CZ307678B6

CZ307678B6 - Nutriční přípravek, způsob šlechtění kmene řasy Trachydiscus minutus a použití nutričního přípravku

Info

Publication number: CZ307678B6
Application number: CZ2014-980A
Authority: CZ
Inventors: Vladislav Cepák; Jaromír Lukavský; Petr Kaštánek
Original assignee: Ecofuel Laboratories S.R.O.; Botanický Ústav Av Čr, V. V. I.
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2019-02-13
Also published as: CZ2014980A3

Abstract

Nutriční přípravek obsahuje alespoň jeden selen obsahující kmen řasy, rezistentní ke koncentraci selenu až 100 mg/litr kultivačního média. Přednostně obsahuje kmen řasy, uložený do sbírky autotrofních mikroorganismů CCALA, vedené Botanickým ústavem AV ČR v.v.i., pracoviště Třeboň, pod označenímCepák et Lukavský 2014/1 pod přírůstkovým číslem CCALA: Cepák et Lukavský 2014/1, nebo kmen řasy, uložený do sbírky autotrofních mikroorganismů CCALA, vedené Botanickým ústavem AV ČR v.v.i., pracoviště Třeboň, pod označenímCepák et Lukavský 2014/2 pod přírůstkovým číslem CCALA: Cepák et Lukavský 2014/2. Způsob šlechtění kmene řasypro nutriční přípravek podle vynálezu, spočívá v tom, že se provádí pasážováním s rostoucí koncentrací NaSeO.

Description

Nutriční přípravek, způsob šlechtění kmene řasy Trachydiscus minutus a použití nutričního přípravku

Oblast techniky

Vynález se týká nutričního přípravku, způsobu šlechtění kmene řasy Trachydiscus minutus a použití nutričního přípravku

Dosavadní stav techniky

Aktuálně roste povědomí o esencionálním významu mikroelementů, které mají značný zdravotní přínos jak pro zvířata, tak i člověka. V současné době se pozornost upírá na význam selenu jako nutričního doplňku v dietě lidí.

Selen je prvek, který je v stopovém množství nezbytný pro biologické funkce v mnoha organismech včetně lidí, avšak jeho vliv na organizmus je silně ovlivněn velikostí dávky. Zatímco v malých koncentracích je esenciální, ve vysokých je toxický. Mikrořasy jsou komerčně zajímavou možností jak vyprodukovat rychle biomasu obohacenou o Se. Pro člověka je doporučená denní dávka selenu asi 300 pg a toxická dávka asi 3200 pg Se/den. Udává se, že strava vnitrozemských evropských států je na Se vcelku chudá, díky půdám chudším na Se a nižší pestrostí stravy (kolem 40 pg). Příliš nízký výskyt Se ve stravě, se u lidí může projevovat úzkostí, unaveností, sklonem k depresím a vznikem arterosklerotických cévních komplikací (European Food Information Council, 2008).

Tento prvek má v nízkých dávkách protinádorový efekt, podporuje vývoj savců, správné funkce imunitního systému a zpomaluje stárnutí. Předávkování Se naopak způsobuje vznik reaktivních kyslíkových radikálů, které mohou způsobit oxidaci DNA, její dvoj vláknové zlomy a poškození buňky.

Mikrořasy obsahují ve své biomase řadu velmi žádaných, z nutričního hlediska cenných složek. Z hlavních komponent obsahují ve značné míře proteiny (cca 40 % až 58 % vztaženo na sušinu), polysacharidy (cca 10 % až 17 %) a lipidy (cca 7 % až 22 %). Tyto hodnoty jsou průměrné např. pro rod zelených sladkovodních řas Chlorophycae, ale jsou v laboratořích kultivovány řasy obsahující až 60 % olejů, respektive škrobu. Mikrořasy jsou zdrojem vitaminů (A, Bl, B2, B6, B12, C, E), kyseliny listové, chlorofylu, karotenoidů, imunostatik (např 1,3-beta glukanu) a řady dalších vzácných a žádaných složek. Z nutričního hlediska jsou zejména vysoce ceněné nenasycené mastné kyseliny s dlouhými řetězci (s obsahem C > 18), které nejsou vyšší rostliny schopné syntetizovat, jako jsou kyseliny ARA (struktura 20:4 omega 6,9,12,15), DHA (struktura 22:6 omega 3,6,9,12,15,18) a EPA (struktura 22:5 omega 3,6,9,12,15). Tyto kyseliny jsou nepostradatelné jako korektory vývoje mozku a očí u dětí, resp. jako doplňky pro kardiovaskulární péči u dospělých. Klinické studie potvrzují též účinky při léčbě aterosklerózy, rakoviny, revmatoidní artritidy a degenerativních onemocnění spojených s věkem, jako makulámí degenerace či Alzheimerovy choroby (Simopoulos, A.P., R.R. Kifer, R.E. Martin, and S.M. Barlaw (eds.), Health Effects of ω -3 Polyunsaturated Fatty Acids, S. Karger AG, Basel, Switzerland, 1991; Nettleton, A.J. (ed.), Omega-3 Fatty Acids and Health, Chapman and Halí, New York, 1995; Drevon, C.A., I. Baksaas, and H.E. Krokan (eds.), Omega-3 Fatty Acids: Metabolism and Biological Effects, Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland, 1993).

Rostlinné oleje či rybí tuk s vysokým obsahem nenasycených mastných kyselin jsou již komerčně využívány jako nutriční doplněk, k prevenci řady civilizačních chorob jako kardiovaskulární, záněty, ale i duševní choroby aj. Rybí olej z mořských ryb jev současnosti asi nejběžnější potravinový doplněk s nenasycenými omega mastnými kyselinami. Stejně tak se uvažuje i o využití kapřího masa, event. se zvýšeným obsahem např. EPA pomocí speciální

- 1 CZ 307678 B6 krmné směsi (patent CZ 302744) jako diety pacientů v lázních zaměřených na léčbu kardiovaskulárních chorob.

Využití současných zdrojů, hlavně mořských ryb, naráží na limity dané přelovením některých druhů, dále pak znečištění moří řadou látek jako DDT, PCB, Hg aj. Proto se hledají možnosti, jako využití řasových kultur k produkci polynenasycených mastných kyselin a řasy samotné jako přídavku kupř. do potravy ryb chovaných v akvakulturách či drůbeži (viz např. projekty OmegaNutrition či BIORAF podporované Technologickou agenturou České republiky).

Řasa Trachydiscus minutus, patřící do skupiny Eustigmatophyta, se vyznačuje tím, že má jako jediné asimilační barvivo chlorolýl a jako asimilační a zásobní produkt lipidy (až 39 % sušiny). Tyto lipidy se vyznačují vysokým obsahem omega poly-nenasycených mastných kyselin, (typicky EPA kolem 42 %, MYR kolem 53 % z celkových lipidů) a je tudíž perspektivní jako přídavek do krmivá zvířat i jako potravinový doplněk pro člověka. Tato řasa je schopna dosáhnout koncentrace 23 g sušiny/litr, dobře snáší kultivaci v různých typech kultivačních systémů (kupř. plošinový kultivátor, okrouhlý bazén, probublávaný kolonový fotobioreaktor), čerpání odstředivým čerpadlem i pádlovým kolem. Snáší dobře oscilace teplot (optimální teplota je 27 °C, ale krátkodobě snese i 40 °C) a světla a dobře se sklízí sedimentací s následným odstředěním a lyofilizací. Určitými modifikacemi živného roztoku a režimu a podmínkami kultivace lze značně ovlivnit složení biomasy ve prospěch požadovaných látek. Hladověním na P a N ve stacionární fázi růstu nebo nízkou teplotou lze obsah nenasycených mastných kyselin ještě zvýšit. Stejně tak stimulace pomocí nano-Fe může stimulovat jeho růst a produkci (Pádrová, K., Lukavský, J., Nedbalová, L., Čejková, A., Cajthaml, T., Sigler, K., Vítová, M., Řezanka, T.: Trace concentrations of iron nanoparticles cause overproduction of biomass and lipids during cultivation of cyanobacteria and microalgae. - Journal of Applied Phycology. DOI 10.1007/sl0811-014-0477-1). Obsah karbohydrátů 14 % a bílkovin až 40 % předurčují biomasu této řasy i po extrakci mastných kyselin jako vhodnou např. jako krmivo. Pro vysoký obsah poly-nenasycených mastných kyselin ale nejsou lipidy z Trachydiscus minutus primárně vhodné na transesterifikaci na metylestery jako biopaliva.

Z přírody izolovaný kmen, Trachydiscus minutus kmen Lukavský et Přibyl 2005/1 byl patentován jako zdroj lipidů a obzvláště více-nenasycených mastných kyselin, použitelných jako nutriční doplněk (CZ patent č. 302118). Problematika řasy Trachydiscus minutus byla zpracována do monografie (Lukavský, J.: Trachydiscus minutus - a new algal EPA producer, In: DAGMAR Krueger and HELGA Meyer (eds.) - „Algae: Ecology, Economic Uses and Environmental Impact“.-- Nova Publishers, p. 77-104, 2012), která zpracovala publikovaná i originální data do r. 2012. Recentní studie a publikace se zabývají hlavně optimalizací pěstování této řasy (Cepák, V., Přibyl, P., Kohoutková, J., Kaštánek, P. (2014): Optimization of cultivation conditions for fatty acid composition and EPA production in the eustigmatophycean microalga Trachydiscus minutus. J. Appl. Phycol. 26: 181-190. lOp. DOI 10.1007/sl0811-013-0119-z., Přibyl, P., Cepák, V., Zachleder, V. (2014): Oil overproduction by means of microalgae: In: Bajpai R., Prokop A, Zappi M (eds.) Algal biorefineries, Vol. 1: Cultivation of cells and products, pp. 241-273, DOI 10.1007/978-94-007-7494-0, ISBN 978-94-007-7493-3.).

V poslední době se ukazuje jako zajímavá cesta využít mikrořasy jako nosiče mikronutrientů potřebných pro výživu člověka či zvířat. Velká pozornost je zejména věnována dotaci selenu, neboť se ukazuje, že mikrořasy jsou schopny vázat selen mj. do podoby organismem dobře využitelných selenoproteinů. V této formě je selen pro organismy lépe využitelný, nežli ve formě anorganických solí. Selen vázaný v biomase řas se prokázal být účinným prostředkem v prevenci řady chorob a bylo kupř. patentováno několik kmenů řasy Scenedesmus quadricauda rezistentních k vysokým koncentracím selenanu a seleničitanu, které Se kumulují do biomasy (Umysová, D., Vítová, M., Doušková, I., Bišová, K, Hlavová, M., Čížková, M., Machát, I., Doucha, J., Zachleder, V. (2009): Bioaccumulation and toxicity of selenium compounds in the green alga Scenedesmus quadricauda. BMC Plant Biology 2009, 9:58 DOI:10.1186/1471-22299-58, CZ patenty č. 300808, 300809 a 300861), přičemž zejména selenometionin vázaný v

-2CZ 307678 B6 proteinech je považován za míru kvality organického selenu. Kmeny v těchto pracech byly získány pasážováním ve zvyšující se koncentraci těchto sloučenin. Se-obohacený Scenedesmus byl kupř. využit jako přídavek krmivá broilerů, kde výrazně zvýšil hodnoty glutation peroxidázové aktivity a zvýšil oxidační stabilitu masa při skladování (Skřivan, M, Marounek, M, Dlouhá, G, Sevčíková, S: Dietary selenium increases vitamin E contents of egg yolk and chicken meat, British Poultry Science,Volume 49, Issue 4, 2008, Skřivan, M, Skřivanová, V, Dlouhá, G, Brányiková, I, Zachleder, V, Vítová M (2010): The use of selenium-enriched alga Scenedesmus quadricauda in a chicken diet, Czech J. Anim. Sci., 55: 565-571). Přídavek Se-obohacené řasy Chlorella byl shledán účinným způsobem obohacením masa broilerů (Ševčíková, S, Skřivan, M, Dlouhá, G, M. Koucký, M (2006): The effect of selenium source on the performance and meat quality of broiler chickens, Czech J. Anim. Sci., 51: 449-457) i prasat (Svoboda (I.) M, Saláková, A, Fajt, Z, Kotrbáček, V, Ficek, R, Drábek, J. (2009a): Efficacy of Se-enriched Alga Chlorella spp. and Se-enriched Yeast on Tissue Selenium Retention and Carcass Characteristics in Finisher Pigs, Acta Vet. Brno 78: 579-587, Svoboda (II) M, Kotrbáček, V, Ficek, R, Drábek J. (2009b): Effect of Organic Selenium from Se-enriched Alga (Chlorella spp.) on Selenium Transfer from Sows to Their Progeny, Acta Vet. Brno, 78: 373-377). Obecně je však možné konstatovat, že selen byl doposud kumulován v běžně se vyskytujících řasách druhu Chlorella sp, Scenedesmus sp. a v sinici Arthrospira sp. Všechny tyto kmeny však mají z nutričního hlediska nevýhodné složení mastných kyselin v řasových lipidech, kdy převažují nasycené či málo-nenasycené mastné kyseliny.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je odstranit shora uvedené nevýhody současného stavu techniky.

Tento úkol se podle vynálezu vyřeší tím, že nutriční přípravek obsahuje alespoň jeden selen obsahující kmen řasy Trachydiscus minutus, rezistentní ke koncentraci selenu až 100 mg/litr kultivačního média. Tím nutriční přípravek současně má vysoký obsah poly-nenasycených mastných kyselin, zvýšený obsah selenu, proteiny a významné obsahy pigmentů s antioxidačními účinky, zejména karotenoidů. Nutriční pripavek může kromě toho obsahovat i další složky.

Kmenem řasy Trachydiscus minutus přitom může přednostně být kmen řasy Trachydiscus minutus, uložený do sbírky autotrofních mikroorganismů CCALA, vedené Botanickým ústavem AV ČR v.v.i., pracoviště Třeboň, pod označením Trachydiscus minutus Cepák et Lukavský 2014/1 pod přírůstkovým číslem CCALA: Cepák et Lukavský 2014/1, nebo kmen řasy Trachydiscus minutus, uložený do sbírky autotrofních mikroorganismů CCALA, vedené Botanickým ústavem AV ČR v.v.i., pracoviště Třeboň, pod označením Trachydiscus minutus Cepák et Lukavský 2014/2 pod přírůstkovým číslem CCALA: Cepák et Lukavský 2014/2. Kmen řasy Trachydiscus minutus přitom může být ve formě suchého prášku, nebo vodné suspenze.

Způsob šlechtění kmene řasy Trachydiscus minutus pro nutriční přípravek podle vynálezu spočívá v tom, že se provádí pasážováním s rostoucí koncentrací Na₂SeO3.

Objasnění výkresů

Vynález je dále blíže objasněn na příkladech svého provedení pomocí výkresů, kde znázorňuje:

Obr. 1 kultivační aparaturu s kulturou po 2 týdnech kultivace,

Obr. 2 fotografie buněk z fluorescenční mikroskopie kultury kultivované v médiu bez selenu

Obr. 3 fotografie buněk z fluorescenční mikroskopie kultury kultivované se 100 mg/1 selenu s auto fluorescencí chlorofýlu a oleje

-3 CZ 307678 B6

Obr. 4 fotografie buněk z mikroskopie kultury kultivované v médiu s koncentrací selenu 100 mg/1, přičemž fotografie a zobrazuje buňky ve fluorescenční mikroskopii, fotografie b v bílém světle,

Obr. 5 jednoklonové kolonie na agarové plotně s koncentrací selenu 100 mg/1 a

Obr. 6 růstové křivky vsádkových, probulávaných kultur řasy Trachydiscus minutus v odstupňovaných koncentracích selenu při teplotě 27 °C a obsahu CO? 2 % objemová. Chybové úsečky jsou x ± 3 sx.

Příklady uskutečnění vynálezu

Živný roztok (Simmer Šetlík (1982) in Zachleder, V.& Setlik, I. Biol. Plant 24, 341) v poloviční koncentraci, byl obohacen seleničitanem sodným tak, aby koncentrace selenu byla 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 a 100 mg/1. Kultivační nádoby (válečky s obsahem 120 ml) byly uzavřeny vatovými zátkami s aerační trubičkou uzavřenou bakteriálním filtrem, naplněny a autoklávovány (viz obr. 1). Koncentrace selenu byla zvyšována zleva do prava po 10 mg Se/1 (poslední váleček je kontrola). Poté byly inokulovány kmenem řasy Trachydiscus minutus kmen Lukavský et Přibyl 2005/1 tak, aby počáteční koncentrace byla 0,5 mg sušiny/ml. Válečky byly exponovány při teplotě 28 °C, světle 350 pmol.mýsec¹ (zářivky typ bílá) a probublávány směsí vzduchu a CO? (2% objemová). V pravidelných intervalech byly odebírány vzorky a stanovena gravimetricky sušina (2 ml byly centrifůgovány v předvážených zkumavkách, sediment byl vysušen při 105 °C do konstantní váhy). Dále byla mikroskopicky hodnocena vitalita auto fluorescencí chlorofylu pod epifluorescenčním mikroskopem (obr. 2, 3). Po 12ti dnech kultivace byl celý obsah válečku sedimentován a sediment doplněn na původní objem stejným tj. selenem obohaceným médiem. Po 4 opakováních tohoto pasážování byla suspense rozetřena po povrchu agarové plotny se shodným médiem a po expozici ve stejných podmínkách byla z jedné vybrané největší kolonie izolována klonová kultura (obr. 4). Narostlá biomasa byla analyzována standardními postupy na obsah jednotlivých mastných kyselin a selenu a selenomethioninu. Pokus byl opakován a postupným pasážováním tak byly získány kmeny uložené pod depozitními označeními Cepák et Lukavský 2014/1, 2014/2, které rostou při koncentraci až 100 mg Se.I¹.

Průmyslová využitelnost

Nutriční přípravek je využitelný pro výživu zvířat a člověka.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Nutriční přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden selen obsahující kmen řasy Trachydiscus minutus, rezistentní ke koncentraci selenu až 100 mg/litr kultivačního média.

2. Nutriční přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že kmenem řasy Trachydiscus minutus je kmen řasy Trachydiscus minutus, uložený do sbírky autotrofních mikroorganismů CCALA, vedené Botanickým ústavem AV ČR v.v.i., pracoviště Třeboň, pod označením Trachydiscus minutus Cepák et Lukavský 2014/1 pod přírůstkovým číslem CCALA: Cepák et Lukavský 2014/1.

3. Nutriční přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že kmenem řasy Trachydiscus minutus je kmen řasy Trachydiscus minutus, uložený do sbírky autotrofních mikroorganismů CCALA, vedené Botanickým ústavem AV ČR v.v.i., pracoviště Třeboň,

-4CZ 307678 B6 pod označením Trachydiscus minutus Cepák et Lukavský 2014/2 pod přírůstkovým číslem CCALA: Cepák et Lukavský 2014/2.

4. Nutriční přípravek podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že kmen řasy

5 Trachydiscus minutus je ve formě suchého prášku, nebo vodné suspenze.

5. Způsob šlechtění kmene řasy Trachydiscus minutus pro nutriční přípravek podle alespoň jednoho z nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že se provádí pasážováním s rostoucí koncentrací Na2>Sc(L.