CZ306011B6 - Farmaceutický přípravek obsahující monensin pro léčení familiární adenomatózní polypózy - Google Patents

Abstract

Vynález se týká nových biologických aktivit monensinu, antibiotika izolovaného ze Streptomyces cinnamonensis. Monensin byl identifikován jako účinný inhibitor kanonické signální dráhy Wnt a byla prokázána jeho aktivita v řadě in vitro a in vivo testů. Vynález se týká farmaceutického přípravku, který obsahuje monensin nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, pro použití při léčení familiární adenomatózní polypózy.

Description

Farmaceutický přípravek obsahující monensin pro léčení familiární adenomatózní polypózy

Oblast techniky

Vynález se týká nových biologických aktivit monensinu, antibiotika izolovaného ze Streptomyces cinnamonensis. Monensin byl identifikován jako účinný inhibitor kanonické signální dráhy Wnt a byla prokázána jeho aktivita v řadě in vitro a in vivo testů. Vynález se týká farmaceutického přípravku, který obsahuje monensin nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, pro léčení familiární adenomatózní polypózy.

Dosavadní stav techniky

Signální dráha Wnt je evolučně zachována u nematod, hmyzu a obratlovců. Hraje nezbytnou roli v embryonálním vývoji a také při udržování homeostáze a obnově tkání z kmenových buněk u dospělého organismu. Deregulace (aberantní aktivace) této klíčové dráhy vede u lidí k různým typům nemocí, včetně rakoviny (1).

Klíčová molekula kanonické větve signalizace Wnt, β-katenin, vykazuje několik buněčných funkcí včetně účasti v adhezních spojích prostřednictvím asociace s E-kadherinem v buněčné membráně (2). V cytoplazmě je β-katenin fosforylován a označen k degradaci komplexem, který je složen z proteinu Axin, tvořícího skelet komplexu, z nádor supresorového proteinu APC („adenomatous polyposis coli“), kasein kinázy 1 (CK1) a glykogen syntázy kinázy 3 (GSK3). Toto kontinuální odčerpávání β-kateninu z cytoplasmy brání jeho translokaci do jádra v nepřítomnosti signálu Wnt (3). Navázání extracelulámího ligandu Wnt k transmembránovému receptoru Frizzled (Fz) a jeho ko-receptoru, proteinu LRP5/6 (low density lipoprotein receptor-related protein 5/6), vede k fosforylaci intracelulámí domény LRP5/6 kasein kinázou 1γ (CKly). Tato událost aktivuje LRP5/6 a podněcuje vazbu degradačního komplexu β-kateninu na komplex Wnt-Fz-LRP5/6, což indukuje ztrátu funkce degradačního komplexu a tedy stabilizaci β-kateninu. Výsledkem těchto změn v cytoplasmě je akumulace β-kateninu a jeho vstup do jádra, kde asociuje s transkripčními faktory z rodiny LEF/TCF. Vytvoření těchto LEF/TCF/β-katenin komplexů, kde β-katenin „poskytuje“ důležitou trans-aktivační doménu, vede k aktivované transkripci genů cílových pro signální dráhu Wnt (4).

Lidský β-katenin sestává ze 781 aminokyselin (ak). Jeho struktura je tvořena sekvenčně konzervativní centrální oblastí (ak 141-664) složenou z 12 Armadillo repetic. Centrální oblast je ohraničena N- a C-koncovými doménami s potenciálně flexibilní strukturou. Mezi C-koncovou doménou a poslední Armadillo repeticí je pak specifická rigidní spirálovitá struktura (helix-C). Centrální oblast proteinu představuje stabilní skelet poskytující interakční povrch pro vazebné partnery β-kateninu (5). Oblasti podílející se na stabilizaci a transkripční aktivitě byly lokalizovány především v N- a C-koncových úsecích β-kateninu. V degradačním komplexu je β-katenin fosforylován na N-terminálních serinech a threoninu (S33, S37, T41 a S45), což ho označuje k polyubikvitinaci a degradaci proteasomem (6). Naproti tomu fosforylace na C-koncových zbytcích (S552 a S675) podporuje transkripční aktivitu β-kateninu. Předpokládaným mechanismem je vazba na chromatin remodelující histonacetylázy, jako je například CBP/P300. C-koncová doména β-kateninu také ovlivňuje vazbu LEF/TCF transkripčních faktorů (7). Ačkoli mechanismus této aktivace není zcela znám, bylo prokázáno, že helix-C v C-koncové části je také esenciální pro signalizační aktivitu β-kateninu (5).

Deregulace kanonické signální dráhy Wnt je typickým znakem mnoha druhů rakoviny u lidí, včetně kolorektálního karcinomu, nádoru prsu nebo melanomu (8). Termín „deregulace“ označuje zejména aktivaci dráhy Wnt v tkáni nebo buněčném typu, kde za „normálního“ stavu tato drá

- 1 CZ 306011 B6 ha není aktivní. Další možností je zvýšení úrovně signálu nad jeho fyziologickou hladinu. K těmto deregulacím dochází jednak nadprodukcí ligandů Wnt a dále mutacemi, které způsobují ztrátu vnitřních regulačních mechanismů dráhy. Mezi složkami signalizace Wnt je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocnění člověka gen pro nádor supresorový protein APC. Specifické mutace v genu APC jsou příčinou familiární adenomatózní polypózy (FAP), dědičné nemoci, při které se u pacientů v tlustém střevu vyvíjí velký počet polypů. Některé z těchto polypů postupně progradují v karcinom. APC je také mutován u většiny sporadických kolorektálních nádorů. Mutace se akumulují v obou alelách tohoto genu a důsledkem toho je produkce zkráceného proteinu APC, který již není dále schopen regulovat stabilitu β-kateninu. V kolorektálních nádorech s nepoškozeným proteinem APC byly zjištěny bodové mutace v genu pro β-katenin (nomenklaturní označení genu je CTNNB1). Tyto mutace chrání β-katenin před degradací a způsobují konstitutivní aktivitu proteinu. Podobné mutace byly zjištěny také u jiných typů nádorů, jako jsou melanomy a hepatocelulámí karcinomy (9). Počáteční mutace v genech APC nebo CTNNB1 jsou obvykle následovány postupně se akumulujícími mutacemi v jiných genech, jako je například KRAS nebo TRP53 (10). Vzhledem k výše uvedeným skutečnostem signální dráha Wnt představuje atraktivní cíl pro terapii zaměřenou proti rakovině.

Monensin (4-[2-[5-ethyl-5-[5-[6-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-3,5-dimethyloxan-2-yl]-3methyl-oxolan-2-yl]oxolan-2-yl]-9-hydroxy-2,8-dimethyl-l,6-dioxaspiro[4,5]dec-7-yl]-3methoxy-2-methylpentanová kyselina) je polyetherová sloučenina s antibiotickým účinkem izolovaná ze Streptomyces cinnamonensis s následujícím chemickým vzorcem:

Monensin je znám již od 80. let minulého století a je řazen mezi přírodní karboxylpolyetherové ionofory. Tyto látky přitahují značnou pozornost pro své antibakteriální, protiplísňové a antiparazitické účinky (11). Je zajímavé, že monensin je používán ve veterinární medicíně a jako doplněk potravy se využívá v živočišné výrobě po mnoho let. Je známo, že u hovězího dobytka podporuje růst svaloviny a zvyšuje produkci mléka, přičemž nebyl prokázán žádný významný negativní účinek na reprodukci a zdraví zvířat. Několik studií ukázalo vztah mezi monensinovou dietou a snížením mléčného tuku (12). Přesto je známo jen málo o molekulárním mechanismu účinku této látky. Nedávno bylo publikováno, že monensin inhibuje androgenní signální dráhu a indukuje apoptózu buněk karcinomu prostaty (13). Autoři této studie prokázali, že monensin snížil množství molekul androgenového receptoru (AR) v buňce a tím inhiboval růst buněk karcinomu prostaty. Což není překvapující s ohledem na to, že β-katenin přímo interaguje s AR a zlepšuje transkripční aktivitu tohoto proteinu (14).

Existuje také několik patentových dokumentů týkajících se dalších fyziologických aktivit monensinu. Tak například v CN 102552300 byl monensin identifikován jako specifický inhibitor signalizace STÁT 3 (signální transdukce a aktivace transkripce). V EP 1 034 782 byl monensin navržen jako agens vhodné pro léčbu deprese. A dále v JP 2006/0520 192 byl monensin popsán jako složka kompozice, která působí na prodlužování neuritu motorických nervových buněk. V dokumentu US 7 544 721 byl monensin navržen jako agens účinné proti corona-virové infekci.

-2CZ 306011 Β6

Podstata vynálezu

Ve studii, která je základem předloženého vynálezu, původci provedli rozsáhlý („high throughput“) screening cílený na nalezení nových chemických látek se schopností modulovat signalizaci Wnt. Původci identifikovali monensin, antibiotikum izolované ze Streptomyces cinnamonensis, jako specifický inhibitor kanonické signální dráhy Wnt. Původci prokázali aktivitu monensinu v různých in vitro testech zahrnujících reportérové buňky STF (SuperTOPFLASH HEK293) a čtyři nádorové buněčné linie pocházející z lidských kolorektálních karcinomů. Kromě toho byla prokázána účinnost monensinu v in vivo testech, kdy monensin zabraňoval regeneraci ocasní ploutve Danio rerio po poškození, redukoval tvorbu sekundární osy těla u embryí Xenopus laevis a snižoval velikost kontinuálně vznikajících nádorů u myší kmene APC^Min.

Původci použili buňky STF obsahující v genomu integrovaný Wnt-responzivní luciferázový reportér SuperTOPFLASH (15) k hledání nových inhibitorů signalizace Wnt/p-katenin. Screening zahrnoval 2448 různých sloučenin získaných ze tří komerčně dostupných knihoven chemických sloučenin (podrobněji viz příklady). V primárním screeningu bylo identifikováno sedm sloučenin vykazujících silný inhibiční účinek na aktivitu SuperTOPFLASH. Tyto „malé molekuly“ zahrnovaly již dříve identifikované inhibitory Wnt dráhy, a sice indometacin (16), thapsigargin (17) a harmin (18). Dále byly takto objeveny čtyři další sloučeniny bez jakéhokoliv známého vztahu k signalizaci Wnt. Předpokládané nové modulátory dráhy Wnt byly dále zkoumány z hlediska rozsahu účinné koncentrace, buněčné toxicity a přímého represivního účinku na luciferázovou reakci. Pro další studie byl nakonec vybrán monensin, který suprimoval signalizaci Wnt, aniž by ovlivnil životaschopnost buněk, v koncentraci 0,2 až 5 μΜ.

V celé řadě in vitro a in vivo experimentů (dále podrobně popsaných v části příklady) bylo zjištěno, že monensin

- inhibuje kanonickou signalizaci Wnt v reportérových buňkách STF

- inhibuje kanonickou signalizaci Wnt při regeneraci ocasní ploutve Danio rerio

- inhibuje kanonickou signalizaci Wnt v embryích Xenopus laevis

- působí na úrovni degradačního komplexu β-kateninu, snižuje množství β-kateninu v buňkách

- snižuje expresi cílových genů signální dráhy Wnt v buněčných liniích kolorektálního karcinomu (CRC; zkratka odvozena z anglického colorectal cancer) SW480, COLO320 a LS174T

- inhibuje proliferaci u výše zmíněných CRC linií a ovlivňuje průběh buněčného cyklu v buňkách SW480 — inhibuje signalizaci Wnt stimulovanou transfekcí plazmidových konstruktů kódujících nemutovaný β-katenin a β-katenin konstitutivně aktivní díky bodovým mutacím

- redukuje vývoj nádorů u myší kmene APC^Min.

Jestliže je tedy monensin schopen snižovat Wnt signalizaci na úrovni degradačního komplexu βkateninu nebo dále po směru signální kaskády („downstream“), původci předpokládali, že tato sloučenina může být využitelná k léčebnému působení na kolorektální nádorové buňky, které mají hlavní mutace většinou v této úrovni signální dráhy. Ačkoli původci neznají přesný mechanismus působení, získané výsledky zde uváděné prokazují schopnost monensinu inhibovat kanonickou signalizaci Wnt a bránit růstu buněk karcinomu střeva. Protože je zároveň tato sloučenina široce využívána ve veterinární praxi, lze předpokládat i bezproblémové využití v humánní medicíně.

Předmětem vynálezu je použití monensinu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení familiární adenomatózní polypózy.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu je užitečný v humánní a případně i veterinární medicíně. Léčením se přitom rozumí jak profylaxe tak vlastní (kurativní) léčení.

-3 CZ 306011 B6

Ve farmaceutickém přípravku může být monensin přítomen také ve formě farmaceuticky přijatelných solí (netoxických, fyziologicky přijatelných) anorganické či organické povahy. Odborník je schopen rutinně připravit vhodné soli.

Farmaceutický přípravek obsahující monensin nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl obsahuje monensin nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl ve farmaceuticky účinném množství. Způsob stanovení farmaceuticky účinného množství je běžným postupem, který je odborníkovi znám.

Účinná látka je ve farmaceutickém přípravku přítomna zpravidla společně s jednou nebo více pomocnými látkami, jako jsou např. plnidla, rozvolňovadla, ředidla, pojidla, emulgátory, pufry, stabilizující činidla, konzervanty a barviva. Odborníkovi jsou známy pomocné farmaceutické látky a jejich použití při formulaci přípravku.

Farmaceutické přípravky obsahující jako účinnou látku monensin nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl mohou být formulovány pro systémové podávání, např. enterální podávání, jako je perorální podávání, např. ve formě tablet nebo tobolek, rektální podávání, např. ve formě čípků, nasální podávání či inhalaci, např. ve formě spreje nebo kapek. Přípravky mohou být výhodně formulovány také pro parenterální podávání, jako injekcí (i.v., i.m., s.c), infúzí nebo pomocí implantovatelného zásobníkového systému. Odborníkovi je zřejmé, že tento výčet není vyčerpávající, a jsou mu známy další vhodné způsoby.

Monensin může být ve farmaceutickém přípravku také v kombinaci s jinou účinnou látkou, např. výhodně s účinnou látkou projevující synergický účinek.

Stanovení dávky účinné látky obsažené v jednotkové lékové formě např. v případě tobolek nebo např. vhodné koncentrace v případě injekčního nebo infuzního roztoku je také běžným postupem odborníkovi známým.

Výše zmíněné znalosti odborníka týkající se farmaceutických přípravků, lékových forem, pomocných látek apod. jsou shrnuty v odborníkovi dostupných odborných příručkách (Gennaro, A.R. et al. Remington: The Science and Practice in Pharmacy. 20. vydání. Lippincot Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, Kibbe, A. H. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Pharmaceutical Press, London, 2000, Chalabala, M. et al. Technologie Léků. Galén, Praha, 2001), případně také v Českém lékopisu (ČL 2009), v Evropském lékopisu (Ph. Eur.) a/nebo lékopisu Spojených států (USP).

Objasnění výkresů

Obr. 1. V primárním screeningu byly identifikovány potenciální inhibitory signální dráhy Wnt

A. Screening tří komerčně dostupných knihoven „malých molekul“ cílený na nalezení nových inhibitorů kanonické signalizace Wnt byl proveden pomocí luciferázového testu s použitím Wnt/p-katenin responzivních buněk STF, kdy kanonická signální dráha Wnt byla stimulována ligandem Wnt3a. Jsou ukázány tři primární výsledky: harmin a thapsigargin jsou známé inhibitory dráhy Wnt, na rozdíl od monensinu, karboxylpolyetherového antibiotika. B. Současně byl měřen účinek sloučenin na životaschopnost buněk při stejných koncentracích s použitím testu CellTiter-Blue Cell Viability. C. Vlevo: kvantifikace regenerace ocasní ploutve ryby Danio rerio. Poslední třetina ocasní ploutve ryby byla odstřihnuta a ryby byly chovány po dobu jednoho týdne v médiu obsahujícím 2 μΜ monensinu, respektive stejné množství rozpouštědla (etanol). Poté byla vyhodnocena procentuální regenerace tkáně ploutve. Data reprezentují 3 nezávislé experimenty; n, počet jedinců zahrnutých ve skupině. Vpravo: reprezentativní obrázky dorostlé části ploutve, které nejsou pigmentovány. **P<0,01 (t-test).

-4CZ 306011 B6

Obr. 2. Monensin specificky redukuje úroveň kanonické signalizace Wnt v referenčních buňkách HEK293 i v embryích Xenopus laevis

A. Luciferázová aktivita v buňkách HEK293, transfekovaných Wnt/p-katenin reportérovým 5 plazmidem pTOPFLASH a plazmidem Renilla, zajišťujícím kontrolu účinnosti transfekce. Signální dráha Wnt byla stimulovány přidáním molekuly Wnt3a do média a buňky byly dále kultivovány s monensinem v koncentraci 1 a 5 μΜ nebo s rozpouštědlem (DMSO). Je zřetelný vliv obou koncentrací monensinu na pokles luciferázové aktivity. Oproti tomu monensin ve stejných koncentracích neměl žádný účinek na luciferázovou aktivitu v buňkách HEK293 transfekovaných 10 NF-κΒ reportérovým plazmidem pNF-KB-Luc a plazmidem Renilla a stimulovaných 10 ng/ml lymfotoxinu a (LTa). B. qRT-PCR analýza cílových genů signalizace Wnt v buňkách HEK293 stimulovaných ligandem Wnt3a a inkubovaných s monensinem v koncentraci 1 a 5 μΜ (20 hodin). Kontrolní buňky byly kultivovány s DMSO. C. Buněčná distribuce a stabilita β-kateninu v myších buňkách L_TK-. Buňky byly stimulovány ligandem Wnt3a a inkubovány přes noc s 5 μΜ 15 monensinem nebo s DMSO. Po inkubaci .byly buňky barveny protilátkou proti β-kateninu a jaderným barvivém DAPI. Zvětšení: 630x. D. Western blot analýza lyzátů z parentální buněčné linie STF a Wntl produkující buněčné linie STF inkubovaných s monensinem v koncentraci 0,5; 1 a 5 μΜ, respektive s DMSO (20 hodin). Byly použity protilátky proti Axin2, celkovému βkateninu, aktivním formám β-kateninu (β-katenin fosforylovaný na S675, označený jako P20 S675-p-KATENIN, a β-katenin nefosforylovaný na S33/37/T41, označený ηοη-Ρ-βKATENIN) a TCF4. a-tubulin dokumentoval nanesení shodného množství proteinu. **/*<0,01 (t-test).

Obr. 3. Monensin působí na úrovni stability β-kateninu

A. Luciferázový test s využitím buněk STF stimulovaných ligandem Wnt3a, 1 μΜ BIO nebo 3 μΜ CHIR99021 a kultivovaných s 1 a 5 μΜ monensinu (výsledná koncentrace v kultivačním médiu) nebo DMSO. Monensin snížil Wnt/β-katenin signalizaci indukovanou jak BIO tak i CHIR99021, a také Wnt3a. Uvedeno je procento luciferázového signálu. B. Monensin snižuje 30 množství β-kateninu u myších buněk L_TK_, stimulovaných 1 μΜ BIO. Buňky byly kultivovány přes noc s 5 μΜ monensinu nebo s DMSO. Po inkubaci byly buňky barveny protilátkou proti βkateninu a jaderným barvivém DAPL Zvětšení: 630x. C. Western blot analýza lyzátů z buněčné linie STF stimulované 1 μΜ BIO a inkubované s monensinem v koncentraci 0,5; 1 a 5 μΜ, respektive s DMSO (20 hodin). Byly použity proti celkovému β-kateninu a jeho aktivním formám 35 (P—S675—β-ΚΑΤΕΝΙΝ a non—P—β—KATENIN, viz legenda k obrázku 2) a TCF4. a—tubulin dokumentoval nanesení shodného množství proteinu. D. Vlevo: kvantifikace zdvojení osy těla u embryí Xenopus laevis indukované injekcí 20 pg XWnt8 mRNA nebo 800pg mRNA β-kateninu do marginální zóny ventrálních buněk čtyřbuněčného stadia blastocysty. V obou případech byl spolu s mRNA injikován monensin v celkovém množství 0,04 pmol na jednu injekci, respektive 40 DMSO ve výsledné koncentraci 0,4 %. Po inkubaci 36 hodin bylo vyhodnoceno množství embryí se sekundární osou těla. Výsledky zahrnují 4, respektive 3 nezávislé pokusy; n, počet hodnocených embryí. Vpravo: reprezentativní obrázky embryí se zdvojenou, respektive jednou osou těla po 36 hodinové inkubaci. E. Luciferázový test s využitím STF buněk transfekovaných plazmidovými konstrukty kódující normální formu β-kateninu (označeno wt β-ΚΑΤΕΝΙΝ) a konstitutiv45 ně aktivní formy β-kateninu: S33Y, S37A, S45A, AS45 a ΔΝ. Kultivace s monensinem v koncentracích 1 a 5 μΜ měla za následek snížení luciferázové aktivity u všech použitých konstruktů β-kateninu, oproti tomu neměla žádný vliv na aktivitu luciferázy u konstruktu Lef 1 asociovaného s aktivační doménou proteinu VP16 viru HSV. Plazmid Renilla byl použit jako kontrola transfekce. **Ρ<0,01; *P<0,05 (t-test).

Obr. 4. Monensin inhibuje kanonickou signalizaci Wnt v buňkách linie SW480, ale nikoliv v buňkách linie HCT116

-5 CZ 306011 B6

A. Luciferázová aktivita v buněčných liniích SW480 a HCT116 transfekovaných Wnt/p-katenin reportérovým plazmidem TOPFLASH, respektive nereaktivním FOPFLASH a plazmidem Renilla. Buňky byly kultivovány přes noc s monensinem v koncentracích 1 a 5 μΜ nebo s DMSO; *P<0,05 (t-test). B. qRT-PCR analýza prokázala sníženou expresi cílových genů signa5 lizace Wnt v SW480 buněčné linii po inkubaci s monensinem v koncentraci 1 a 5 μΜ (42 hodin).

V HCT116 buňkách nebyl účinek látky statisticky významný. Kontrolní buňky byly kultivovány s DMSO. C. buněčná distribuce a množství β-kateninu v buněčných liniích SW480 a HCT116. Buňky byly kultivovány přes noc s 5 μΜ monensinu nebo s DMSO. Po inkubaci byly buňky barveny protilátkou proti β-kateninu a jaderným barvivém DAPI. Zvětšení: 400x. D. Western io blot analýza lyzátů SW480 a HCT116 buněk inkubovaných s monensinem v koncentraci 0,5; 1 a 5 μΜ nebo DMSO (42 hodin). Byly použity protilátky proti celkovému β-kateninu a aktivním formám β-kateninu (P-8675-β-ΚΑΤΕΝΙΝ a ηοη-Ρ-β-ΚΑΤΕΝΙΝ). α-tubulin dokumentoval nanesení shodného množství proteinu. E. Poměrná inkorporace ³H-thymidinu v buněčné linii kolorektálního karcinomu SW480, HCT116 (vlevo) a kontrolních buněčných liniích HeLa a 15 HEK293 (vpravo). Buňky byly inkubovány přes noc s 1 μθΐ ³H-thymidinu a s monensinem v koncentraci 0,5; 1 a 5 μΜ nebo DMSO. Signál z kontrolních buněk kultivovaných v DMSO byl definován jako 100 %. Graty zobrazují průměrné hodnoty ze 4 nezávislých experimentů.

Obr. 5. Monensin snižuje velikost střevních nádorů myší kmene APC^Min

A. Reprezentativní mikrofotografie (a, b) a detailnější mikroskopické snímky (a', b') ukazující různou velikost adenomů (označeny černými šipkami) v jejunu myší kmene APC^Min, kterým byl denně po dobu 6 týdnů podáván DMSO (a, a') nebo monensin (b, b')- Řezy byly obarveny protilátkou proti β-kateninu a hematoxylinovým jaderným barvivém. B. Vlevo: průměrná plocha jed25 noho nádoru byla významně snížena ve skupině, které byl podáván monensin. Uprostřed: celkový počet nádorů v tenkém střevu zůstal podobný u obou skupin. Vpravo: statistický graf s kvantifikací plochy nádorů v celém tenkém střevě myší kmene APC^Min ukazující statisticky významné zmenšení celkové plochy nádorů u zvířat, kterým byl podáván monensin; */*<0,05 (t-test) C. Reprezentativní snímky ukazující, že nádory u myší po ošetření monensinem mají nezměněné 30 množství buněk pozitivních na znak proliferace antigen Ki67 (c, c', ď). Oproti tomu po podání monensinu více buněk v nádoru produkuje inhibitor buněčného cyklu p21 (e, e', f, f) a prochází apoptózou (TACS; g, g', h, h'). D. Reprezentativní snímky neadenomatózní tkáně epitelu tenkého střeva myší obou skupin ukazují, že architektura epitelu nebyla poškozena podáváním monensinu. Řezy byly barveny protilátkou proti znaku proliferace Ki67 (i, k) a protilátkou proti znaku 35 terminálně diferencovaných buněk cytokeratinu 20 (Krt20; j, 1). Tkáně byly kontrastně obarveny hematoxylinovým jaderným barvivém. Černé úsečky ve spodních rozích snímků představují 0,6 mm (a,b); 0,2 mm (a', b', c, d, e, f, g, h) a 0,08 mm (c', ď, e', f, g', h').

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Tento příklad popisuje stručně screening, ve kterém byl identifikován monensin jako inhibitor Wnt signální dráhy, a dále jsou zde popsány metody použité v dalších příkladech demonstrujících in vitro a in vivo protinádorovou aktivitu monensinu.

Vyhledávání inhibitorů kanonické signální dráhy Wnt screeningem velkého rozsahu

Pro vyhledávání nových inhibitorů signalizace Wnt/β-katenin byly použity buňky STF obsahující Wnt-responzivní luciferázový reportér SuperTOPFLASH integrovaný v genomu buněk (15). Screening zahrnoval 2448 různých sloučenin získaných ze tří komerčně dostupných knihoven (viz dále). Buňky STF byly stimulovány rekombinantním ligandem Wnt3a a současně byla do

-6CZ 306011 B6 kultivačního média přidána specifická sloučenina v 1 μΜ koncentraci. Luciferázová aktivita byl kvantifikována po 24 hodinách využitím detekce bioluminiscenčního signálu. V primárním screeningu bylo identifikováno sedm sloučenin, které vykazovaly významný inhibiční účinek na luciferázovou aktivitu. Tyto „malé molekuly“ zahrnovaly již dříve identifikované inhibitory dráhy Wnt: indometacin (16), thapsigargin (17) a harmin (18). A dále byly objeveny čtyři sloučeniny bez jakéhokoliv známého vztahu k signalizaci Wnt. Tyto předpokládané modulátory dráhy Wnt byly dále zkoumány na účinný rozsah koncentrace, buněčnou toxicitu a přímý represivní účinek na luciferázovou reakci. Nakonec byl pro následné studie vybrán monensin, polyetherové antibiotikum suprimující signalizaci Wnt (bez vlivu na životaschopnost buněk) v koncentraci 0,2 až 5 μΜ (obr. 1 A, B).

Specifický účinek monensinu byl ověřen experimentem in vivo, kdy byla sledována schopnost monensinu zabránit regeneraci tkáně ocasní ploutve ryby Danio rerio po poškození. Tento živočich, stejně jako jiní nižší obratlovci, má schopnost regenerace poškozených tkání a orgánů pomocí kmenových buněk. Proces nazývaný epimorfní regenerace je řízen signální kaskádou Wnt/p-katenin (19). Díky jednoduché struktuře, rychlosti regenerace a absence pimentu v regenerované tkáni je tento experiment vhodný pro primární ověření inhibice signální dráhy Wnt. Po chirurgickém odstranění koncové třetiny ocasní ploutve byly ryby chovány v chovném médiu E3 s 2μΜ monensinem či adekvátním množstvím etanolu. Vyhodnocení regenerace tkáně týden po amputaci ukázalo 50% ztrátu regenerace u jedinců kultivovaných v médiu s monensinem v porovnání s kontrolní skupinou (obr. 1C).

Materiály a Metody

Purifíkace rekombinantního Wnt3a

Myší ligand Wnt3a byl izolován z kultivačního média Wnt3a-produkujících L buněk bez kroku heparinové purifíkace podle detailního protokolu Willert et al. (20).

Buněčné linie a luciferázové testy

Humánní buňky HEK293, SW480, COLO320, LS174T, HCT116 a HeLa, myší buňky L_TK_ a Wnt3a-produkující L buňky byly zakoupeny z knihovny ATCC (American type Culture Collection). Buňky STF obsahující v genomu integrovaný Wnt/p-katenin-responzivní luciferázový reportér, SuperTOPFLASH, byly získány od Q. Xu a J. Nathanse (15). Konstrukt kódující myší protein Wntl byl připraven v lentivirovém vektoru pCDHl (System Biosciences). Wntl produkující buňky STF byly generovány transdukcí buněk STF retrovirem pLHCX (BD Clontech) obsahujícím myší gen Wntl. Plazmidy NF-κΒ—Luc a pRL—TK (Renilla) byly zakoupeny od společnosti Promega. Luciferázové testy byly prováděny s použitím testovacího systému One-Gio Luciferase Assay System (Promega) pro primární screening a Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) pro následné testy s použitím Renilly, a měřeny přístrojem En Vision Multilabel Reader (PerkinElmer).

Primární screening

Buňky STF byly naneseny na 384jamkové destičky (Corning) v denzitě 2500 buněk na 1 jamku s použitím dávkovače Multidrop Combi (Thermo Scientific) a byly kultivovány přes noc. Pak byl přidán ligand Wnt3a a zároveň také sloučeniny z knihovny použitím pipetovacího robota (V&P Scientific) spojeného s automatickou pracovní stanicí JANUS Automated Workstation (PerkinElmer) na konečnou koncentraci 1 μΜ. Knihovna sloučenin zahrnovala Library of Pharmacologically Active Compounds (LOPAC1280, Sigma-Aldrich), Prestwick Chemical Library (Illkirch, Francie) a NIH Clinical Trial Collection (NIH, USA). Buňky byly kultivovány po dobu 24 hodin a poté byla určena luciferázová aktivita. Životaschopnost buněk byla určena po 48 hodinách inkubace s použitím testu CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega).

-7 CZ 306011 B6

Chemické sloučeniny

Kromě výše uvedených knihoven byly použity následující komerčně dostupné sloučeniny: monensin, sodná sůl (M5273, Sigma-Aldrich), BIO (B1686, Sigma-Aldrich), CHIR99021 (SI263, Selleckchem).

Plazmidy a transfekce

Konstrukty kódující normální β-katenin a β-katenin nesoucí mutaci v šeřinu 45 (S45A, AS45) a myší Lefl asociovaný s VP16 virovou aktivační doménou (Lefl-VP16) byly vytvořeny pomocí PCR a klonovány do savčího expresního vektoru pCINEO (Promega), respektive pEGFP-C3 (Clontech). Konstrukty kódující β-katenin s mutací v šeřinu 33 a šeřinu 37 (S33Y, S37A) a βkatenin postrádající N-koncovou doménu (ΔΝ, ak 132-781) (laskavě poskytl T. Valenta) byly generovány v savčích expresních vektorech pCS2 a pcDNA3.1 (Invitrogen). Transfekce byly prováděny s použitím činidla Lipofectamin 2000 (Invitrogen).

Regenerace ocasní ploutve u Danio rerio

Ryby Danio rerio mladší 6 měsíců byly pěstovány ve standardním médiu E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KC1, 0,33 mM CaCl₂ a 0,33 mM MgS0₄ v destilované vodě) při 28 °C. Ryby o velikosti 2,5 cm byly uspány trikainem (ethyl 3-aminobenzoát methanesulfonát; Sigma) a byla jim amputována přibližně 1/3 ocasní ploutve. Ryby byly náhodně rozděleny do skupin a chovány po dobu 1 týdne v médiu E3 s 2 μΜ monensinem nebo odpovídajícím množstvím etanolu. Po týdnu byly ryby vyfotografovány a délka zregenerované tkáně, rozpoznatelná díky absenci pigmentu, byla procentuálně vyhodnocena pomocí programu ImageJ.

Indukce zdvojené osy těla u pulců žáby Xenopus laevis

Xenopus mRNA Wnt8 (XWnt8) byla syntetizovaná z linearizovaného plazmidového templátu s použitím soupravy mMESSAGE mMACHEVE (Ambion). XWnt8 mRNA (20 pg) nebo mRNA β-kateninu (800 pg) společně s 0,04 pmol monensinu, respektive DMSO (výsledná koncentrace 0,4 %), byla injikována (celkový objem injikovaného roztoku byl 4 nl) do marginální zóny ventrálních blastomer čtyřbuněčného stádia embrya Xenopus laevis. Embrya byla inkubována ve 20 °C a zdvojení osy těla bylo posuzováno po 36 hodinách.

Purifikace RNA a qRT-PCR

Celková RNA byla izolována z buněk s použitím činidla RNA Blue (Top-Bio) a následně reverzně transkribována. Kvantitativní PCR v reálném čase (SYBR Green PCR Master Mix, Roche) byl prováděna v zařízení LightCycler 480 System (Roche). Dva různé geny byly použity jako endogenní kontrola pro každý qRT-PCR experiment.

Statistická analýza

Data získaná v jednotlivých analýzách byla hodnocena t-testem. Odlišena jsou statisticky významná data (*, P = < 0,05) a velmi významná data (**, P = < 0,01).

Imunocytochemická a imunohistochemická vyšetření

Obě techniky byly prováděny podle standardních protokolů. Byly použity následující komerčně dostupné protilátky: myší monoklonální anti-β-katenin, (sc-7963; Santa Cruz), myší monoklonální anti-Ki67 (Mob 237; Diagnostic BioSystems), myší monoklonální anti-Krt20, (M7019; Dako), myší monoklonální anti-p21 (556431, BD Pharmingen). Pro detekci apoptotických buněk byla použita souprava TumorTACS In Situ Apoptosis Deetection Kit (4815-30-K, RD Systems).

-8CZ 306011 B6

Imunoblotování

Buněčné lyzáty byly imunoblotovány s použitím následujících primárních protilátek: myší monoklonální anti-[3-katenin (610153, BD Transduction Laboratories™), králičí polyklonální antinon-fosfo-p-katenin/S33/S37/T41 (#4270; Cell Signaling), králičí polyklonální anti-fosfo-βkatenin/Ser675 (#4176; Cell Signaling), králičí monoklonální anti-Axin2 (#2151; Cell Signaling), králičí monoklonální anti-TCF4 (#2569, Cell Signalling), myší monoklonální anti-atubulin (TU-01; Exbio CZ).

Měření buněčného dělení

Metabolická inkorporace [³H]-thymidinu (M.G.P., konečná koncentrace 0,1 mCi/μΙ) byla měřena ve čtečce MikroBeta2 Microplate Reader (PerkinElmer) po inkubaci ve 37 °C přes noc.

Analýza buněčného cyklu

Buňky byly fixovány 70% etanolem a obarveny propidiumjodidem (Sigma, konečná koncentrace 20 pg/ml). Buněčná fluorescence byla měřena průtokovým cytometrem (BD LSRII). Buňky byly obarveny barvivém Hoechst 33342 (Invitrogen) pro rozlišení mezi buňkami ve fázi G2 buněčného cyklu a tzv. buněčnými dublety.

Léčba nádorů u myší kmene APC^M,n

Čtyři týdny stará příbuzná mláďata byla odstavena a genotypována. Dvanáct APC^Min myší bylo náhodně rozděleno do dvou skupin a podrobeno působení buďto monensinu (10 mg/kg) nebo pouze rozpouštědlu (DMSO). Látky byly podávány denně po dobu 6 týdnů. Poté byly myši usmrceny a střeva byla vyjmuta, promyta v PBS a fixována ve 4% formaldehydu po 3 dny. Fixovaná střeva byla zalita do parafínu, nařezána a imunohistochemicky obarvena. Počet a velikost střevních lézí byly kvantifikovány pomocí programu Ellipse (ViDiTo).

Příklad 2

Monensin inhibuje kanonickou signální dráhu Wnt v reportérových buňkách HEK293 a v embryích Xenopus laevis

Pro potvrzení specifity účinku monensinu byly provedeny testy luciferázové aktivity v buňkách HEK293 s použitím Wnt/[3-katenin-responzivního reportérového plazmidů TOPFLASH, neresponzivního plazmidů FOPFLASH jako negativní kontrolou a plazmidem NF-kB-Luc jakožto luciferázovým reportérem NF-κΒ dráhy. Buňky transfekované reportérovými plazmidy byly stimulovány přidáním rekombinantního ligandu Wnt3a nebo lymfotoxinu-α do média a inkubovány přes noc se zvyšujícími se koncentracemi monensinu; všechny transfekční směsi obsahovaly plazmid exprimující Renillu pro normalizaci transfekční účinnosti. Ve shodě s výsledky získanými na buňkách STF, 1 a 5 μΜ monensin redukoval TOPFLASH aktivitu na 34 %, respektive na 32 %. Oproti tomu neměl monensin žádný účinek na transkripci reportérů NF-kB-Luc a FOPFLASH (obr. 2A, data získána při použití plazmidů FOPFLASH nejsou ukázána).

Dále byla provedena analýza buněk HEK293 kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR). Buňky byly kultivovány s ligandem Wnt3a a DMSO nebo 1 μΜ, respektive 5 μΜ monensinu. Snížení exprese známých cílových genů signalizace Wnt (AXIN2, CYCLIN Dl, LGR5, NKD1, SP5) byla zaznamenána po 20 hodinách působení monensinu ve srovnání buňkami podrobenými působení samotného DMSO (obr. 2B). Protože exprese cílových genů signalizace Wnt je regulována degradací β-kateninu v cytoplazmě, původci dále zkoumali buněčnou lokalizaci a množství β-kateninu pomocí imunofluorescenčního barvení v myších buňkách L_TK . Dráha Wnt byla sti

-9CZ 306011 B6 mutována přidáním ligandů Wnt3a a buňky byly kultivovány buďto s 5 μΜ monensinu, nebo s DMSO. Viditelné snížení celkového β-kateninu bylo zaznamenáno po inkubaci přes noc (obr. 2C).

Kromě toho byla provedena Western blot analýza parentální buněčné linie STF a STF buněčné linie produkující ligand Wntl. Po 20 hodinové inkubaci s různými koncentracemi monensinu bylo zaznamenáno snížení množství celkového β-kateninu a také dvou transkripčně aktivních forem β-kateninu (protein defosforylovaný na S33/37/T41 a fosforylovaný na S675). Tento jev ukazuje na probíhající destabilizaci a degradaci buněčného β-kateninu. Navíc, protein Axin2, jehož produkce je regulována signální dráhou Wnt, byl také snížen působením monensinu. Je zajímavé, že TCF4 transkripční faktor zůstal nezměněn (obr. 2D).

Příklad 3

Monensin působí na úrovni destabilizace a degradace β-kateninu

Dále původci chtěli zjistit, na které úrovni signální kaskády Wnt monensin působí. Nejdříve byla proto stimulována signální dráha Wnt s použitím dvou specifických inhibitorů GSK3 s podobným mechanismem účinku: BIO ((2'Z,3'E)-6-bromindirubin-3'-oxim) a CHIR99021 (21). Jestliže by monensin působil na úrovni Ugandu nebo membránových receptorů, nebyl by schopen zabránit účinku látek, které aktivují dráhu níže v kaskádě na úrovni degradačního komplexu βkateninu. Luciferázový test na buňkách STF ukázal silnou inhibici u obou Wnt agonistů, BIO a CHIR99021, v přítomnosti monensinu (obr. 3A). S ohledem na to monensin může působit na úrovni degradačního komplexu nebo na nižším stupni signální kaskády. Pro kontrolu změn v množství a distribuci β-kateninu při stimulaci BIO a působení monensinu nebo DMSO bylo provedeno další imunofluorescenční barvení myších buněk L_Tk- Snížení jak cytoplazmatického tak jaderného β-kateninu potvrdilo předchozí výsledky (obr. 3B). Také Western blot analýza na buňkách STF kultivovaných 20 hodin s BIO ve třech koncentracích monensinu vykazovala snížení množství všech použitých forem β-kateninu (obr. 3C).

Pro potvrzení účinnosti monensinu na úrovni degradace β-kateninu v živém organismu byl proveden experiment indukující tvorbu sekundární osy těla u embryí Xenopus laevis. Injekce ektopické Xenopus mRNA Wnt8 (XWnt8) do marginální zóny dvou ventrálních blastomer čtyřbuněčného stádia embrya stimuluje kanonickou signalizaci Wnt na ventrální straně embrya a indukuje tvorbu sekundární osy těla (22). Stejný účinek má použití mRNA β-kateninu. S použitím specifického inhibitoru dráhy Wnt může být blokováno zdvojení osy těla embiya a zachován normální fenotyp. Současné injikování 20 pg XWnt8 s 0,04 pmol monensinu vedlo k získání 30,7 % embryí s dvojitou osou těla (n = 209), zatímco současné injikování 20 pg XWnt8 s DMSO vedlo k 65,9% výskytu embryí s dvojitou osou (n = 205; t-test: p = 0,002). Když bylo 800 pg mRNA β-kateninu injikováno současně s monensinem, tvorba sekundární osy byla snížena opět na 40,7 % (n = 130), ve srovnání se 78,1 % při současném injikování DMSO (n = 118; ttest: p = 0,0407; Obr. 3D).

Pro další objasnění mechanismu funkce monensinu byl zkoumán modulační účinek sloučeniny na buňkách STF transfekovaných plazmidovými konstrukty kódujícími různé formy genu pro βkatenin a plazmidem Renilla jako kontrolou účinnosti transfekce. Byl použit nemutovaný βkatenin (wt, „wild-type“) a β-katenin s mutacemi vyvolávajícími konstitutivní aktivaci proteinu (S33Y, S37A, S45A, AS45) včetně proteinu zcela postrádajícího N-koncovou doménu (ΔΝ). Luciferázová analýza ukázala statisticky významnou inhibici všech těchto proteinových variant při použití dvou různých koncentrací monensinu. Naproti tomu nebyl zaznamenán žádný významný účinek monensinu v buňkách transfekovaných plazmidem kódujícím fúzní protein složený z transkripčního faktoru Lefl a aktivační domény proteinu VP16 viru herpes simplex (LeflVP16), což ukazuje, že monensin neovlivňuje aktivitu samotných transkripčních faktorů rodiny

- 10CZ 306011 B6

LEF/TCF. Tyto výsledky jsou důkazem β-katenin-dependentního účinku monensinu (obr. 3E). Dále původci předpokládali, že by v důsledku působení monensinu mohlo docházet k inhibici určité buněčné kinázy nebo skupiny kináz. Byla proto provedena analýza inhibice zástupců všech „rodin“ savčích kináz monensinem v koncentraci 0,1 a 1 μΜ. Nicméně, i když byly nepatrné změny v aktivitách různých kinázových rodin, žádná významná inhibice nebyla prokázána (data nejsou ukázána).

Příklad 4

Monensin snižuje expresi cílových genů signální dráhy Wnt a brání proliferaci lidských buněčných linií kolorektálního karcinomu (CRC) SW480, COLO320 a LS174T

Jestliže monensin je schopen snížit signalizaci Wnt na úrovni degradačního komplexu βkateninu nebo níže v signální kaskádě, původci předpokládali, že by monensin mohl být použitelný při léčení kolorektálních nádorů, neboť nádorové buňky tohoto typu mají hlavní mutace většinou na této úrovni kaskády. Původci proto zkoumali účinek monensinu na čtyřech CRC liniích: SW480 a COLO320, obsahujících mutaci v genu APC; LS174T a HCT116, obsahujících mutaci v genu CTNNB1. Prvotní luciferázový experiment na liniích SW480 a HCT116, transfekovaných plazmidy TOPFLASH, FOPFLASH a Renilla, ukázal statisticky významnou reaktivitu buněk SW480 na monensin. Buňky HCT116 vykazovaly velmi nízkou hladinu aktivace signální dráhy Wnt a nebyl na nich pozorován žádný významný efekt po kultivaci s monensinem (obr. 4A). qRT-PCR analýza všech 4 linií ukázala snížení exprese cílových genů signalizace Wnt (AXIN2, CYCLIN Dl, NKD1, SP5) v liniích SW480, COLO320 a LS174T inkubovaných 42 hodin s monensinem ve dvou koncentracích. Překvapivě opět nebyl pozorován žádný statisticky významný účinek na buňky linie HCT116 (obr. 4B a data nejsou ukázána).

Následně provedená vizualizace buněčné distribuce a množství β-kateninu potvrdila, že u linií SW480, COLO320 a LS174T dochází k významnému poklesu množství proteinu. Všechny tři linie vykazují množství cytoplazmatického β-kateninu, který je charakteristický pro aktivní kanonickou signalizaci Wnt. Oproti tomu buňky HCT116 vykazují téměř výhradně membránovou lokalizaci β-kateninu, která se po kultivaci buněk s monensinem nemění, přestože buňky částečně mění svůj tvar (tento jev byl pozorován i u ostatních linií) (obr. 4C a data nejsou ukázána). Western blot analýza všech CRC kultivovaných s monensinem ukázala překvapivě méně viditelný rozpad celkového β-kateninu a jeho aktivních forem u buněk SW480, COLO320 a LS174T. Tento jev může být způsoben tím, že v buněčném lyzátu je přítomen i membránově vázaný β— katenin, u něhož původci předpokládají, že monensin nemá žádný vliv na jeho množství. U HCT116 buněk nebyla po kultivaci s monensinem zaznamenána žádná viditelná změna v množství proteinů (obr. 4D a data nejsou ukázána).

Při inhibici kanonické signální dráhy Wnt je obvykle redukována i proliferace buněk humánního kolorektálního karcinomu. Účinek monensinu na buněčnou proliferaci byl tedy testován na panelu CRC linií. Buňky byly inkubovány přes noc s různou koncentrací monensinu a s radioaktivním [³H]-thymidinem. V průběhu buněčného cyklu se [³H]-thymidin inkorporuje do nově syntetizované DNA a tak může být měřena radioaktivita celkové DNA z buněk. U SW480 a COLO320 buněk vystavených působení monensinu byla proliferace snížena o více než 50 % ve srovnání s kontrolními buňkami vystavenými působení DMSO, proliferace LS174T buněk byla přibližně o 25 % nižší než u kontrolních buněk. Podle očekávání výsledky neukázaly žádné významné rozdíly v proliferaci HCT116 buněk ani kontrolních linií HEK.293 a HeLa (obr. 4E a data nejsou ukázána). Navíc analýzou buněčného cyklu buněk SW480 bylo zjištěno, že monensin snížil podíl buněk v S fázi (ze 42,3 % u kontrolních buněk na 33,8 % v buňkách vystavených působení 5μΜ monensinu) a v G₂/M fázi (z 11,3 % na 5,2 %) a zvýšil buněčnou frakci v Gi fázi (ze 44,4 % na 59,2 %) u této linie. U buněk HCT116 inkubovaných s ΙμΜ monensinem nebyla zaznamenána žádná závažná změna ve fázích buněčného cyklu. Zajímavé je, že když byly inkubovány s 5μΜ

- 11 CZ 306011 B6 monensinem HCT116 buňky vykazovaly mírný nárůst buněk v S fázi (z 50,8 na 58,4 %) a pokles buněk v G₂/M fázi (z 18,5 na 11,9 %), zatímco poměr buněk v G, fázi zůstal nezměněný (data nejsou ukázána).

Příklad 5

Monensin redukuje vývoj nádorů u myší kmene APC^Mln

Myši kmene APC^Min (APC - mnohočetná intestinální neoplázie) nesou vrozenou mutaci v jedné alele genu APC. Mutovaná alela vytváří zkrácený protein APC. Kvůli časté spontánní mutaci v druhé alele se u myší APC^Min vyvíjejí mnohočetné polypy nejčastěji v tenkém střevě, ale i v kolonu. Proto myši APC^M,n poskytují cenný zvířecí model pro humánní karcinom střeva včetně familiární adenomatózní polypózy a sporadických střevních nádorů. Myší kmen APC^Min je užitečný pro testování chemických látek cílených proti časnému stádiu adenomů, protože intestinální polypy se objevují již během třetího týdnu po narození zvířete a následně v průběhu života narůstá jejich počet a velikost (23). Účinek monensinu byl proto testován na myších APC^Min během 6 týdnů každodenního podávání monensinu, respektive DMSO. Dvěma rovnocenným skupinám po 6 myších (3 samci a 3 samice) ve stejném věku byl denně perorálně podáván monensin v množství 10 mg/kg nebo rozpouštědlo (DMSO) ve stejném objemu. Po 6 týdnech byly myši usmrceny, odebraná střeva byla zalita do parafínu a nařezána. Imunohistochemické barvení vizualizovalo zvýšenou expresi β-kateninu ve všech střevních lézích, což dokazuje zvýšenou míru kanonické signalizace Wnt v nádorové tkáni. Obarvení umožnilo odlišit nádory a zdravou sliznici, proto mohla být následně provedena kvantitativní analýza počtu a velikosti nádorů v tenkém střevě s využitím programu pro obrazovou analýzu Ellipse. U skupiny, které byl podáván monensin, bylo pozorováno v tenkém střevě významné zmenšení celkové plochy nádorů (průměr: 10,16 mm²) ve srovnání s kontrolní skupinou (průměr: 16,46 mm²; t-test: p = 0,0125). Navíc průměrná oblast jednoho nádoru v tenkém střevě byla snížena u zvířat léčených monensinem (průměr: 0,199 mm ) ve srovnání s kontrolními zvířaty (průměr: 0,299 mm ; t-test: p = 0,0144). Obě skupiny přitom vykazovaly podobný počet nádorů v tenkém střevě (obr. 5A, B).

Následně bylo střevo imunohistochemicky barveno s použitím protilátek proti Ki67, markéru proliferujících buněk, a proti proteinu p21, inhibitoru buněčného cyklu. Byla také použita souprava TumorTACS In Situ Kit pro detekci apoptotických buněk značením zlomů dvojšroubovice DNA. Nádory vystavené působení monensinu vykazovaly téměř stejné množství proliferujících buněk jako kontrolní nádory, původci však pozorovali silnější barvení pro protein p21 i pro apoptotické buňky ve srovnání s kontrolními nádory ze stejné části střeva. Barvení bylo zaznamenáno zejména na povrchu pozorovaných lézí (obr. 5C).

Podstatné je, že po vyšetření zdravé sliznice u obou skupin použitím protilátek proti konkrétním epiteliálním buněčným populacím, jako je například Ki67, značící kmenové a progenitorové buňky ve střevní kryptě nebo Krt20, protein produkovaný v terminálně diferencovaných epiteliálních buňkách na střevních klcích, nebyly pozorovány žádné změny v proliferaci a diferenciaci buněk ani v architektuře střevního epitelu (obr. 5D). Lze tedy shrnout, že myši kmene APC^Min léčené 6 týdnů monensinem měly ve srovnání s kontrolní skupinou menší nádory v důsledku inhibice kanonické signální dráhy Wnt bez negativních vedlejších účinků na obnovu a homeostázi nezasaženého střevního epitelu.

Citovaná literatura

1. Herr, P., Hausmann, G. and Basler, K. (2012) WNT secretion and signalling in human disease. Trends Mol Med, 18,483-493.

2. Heuberger, J. and Birchmeier, W. (2010) Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2, a002915.

- 12CZ 306011 B6

3. MacDonald, B.T., Tamai, K. and He, X. (2009) Wnt/beta-CATENFN signaling: components, mechanisms, and diseases. Dev Cell, 17, 9-26.

4. Bilic, J., Huang, Y.L., Davidson, G., Zimmermann, T., Cruciat, C.M., Bienz, M. and Niehrs, C. (2007) Wnt induces LRP6 signalosomes and promotes dishevelled-dependent LRP6 phosphorylation. Science, 316, 1619-1622.

5. Valenta, T., Hausmann, G. and Basler, K. (2012) The many faces and functions of betaCATENIN. EmboJ, 31, 2714-2736.

6. Piedra, J., Martinez, D., Castano, J., Miravet, S., Dunách, M. and de Herreros, A.G. (2001) Regulation of beta-CATENIN structure and activity by tyrosine phosphorylation. J Biol Chem, 276, 20436-20443.

7. Daugherty, R.L. and Gottardi, C.J. (2007) Phospho-regulation of Beta-CATENIN adhesion and signaling functions. Physiology, 22, 303-309.

8. Polakis, P. (2012) Wnt signaling in cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol, 4.

9. Bienz, M. and Clevers, H. (2000) Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Cell, 103, 311320.

10. Phelps, R.A., Chidester, S., Dehghanizadeh, S., Phelps, J., Sandoval, I.T., Rai, K., Broadbent, T., Sarkar, S., Burt, R.W. and Jones, D.A. (2009) A two-step model for colon adenoma initiation and progression caused by APC loss. Cell, 137, 623-634.

11. Huczynski, A., Janczak, J., Lowicki, D. and Brzezinski, B. (2012) Monensin A acid complexes as a model of electrogenic transport of sodium cation. Biochim Biophys Acta, 1818, 21 OS2119.

12. Duffield, T., Bagg, R., Kelton, D., Dick, P. and Wilson, J. (2003) A field study of dietary interactions with monensin on milk fat percentage in lactating dairy cattle. J Dairy Sci, 86, 41614166.

13. Ketola, K., Vainio, P., Fey, V., Kallioniemi, O. and Iljin, K. (2010) Monensin is a potent inducer of oxidative stress and inhibitor of androgen signaling leading to apoptosis in prostatě cancer cells. Molecular cancer therapeutics, 9, 3175-3185.

14. Verras, M. and Sun, Z. (2006) Roles and regulation of Wnt signaling and beta-CATENIN in prostatě cancer. Cancer Lett, 237, 22-32.

15. Xu, Q., Wang, Y., Dabdoub, A., Smallwood, P. M., Williams, J., Woods, C, Kelley, M.W., Jiang, L., Tasman, W., Zhang, K. et al. (2004) Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell, 116, 883-895.

16. Hawcroft, G., DAmico, M., Albanese, C., Markham, A. F., Pestell, R. G. and Hull, M. A. (2002) Indomethacin induces differential expression of beta-CATENIN, gamma-CATENIN and T-cell factor target genes in human colorectal cancer cells. Carcinogenesis, 23, 107-114.

17. Lu, D. and Carson, D.A. (2009) Spiperone enhances intracellular calcium level and inhibits the Wnt signaling pathway. BMC pharmacology, 9, 13.

18. Waki, H., Park, K.W., Mitro, N., Pei, L., Damoiseaux, R., Wilpitz, D.C., Reue, K., Saez, E. and Tontonoz, P. (2007) The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulátor of PPARgamma expression. Cell Metab, 5, 357-370.

19. Stoick-Cooper, C.L., Weidinger, G., Riehle, K.J., Hubbert, C, Major, M.B., Fausto, N. and Moon, R.T. (2007) Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development, 134, 479-489.

20. Willert, K., Brown, J.D., Danenberg, E., Duncan, A.W., Weissman, I.L., Reya, T., Yates, J.R., 3rd and Nusse, R. (2003) Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. Nature, 423, 448-452.

21. Meijer, L., Flajolet, M. and Greengard, P. (2004) Pharmacological inhibitors of glycogen synthase kinase 3. Trends in pharmacological sciences, 25, 471-480.

22. Doubravska, L., Krausova, M., Gradl, D., Vojtěchova, M., Turnova, L., Lukas, J., Valenta, T., Pospichalova, V., Fafilek, B., Plachy, J. et al. (2011) Fatty acid modification of Wntl and

- 13 CZ 306011 B6

Wnt3a at serine is prerequisite for lipidation at cysteine and is essential for Wnt signalling. Cell Signal, 23, 837-848.

23. Jacoby, R.F., Marshall, D.J., Newton, M.A., Novakovic, K., Tutsch, K., Cole, C.E., Lubet, R.A., Kelloff, G.J., Verma, A., Moser, A.R. et al. (1996) Chemoprevention of spontaneous intestinal adenomas in the Ape Min mouše model by the nonsteroidal anti-inflammatory drug piroxicam. Cancer Res, 56, 710-714.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití monensinu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení familiární adenomatózní polypózy.