its elasticity. It can also inhibit melanogenesis by about 40%, reducing age spots, freckles and dark circles under the eyes. It can also be used to reduce wrinkles, to hydrate the skin and also to increase its smoothness and firmness. Clinical studies have shown positive benefits of astaxanthin in the cardiovascular system, eyes and brain, and in protecting the skin from UV damage. Further studies have shown improvements in endurance and strength, as well as other areas of application for athletes. Many epidemiological studies have shown that astaxanthin significantly reduces the risk of developing a very wide range of diseases, such as various cancers, gastric ulcers, liver disease, diabetes, oxidative damage to the eyes and skin by UV light, heart attack or coronary heart disease and neurodegenerative diseases. The importance of astaxanthin lies primarily in the fact that its antioxidant capacity is many times stronger than other compounds, such as β-carotene, vitamin E, zeaxanthin, canthaxanthin or lutein. Unlike lycopene, β-carotene and lutein, astaxanthin lacks a pro-oxidant effect and thus protects membrane structures.

Všechny výše uvedené důvody zvyšují v posledních letech zájem o aplikace astaxantinu v oblasti farmacie. Budoucí výzkum se musí zaměřit na studium biologických aktivit těchto skupin látek přírodního původu. Tento výzkum je však přímo závislý na dostupnosti AXTe v požadovaném množství, složení a čistotě.All of the above reasons have increased interest in the application of astaxanthin in the field of pharmacy in recent years. Future research must focus on studying the biological activities of these groups of substances of natural origin. However, this research is directly dependent on the availability of AXTe in the required quantity, composition and purity.

V současnosti se pro izolaci volného astaxantinu využívá převážně preparativní vysokoúčinná kapalinová chromatografie označovaná PrepHPLC. Tato metoda je však málo efektivní v důsledku dlouhých separačních časů, velké spotřebě rozpouštědel, rozkladem nebo nevratnou adsorpcí na sorbent, a především pak vysokou cenou instrumentace i separačních kolon. Další možností jsou protiproudé separační techniky neboli countercurrent separation CCS, které využívají vlastností dvou nemísitelných kapalin bez přítomnosti jakékoliv pevné stacionární fáze. Obecně je možno rozdělovači chromatografické techniky rozdělit na základě způsobu, jakým je realizována retence kapalné stacionární fáze, a to s využitím gravitační síly, kde se jedná o protiproudou kapkovou chromatografii neboli CDC, nebo odstředivé síly na principu hydrodynamickém, kde se jedná o protiproudou chromatografii neboli CCC, a hydrostatickém, kde se jedná o centrifúgační rozdělovači chromatografii neboli CPC. Separace cílových látek poté probíhá na základě jejich hodnoty rozdělovacího koeficientu (K) pro dané němí site Iné kapalné fáze. Mezi hlavní výhody všech protiproudých separačních technik patří eliminace ireverzibilní adsorpce, nízká spotřeba rozpouštědel, větší objem nástřiku, nízké riziko denaturace vzorku, velká separační kapacita a vynikající regenerace mezi nástřiky. Tato metoda ve srovnání s PrepHPLC navíc vykazuje vysokou výtěžnost izolovaného produktu pří výrazně nižší spotřebě rozpouštědel. Z těchto důvodů seAt present, the preparation of free astaxanthin uses predominantly preparative high performance liquid chromatography called PrepHPLC. However, this method is inefficient due to long separation times, high solvent consumption, decomposition or irreversible adsorption on the sorbent, and above all the high cost of instrumentation and separation columns. Another possibility is countercurrent separation techniques or countercurrent separation CCS, which use the properties of two immiscible liquids without the presence of any solid stationary phase. In general, chromatographic separation techniques can be separated based on the manner in which the retention of the liquid stationary phase is realized, using gravitational force in the case of countercurrent droplet chromatography or CDC, or centrifugal force on hydrodynamic principles in the case of countercurrent chromatography or CCC, and hydrostatic, which is centrifugal size exclusion chromatography or CPC. The separation of the target substances then takes place on the basis of their value of the partition coefficient (K) for the given silent sieve Other liquid phases. The main advantages of all countercurrent separation techniques include elimination of irreversible adsorption, low solvent consumption, larger injection volume, low risk of sample denaturation, large separation capacity and excellent regeneration between injections. In addition, compared to PrepHPLC, this method shows a high yield of isolated product with significantly lower solvent consumption. For these reasons,

- 2 CZ 308677 B6 v poslední době tato metoda stala účinným preparativní technikou široce používanou pro separaci a čištění biologicky aktivních sloučenin získávaných z přírodních zdrojů.Recently, this method has become an effective preparative technique widely used for the separation and purification of biologically active compounds obtained from natural sources.

V současnosti se všechny výše uvedené způsoby izolace a purifikace omezují pouze na získávání volného AXT. Problematika separace čistých esterifikovaných forem astaxantinu AXTe dosud nebyla uspokojivě vyřešena v laboratorním ani v pilotním měřítku.At present, all of the above methods of isolation and purification are limited to obtaining free AXT. The issue of separation of pure esterified forms of astaxanthin AXTe has not yet been satisfactorily resolved on a laboratory or pilot scale.

Úkolem vynálezu je proto vytvoření způsobu získání fýtokomplexu na bázi astaxantinu z biomasy mikrořas, který by odstraňoval výše uvedené nedostatky, který by poskytoval vysoký výtěžek fýtokomplexu tvořeného směsí volného astaxantinu a esterifikovaných forem astaxantinu bez vedlej ších produktů metabolismu mikrořas, a který by výrazně zj ednodušoval časově i ekonomicky náročný proces získání fýtokomplexu z biomasy mikrořas.It is therefore an object of the present invention to provide a process for obtaining an astaxanthin-based phytocomplex from microalgae biomass which overcomes the above drawbacks, which provides a high yield of a phytocomplex formed of a mixture of free astaxanthin and esterified forms of astaxanthin without by-products of microalgal metabolism. and an economically demanding process of obtaining a phytocomplex from microalgae biomass.

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Vytčený úkol je vyřešen pomocí způsobu získání fýtokomplexu na bázi astaxantinu z biomasy mikrořas podle tohoto vynálezu. Vynález se týká nového postupu izolace a purifikace fýtokomplexu obsahujícího monoestery astaxantinu neboli AXTme pomocí protiproudé vytřepávací chromatografie neboli Coutercurrent Chromatography CCC. Navržený postup se vyznačuje vysokou výtěžností získané frakce fýtokomplexu. Předkládaný vynález tedy popisuje účinný způsob získání fýtokomplexu na bázi astaxantinu z biomasy mikrořasy Haematococcus pluvialis pomocí komplexního procesu zahrnujícího krok extrakce biomasy mikrořas a krok izolace fýtokomplexu ze vzniklého surového extraktu pomocí vysoce účinné protiproudé vytřepávací chromatografie s vícenásobným nástřikem. Surový extrakt obsahuje směs volného astaxantinu, monoesteru astaxantinu, diesteru astaxantinu, pigmentů a lipidů.The object is achieved by the method for obtaining an astaxanthin-based phytocomplex from the microalgae biomass according to the invention. The invention relates to a new process for the isolation and purification of a phytocomplex containing astaxanthin monoesters or AXTme by means of countercurrent chromatography (Coutercurrent Chromatography CCC). The proposed process is characterized by a high yield of the obtained phytocomplex fraction. Thus, the present invention describes an efficient method for obtaining an astaxanthin-based phytocomplex from Haematococcus pluvialis microalgal biomass by a complex process comprising the step of extracting microalgal biomass and the step of isolating the phytocomplex from the resulting crude extract by high performance countercurrent multiple chromatography. The crude extract contains a mixture of free astaxanthin, astaxanthin monoester, astaxanthin diester, pigments and lipids.

Podstata tohoto vynálezu spočívá v tom, že se připraví extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém sestávající z několika organických rozpouštědel v různých poměrech, který vykazuje vhodnou hodnotu rozdělovacího koeficientu (K), vhodnou dobu ustálení extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému a vhodnou hustotu pro pět majoritních monoesterů astaxantinu AXTme tvořících fýtokomplex, a který je dále použit pro celý proces čištění a následné izolace. Ve vybraném extrakčním dvoufázovém rozpouštědlovém systému je rozpustnost fýtokomplexu vyšší v horní fázi, takže horní fáze se používá i jako rozpouštědlo pro efektivní extrakci biomasy. Hodnota K navíc vykazuje ideální rozdělovači poměr fýtokomplexu mezi horní fází a spodní fází, což je vhodné pro účely jeho izolace za použití protiproudé vytřepávací chromatografie neboli CCC, a proto se horní fáze použije jako stacionární fáze a spodní fáze jako fáze mobilní.The object of the present invention is to provide an extraction biphasic solvent system consisting of several organic solvents in different ratios which has a suitable partition coefficient (K), a suitable settling time of the extraction biphasic solvent system and a suitable density for the five major astaxanthin AXTme monoesters forming phytocomplex, and which is further used for the whole process of cleaning and subsequent isolation. In the selected extraction two-phase solvent system, the solubility of the phytocomplex is higher in the upper phase, so that the upper phase is also used as a solvent for efficient biomass extraction. In addition, the K value shows an ideal partition ratio of the phytocomplex between the upper phase and the lower phase, which is suitable for its isolation using countercurrent shaking chromatography or CCC, and therefore the upper phase is used as stationary phase and the lower phase as mobile phase.

Ve výhodném provedení se biomasa mikrořas extrahuje třikrát a výsledné extrakty se spojí za vzniku výsledného surového extraktu. Surový extrakt se z biomasy mikrořas extrahuje pomocí macerace a/nebo mechanickým rozrušením buněk biomasy. Vzorek pro nástřik se s výhodou nanese do kolony protiproudé vytřepávací chromatografie pětkrát pro získání většího množství fýtokomplexu.In a preferred embodiment, the microalgae biomass is extracted three times and the resulting extracts are combined to form the final crude extract. The crude extract is extracted from the algal biomass by maceration and / or mechanical disruption of the biomass cells. The sample for injection is preferably applied to a countercurrent chromatography column five times to obtain a larger amount of phytocomplex.

Tento přístup má dvě výhody. Za prvé, použití horní fáze vybraného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému pro extrakci biomasy zabezpečí jeho vysokou selektivitu ve vztahu k fýtokomplexu, takže dochází k vyloučení vysoce lipofilních nečistot. Tím se zkracuje proces čištění a zajišťuje vysoký výtěžek fýtokomplexu. Za druhé, umožňuje vícenásobný nástřik vzorků pro izolaci fýtokomplexu pomocí protiproudé vytřepávací chromatografie CCC, protože po jeho eluci se již neobjeví žádné nečistoty, které by mohly narušit a kontaminovat následný izolační cyklus. Nástřik vzorku se provádí bez nutnosti obnovit hydrodynamickou rovnováhu extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému, čímž se významně sníží spotřeba rozpouštědel a času. Na rozdíl od všech předcházejících způsobů izolace astaxantinu AXT z přírodních zdrojů, způsob jeho získání dle předkládaného vynálezu sjednocuje chemickou povahu rozpouštědel používanýchThis approach has two advantages. First, the use of the upper phase of the selected two-phase extraction solvent system for biomass extraction will ensure its high selectivity with respect to the phytocomplex, so that highly lipophilic impurities are eliminated. This shortens the cleaning process and ensures a high yield of the phytocomplex. Second, it allows multiple injections of samples for isolation of the phytocomplex by means of countercurrent shaking chromatography of CCC, because after its elution no impurities will appear which could disrupt and contaminate the subsequent isolation cycle. The sample is injected without the need to restore the hydrodynamic equilibrium of the extraction two-phase solvent system, thus significantly reducing solvent consumption and time. Unlike all previous methods of isolating astaxanthin AXT from natural sources, the method of obtaining it according to the present invention unifies the chemical nature of the solvents used.

-3CZ 308677 B6 v celém procesu purifikace, čímž zvyšuje jeho účinnost a ekonomiku. Výsledkem způsobu podle tohoto vynálezu je fytokomplex s vyšším podílem esterifikovaných forem astaxantinu AXTe v porovnání s oleoresinem, či práškem z biomasy, který je vhodný pro lidskou spotřebu i aplikaci v kosmetice či farmacii. Tento integrovaný přístup lze navíc jednoduše rozšířit na průmyslovou úroveň.-3GB 308677 B6 throughout the purification process, thus increasing its efficiency and economy. The method according to the invention results in a phytocomplex with a higher proportion of esterified forms of astaxanthin AXTe compared to oleoresin, or biomass powder, which is suitable for human consumption and application in cosmetics or pharmacy. In addition, this integrated approach can easily be extended to the industrial level.

Hlavní výhodou způsobu získání fýtokomplexu na bázi astaxantinu z biomasy mikrořas podle tohoto vynálezu je použití jednotného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému v celém procesu získání čistého fýtokomplexu. Vynález dále inovativně využívá stanovení dělicích koeficientů jednotlivých monoesterů astaxantinu AXTme obsažených ve fýtokomplexu jako kritéria pro integraci kroků extrakce a izolace. Další výhodou takto získaného fýtokomplexu oproti běžně dodávaným surovým extraktům ve formě oleoresinu obsahujícím široké spektrum dalších látek je jeho vyšší podíl esterifikovaných forem astaxantinu AXTe, jenž vykompenzuje dodatečné náklady na použití protiproudé vytřepávací chromatografie CCC separační technologie. Dosažený stupeň čistoty fýtokomplexu a reprodukovatelnost jeho přípravyje zvláště významná při aplikacích v oblasti farmacie a zdravotnictví. Další výhodou tohoto způsobu je zvýšení výtěžnosti celého izolačního procesu získávání fýtokomplexu obsahujícího monoestery astaxantinu a jeho rozšiřitelnost neboli up-scale na průmyslovou úroveň. V současné době je zkoumána biologická aktivita izolované frakce esterů astaxantinu a předběžné výsledky poukazují na možností jejího následného využití společnostmi zabývajícími se výrobou bioaktivních ingrediencí z přírodních zdrojů v potravinářském, krmivářském, farmaceutickém i kosmetickém průmyslu.The main advantage of the method for obtaining an astaxanthin-based phytocomplex from microalgal biomass according to the invention is the use of a uniform extraction two-phase solvent system in the whole process of obtaining a pure phytocomplex. The invention further innovatively utilizes the determination of the partition coefficients of the individual astaxanthin AXTme monoesters contained in the phytocomplex as criteria for the integration of the extraction and isolation steps. Another advantage of the phytocomplex thus obtained over the commercially available crude extracts in the form of oleoresin containing a wide range of other substances is its higher proportion of esterified forms of astaxanthin AXTe, which compensates for the additional costs of using countercurrent CCC separation technology. The achieved degree of purity of the phytocomplex and the reproducibility of its preparation is particularly important in applications in the field of pharmacy and healthcare. Another advantage of this method is the increase in the yield of the whole isolation process of obtaining the phytocomplex containing astaxanthin monoesters and its scalability or up-scale to the industrial level. The biological activity of the isolated fraction of astaxanthin esters is currently being investigated and preliminary results indicate the possibility of its subsequent use by companies engaged in the production of bioactive ingredients from natural sources in the food, feed, pharmaceutical and cosmetic industries.

Objasnění výkresůExplanation of drawings

Uvedený vynález bude blíže objasněn na následujících vyobrazeních, kde:The present invention will be further elucidated in the following figures, where:

obr. 1 znázorňuje graf optimalizace průtoku mobilní fáze v protiproudé vytřepávací chromatografii obr. 2 znázorňuj e graf zobrazuj ící metodu j ednorázového nástřiku vzorku do CCC v laboratorním měřítku, obr. 3 znázorňuje graf zobrazující metodu vícenásobného nástřiku vzorku do CCC v laboratorním měřítku, obr. 4 znázorňuje graf zobrazující metodu jednorázového nástřiku vzorku do CCC v pilotním měřítku, obr. 5 znázorňuje graf zobrazující metodu vícenásobného nástřiku vzorku do CCC v pilotním měřítku, obr. 6 znázorňuje tabulku zobrazující hodnoty dělicího koeficientu, doby ustálení a rozdíl hustoty ASTme v různých extrakčních dvoufázových rozpouštědlových systémech, obr. 7 znázorňuje tabulku zobrazující optimalizace poměru hmoty extraktu k objemuFig. 1 is a graph of mobile phase flow optimization in countercurrent shaking chromatography; Fig. 2 is a graph showing a single sample sample injection method into CCC on a laboratory scale; Fig. 3 is a graph showing a multiple sample injection method into CCC sample on a laboratory scale; 4 is a graph showing a single sample injection method into the CCC on a pilot scale, FIG. 5 is a graph showing a multiple sample injection method into the CCC on a pilot scale, FIG. 6 is a table showing partition values, settling times and ASTme density difference in different two-phase extraction. solvent systems, Fig. 7 is a table showing the optimum mass to volume ratio optimizations

Příklady uskutečnění vynálezuExamples of embodiments of the invention

Výběr extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systémuSelection of an extraction two-phase solvent system

Při výběru vhodného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému bylo testováno několik různých extrakčních dvoufázových rozpouštědlových systémů složených z w-heptanu, acetonitrilu, acetonu a etanolu v různých poměrech. Jako kritérium při výběru vhodného extrakčníhoSeveral different two-phase solvent extraction systems composed of n-heptane, acetonitrile, acetone and ethanol in various ratios were tested to select a suitable two-phase solvent extraction system. As a criterion in selecting a suitable extraction

-4CZ 308677 B6 dvoufázového rozpouštědlového systému byla použita hodnota dělicího koeficientu (K), hodnota doby ustálení extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému a rozdílu hustoty pro pět majoritních esterů astaxantinu tvořících fytokomplex. Optimální hodnoty všech výše uvedených parametrů vykazoval extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém složený z w-heptanuacetonitrilu v poměru 1:1 (v/v) označený jako Systém 1 na obr. 6 v tabulce 1. Především hodnoty rozdělovačích koeficientů pro jednotlivé monoestery astaxantinu AXTme ukazují, že rozpustnost jednotlivých esterifikovaných forem astaxantinu AXTe je lepší pro horní fázi Systému 1 označovanou jako UP1. Vyšší afinita AXTe k UP1 navíc umožňuje selektivní extrakci AXTme s vysokým výtěžkem s výjimkou vysoce lipofilních nečistot. Z tohoto důvodu se UP1 výhodně používá jak pro extrakci biomasy, tak i pro následný krok izolace fýtokomplexu jako stacionární fáze v CCC. Tento extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém dále umožňuje nástřik velkého množství vzorku a také aplikaci metody vícenásobného nástřiku vzorků.The value of the partition coefficient (K), the settling time of the extraction of the two-phase solvent system and the difference in density for the five major esters of astaxanthin forming the phytocomplex were used. The optimal values of all the above parameters were shown by the extraction two-phase solvent system composed of n-heptaneacetonitrile in the ratio 1: 1 (v / v) designated as System 1 in Fig. 6 in Table 1. In particular the values of partition coefficients for individual monoesters of astaxanthin AXTme show that the solubility of the individual esterified forms of astaxanthin AXTe is better for the upper phase of System 1 referred to as UP1. In addition, the higher affinity of AXTe for UP1 allows the selective extraction of AXTme in high yield with the exception of highly lipophilic impurities. For this reason, UP1 is preferably used both for biomass extraction and for the subsequent step of isolating the phytocomplex as a stationary phase in CCC. This two-phase solvent extraction system further allows the injection of a large amount of sample as well as the application of the multiple sample injection method.

Extrakce biomasyBiomass extraction

Pro získání fýtokomplexu dle tohoto vynálezu byla použita sprej ově sušená a dezintegrovaná biomasa mikrořasy Haematococcus pluvialis. V jiném příkladu provedení se pro získání surového extraktu použije macerace. Pomocí UP1 byl získán surový extrakt s vyšším obsahem fýtokomplexu než u extraktů, které byly získány pomocí acetonu, jenž je považován za nejúčinnější referenční rozpouštědlo pro extrakci AXTe z biomasy mikrořas. Extrakce biomasy byla opakována třikrát se stejným množstvím biomasy a stejným objemem rozpouštědla. Výsledné tři extrakty byly spojeny, rozpouštědla odpařena za sníženého tlaku při 38 °C na rotační vakuové odparce. Získaný vysušený extrakt byl použit pro následnou izolaci fýtokomplexu pomocí CCC.Spray-dried and disintegrated Haematococcus pluvialis microalgae biomass was used to obtain the phytocomplex of the present invention. In another exemplary embodiment, maceration is used to obtain the crude extract. UP1 yielded a crude extract with a higher phytocomplex content than the extracts obtained with acetone, which is considered to be the most efficient reference solvent for the extraction of AXTe from microalgal biomass. The biomass extraction was repeated three times with the same amount of biomass and the same volume of solvent. The resulting three extracts were combined, the solvents evaporated under reduced pressure at 38 ° C on a rotary evaporator. The obtained dried extract was used for the subsequent isolation of the phytocomplex by CCC.

Izolace fýtokomplexu pomocí CCCIsolation of phytocomplex using CCC

V systému CCC musí vhodný extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém vykazovat správný rozdělovači koeficient, a to v rozmezí 0,3 < K < 2,5, dobu ustálení extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému (~ 30 s.) a také rozdíl hustoty (> 0,08 g/ml) [J. Chromatogr. A 1065 (2005) 145 - 168],In a CCC system, a suitable two-phase solvent extraction system must have the correct partition coefficient, in the range 0,3 <K <2,5, the settling time of the two-phase extraction solvent system (~ 30 s.) And also the density difference (> 0,08 g / ml) [J. Chromatogr. A 1065 (2005) 145-168]

Vybraný dvoufázový rozpouštědlový systém (Systém 1) se porovnáním s ostatními zkoušenými extrakčními dvoufázovými rozpouštědlovými systémy ukázal jako vhodný systém pro použití v CCC. Jeho doba ustálení byla 4 s, rozdíl hustoty 0,088 g/ml a dělicí koeficienty byly pro jednotlivé AXTme následující: 0,25 (1), 0,36 (2), 0,52 (3), 1,04 (4), 1,63 (5). Jak je uvedeno na obr. 6 v tabulce, Systém 1 splnil všechny výše uvedené požadavky, a proto byl vybrán pro získávání fýtokomplexu. V laboratorním i pilotním měřítku byly jako stacionární a mobilní fáze použity horní fáze UP1 a spodní fáze LPI zvoleného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému. Extrakce biomasy byla prováděna vždy pomocí horní fáze UP zvoleného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému. Jak je vidět na obr. 2, vybraný extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém představuje nejen vhodný extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém pro extrakci fýtokomplexu z biomasy, ale také vhodnou mobilní fázi pro použití v CCC. Nástřik probíhal 200 mg surového extraktu rozpuštěného v 1 ml UP1. V laboratorním měřítku byla retence stacionární fáze během izolace pomocí CCC 75 % při rychlosti rotace kolony 1200 otáček/min. Pro efektivní, rychlou a účinnou metodu separace esterů astaxantinu jsme použili metodu reverzní eluce, při které byla jako mobilní fáze použita spodní fáze LP zvoleného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému. Tato metoda však umožňuje pouze jednorázový nástřik, takže bylo možné zpracovat pouze malé množství vzorku. Pro zvýšení produktivity vyvinuté metody CCC, jsme použili metodu vícenásobného nástřiku, při kterém podmínky hydrodynamické rovnováhy použité pro optimální separaci esterů astaxantinu v prvním nástřiku byly opětovně obnoveny po ukončení separace, aniž by bylo nutné zastavit chromatografický systém před následujícím nástřikem vzorku. Za tímto účelem byla frakce stacionárního objemu fáze, která se normálně ztratí během izolace pomocí CCC, získána pomocí souběžného elučního režimu, což znamená současné čerpání mobilní a stacionární fáze po eluci fýtokomplexu. Obnovy ztraceného objemu stacionární fáze během prvního běhu bylo tedy účinně dosaženo při čerpání stacionární fáze průtokemThe selected two-phase solvent system (System 1) proved to be a suitable system for use in CCC by comparison with other tested two-phase solvent extraction systems tested. Its settling time was 4 s, the density difference was 0.088 g / ml and the partition coefficients for each AXTme were as follows: 0.25 (1), 0.36 (2), 0.52 (3), 1.04 (4), 1.63 (5). As shown in Fig. 6 in the table, System 1 met all the above requirements and was therefore selected to obtain a phytocomplex. On a laboratory and pilot scale, the upper phases of UP1 and the lower phases of LPI of the selected extraction two-phase solvent system were used as stationary and mobile phases. Biomass extraction was always performed using the upper phase UP of the selected extraction two-phase solvent system. As can be seen in Figure 2, the selected two-phase solvent extraction system represents not only a suitable two-phase solvent extraction system for extracting the phytocomplex from biomass, but also a suitable mobile phase for use in CCC. The injection was carried out with 200 mg of crude extract dissolved in 1 ml of UP1. On a laboratory scale, the retention of the stationary phase during the CCC isolation was 75% at a column rotation speed of 1200 rpm. For an efficient, fast and efficient method of separation of astaxanthin esters, we used the reverse elution method, in which the lower phase LP of the selected extraction two-phase solvent system was used as the mobile phase. However, this method only allows a single injection, so that only a small amount of sample could be processed. To increase the productivity of the CCC method developed, we used the multiple injection method, in which the hydrodynamic equilibrium conditions used for optimal separation of astaxanthin esters in the first injection were resumed after separation without stopping the chromatographic system before the next sample injection. For this purpose, the fraction of the stationary volume of the phase, which is normally lost during the isolation by CCC, was obtained by means of a simultaneous elution mode, i.e. the simultaneous pumping of the mobile and stationary phases after the elution of the phytocomplex. Thus, the recovery of the lost volume of the stationary phase during the first run was effectively achieved by pumping the stationary phase by flow

-5CZ 308677 B6 ml/min a mobilní fáze průtokem 3 ml/min okamžitě po eluci fytokomplexu. V důsledku toho extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém v koloně opět dosáhl vhodných hydrodynamických podmínek pro nový nástřik vzorku, takže bylo možno provést další separační cyklus. Na základě dříve optimalizovaných podmínek bylo úspěšně dosaženo pěti separačních cyklů izolace fýtokomplexu ze surového extraktu, jak je znázorněno na obr. 3. Nástřik surového extraktu byl 200 mg extraktu rozpuštěného v 1 ml UPl/cyklus. Obsah jednotlivých AXTme ve fýtokomplexu byl stanoven metodou vysoce účinné kapalinové chromatografíe ve spojení s detektorem diodového pole (HPLC-DAD).-5GB 308677 B6 ml / min and the mobile phase at a flow rate of 3 ml / min immediately after elution of the phytocomplex. As a result, the extraction two-phase solvent system in the column again reached suitable hydrodynamic conditions for a new sample injection, so that a further separation cycle could be performed. Based on the previously optimized conditions, five separation cycles of isolation of the phytocomplex from the crude extract were successfully achieved, as shown in Fig. 3. The injection of the crude extract was 200 mg of extract dissolved in 1 ml of UP1 / cycle. The content of individual AXTme in the phytocomplex was determined by high performance liquid chromatography in conjunction with a diode array detector (HPLC-DAD).

Pro laboratorní izolaci fytokomplexu (Příklad 1) ze surového extraktu byl použit vysokoúčinný protiproudý vytřcpávací chromatograf Spectrum (Dynamic Extraction, UK) o objemu kolony 134 ml a vnitřním průměru 0,8 mm z polytetrafluorethylenu (PTFE). Rychlost otáček preparativní kolony byla nastavena na hodnotu 1200 otáček/min. pomocí regulátoru rychlosti. Teplota separační kolony byla udržována inteligentním chladičem vody H50/H150 (Smart Water Chiller) na hodnotě 28 °C. Mobilní fáze byla čerpána kolonou pomocí kvartemí pumpy Q-Grad (ECOM s.r.o., ČR). Separace byla monitorována spektrofotometrem Sapphire UV-VIS (ECOM s.r.o., ČR) a chromatogram při vlnové délce 480 nm byl zaznamenán softwarem EZChrom SI (ECOM s.r.o., ČR). Pro pilotní experimenty přípravy fytokomplexu (Příklad 2) byl použit CCC model Quattro (AECS, UK) o objemu separační kolony 1 L a vnitřním průměru 3,2 mm z polytetrafluorethylenu (PTFE).A Spectrum (Dynamic Extraction, UK) high performance countercurrent chromatographic chromatograph with a column volume of 134 ml and an internal diameter of 0.8 mm made of polytetrafluoroethylene (PTFE) was used for laboratory isolation of the phytocomplex (Example 1) from the crude extract. The speed of the preparative column was set at 1200 rpm. using the speed controller. The temperature of the separation column was maintained at 28 ° C by an H50 / H150 Smart Water Chiller. The mobile phase was pumped through the column using a Q-Grad quaternary pump (ECOM s.r.o., Czech Republic). The separation was monitored with a Sapphire UV-VIS spectrophotometer (ECOM s.r.o., Czech Republic) and the chromatogram at a wavelength of 480 nm was recorded with EZChrom SI software (ECOM s.r.o., Czech Republic). A CCC model Quattro (AECS, UK) with a separation column volume of 1 L and an internal diameter of 3.2 mm made of polytetrafluoroethylene (PTFE) was used for pilot experiments of phytocomplex preparation (Example 2).

Příklad 1Example 1

Laboratorní izolace fýtokomplexu z mikrořasy Haematococcus pluvialisLaboratory isolation of phytocomplex from microalgae Haematococcus pluvialis

Biomasa H. pluvialis byla extrahována horní fází zvoleného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému UP1.4,050 g biomasy H. pluvialis rozdrcené ve třecí misce s mořským pískem bylo extrahováno 0,125 litrem výše uvedené směsi. Tato operace byla opakována třikrát. Výsledné tři extrakty byly spojeny dohromady a rozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku při 38 °C pomocí rotační vakuové odparky. Získaný vysušený extrakt p hmotnosti 1,2 g byl použit pro izolaci fytokomplexu pomocí CCC.H. pluvialis biomass was extracted with the upper phase of the selected extraction two-phase solvent system UP1.4.050 g of H. pluvialis biomass crushed in a sea sand mortar was extracted with 0.125 liters of the above mixture. This operation was repeated three times. The resulting three extracts were combined and the solvents were evaporated under reduced pressure at 38 ° C using a rotary evaporator. The obtained dried extract p weighing 1.2 g was used for isolation of the phytocomplex by CCC.

Prvním krokem při izolaci fýtokomplexu z extraktu biomasy mikrořasy H. pluvialis bylo nalezení optimálního extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému složeného z w-heptanu, acetonitrilu, acetonu a etanolu v různých poměrech. Připravené extrakční dvoufázové rozpouštědlové systémy byly protřepány a ponechány 10 minut do ustálení rovnováhy. Když byly vytvořeny dvě oddělené fáze, byl odebrán 1 ml z každé fáze, ve které byly rozpuštěny 2 mg surového extraktu. Nově vytvořené horní fáze a spodní fáze byly odděleny a následně použity pro výpočet hodnoty rozdělovacího koeficientu K na základě ploch chromatografických píků pěti majoritních monoesterů astaxantinu obsažených ve fytokomplexu a separovaných pomocí HPLCDAD, jako je zobrazeno v tabulce na obr. 6. V této tabulce jsou také uvedeny hodnoty doby ustálení extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému a rozdílu hustoty mezi spodní fází a horní fází.The first step in isolating the phytocomplex from H. pluvialis microalgal biomass extract was to find the optimal extraction two-phase solvent system composed of n-heptane, acetonitrile, acetone and ethanol in different ratios. The prepared extraction two-phase solvent systems were shaken and allowed to equilibrate for 10 minutes. When two separate phases were formed, 1 ml was taken from each phase in which 2 mg of crude extract was dissolved. The newly formed upper phases and lower phases were separated and subsequently used to calculate the partition coefficient K based on the areas of the chromatographic peaks of the five major astaxanthin monoesters contained in the phytocomplex and separated by HPLCDAD, as shown in the table in Figure 6. the values of the settling time of the extraction two-phase solvent system and the difference in density between the lower phase and the upper phase are given.

Pro efektivní izolaci fýtokomplexu pomocí CCC jsme použili extrakční dvoufázový rozpouštědlový Systém 1, kde spodní fáze LPI a horní fáze UP1 se používají jako mobilní a stacionární fáze. Jak je uvedeno v tabulce na obr. 7, maximální množství extraktu rozpustného v 1 ml UP1 je 200 mg a toto množství bylo standardně použito pro nástřik vzorku na CCC. Optimální podmínky pro retenci stacionární fáze (minimálně 75 %) při HPCCC separaci byly následující: rychlost otáčení kolony 1200 otáček/min, průtok 4 ml/min. Průběh izolace je znázorněn na obr. 2. Za výše uvedených separačních podmínek je fýtokomplex eluován do 60 minut. Tato metoda ovšem znamená použití pouze jednorázového nástřiku vzorku, čímž lze zpracovat pouze menší množství vzorku. Proto, aby se zvýšila propustnost izolační metody CCC, byla vyvinuta metoda reverzní eluce s vícenásobným nástřikem, kde podmínky, které byly stanoveny pro získáníFor efficient isolation of the phytocomplex by CCC, we used an extraction two-phase solvent System 1, where the lower phase LPI and the upper phase UP1 are used as mobile and stationary phases. As shown in the table in Fig. 7, the maximum amount of extract soluble in 1 ml of UP1 is 200 mg, and this amount was used as standard to inject the sample onto CCC. The optimal conditions for the retention of the stationary phase (minimum 75%) in the HPCCC separation were as follows: column rotation speed 1200 rpm, flow rate 4 ml / min. The course of isolation is shown in Fig. 2. Under the above-mentioned separation conditions, the phytocomplex is eluted within 60 minutes. However, this method involves the use of only a single sample injection, so that only a small amount of sample can be processed. Therefore, in order to increase the permeability of the CCC isolation method, a reverse elution method with multiple injection was developed, where the conditions that were determined to obtain

-6CZ 308677 B6 fytokomplexu v prvním cyklu, byly pro opětovné dosažení hydrodynamické rovnováhy obnoveny bez nutnosti zastavit chromatografický systém.-6CZ 308677 B6 phytocomplex in the first cycle, were restored to regain hydrodynamic equilibrium without having to stop the chromatographic system.

Základním předpokladem pro práci v režimu reverzní eluce je vývoj vhodného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému, ve kterém se spodní fáze zvoleného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému použije jako mobilní fáze. Pro zvýšení produktivity vyvinuté metody CCC, jsme použili metodu vícenásobného nástřiku, při kterém podmínky hydrodynamické rovnováhy použité pro optimální separaci esterů astaxantinu v prvním nástřiku byly opětovně obnoveny po ukončení separace, aniž by bylo nutné zastavit chromatografický systém před následujícím nástřikem vzorku. Za tímto účelem byla část objemu stacionární fáze, která se normálně ztratí během separace, získána zpět pomocí souběžného elučního režimu, což znamená po určitou dobu současné čerpání mobilní a stacionární fáze po eluci fytokomplexu. Obnovy ztraceného objemu stacionární fáze během prvního běhu bylo tedy účinně dosaženo při čerpání stacionární fáze průtokem 1 ml/min a mobilní fáze průtokem 3 ml/min po dobu 6 minut po eluci fytokomplexu. V průběhu této minimálně nutné doby potřebné pro ekvilibraci obou fází extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém v koloně opět dosáhl vhodných hydrodynamických podmínek pro nový nástřik vzorku, takže je možno provést další separační cyklus bez nutnosti přerušení průtoku mobilní fáze kolonou. Na základě všech výše uvedených podmínek a kritérií je možno provést několikanásobný nástřik vzorku na CCC. Na obr. 3 je uveden konkrétní příklad pěti následných produkčních cyklů separace fytokomplexu z extraktu biomasy pomocí CCC. Množství 200 mg extraktu H. pluvialis bylo zpracováno v každém cyklu v intervalech 60 minut, čímž bylo získáno 62 mg fýtokomplexu. Celkově se pomocí tohoto postupu vícenásobného nástřiku vzorku zpracuje 1,2 g extraktu, což vedlo k získání 372 mg vysoce čistého fýtokomplexu.The basic prerequisite for working in the reverse elution mode is the development of a suitable extraction two-phase solvent system, in which the lower phase of the selected extraction two-phase solvent system is used as the mobile phase. To increase the productivity of the developed CCC method, we used the multiple injection method, in which the hydrodynamic equilibrium conditions used for optimal separation of astaxanthin esters in the first injection were resumed after separation without stopping the chromatographic system before the next sample injection. For this purpose, a part of the volume of the stationary phase, which is normally lost during the separation, was recovered by means of a simultaneous elution regime, which means for some time simultaneous pumping of the mobile and stationary phases after elution of the phytocomplex. Thus, recovery of the lost volume of the stationary phase during the first run was effectively achieved by pumping the stationary phase at a flow rate of 1 ml / min and the mobile phase at a flow rate of 3 ml / min for 6 minutes after elution of the phytocomplex. During this minimum time required to equilibrate the two phases, the extraction biphasic solvent system in the column again reached suitable hydrodynamic conditions for re-injection of the sample, so that another separation cycle can be performed without interrupting the flow of mobile phase through the column. Based on all the above conditions and criteria, it is possible to perform multiple sample injections on the CCC. Fig. 3 shows a specific example of five successive production cycles of separation of the phytocomplex from the biomass extract by CCC. An amount of 200 mg of H. pluvialis extract was processed in each cycle at 60 minute intervals to obtain 62 mg of phytocomplex. A total of 1.2 g of extract was processed by this multiple sample injection procedure, resulting in 372 mg of a highly pure phytocomplex.

Příklad 2Example 2

Pilotní izolace fytokomplexu z mikrořasy Haematococcus pluvialisPilot isolation of phytocomplex from Haematococcus pluvialis microalgae

Pro izolaci fytokomplexu z extraktu připraveného z biomasy mikrořasy H. pluvialis v pilotním měřítku byl použit stejný extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém, který jsme vyvinuli, optimalizovali a aplikovali na jeho izolaci v laboratorním měřítku, tj. Systém 1 v tabulce na obr. 6.To isolate the phytocomplex from the extract prepared from H. pluvialis microalgae biomass on a pilot scale, the same extraction two-phase solvent system was used, which we developed, optimized and applied to its isolation on a laboratory scale, ie System 1 in the table in Fig. 6.

Pro extrakci biomasy v pilotním měřítku bylo 100 g biomasy H. pluvialis extrahováno 2 litry horní fáze UP1 vybraného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému. Tato operace byla opakována třikrát. Výsledné tři extrakty byly spojeny dohromady a rozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku při 38 °C pomocí rotační vakuové odparky. Získaný vysušený extrakt v množství 30 g byl použit pro pilotní izolaci fytokomplexu.For pilot scale biomass extraction, 100 g of H. pluvialis biomass was extracted with 2 liters of the upper phase UP1 of the selected extraction two-phase solvent system. This operation was repeated three times. The resulting three extracts were combined and the solvents were evaporated under reduced pressure at 38 ° C using a rotary evaporator. The obtained dried extract in an amount of 30 g was used for pilot isolation of the phytocomplex.

Obdobně jako v případě laboratorní izolace, i v pilotní izolaci byly jako stacionární a mobilní fáze použity horní fáze UP 1 a spodní fáze LP 1 zvoleného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému. Extrakce biomasy byla prováděna také pomocí horní fáze UP. V souladu s určeným bodem nasycení, jak je znázorněno v tabulce na obr. 7, bylo 1 g extraktu rozpuštěno v 5 ml UP1 a toto množství bylo použito pro nástřik na CCC v případě pilotní separace. Optimální podmínky pro retenci stacionární fáze (minimálně 76 %) při CCC separaci byly následující: rychlost otáčení kolony 750 otáček/min., průtok 10 ml/min. Průběh izolace je znázorněn na obr. 4. Za výše uvedených separačních podmínek je fýtokomplex eluován do 90 minut.Similarly to the laboratory isolation, the upper phases UP 1 and the lower phases LP 1 of the selected extraction two-phase solvent system were used as stationary and mobile phases in the pilot isolation. Biomass extraction was also performed using the upper UP phase. In accordance with the determined saturation point, as shown in the table in Fig. 7, 1 g of the extract was dissolved in 5 ml of UP1, and this amount was used for CCC injection in the case of pilot separation. The optimal conditions for the retention of the stationary phase (minimum 76%) in CCC separation were as follows: column rotation speed 750 rpm, flow rate 10 ml / min. The course of isolation is shown in Fig. 4. Under the above separation conditions, the phytocomplex is eluted within 90 minutes.

Pro efektivní, rychlou a účinnou metodu separace fytokomplexu jsme použili metodu reverzní eluce, při které byla jako mobilní fáze použita spodní fáze LPI zvoleného extrakčního dvoufázového rozpouštědlového systému. Tato metoda však umožňuje pouze jednorázový nástřik, takže bylo možné zpracovat pouze malé množství vzorku. Pro zvýšení produktivity vyvinuté metody CCC, jsme použili metodu vícenásobného nástřiku, při kterém podmínky hydrodynamické rovnováhy použité pro optimální izolaci fytokomplexu v prvním nástřiku byly opětovně obnoveny po ukončení separace, aniž by bylo nutné zastavit chromatografický systém před následujícím nástřikem vzorku. Za tímto účelem byla frakce stacionárního objemu fáze, která se normálně ztratíFor an efficient, fast and efficient method of phytocomplex separation, we used the reverse elution method, in which the lower phase LPI of the selected extraction two-phase solvent system was used as the mobile phase. However, this method only allows a single injection, so that only a small amount of sample could be processed. To increase the productivity of the developed CCC method, we used the multiple injection method, in which the hydrodynamic equilibrium conditions used for optimal isolation of the phytocomplex in the first injection were restored after separation without having to stop the chromatographic system before the next sample injection. For this purpose, the fraction of the stationary volume of the phase was normally lost

-7 CZ 308677 B6 během separace CCC, získána pomocí souběžného elučního režimu, což znamená současné čerpání mobilní a stacionární fáze po eluci fytokomplexu. Obnovy ztraceného objemu stacionární fáze během prvního nástřiku bylo tedy účinně dosaženo při čerpání stacionární fáze průtokem 3 ml/min. a mobilní fáze průtokem 7 ml/min okamžitě po eluci fytokomplexu po dobu 25 min. Tímto 5 způsobem extrakční dvoufázový rozpouštědlový systém v koloně opět dosáhl vhodných hydrodynamických podmínek pro nový nástřik vzorku, takže bylo možno provést další separační cyklus. Na základě dříve optimalizovaných podmínek bylo pro výrobu fýtokomplexu z mikrořas úspěšně dosaženo pěti separačních cyklů, jak je znázorněno na obr. 5. Množství 1 g extraktu H. pluvialis bylo zpracováno v každém cyklu v intervalech 90 minut, čímž bylo získáno 285 mg to fýtokomplexu. Celkově se pomocí tohoto postupu vícenásobného nástřiku zpracuje 5 g extraktu, což vede k získání 1,425 g fytokomplexu.-7 CZ 308677 B6 during the separation of CCC, obtained by means of a simultaneous elution mode, which means the simultaneous pumping of the mobile and stationary phases after the elution of the phytocomplex. Thus, the recovery of the lost volume of the stationary phase during the first injection was effectively achieved by pumping the stationary phase at a flow rate of 3 ml / min. and the mobile phase at a flow rate of 7 ml / min immediately after elution of the phytocomplex for 25 min. In this way, the extraction two-phase solvent system in the column again reached suitable hydrodynamic conditions for a new sample injection, so that a further separation cycle could be performed. Based on previously optimized conditions, five separation cycles were successfully achieved for microalgal phytocomplex production, as shown in Figure 5. An amount of 1 g of H. pluvialis extract was processed in each cycle at 90 minute intervals to obtain 285 mg of phytocomplex. A total of 5 g of extract was processed by this multiple injection procedure, resulting in 1.425 g of phytocomplex.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Způsob získání fýtokomplexu na bázi astaxantinu z biomasy mikrořas podle tohoto vynálezu lze využít zejména při výrobě bioaktivních ingrediencí z přírodních zdrojů v potravinářském, krmivářském, farmaceutickém i kosmetickém průmyslu.The process for obtaining an astaxanthin-based phytocomplex from microalgae biomass according to the invention can be used in particular in the production of bioactive ingredients from natural sources in the food, feed, pharmaceutical and cosmetic industries.

Claims

PATENT CLAIMS

A process for obtaining an astaxanthin-based phytocomplex from microalgae biomass, wherein the biomass is produced by a Haematococcus pluvialis microalgae strain, from which the astaxanthin-based phytocomplex is extracted and isolated by countercurrent shaking chromatography, characterized in that an extraction two-phase solvent system is prepared. -heptane-acetonitrile in a ratio of 1: 1 (v / v), in the upper phase of which the algal biomass is extracted at least once, the resulting crude extract is dried and dissolved in the upper phase of the two-phase solvent system extraction, thus preparing a sample for injection into a countercurrent shaker. chromatography using the upper phase of the extraction of the biphasic solvent system as the mobile phase and the upper phase of the extraction of the biphasic solvent system as the stationary phase, the sample being injected into the countercurrent chromatography column at least twice to elute the phytocomplex containing astaxanthin monoesters which e subsequently isolates.

The method according to claim 1, characterized in that the microalgae biomass is extracted three times and the resulting extracts are combined to form the final crude extract.

Process according to Claim 1 or 2, characterized in that the sample to be injected is applied to the countercurrent chromatography column five times.

Method according to one of Claims 1 to 3, characterized in that the crude extract is extracted from the biomass of the microalgae by maceration and / or by mechanical disruption of the biomass cells.

Process according to one of Claims 1 to 4, characterized in that the crude extract contains a mixture of free astaxanthin, astaxanthin monoester, astaxanthin diester, pigments and lipids.