CZ305633B6 - Deriváty benzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití - Google Patents

Deriváty benzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ305633B6
CZ305633B6 CZ2014-539A CZ2014539A CZ305633B6 CZ 305633 B6 CZ305633 B6 CZ 305633B6 CZ 2014539 A CZ2014539 A CZ 2014539A CZ 305633 B6 CZ305633 B6 CZ 305633B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
thiazol
urea
hydroxyphenyl
fluorobenzo
chlorobenzo
Prior art date
Application number
CZ2014-539A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2014539A3 (cs
Inventor
Kamil Musílek
Kamil Kuča
Ondřej Benek
Ondřej Soukup
Daniel Jun
Laura Aitken
Frank J. Gunn-Moore
Terry K. Smith
Patrick Guest
Original Assignee
Univerzita Hradec Králové
Fakultní nemocnice Hradec Králové
The University Court Of The University Of St. Andrews
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Hradec Králové, Fakultní nemocnice Hradec Králové, The University Court Of The University Of St. Andrews filed Critical Univerzita Hradec Králové
Priority to CZ2014-539A priority Critical patent/CZ305633B6/cs
Publication of CZ2014539A3 publication Critical patent/CZ2014539A3/cs
Publication of CZ305633B6 publication Critical patent/CZ305633B6/cs

Links

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)

Abstract

Předkládané řešení poskytuje deriváty benzothiazolylmočoviny, které jsou modulátory aktivity beta-amyloid vázající alkoholdehydrogenázy (ABAD). Dále poskytuje způsob jejich přípravy a jejich léčebné použití.

Description

Deriváty benzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití
Oblast techniky
Vynález se týká nových modulátorů aktivity beta-amyloid vázající alkoholdehydrogenázy (ABAD) na bázi derivátů benzothiazolylmočoviny, způsobu jejich přípravy a jejich léčebného použití.
Dosavadní stav techniky
Alzheimerova nemoc (AD) je nejčastější formou senilní demence a její léčba představuje vysoké finanční i sociální náklady. Současná léčba je v nej lepším případě paliativní, léčí symptomy, nikoli příčiny nemoci. Tudíž jsou další rozvoj nemoci a pacientova smrt nevyhnutelné. Nesmírně důležitý je proto vývoj efektivnějších terapeutických prostředků proti této nemoci.
Amyloid beta peptid (Αβ) je obecně uznávaným faktorem zapříčiňujícím rozvoj AD. Bylo zjištěno, že tento peptid interaguje s mitochondriálním enzymem nazvaným beta-amyloid vázající alkohodehydrogenáza (amyloid binding alcohol dehydrogenáze - ABAD) (Yan, S. D., Fu, J., Soto, C., Chen, X., Zhu, H., Al-Mohanna, F., Collison, K., Zhu, A., Stem, E., Saido, T., Tohyama, M., Ogawa, S., Roher, A., and Stem, D. (1997) Nature 389, 689-695). ABAD je 27 kDa multifunkční enzym mitochondriálního matrixu, který katalyzuje redukci aldehydů a ketonů a oxidaci alkoholů (He, X. Y., Yang, Y. Z., Schulz, H., and Yang, S. Y. (2000) Biochem. J. 345 Pt 1, 139-143; Powell, A. J., Read, J. A., Banfield, M. J., Gunn-Moore, F., Yan, S. D., Lustbader, J., Stem, A. R., Stem, D. M., and Brady, R. L. (2000) J. Mol. Biol. 303, 311-327). V experimentech in vitro bylo zjištěno, že interakce mezi ABAD a Αβ je cytotoxická a způsobuje mitochondriální disfunkci, produkci reaktivních radikálů a následně buněčnou smrt (Lustbader, J. W., Cirilli, M., Lin, C., Xu, H. W., Takuma, K., Wang, N., Caspersen, C., Chen, X., Pollak, S., Chaney, M., Trinchese, F., Liu, S., Gunn-Moore, F., Lue, L.-F., Walker, D. G., Kuppusamy, P., Zewier, Z. L., Arancio, O., Stem, D., Yan, S. S., and Wu, H. (2004) Science 304, 448—452). Zajímavé je, že pro tuto cytotoxicitu je třeba, aby byl ABAD enzym katalyticky aktivní (Yan, S. D., Shi, Y., Zhu, A., Fu, J., Zhu, H., Zhu, Y., Gibson, L., Stem, E., Collison, K., Al-Mohanna, F., Ogawa, S„ Roher, A., Clarke, S. G„ and Stem, D. M. (1999) J. Biol. Chem. 274, 2145-2156).
Přímá inhibice nebo aktivace ABAD tudíž může vést k nové strategii léčby Alzheimerovy choroby.
V roce 2006 popsal Xie et al. frentizol jako sloučeninu schopnou inhibovat ABAD-Αβ interakci (Xie, Y„ Deng, S., Chen, Z., Yan, S., Landry, D. W. (2006) Bioorg. Med. Chem. Lett. 16, 4657 4660).
N
V- NH
S ^NH
O V frentizol
Frentizol je slabý inhibitor s hodnotou IC50 přibližně 200 μΜ. Xie et al. rovněž popsal analogy frentizolu, z nichž dva vykazovaly 30x vyšší aktivitu v inhibici ABAD-Αβ interakce ve srovnání s frentizolem (IC50 menší než 10 μΜ):
- 1 CZ 305633 B6
OH
Dosud nebyly nalezeny modulátory aktivity enzymu ABAD na bázi obdobného strukturního typu, které mohou mít uplatnění v léčbě Alzheimerovy choroby.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu jsou nově připravené modulátory aktivity ABAD na bázi benzothiazolových derivátů.
Předmětem tohoto vynálezu jsou deriváty benzothiazolylmočoviny obecného vzorce I
a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami, kde X, R1, R2 a R3 jsou vybrány z následujících kombinací
X R1 R2 R3 název sloučeniny
Cl H H OH jV-(2-hydroxyfenyl)-A-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea
F OH Cl H V-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-/V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2- -yl)urea
Cl OH Cl H A-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-V-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2- -yl)urea
F -OPh H H A-(4-phenoxyfenyl)-V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea
Cl -C(O)OEt H H Ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoát
F -C(O)Me H H JV-(4-acetylfenyl)-7V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea
pro použití při léčení Alzheimerovy choroby a/nebo demence.
Předmětem tohoto vynálezu jsou rovněž deriváty benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z A-(2-hydroxyfenyl)-jV'-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(3-chlor-4-hydro
-2CZ 305633 B6 xyfenylj-M-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, /V-Q-chlor-A-hydroxyfenylj-M-íó-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(4-fenoxyfenyl)-/V'-(6-fluorbenzo[d]thaizol-2-yl)urey, ethyM[3-(6-chlorbenzo]d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a 2V-(4-acetylfenyl)-A’-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
Ve výhodném provedení jsou předmětem vynálezu deriváty benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z A-(2-hydroxyfenyl)-A’-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(3-chlor4-hydroxyfenyl)-7V’-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, 7V-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-/V'-(6chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(4-fenoxyfenyl)-7V’-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a A-(4-acetylfenyl)-/V'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami, pro použití pro modulaci aktivity beta-amyloid vázající alkoholdehydrogenázy vážící amyloid-beta (ABAD). Modulací se rozumí změna aktivity tohoto enzymu, tj. aktivace nebo inhibice. Ve sloučeninách podle vynálezu je alespoň jeden ze substituentů R1, R2, R3 hydroxy skupina, fenoxy skupina nebo substituent s karbonylovou skupinou. Látky s hydroxy skupinou jeví zejména inhibiční aktivitu vůči ABAD enzymu. Látky s fenoxy skupinou nebo substituentem s karbonylovou skupinou jeví zejména aktivační aktivitu vůči enzymu ABAD.
Předmětem vynálezu jsou rovněž deriváty benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z V-(2-hydroxyfenyl)-jV’-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(3-chlor-4-hydroxyfenylj-7V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-/V’-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(4-fenoxyfenyl)-V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, ethyl-4-[3-(6chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a 7V-(4-acetylfenyl)-7V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2yljurey, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami, pro použití jako léčivo.
Předmětem vynálezu je dále použití derivátů benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z A-(2-hydroxyfenyl)-V-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, V-(3-chlor-4-hydroxyfenylj-jV^ó-fluorbenzotdjthiazoI^-yljurey, A-(3-chlor-A-hydroxyfenyl)-A'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(4-fenoxyfenyl)-A’-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, ethyM-[3-(6chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a A-(4-acetylfenyl)-/V'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2yljurey, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro výrobu léčiva pro léčení Alzheimerovy nemoci a/nebo demence.
Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický přípravek obsahující alespoň jeden derivát benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z/V-(2-hydroxyfenyl)-/V’-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, /V-(3-chlor-A-hydroxyfenyl)-A-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(3chlor-A-hydroxyfenyl)-/V'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(4-fenoxyfenyl)-A'-(6fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a N(4-acetylfenyl)-/V'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič. Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidla jako cukry, škroby, dále karboxymethylový škrob, zesíťovaný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, rozpouštědla, pojivá, atd.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Závislost ABAD aktivity na koncentraci sloučenin K690 a K691.
Obr. 2: Hanes-Woolfovo zobrazení kinetiky ABAD (μΜ min1 mg”1) v závislosti na koncentraci acetoacetyl-Co za přítomnosti (1,25 μΜ a 5 μΜ) a absence inhibitoru K690 (A) a K691 (B).
-3 CZ 305633 B6
Obr. 3: Hanes-Woolfovo zobrazení kinetiky ABAD (μΜ min 1 mg ') v závislosti na koncentraci NADH za přítomnosti (1,25 μΜ a 5 μΜ) a absence inhibitoru K.690 (A) a K691 (B).
Obr. 4: Relativní aktivity ABAD enzymu v přítomnosti derivátů benzothiazolylmočoviny při koncentraci 25 μΜ.
Příklady uskutečnění vynálezu
Vynález je popsán v následujících příkladech, které nijak neomezují jeho rozsah. Výchozí suroviny pro sloučeninu obecného vzorce I jsou dostupné z komerčních zdrojů.
Příklad 1: Příprava ABAD inhibitorů
2-amino-6-fluorbenzo[d]thiazol (1 g, 5,95 mmol) byl rozpuštěn ve směsi bezvodého dichlormethanu (DCM; 60 ml) a bezvodého dimethylformamidu (DMF, 10 ml). Byl přidán 1, Γ-karbonyldiimidazol (CDI; 1,16 g, 7,13 mmol) a reakční směs byla dobře míchána za refluxu po dobu 16 hodin v atmosféře dusíku. Výsledná sraženina byla zfiltrována, promyta DCM (30 ml) a usušena. Vznikl A-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)-lH-imidazol-l-karboxamid jako bílá pevná látka (výtěžek 95 %).
V dalším kroku byl A-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)-lH-imidazol-l-karboxamid (0,3 g, 1,14 mmol) rozpuštěn ve směsi bezvodého DMF (10 ml) a triethylaminu (Et3N; 0,35 ml). K reakční směsi byl přidán 4-hydroxyanilin (0,14 g, 1,26 mmol) a reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 16 hodin v atmosféře dusíku. Reakční směs byla naředěna vodou (40 ml) nebo 10 % HC1 (40 ml; sloučeniny s karboxylovou skupinou), pevný produkt byl zfiltrován, promyt vodou (30 ml), MeOH (5 ml) a usušen. Byla získána béžová pevná látka hydroxyfenylj-jV-íó-fluorbenzofdjthiazol^-yljurea) ve výtěžku 95 %.
Analogickým postupem byly připraveny následující deriváty, jejichž charakterizace je uvedena:
jV-(2-hydroxyfenyl)-A'-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea(K689)
T.t. 216-218 °C. Výtěžek 42 %. *H NMR (500 MHz, DMS(W): δ (ppm) 11,30 (br s, 1H), 10,12 (br s, 1H), 8,84 (br s, 1H), 8,04 (d, J= 1,8 Hz, 1H, H-7), 7,99 (d, J= 6,5 Hz, 1H), 7,64 (d, J= 8,6 Hz, 1H, H-4), 7,40 (dd, J = 8,6, 2,1 Hz, 1H, H-5), 6,93 - 6,88 (m, 2H), 6,85 - 6,77 (m, 1H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-ťř6): δ (ppm) 160,77, 152,24, 148,09, 146,47, 133,35, 126,67, 126,54, 125,97, 123,13, 121,01, 120,77, 119,28, 119,06, 114,91. ESI-MS: m/z 320 [M+H]+ (vypočteno pro C14HioC1N302S: 319,02). EA: vypočteno C 52,59; H, 3,15; N 13,14; S 10,03. Nalezeno: C 52,72; H 3,27; N 13,09; S 10,07.
V-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-N'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea (K690)
T.t. 298-299,5 °C. Výtěžek 74 %. *H NMR (500 MHz, DMSO-íř6): δ (ppm) 9,94 (br s, 1H), 8,98 (br s, 1H), 7,82 (dd, J= 8,6, 2,6 Hz, 1H, H-7), 7,69 - 7,61 (m, 1H, H^l), 7,59 (d, 2,5 Hz, 1H,
H-2'), 7,22 (td, J= 9,1, 2,7 Hz, 1H, H-5), 7,18 (dd, J= *,Ί, 2,5 Hz, 1H, H-6'), 6,94 (d, J= 8,7 Hz, 1H, H-5'). I3C NMR (126 MHz, DMSO-í/6): δ (ppm) 159,42, 158,29 (d, J = 239,1 Hz), 151,83, 149,05, 145,57, 132,52, 130,60, 120,92, 120,57, 119,59, 119,36, 116,67, 113,80 (d, J = 23,4 Hz), 108,11 (d, J= 27,0 Hz). ESI-MS: m/z 338 [M+FT] (vypočteno pro Ci4H9C1FN3O2S: 337,01). EA: vypoč. C 49,78; H 2,69; N 12,44; S 9,49. Nalezeno: C 47,39; H 2,89; N 12,12; S9,15.
-4CZ 305633 B6
A-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-N'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-y l)urea (K691)
T.t. 283,5-285 °C. Výtěžek 30 %. *Η NMR (300 MHz, DMSO-Λ6): δ (ppm) 9,95 (br s, 1H), 9,01 (br s, 1H), 8,04 (d, J= 2,1, 1H, H-7), 7,70 - 7,56 (m, 2H, H-4,2'), 7,40 (dd, J= 8,6, 2,2 Hz, 1H, H-5), 7,19 (dd, J = 8,8, 2,5 Hz, 1H, H-6'), 6,94 (d, J = W, 1H, H-5'). 13C NMR (75 MHz, DMSO-t/6): δ (ppm) 160,40, 151,93, 149,07, 132,94, 130,55, 126,88, 126,20, 121,24, 120,93, 119,60, 119,34, 116,66. ESI-MS: m/z 354 [M+H^] (vypoč. pro Cl4H9Cl2N3O2S: 352,98). EA: vypoč. C 47,47; H 2,56; N 11,86; S 9,05. Nalezeno: C 47,12; H 2,96; N 11,49; S 9,33.
V-(4-fenoxyfenyl)-N'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea (K700)
T.t. 305 - 307 °C. Výtěžek 83 %. 'H NMR (300 MHz, DMSO-76): δ (ppm) 9,15 (br s, 1H), 7,82 (dd, J= 8,6,2,2 Hz, 1H, H-7), 7,69 - 7,62 (m, 1H, H-4), 7,53 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 7,37 (t, J= 7,8 Hz, 2H), 7,23 (td, J = 9,1, 2,5 Hz, 1H, H-5), 7,10 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,02 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 6,98 (d, J = 8,0, 2H). I3C NMR (126 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 158,29 (d, 7=238,4 Hz), 151,74, 134,16, 132,54, 129,96, 122,99, 120,79, 120,67, 119,67, 117,87, 113,80 (d, J = 24,3 Hz), 108,09 (d, J= 27,1 Hz). ESI-MS: m/z 380 [M+lT] (vypoč. pro C20Hi4FN3O2S: 379,08). EA: vypoč. C 63,31; H 3,72; N 11,08; S 8,45. Nalezeno: C 62,89; H 3,40; N 10,70; S 8,05.
Ethyl—4-(3-( 6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoát (K.704)
T.t. 333-335 °C. Výtěžek 32 %. 'H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 9,53 (br s, 1H), 7,99 7,79 (m, 3H, H-7,2',6'), 7,72 - 7,56 (m, 3H, H-4,3',5'), 7,29 - 7,20 (m, 1H, H-5), 4,33 - 4,25 (m, 2H, -O-CH2-CH3), 1,31 (t, J = 6,5 Hz, 3H, -O-CH2-CH3). 13C NMR (126 MHz, DMSO¢^): δ (ppm) 165,30, 158,36 (d, 7 = 237,4 Hz), 142,93, 130,39, 123,85,118,02, 117,49, 113,94 (d, J = 23,6 Hz), 108,21 (d, J = 26,9 Hz), 60,44, 14,24. ESI-MS: m/z 360 [M+ď] (vypoč. pro Ci7H|4FN3O3S: 359,07). EA: vypoč. C 56,82; H 3,93; N 11,69; S 8,92. Nalezeno: C 56,37; H 3,77; N 11,92; S 9,24.
Ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoát (K705)
T.t. 326-328 °C. Výtěžek 45 %. *H NMR (500 MHz, DMSO-J6): δ (ppm) 9,19 (br s, 1H), 8,08 (s, 1H, H-7), 7,97 - 7,86 (m, 2H, H-2',6'), 7,72 - 7,55 (m, 3H, H-4,3',5'), 7,48 - 7,39 (m, 1H, H-5), 4,34 - 4,25 (m, 2H, -O-C7/2-CH3), 1,32 (t, 7= 6,9 Hz, 3H, -O-CH2-CJ/3). 13C NMR (126 MHz, DMSO-76): δ (ppm) 165,27, 160,41, 151,78, 142,91, 132,73, 130,37, 127,04, 126,31, 123,86, 121,33, 118,03, 117,45, 60,45, 14,24.
ESI-MS: m/z 376 [M+H+] (vypoč. Ci7Hi4C1N3O3S: 375,04). EA: vypoč. C 54,33; H 3,75; N 11,18; S 8,53. Nalezeno: C 54,01; H 3,89; N 11,50; S 8,82.
V-(4-acetylfenyl)-A’-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea (K706)
T.t. 308-310 °C. Výtěžek 48 %. 'H NMR (500 MHz, DMSO-76): δ (ppm) 9,53 (br s, 1H), 8,00 - 7,80 (m, 3H, H-7,3',5'), 7,71 - 7,55 (m, 3H, H-4,2',6'), 7,25 (t, 7= 7,8 Hz, 1H, H-5), 2,53 (s, 3H, -CO-CT/3) 13C NMR (126 MHz, DMSO-76): δ (ppm) 196,41, 158,37 (d, 7 = 235,7 Hz), 151,85, 143,91, 143,02, 132,24, 131,36, 129,67, 120,45, 117,89, 117,38, 113,96 (d, 7= 23,8 Hz), 108,26 (d, 7= 27,9 Hz), 26,45. ESI-MS: m/z 330 [M+H] (vypoč. pro C,6HI2FN3O2S: 329,06). EA: vypoč. C 58,35; H 3,67; N 12,76; S 9,74. Nalezeno: C 57,97; H 3,46; N 13,18; S 10,19.
Příklad 2: Čištění ABAD
Buňky E. coli BL21-CodonPlus, obsahující Histev-ABAD protein, byly suspendovány po dobu 30 min, 4 °C, ve štěpícím pufru (20 mM NaH2PO4, 30 mM imidazol, 500 mM NaCl, 10% (v/v)
-5CZ 305633 B6 glycerol, pH 7,5) s přídavkem kompletně EDTA-zbaveného inhibitoru proteasy (Roche), lysozymu (1 mg/mL), DNasy (20 pg/mL) a Tritonu X-100 (0,1 % (v/v)). Buňky byly štěpeny průchodem přes buněčný disruptor při 30 kPSI (Constant Systems Ltd) a lyzát byl vyčištěn centrifiigací (Sorvall Evolution RC, rotor S5-34 55-34 úhel, 20500 rpm, 30 min, 4 °C). Vyčištěný lyzát byl přefiltrován (0,44 pm membrána; Whatman) a poté aplikován na Ni-NTA (GE Healthcare) sloupec, předem promytý štěpícím pufrem, a protein byl eluován 300 mM imidazolovým pufrem (20 mM NaH2PO4, 300 mM imidazol, 500 mM NaCl, 10 % (v/v) glycerol, pH 7,5). K proteinu byla přidána proteasa Tobacco etch viru (TEV) v hmotnostním poměru 10:1, aby odštěpila histidinovou značku a protein byl poté dialyzován do 20 mM Tris-HCl, 30 mM imidazolu, 500 mM NaCl, 10 % (v/v) glycerolu, pH 7,5 obsahujícím EDTA (1 mM) a DTT (1 mM) ke zvýšení rozpustnosti. Štěpení a dialýza enzymu probíhala při teplotě 4 °C po dobu 16 h. Kompletní štěpení bylo nejprve zkontrolováno SDS- PAGE a potom kompletně štěpený protein prošel druhým Ni-sloupcem a eluát obsahující ABAD protein byl zkoncentrován na ~ 7 mL pomocí Vivaspin kolony (10 kDa MWCO, GE Healthcare). Nakonec byl produkt přečištěn a zbaven imidazolu pomocí gelové filtrace (Hi-Load 16/60 Superdex 75 prep grade column, GE Healthcare flow rate 1,5 mL/min). Protein byl eluován pufrem pro gelovou filtraci (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, pH 7,5) a zkoncentrován (Vivaspin column (10 kDa MWCO, GE Healthcare) na 10 mg/ml. Byly odebrány vzorky o objemu 10 pL, 25 pL a 50 pL, zmrazený v kapalném dusíku a uskladněny při teplotě -80 °C.
Příklad 3: Kinetika podle Michaelis-Mentenové
Byly připraveny 10 mM zásobní roztok NADH a 4,8 mM roztok acetoacetyl-CoA v HEPES pufru (10 mM, pH 7,4). Dále byl připraven pufr pro testování, složený z 10 mM HEPES pufru a 0,5 % želatiny (w/v), zahřátý na teplotu 37 °C a pH upraveno na hodnotu 7,4 pomocí NaOH.
Master mix roztoky byly připraveny v pufru pro testování obsahujícím 1 mM NADH a acetoacetyl-CoA v koncentracích 0 pM, 25 pM, 50 pM, 100 pM, 200 pM a 400 pM. Každý roztok byl rozdělen do tří jamek na 96-ti jamkové destičce (150 pL na jamku). ABAD (výsledná koncentrace 0,5 pg/mL) byl přidán do každé jamky a byla měřena absorbance při 340 nm.
Vybrané sloučeniny podle vynálezu (K690 a K691) byly přidány k reakční směsi v koncentracích 1,25 pM a 5 pM (1 % DMSO (v/v) a testovány. Výsledky jsou shrnuty do grafů na obr. 2 a 3.
Příklad 4: Testování sloučenin
Byly připraveny 10 mM zásobní roztoky v DMSO ve všech nových sloučenin připravených v příkladu 1. Roztoky NADH a acetoacetyl-CoA byly připraveny v HEPES pufru (10 mM, pH 7,4) a jejich koncentrace byly 10 mM, resp. 4,8 mM. Byl připraven pufr pro esej obsahující 10 mM HEPES a 0,5% želatiny (w/v), zahřát na teplotu 37 °C a jeho pH upraveno na hodnotu 7,4 pomocí NaOH.
Master mix roztok každé sloučeniny připravené v Příkladu 1 byl připraven v pufru pro testování; 100 μΜ sloučeniny, 250 μΜ NADH a 120 μΜ acetoacetyl-CoA. Výsledná koncentrace DMSO byla udržována na 1 % kvůli rozpustnosti sloučenin. Byl připraven kontrolní vzorek obsahující stejnou koncentraci DMSO.
Každý roztok byl rozdělen do tří jamek na 96ti jamkové destičce (150 pL na jamku). ABAD (výsledná koncentrace 0,5 pg/mL) byl přidán do každé jamky a byla měřena absorbance při 340 nm.
Další měření byla provedena pro koncentraci sloučeniny 25 pM (1 % DMSO (v/v)).
-6CZ 305633 B6
Výsledné relativní aktivity ABAD enzymu jsou uvedeny v Tabulce 1 a obr. 4.
Tabulka 1: Relativní aktivity ABAD enzymu v přítomnosti derivátů benzothiazolylmočoviny při koncentracích 25 μΜ a 100 μΜ.
Číslo sloučeniny X R1 R2 R3 100 pM SEM 25 pM SEM
kontrola - 1,00 0,03 1,00 0,03
K689 Cl H H OH 0,41 0,01 0,78 0,03
K690 F OH Cl H 0,31 0,01 0,39 0,00
K691 Cl OH Cl H 0,34 0,01 0,38 0,01
K700 F OPh H H 1,04 0,03 1,06 0,02
K704 F COOEt H H 1,05 0,03 1,07 0,02
K705 Cl COOEt H H 1,05 0,03 1,06 0,02
K706 F COMe H H 1,09 0,01 1,28 0,08
Příklad 5: Hodnoty IC50 a měření aktivity ABAD enzymu za přítomnosti inhibitoru
Inhibiční vlastnosti vybraných sloučenin podle vynálezu byly testovány pro sérii koncentrací (10 mM zásobní roztoky byly sériově zředěny 11 krát) a byly vypočteny hodnoty IC50. Byl připraven pufr pro esej obsahující 10 mM HEPES a 0,5 % želatiny (w/v), zahřát na teplotu 37 °C a jeho pH upraveno na hodnotu 7,4 pomocí NaOH.
Pro každou sloučeninu byl připraven Master mix v pufru pro testování, obsahující 250 μΜ NADH, 120 μΜ acetoacetyl-CoA a vybranou sloučeninu v příslušné koncentraci (1% DMSO v/v). Rovněž byl připraven kontrolní roztok obsahující ekvivalentní objem DMSO.
Každý roztok byl rozdělen do tří jamek na 96ti jamkové destičce (150 pL na jamku). ABAD (výsledná koncentrace 0,5 pg/mL) byl přidán do každé jamky a byla měřena absorbance při 340 nm.
Další měření byla provedena pro koncentraci sloučeniny 25 pM (1 % DMSO (v/v)).
V přítomnosti sloučenin K690 (7V-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-/V'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2yl)urea) a K691 (jV-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-A'-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea) byla pozorována inhibice ABAD enzymu a byly vypočteny hodnoty IC5o pomocí GraphPad Prism. IC50 hodnoty nalezené pro K690 a K691 byly 2,00 pM ± 1,08 pM a 1,78 pM ± 1,12 pM. Nalezené hodnoty ABAD specifické aktivity v přítomnosti vzrůstající koncentrace látky K690, respektive K691, jsou znázorněny na obr. 1.

Claims (5)

1. Deriváty benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z jV-(2-hydroxyfenyl)A'-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-fS-chlor-A-hydroxyfenylJ-M-fó-fluorbenzotdJthiazol-2-yl)urey, jV-^-chlor-A-hydroxyfenylj-M-íb-chlorbenzofdjthiazol^-yljurey, N-(4fenoxyfenylj-ÝV-Có-fluorbenzofdjthaizol^-yljurey, ethyl^l-[3-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2yl)ureido]benzoátu, ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a A-(4-acetylfenyl)-7V'-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami, pro použití při léčení Alzheimerovy choroby a/nebo demence.
2. Deriváty benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z V-(2-hydroxyfenyl)V-fó-chlorbenzofdjthiazol^-yljurey, A-(3-chlor—4-hydroxyfenyl)-V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl )urey, V-(3-ch lor-4-hydroxyfeny IJ-V-fó-ch lorbenzo[d]th iazol-2-y l)urey, A-(4fenoxyfenyl)-A-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, ethyM-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2yl)ureido]benzoátu aA-^-acetylfenylj-JV-Có-fluorbenzofdlthiazoW-yljurey, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
3. Deriváty benzothiazolylmočoviny podle nároku 2 a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami, pro použití pro modulaci aktivity beta-amyloid vázající alkoholdehydrogenázy.
4. Deriváty benzothiazolylmočoviny podle nároku 2 a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami, pro použití jako léčivo.
5. Farmaceutický přípravek obsahující alespoň jeden derivát benzothiazolylmočoviny podle nároku 2 a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič.
CZ2014-539A 2014-08-13 2014-08-13 Deriváty benzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití CZ305633B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2014-539A CZ305633B6 (cs) 2014-08-13 2014-08-13 Deriváty benzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2014-539A CZ305633B6 (cs) 2014-08-13 2014-08-13 Deriváty benzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2014539A3 CZ2014539A3 (cs) 2016-01-13
CZ305633B6 true CZ305633B6 (cs) 2016-01-13

Family

ID=55080334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2014-539A CZ305633B6 (cs) 2014-08-13 2014-08-13 Deriváty benzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ305633B6 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ307796B6 (cs) * 2018-03-27 2019-05-09 Univerzita Hradec Králové Deriváty arylbenzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001052847A1 (en) * 2000-01-19 2001-07-26 Alteon, Inc. Thiazole, imidazole and oxazole compounds and treatments of disorders associated with protein aging
WO2002053161A1 (en) * 2000-12-29 2002-07-11 Alteon, Inc. Method for treating fibrotic diseases or other indications
WO2006018662A2 (en) * 2004-08-16 2006-02-23 Prosidion Limited Aryl urea derivatives for treating obesity
WO2010077068A2 (en) * 2008-12-29 2010-07-08 Korea Institute Of Science And Technology Benzoarylureido compounds, and composition for prevention or treatment of neurodegenerative brain disease containing the same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001052847A1 (en) * 2000-01-19 2001-07-26 Alteon, Inc. Thiazole, imidazole and oxazole compounds and treatments of disorders associated with protein aging
WO2002053161A1 (en) * 2000-12-29 2002-07-11 Alteon, Inc. Method for treating fibrotic diseases or other indications
WO2006018662A2 (en) * 2004-08-16 2006-02-23 Prosidion Limited Aryl urea derivatives for treating obesity
WO2010077068A2 (en) * 2008-12-29 2010-07-08 Korea Institute Of Science And Technology Benzoarylureido compounds, and composition for prevention or treatment of neurodegenerative brain disease containing the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
4th Meeting of the Paul Ehrlich MedChem Euro-PhD Network, 20.-22.6.2014 *
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16 (2006), str. 4657-4660 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ307796B6 (cs) * 2018-03-27 2019-05-09 Univerzita Hradec Králové Deriváty arylbenzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2014539A3 (cs) 2016-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mentese et al. Microwave assisted synthesis of some hybrid molecules derived from norfloxacin and investigation of their biological activities
AU2009295946B2 (en) Chromenone analogs as sirtuin modulators
AU2004281536B2 (en) Novel alanyl-amino peptidase inhibitors for functionally influencing different cells and treating immunological, inflammatory, neuronal, and other diseases
CA2618360C (en) Benzothiazoles and thiazolopyridines as sirtuin modulators
AU2009243006B2 (en) Quinolines and related analogs as sirtuin modulators
US20090163476A1 (en) N-Phenyl Benzamide Derivatives as Sirtuin Modulators
US10231954B2 (en) Neurodegenerative therapies
US20070037809A1 (en) Sirtuin modulating compounds
CA2747158A1 (en) Phthalazinone and related analogs as sirtuin modulators
SG172001A1 (en) Isoindolinone and related analogs as sirtuin modulators
AU2012325911B2 (en) Substituted bicyclic aza-heterocycles and analogues as sirtuin modulators
NO20084845L (no) 2-pyrazinonderivater for behandling av sykdom eller tilstander der inhibiering av neutrofil elastaseaktivitetet er gunstig
AU2006218403A1 (en) Fused heterocyclic compounds and their use as sirtuin modulators
AU2006218405A1 (en) Acridine and quinoline derivatives as sirtuin modulators
WO2010046445A3 (en) Urea derivatives of substituted nortropanes, medicaments containing such compounds and their use
ZA200608712B (en) Substantially pure 2-{[2-(2-methylamino-pyrimidin-4-yl)-1II-indole-5-carbonyl]-amino}-3-(phenylpyridin-2-yl-amino)-propionic acid as an IkB kinase inhibitor
WO2011130595A2 (en) Sirtuin activators and activation assays
US20120165330A1 (en) Quinazolinone and related analogs as sirtuin modulators
WO2011116176A1 (en) 3-substitued imidazo (4, 5-b) pyridines and analogs as sirtuin modulators
CZ305633B6 (cs) Deriváty benzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití
CZ307796B6 (cs) Deriváty arylbenzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití
TW200738673A (en) Heteroaryl-substituted amides comprising a saturated linker group, and their use as pharmaceuticals
CZ2022319A3 (cs) Deriváty 2-arylbenzothiazolu, způsob jejich přípravy a jejich použití
WO2023072966A1 (en) Imidazolone derivatives as inhibitors of protein kinases in particular dyrk1a, clk1 and/or clk4
TW200716620A (en) Heteroaryl-carboxylic acid (sulfamoyl alkyl) amide-derivatives as factor Xa inhibitors