CZ302862B6

CZ302862B6 - Lécivo na lécení otoku

Info

Publication number: CZ302862B6
Application number: CZ20010538A
Authority: CZ
Inventors: Lucas@Rudolf; Baetselier@Patrick De; Pugin@Jérôme; Bloc@Alain; Fransen@Lucie
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2011-12-21
Also published as: DE69937206T2; EP1247531A2; ATE395072T1; US20030185791A1; DE69938743D1; PL203706B1; US20030105021A1; ES2296872T3; DE69937206D1; EP1247531A3; HU227661B1; WO2000009149A1; PL345997A1; EP1105152A1; IL141064A0; EP1264599A1; AU5620999A; CN1181886C; DK1264599T3; CZ2001538A3

Abstract

Použití peptidu odvozeného od TNF-.alfa. a obsahujícího retezec 7 až 17 sousedících aminokyselin, pricemž tento peptid má aminokyselinovou sekvenci obsahující hexamer TX.sub.1.n.EX.sub.2.n.X.sub.3.n.E, kde X.sub.1.n., X.sub.2 .n.a X.sub.3 .n.muže být jakákoliv prirozená nebo neprirozená aminokyselina, a nevykazuje žádnou vazebnou aktivitu k TNF receptoru, pro prípravu léciva na lécení otoku, vcetne plicního edému.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká léčiva na léčení otoků. Vynález se zakládá na zjištění, Že peptidy odvozené od specifické domény faktoru nekrózy nádorů (tumor necrosis faktor alfa, TNF-α) mohou být účinně použity k léčbě otoků. Specifičtěji se předkládaný vynález týká použití peptidů odvozených od oblasti od Ser¹⁰⁰ do Glu¹¹⁶ lidského TNF-α v léčbě plicního edému. Například je ukázáno, že peptid v cirkulámí formě mající aminokyselinovou sekvenci CGQRETPEGAEAKPWYC velmi účinně indukuje resorpci otoků.

Dosavadní stav techniky

Bylo prokázáno, že transplantace plic je užitečná v léčbě pacientů splicními onemocněními v konečném stadiu. Avšak plicní edém neboli otok (oba termíny jsou zaměnitelné) vzniklý po reperfůzi transplantátu je hlavním klinickým problémem, na který v současnosti neexistuje účinná léčba. Důkazy z nedávné doby navíc ukazují, že klíčovou roli v regulaci dynamické interakce mezi plicní vazodilatací a vazokonstrikcí hraje endotel, který je také hlavním cílem během ischémie/reperťúze a během poškození plic na podkladě syndromu akutního respiračního distresu (ARDS). Z tohoto důvodu vzhledem ke skutečnosti, že plicní edém vede často k rejekci transplantátu, a že je trvale nedostatek plícních orgánů dostupných k transplantaci, je urgentně zapotřebí zabránit nebo léčit plicní edém.

Během ischémie a reperfúze (I/R) dochází k typické indukci zánětlivých cytokinů, jako je TNFa. TNF je pliotropní cytokin produkovaný hlavně aktivovanými makrofágy, který je syntetizován jako transmembránová molekula, která může být uvolněna metaloproteázami z buněčného povrchu do cirkulace (Gearing et al., 1994). Bylo prokázáno, že TNF se váže alespoň na dva typy membránově vázaných receptorů (TNF receptor l (55 kD) a TNF receptor 2 (75 kD), které jsou exprimovány na většině somatických buněk, s výjimkou erytrocytů a nestimulovaných T lymfocytů. TNF může být považován za dvojsečný meč: bylo skutečně prokázáno, že je-li produkován ve zvýšené míře, může hrát TNF roli v patologii různých infekčních onemocnění, jako je například sepse indukovaná lipopolysacharidem (Beutler et al., 1985), mozková malárie (Grau et al., 1987, stejně tak jako s léčbou spojená mortalita u Africké trypanosomiázy (Lucas et al., 1993). Na druhou stranu bylo prokázáno, že TNF je jedním nejúčinnějších protektivních látek proti septické peritonitidě u myší a krys způsobené ligací céka a punkcí (Echtenacher et al., 1990, Alexander et al., 1991, Lucas et al., 1997, a hraje roli v obraně hostitele během pneumokokové pneumonie u myší (van der Poli et al., 1997). Navíc bylo prokázáno, že myši s deficiencí TNF receptorů 1 jsou významněji citlivější vůči infekci bakterií Listeria monocytogenes (Rothe et al., 1993, Pfeffer et al., 1993) a baktérií Mycobacterium tuberculosis (Flynn et al., 1995, stejně tak jako vůči infekcím plísňovým Steinshamn et al., 1996) a infekcím způsobeným Toxoplasmou (Deckert-Schluter et al., 1998). Proto je zřejmé, že kromě škodlivých účinků TNF během jeho nadprodukce, nebo dlouhodobé chronické sekrece, je TNF také jedním z nej účinnějších protektivních látek proti infekcím způsobených různými patogeny. V tomto ohledu byly peptidy odvozené od TNF navrženy k použití k léčbě různých chorob (DE 38411759, Bóhm et al.).

Kromě celé řady účinků způsobených aktivací jeho dvou typů receptorů (TNF receptor 1, 55 kD a TNF receptor 2, 75 kD) může TNF také zprostředkovávat aktivity nezávislé na receptorech. Koncová doména TNF je umístěna na vrcholu struktury ve tvaru zvonu a je prostorově odlišná od jeho receptorových vazebných míst, které jsou lokalizovány na bázi trimerické molekuly (Lucas et al., 1994). Tato doména má lektinu podobnou aktivitu vůči specifickým oligosacharidům, jako je například trimanóza a diacetylchitobióza. TNF i koncový peptid TNF jsou schopné zprostředkovat trypanolytickou aktivitu interferencí s lysozomální integritou trypanozómu účinkem závislým na pH pravděpodobně inzercí TNF do lysozomální membrány (Magez et al., 1997). Navíc

-1 CZ 302862 B6 mutanty koncového peptídu, u kterých byly tri klíčové aminokyseliny (T(105), E(107), E(ll0)) nahrazeny A, zcela ztratily schopnost zprostředkovat tuto aktivitu (Lucas et al., 1994). Myší TNF (mTNF) trojitá mutanta, T105A-E107A-E110A (označovaný od této chvíle jako trojitý mTNF), postrádá ve srovnání s divokým typem TNF trypanolytickou a lektinu podobnou afinitu k oligosacharidům. Trojitý TNF má ve srovnání s divokým typem mTNF za podmínek in vivo významnou systémovou toxicitu, ale jeho protektivní účinek na vznik peritonitidy zůstává na myším modelu zachován (Lucas et al., 1997).

Další aktivitou nezávislou na receptoru je jeho kapacita inzerce do membrán a kapacita tvorby sodíkových kanálů (Baldwin et al., 1996). Jinými autory bylo vskutku prokázáno, že TNF vytváří na umělém modelu lipidovém dvojvrstvy sodíkový kanál, což je aktivita závislá na pH, pravděpodobně protože vyžaduje „roztržení“ trimeru, čímž dochází k expozici hydrofobních reziduí membráně (Kagan et al., 1992).

Nedávná pozorování ukázala, že instilace anti-TNF neutralizačních protilátek do plic potkanů 5 minut před bakteriální infekcí inhibuje zvýšení clearance alveolámí tekutiny, o které je známo, že je řízena změnou intracelulámí ho obsahu sodíku v alveolámích epiteliálních buňkách. Navíc instilace TNF zvýšila u normálních potkanů za jednu hodinu clearance alveolámí tekutiny o 43 % (Rezaiguia et al., 1997). Ačkoli druhý nález ukazuje, že TNF může být použit k indukci clearance alveolámí tekutiny, nemůže být divoký typ TNF použit terapeuticky pro jeho vysokou systémovou toxicitu. Předkládaný vynález se týká použití vybrané skupiny peptidů odvozených od TNF, které mohou k našemu překvapení být účinně použity k indukci resorpce edému, a které nemají ve srovnání s divokým typem TNF systémovou toxicitu.

Je zřejmé, že existuje urgentní potřeba účinné prevence nebo léčby plicního edému. Ačkoli některé údaje ukazují, že TNF může být použit v resorpci edému, je jasné, že tato pleiotropní a potenciálně toxická molekula nemůže být použita v léčbě edému.

V tomto ohledu si předkládaný vynález dává za cíl poskytnutí netoxické molekuly se stejnou kapacitou indukce resorpce edému jako TNF. Specifičtěji má předkládaný vynález za cíl poskytnutí netoxických peptidů odvozených od TNF, které mohou být použity k prevenci nebo léčbě edému. Navíc má předkládaný vynález za cíl poskytnutí farmaceutického preparátu obsahujícího peptidy odvozené od TNF, které indukují resorpci edému. Předkládaný vynález má v podstatě za cíl poskytnout nové léčebné použití trypanocidních peptidů odvozených od TNF, jak je popsáno Lucasem et al. (1994), ajeho fragmentů a variant.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu v základním provedení i) je použití peptidů odvozeného od TNF-a a obsahujícího řetězec 7 až 17 sousedících aminokyselin, přičemž tento peptid má aminokyselinovou sekvenci obsahující hexamer TX]EX₂X₃E, kde X_h X₂ a X₃ může být jakákoliv přirozená nebo nepřirozená aminokyselina, a - nevykazuje žádnou vazebnou aktivitu k TNF receptoru, pro přípravu léčiva na léčení otoků.

Do rozsahu základního provedení vynálezu i) spadají zejména následující přednostní provedení ii) až xii):

i i) Použití podle provedení i), kde hexamer má sekvencí TPEGAE.

. 7 .

iii) Použití podle provedení i) nebo ii), kde peptid obsahuje řetězec 7 až 17 sousedících aminokyselin pocházející z oblasti lidského TNF-α od Ser¹⁰⁰ do Glu⁶ nebo z oblasti myšího TNF-a od Ser do Glu¹¹⁵.

iv) Použití podle provedení iii), kde peptid obsahuje řetězec 11 až 16 sousedících aminokyselin.

v) Použití podle provedení iii), kde peptid obsahuje řetězec 13 až 15 sousedících aminokyselin, v i) Použití podle provedení iii), kde peptid obsahuje řetězec 14 sousedících aminokyselin.

vii) Použití podle provedení vi), kde řetězec 14 sousedících aminokyselin je zvolen ze souboru sestávajícího ze sekvencí sousedících aminokyselin QRETPEGAEAKPWY a PKDTPEGAELKPWY.

viii) Použití podle kteréhokoliv z provedení i) až vii), kde peptidem je syntetický peptid.

ix) Použití podle kteréhokoliv z provedení i) až viii), kde peptid je cirkularizován.

x) Použití podle provedení ix), kde peptid je cirkularizován nahrazením NH2- a COOH- terminálních aminokyselin zbytky cysteinu, přičemž mezi těmito cysteinovými zbytky je vytvořen disulfidový můstek.

xi) Použití podle provedení x), kde cirkularizované peptidy jsou zvoleny ze souboru sestávajícího z cirkularizovaných peptidů CGQRETPEGAEAKPWYC a CGPKDTPEGAELKPWYC.

xii) Použití podle kteréhokoliv z provedení i) až xi), kde otokem je plicní edém.

V dalším popisuje vynález objasňován v širším kontextu než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen aspekty explicitně uvedené výše, a jen ty jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam.

Zde popisovaný vynález navazuje na dříve publikované práce a probíhající patentové přihlášky. Tyto práce se například skládají z vědeckých publikací, patentů nebo probíhajících přihlášek. Všechny tyto publikace a přihlášky, citované výše nebo níže jsou tímto začleněny jako reference. Předkládaný vynález se týká použití peptidů obsahujícího řetězec 7 až 17, přednostně řetězec 11 až 16, přednostněji 13 až 15 a nej přednostněji řetězec 14 po sobě jdoucích aminokyselin odvozených z oblasti Ser’⁰⁰ až Glu⁶ lidského TNF-α, nebo z oblasti Ser až Glu⁵ myšího TNF-a k výrobě léku určeného k léčbě edému. Specifičtěji se vynález týká použití peptidů, jak je popsán výše, kde řečený řetězec 14 po sobě jdoucích aminokyselin je vybrán ze skupiny tvořené po sobě jdoucími aminokyselinami QRETPEGAEAKPWY a PKDTPEGAELKPWY, jak je popsáno Lucasem et al. (1994). Posledně jmenované sekvence jsou uvedeny v dobře známém jednopísmenovém kódu pro aminokyseliny (trojpísmenný kód je použit někdy v dalším textu).

Termín „peptid“ se týká polymeru aminokyselin (aa) odvozených z trypanolytické domény TNF mající lektinu podobnou afinitu, jak je popsáno Lucasem et al, (1994). Navíc se tento termín týká polymeru 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, nebo 17 po sobě jdoucích aminokyselin odvozených z oblasti Ser¹⁰⁰ až Glu¹¹⁶ lidského TNF-α, nebo z oblasti Ser až Glu¹¹⁵ myšího TNF-α. Uvedené TNF oblasti se také týkají oblastí uvedených na Obr. 5, strana 172 v článku autorů Pennica a Goeddel, v publikací editorů Webb a Goedell (1987). Mělo by však být jasné, že oblast Ser¹⁰⁰až Glu⁶ lidského TNF-α je identická s oblastí Ser až Glu⁵ lidského TNF-α uvedené na Obr. 5, strana 172 v článku autorů Pennica a Goedell, v publikaci editorů Webb a Goedell (1987). Termín „peptid“ se specifičtěji týká peptidů obsahujícího hexamer TPEGAE uvedených oblastí TNF nebo jakéhokoli peptidů obsahujícího odpovídající aminokyseliny T, E a E uvedeného hexameru, které byly prokázány Lucasem et al. (1994), že jsou kritickými třemi aminokyselinami.

-3 CZ 302862 B6

Mělo by být jasné, že se předkládaný vynález týká jakéhokoli peptidu odvozeného od uvedených oblastí TNF a nevylučuje posttrans lační modifikace peptidů, jako jsou například gly kosy láce, acetylace, fosforylace, modifikace s mastnými kyselinami, a podobně. V předkládaném vynálezu jsou zahrnuty například peptidy obsahující jeden nebo více analogů aminokyselin (včetně nepřirozených aminokyselin), peptidů se substituovanými vazbami, mutované verze nebo přirozené sekvenční varianty peptidů, peptidů obsahujících di sulfidové můstky mezi cystě i nový mi rezidui, stejně tak jako další modifikace známé v oboru. Peptidy, které jsou předmětem předkládaného vynálezu jsou také definovány funkčně, což znamená, že se předkládaný vynález týká jakéhokoli peptidu, který může být použit k léčbě edému, nebo který může být použit k výrobě léků pro léčbu edému. Předkládaný vynález se v podstatě týká jakékoli molekuly získané jakýmkoli způsobem známým v oboru se stejnými nebo velmi podobnými charakteristikami jako trypanolytické peptidy definované Lucasem et al. (1994).

Peptidy, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou být připraveny jakýmkoli způsobem známým v oboru, jako je například klasická chemická syntéza, jak je popsána Houbenweylem (1974) a Athertonem a Shepardem (1989), nebo pomocí rekombinantních DNA technik popsaných Maniatisem et al. (1982), a specifičtěji Lucasem et al. (1994).

Termín edém (neboli otok) se týká jakékoli abnormální nadměrné akumulace (serózní) tekutiny v pojivové tkáni nebo v serózní dutině. Zejména se tento termín týká plicního edému (viz také část Příklady provedení vynálezu).

Navíc se předkládaný vynález týká použití peptidu popsaného výše, kde řečený peptid je v cirku lamí formě. Specifičtěji se předkládaný peptid týká použití peptidu popsaného výše, kde řečený peptid je převeden do cirkulámí formy pomocí náhrady NH₂ a COOH terminálních aminokyselin cysteinem, takže dochází k tvorbě disulfidického můstku mezi oběma cysteiny. V tomto ohledu se předkládaný vynález týká použití peptidu popsaného výše, kde řečené cirkulámě utvořené peptidy jsou vybrány ze skupiny tvořené cirkulámě utvořenými peptidy CGQRETPEGAEAKPWYC a CGPKDTPEGAELKPYWC, jak je popsáno Lucasem et al. (1994).

Předkládaný vynález se konečně týká farmaceutického preparátu určeného k léčbě edému, který obsahuje peptid popsaný výše. Termín „farmaceutický preparát určený k léčbě edému“ se týká jakéhokoli preparátu obsahujícího peptid definovaný výše, který zabraňuje, zmírňuje nebo léčí edémy, zejména plicní edémy. Specifičtěji se termíny „farmaceutický preparát určený k léčbě edému“ nebo „lék určený k léčbě edému“ (oba termíny jsou zaměnitelné) týkají preparátu obsahujícího peptid popsaný výše a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipientní látku (oba termíny jsou zaměnitelné), který je určen k léčbě edému. Vhodné nosiče nebo excipientní látky známé zkušené osobě jsou fyziologický roztok, Ringerův roztok, roztok sacharózy, Hankův roztok, ztužené oleje, etyl oleát, 5% dextróza ve fyziologickém roztoku, látky, které zvyšují ízotonicitu a chemickou stabilitu, pufry a konzervační látky. Další vhodné nosiče zahrnují jakýkoli nosič, který sám neindikuje tvorbu protilátek, které jsou škodlivé jedinci léčenému preparátem, jako jsou například následující nosiče: proteiny, polysacharidy, polymléčné kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymemí aminokyseliny aminokyselinové kopolymery. „Lék“ může být podán jakýmkoli vhodným způsobem známým zkušené osobě. Přednostním způsobem podání je podání parenterální. U parenterálního podání je lék, jehož se vynález týká, zformulován do jednotkové dávkovači injekční formy, jako je například roztok, suspenze, nebo emulze ve spojení s farmaceuticky přijatelnými excipientními látkami, jak je to definováno výše. Dávka a způsob podání jsou však individuální. Lék je obecně podán tak, že peptid, který tvoří jeho účinnou složku, je podán v dávce mezi I pg/kg a 10 mg/kg, přednostněji mezi 10 pg/kg a 5 mg/kg, nejpřednostněji mezi 0,1 a 2 mg/kg. Přednostně je lék podán jako bolusová dávka. Může být použita také kontinuální infúze. Pokud je použit tento způsob, může být lék podán infúzí v dávce mezi 5 a 20 pg/kg/minutu, přednostněji mezi 7 a 15 pg/kg/minutu.

-4CZ 302862 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: (A) Vztah proud-napětí v mikrovaskulámích endoteliálních buňkách myších plic (MVEC), preinkubace po dobu 30 minut s divokým typem mTNF (100 ng(ml) nebo NES pufřem při pH 6 a pH 7,3. Hodnoty reprezentující průměry 5 nebo více buněk ± SEM (*: p rovno nebo méně než 0,05). (B) Charakteristické stopy proudu myších MVEC předléěených médiem (horní část) nebo 100 ng/ml TNF (spodní část) při pH 6,0.

i» Obrázek 2: Vztah proud-napětí u rezidentních peritoneálních makrofágů izolovaných od (A) kontrol a (B) TNFR1/2⁰⁷⁰ C57BL/6 myši. Buňky byly předléčeny po dobu 30 minut pomocí média, divokého typu mTNF (100 ng/ml), nebo Ltip peptidu (100 pg/ml). Hodnoty vyjadřují průměry 5 nebo více buněk ± SEM (*: p rovno nebo méně než 0,05).

Obrázek 3: Účinek amiloridu (100 μΜ) přidaného na 30 minut během preinkubačního kroku na zvýšení membránové vodivosti u MVEC indukovaných mTNF. Srovnání účinku trojitého mTNF (100 ng/ml) a divokého typu mTNF (100 ng/ml) po 30 minutové preinkubaci s plicními MVEC. Hodnoty vyjadřují průměry 5 nebo více buněk ± SEM (*: p rovno nebo méně než 0,05).

Obrázek 4: (A) Efekt Ltip (100 pg/ml) versus kontroly u CBA plicních MVEC při pH 6 a pH 7,3. (B) Srovnání efektu 30 minutové preinkubace MVEC s peptidem Ltip, mutTip scrambTip při pH 6. Účinek amiloridu (100 μΜ) přidaného během preinkubace na zvýšení membránové vodivosti u MVEC indukované peptidem Ltip. Hodnoty ukazují průměry 5 nebo více buněk ± SEM (*: P méně nebo rovno 0,05).

²⁵

Obrázek 5: Účinek mTNF koncového peptidu (1 mg/plíce) nebo na změnu váhy plic (v g) během experimentu s perfúzí izolovaných plic trvajícím 150 minut.

Obrázek 6: Účinek divokého typu mTNF (·, 1 μg/pIíce), nebo mTNF koncového peptidu (A,

1 pg/plíce), versus kontroly (O NaCl), na změnu váhy plic (v % versus bazální váha plic po minutách) během experimentů s izolovanou perfúzí plic po 150 minutách. Každý symbol (O, ·, nebo A) reprezentuje jednu plíci.

Předkládaný vynález bude nyní ilustrován odkazem na následující příklady, které představují obzvláště výhodné formy vynálezu. Mělo by však být poznamenáno, že tyto formy vynálezu jsou ilustrativní a nemohou být považovány jako omezující vynález v jakémkoli směru.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Materiál a metodika

Zvířata, buňky a činidla. Byly použity myši mužského pohlaví s deficiencí TNF receptorů kmene CBA/J nebo C57BL/6, stejně tak jako TNFRl/2^0/0 C27BL/6 ve věku 8 až 10 týdnů, které byly poskytnuty H. Bluethmannem, F. Hoffman La Roche, Basilej, Švýcarsko. O zvířata bylo pečováno ve shodě s institucionálními směrnicemi. Plicní mikrovaskulámí endoteliální buňky byly izolovány z myší CBA/J a charakterizovány, jak je popsáno (Jackson et al., 1990), za použití magnetických kuliček (Dynabeads M-450, Dynal, Oslo, Norsko) kovalentně navázaných na purifikovanou potkaní anti-myší PECAM-I monoklonální protilátku (darovanou B. Imhofdem, Ženevská universita). Mikrovaskulámí plicní endoteliální buňky byly resuspendovány v DM EM obsahujícím 2mM L-glutamin, 100 U/ml penicilinu, 10 mg/ml streptomycinu, 20% FCS,

-5 CZ 302862 B6

U/ml heparinu a 100 mg/ml růstového doplňku pro endoteliální buňky (Brunschwig Chemie, Basilej, Švýcarsko). Pro experimenty se zasvorkovanými políčky byly buňky umístěny na Petriho misky o velikosti 35x10 mm uzpůsobené pro snadné uchopení (Beckton Dickinson, Plymouth, UK) a předem potažené 0,2% želatinou (Sigma, Buchs, Švýcarsko). Rezidentní peritoneální makrofágy izolované v ledově studeném RPMI obsahujícím antibiotika a 10 U/ml heparinu byly ponechány adherovat na Petriho misky o velikosti 35x10 mm se snadným uchopením po dobu 4 hodin, a poté byly všechny neadherované buňky odstraněny. Buňky rostly v RPMI 1640 obsahujícím 2 mM L-glutaminu, 100 U/ml penicilínu, 10pg/ml streptomycinu a 10% fetálního bovinního séra (vše od firmy Gibco). Pro experimenty se zasvorkovanými políčky byly makrofágy použity 24 hodin po izolaci.

TNF a peptidy. Rekombinantní myší TNF odvozený zE.coli (dále v textu uváděn jako TNF) a rekombinantní (T104A-E106A-E109A) trojitá TNF mutanta odvozená z E.coli (mutTNF) byly syntetizovány, jak je popsáno jinde (Lucas et al., 1997). Peptidy odvozené z TNF byly syntetizovány s pomocí Fmoc-a-aminoskupinové protekce (Fields et al. 1990) a purifikovány na Cl8 vysoko-účinné kapalinové chromatografické koloně s reverzní fází.

Byly syntetizovány následující peptidy odvozené od TNF:

Dlouhý koncový peptid 99-115 (Ltip) CG-CGPKDTPEGAELKPWYC

Zmutovaný koncový peptid 99-115 (mutTip) CG-CGPKDAPAGAALKPWYC

Smíchaný koncový peptid (scamblTip) GC-CGTKPWELGPDEKPAYC

Krátký koncový peptid (Štip) CTPEGAEC

Za účelem teoreticky uchovat původní konformaci TNF v co největší míře, byly peptidy Ltip, MutTip a ScramblTip převedeny do cirkulámí formy. Ser TNF sekvence byla nahrazena Cys a Cys^t0° byl nahrazen Gly, takže mohl být v peptidech vytvořen disulfidový můstek mezi Cys a Cys¹¹⁵. Peptid Štip nemohl být převeden do cirkulámí formy, Peptidy nebyly biotinylovány.

Elektroíyziologie. Buňky byly preinkubovány po dobu 30 minut s TNF, mutTNF a koncovými peptidy při teplotě 37 °C v pufru obsahujícím 145 mM NaCl, 3mM KC1, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCI₂, 10 mM D-glukózy a 10 mM Hepes a pH bylo upraveno pomocí NaOH na požadovanou hodnotu. Buňky byly poté promyty stejným pufrem s pH upraveným na 7,3 a experimenty byly provedeny za použití technik s pevným utěsněním a záznamem celé buňky. Proudy byly zaznamenány pomocí zesilovače Axopatch-200A (Axon Instrument lne, Foster City, CA, USA) nízce filtrovaným při 1 kHz. Digitalizace a následná analýza byly provedeny za použití programu WCP (J. Dempster, Strathclyde Electrophysiology Software, Glasgow, UK). Políčkové pipety byly vytaženy z borosilikátového skla a vyhlazeny ohněm tak, aby měly otevřený odpor 3 až 5 MW s vnitřním roztokem obsahujícím 130 mM CsCl, 2 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, 20 mM TEA-C1, 10 mM D-glukózy, 10 mM HEPES, pH bylo upraveno na hodnotu 7,3 pomocí CsOH. Sériové odpory byly udržovány pod 10 MW. Kapacitance a kompenzace sériové rezistence byly nastaveny na 70 %, Všechny experimenty byly prováděny při pokojové teplotě. Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± SEM, pokud nebylo jinak uvedeno. Na vyhodnocení proudů a hodnot membránové vodivosti byla provedena variační analýza s post-hoc Dunn-Bonferroniho testem za účelem zjištění významnosti rozdílů pozorovaných mezi oběma skupinami. Hodnota p 0,05 byla považována za významnou.

Fluorescence tryptofanu. Měření fluorescence bylo provedeno pomocí PTI spektrofluorometru. Excitační vlnová délka byla 295 nm, šířka štěrbiny byla 5 nm pro excitaci a 2,5 nm pro emisi. U každého zaznamenaného spektra bylo odstraněno Ramanovo rozptylové spektrum odečtením pufru jako slepého vzorku. Všechny pufry obsahovaly 150 mM NaCl a 20 mM pufru N-[2-morfolino] etan-sulfonové kyseliny (MES) o požadovaném pH. Vzorky byly před změřením emisního spektra inkubovány po dobu 1 hodiny a 30 minut při požadovaném pH. Koncentrace divokého typu a zmutovaného TNF byly 6 pg/ml.

-6CZ 302862 B6

Příprava lipozómů. Velké unilamelámí lipozómy byly připraveny evaporací na reverzní fázi, jak bylo popsáno dříve (Vecsey-Semjen et al., 1996). Lipozómy byly připraveny buďto ze 100% vaječného fosfatidylglycerolu (EPG), nebo ze směsi EPC a EPG (1:1 w/w) v pufru obsahujícím

100 mM Kel, 20 mM N-[2-hydroxyetyl]piperazin-N'-[2-etan-sulfonové kyseliny] (HEPES), pH 7,4 a 1,5 mg/ml 6-metoxy-N-(3-sulfopropyl)chinoIinia (SPQ).

Měření refluxu chloridů. Všechny fluorescenční experimenty byly provedeny za použití PTI spektrofluorometru vybaveného termostatickým držákem kyvety (37 °C). Barvivo bylo excitová10 no při 350 nm a emise byly zaznamenávány při 422 nm, přičemž excitační i emisní šířky paprsku byly nastaveny na 5 nm. Lipozómy byly naředěny do finální koncentrace 50 pg/ml v roztoku obsahujícím 100 mM KNO₃ a 20 mM MES pH 6,1, nebo 20 mM HEPES, pH 7,4. Divoký typ a zmutovaný TNF byly přidány do finální koncentrace 3 pg/ml.

Prozánětlivá aktivita TNF a koncových peptídů TNF. Prozánětlivá aktivita TNF a odvozených peptídů byla stanovena za použití biostanovení měřícího kapacitu TNF indukovat zvýšení exprese povrchové intercelulámí adhezní molekuly (ICAM)-1 u epitelií A549 podobných alveolámímu typu II (Pugin et al., 1996). Stručně řečeno byly buňky A549 umístěny ve shluku na mikrotitraění destičku a inkubovány po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C s různými koncentracemi TNF, io mutTNF a peptidy. Zvýšení exprese povrchového ICAM-1 bylo detekováno přímým ELIS A stanovením na buňkách za použití první anti-ICAM-l protilátky (R+D Systems, Abdington, UK), druhé oslí anti-myší IgG-peroxidáza konjugované protilátky (Jackson), prokazované ofenylendiaminem (Sigma) a zastavované pomocí H₂SO₄. Optické denzity (OD) byly stanovovány při 490 nm s odečtením optické denzity při 620 nm.

Výsledky

Příklad LI: Účinek TNF na membránovou vodivost u myších buněk Nejprve jsme na primárních myších zkoumali, zdali TNF modifikoval proud celé buňky. Po 30 minutové pre inkubaci rezidentních peritoneálních makrofágů a p lícních mikrovasku lamích endoteliálních buněk pomocí 100 ng/ml TNF došlo u mikrovasku lamích endoteliálních buněk k významnému zvýšení zevního a do mešní míry i vnitřního proudu, jak bylo stanoveno v experimentu se zasvorkovanými políčky, ve srovnání s buňkami neexponovanými TNF (endoteliální buňky, Obr. 1A a makrofágy,

Obr. 2). Snížení preinkubační doby (na 5 minut) nebo dávky TNF (na 10 ng/ml) vedlo k podobným výsledkům (údaje nejsou uvedeny). K tomuto efektu bylo zapotřebí kyselých preinkubačních podmínek, protože kněmu nedošlo pokud byla preinkubace provedena při pH 7,3 (Obr. 1). Vodivost indukovaná TNF byla nezávislá na napětí a vykazovala reverzní potenciál okolo 0 mV v případě endoteliálních buněk. Aby bylo možno zjistit, zdali zvýšení iontového proudu induko40 váného pomocí TNF bylo závislé na TNF receptorů, byly rezidentní peritoneální makrofágy izolovány od myší s deficiencí TNF receptorů-1 i 2 (TNFR/2^0/0) a byly testovány v experimentu se zasvorkovanými políčky. TNF indukoval u buněk postrádajících TNF receptory proud závislý na napětí (Obr. 2B). Tento kritický experiment prokázal, že TNF indukovaná vodivost se u savčích buněk vyskytla nezávisle na TNF receptorů. Tyto výsledky také ukazují, že proud indukovaný

TNF není specifický pro určitý buněčný typ.

Protože doména TNF, která je podobná lektinu, je prostorově a funkčně odlišná od jeho receptorových vazebných míst, zkoumali jsme dále, zdali hraje u savčích buněk tato doména roli v pozorovaném efektu TNF na aktivaci iontových kanálů. Proto byl porovnán efekt TNF mutanty (mutTNF), u kterého byly tri kritická rezidua pro lektinu podobnou aktivitu TNF nahrazeny alaninem, s TNF u endoteliálních buněk. Jak je uvedeno na Obr. 3, mutTNF zcela postrádá efekt TNF na aktivaci vodivosti dokonce i při 100 násobně vyšší dávce (l pg/ml mutTNF versus 10 ng/ml TNF, údaje nejsou uvedeny). Oproti tomu nativní a zmutované molekuly TNF vykázaly u A549 epiteliálních buněk podobný potenciál indukce ICAM-1 (Obr. 4). To ukázalo, že navzdo55 ry konzervované aktivitě zprostředkované TNF receptorem, nebyl mutTNF schopen zvýšit pro-7CZ 302862 B6 pustnost iontů. Aby bylo možné ověřit hypotézu, že TNF otvírá sodíkový kanál, provedli jsme další experimenty v přítomnosti amiloridu, který je blokátorem epiteliálního sodíkového kanálu. Sto uM amiloridu přidaného během preinkubace při pH 6,0 zrušilo zvýšení vodivosti indukované TNF (Obr. 3).

Příklad 1.2: Koncová doména TNF zprostředkovává účinek na zvýšení membránové vodivosti

Protože se koncová doména TNF zdála být kritická pro aktivaci iontové propustnosti, testovali jsme dále, zdali peptid napodobující tuto oblast, byl dostatečný ke zvýšení membránové vodivosti, jak bylo pozorováno u nativního TNF. Léčba endoteliálních buněk a makrofágů dlouhým koncovým peptidem v cirkulámí formě o délce 17 aminokyselin (Ltip peptid), který napodobuje lektinu podobnou doménu TNF, vedl při kyselém pH ke zvýšenému zevnímu i vnitřnímu proudu u mikrovaskulámích endoteliálních buněk. Na rozdíl od TNF tento efekt přetrvával při neutrálním pH, ačkoli méně vyjádřeně (Obr. 2A a 4A). Podobně jako u TNF byl tento efekt blokován 100 μΜ amiloridu (Obr. 4B). Zmutovaný T104A-E106A-E109A) peptid v cirkulámí formě o délce 17 aminokyselin (mutTip peptid) a peptid v cirkulámí formě o délce 17 stejných, však náhodně sestavených aminokyselin (scrambTíp peptid) byly inaktivní s ohledem na aktivitu iontového kanálu (Obr. 4B). Tyto výsledky ukazují, že koncová doména TNF byla zodpovědná za zprostředkování jeho aktivity zvyšující membránovou vodivost a také potvrzují, že rezidua T104, El06 El09 byly pro tento efekt nezbytné. Ltip peptid byl také aktivní u buněk sdeficiencí TNFR-1 i 2 receptorů (Obr. 2Β). Avšak krátký koncový hexapeptid obsahující 3 koncové aminokyseliny nedokázal u mikrovaskulámích endoteliálních buněk indukovat proud závislý na napětí (tyto výsledky nejsou uvedeny), což naznačuje, že tento peptid nemá nezbytnou strukturu zodpovídající za iontově kanálový efekt. Zajímavé bylo, že žádný zpeptidů neindukoval ICAM-1 v buňkách A549, což ukazuje, že tyto peptidy ztratily aktivitu zprostředkovávanou TNF receptorem.

Příklad 1.3: Nativní a zmutovaný TNF se pri kyselém pH částečně rozbaluje

Již dříve bylo prokázáno, že TNF interaguje s lipidy v závislosti na pH, a že tato membránová interakce koreluje s částečným rozbalením proteinu (Hlodán et al., 1994, Baldwin et al., 1996). Z tohoto důvodu jsme zkoumali, zdali chybění aktivity mutTNF na plicní MVEC při kyselém pH je způsobeno jeho neschopností se částečně rozbalit a interagovat s membránami. Konformace mutTNF pri různých pH byla sledována měřením vnitřní tiyptofanové fluorescence molekuly. Intenzita fluorescence poklesla po acidifíkaci média a pri maximální emisi došlo k červenému posunu při 318 nm při pH 6 na 339 nm pri pH 4,6. Tato pozorování ukázala, že původně skrytá rezidua tryptofanu se exponují rozpouštědlu. Protein nebyl však plně rozbalen, protože spektrum při pH 4,6 nebylo v červené oblasti tak posunuto, jako tomu bylo u mutTNF v 6M GuHCl. Tyto výsledky ukazují, že mutTNF byl schopen v kyselém prostředí se rozbalit. Toto rozbalení mutTNF v kyselém prostředí bylo vskutku rychlejší a o něco rozsáhlejší než u divokého typu TNF.

Příklad 1.4: Nativní i zmutovaný TNF interaguje s membránami pří kyselém pH

Dále jsme zkoumali, zdali byl mutTNF schopen interakce s membránami při kyselém pH pomocí sledování jeho schopnosti indukovat únik chloridů z lipozómů obsahujících 100% vaječný fosfatidyl glycerol (EPG). Nativní TNF indukoval odtok chloridů pri pH 6,1. MutTNF byl při pH 6 stále zabalen, my jsme však již dříve prokázali, že pH na povrchu 100% EPG vezikul je mnohem nižší, než je celkové pH, a specifičtěji, že při celkovém pH 6 je povrchové pH 4,35. Proto je pravděpodobné, že došlo k částečnému rozbalení mutTNF na povrchu EPG vezikul. Efekt mutTNF na SPQ fluorescenci byl dokonce mnohem více vyjádřen než u divokého typu TNF, a to ve shodě s faktem, že rozbalení za kyselých podmínek bylo mnohem rychlejší než u divokého

-8CZ 302862 B6 typu TNF. Podobně jako bylo pozorováno dříve u nativního TNF (Baldwin et at, 1996), mutTNF neinteragoval s membránami při neutrálním pH.

Abychom vyzkoumali, zdali odtok chloridů byl způsoben vazbou nebo vložením membrány pomocí TNF, provedli jsme analýzu, zdali jsou brómované lipidy schopné zhasit vnitřní fluorescenci TNF a mutTNF po interakci s membránou. Brómované lipidy byly užitečné pro určení topologie membránových proteinů (Bolen et at, 1990), (Markelo et at, 1985), stejně tak jako pro studium membránové interakce toxinů tvořících póry (Gonzales-Manas et at, 1992) (Van der Goot et at, 1991) (Vecsey-Semjen et at, 1997). TNF obsahuje dvě tryptofanová rezidua, jedno na vrcholku domény vázající se k receptoru jednu na vrcholku takzvané koncové domény. Pokud by konec TNF trimeru byl vložen do lipidové dvoj vrstvy, mělo by dojít k vymizení fluorescence Trp-113 po vložení do lipozómů tvořených dioleoylfosfatidylglycerolem s připojeným brómem v pozici 9 a 10 acylových řetězců. My jsme skutečně již dříve prokázali, že tryptofany lokalizované na hranici mezi hlavními lidovými skupinami a acylovými řetězci byly schopné potlačit bromidy. Nebyli jsme však schopni pozorovat potlačení fluorescence po přidání buďto TNF, nebo mutTNF při kyselém pH k vezikulám tvořených hromovanými lipidy.

Pozorování popsané výše ukazuje, že mutTNF podléhá při kyselém pH částečnému rozbalení a je poté schopný interagovat s membránami. Chybění potlačení fluorescence hromovanými lipidy však naznačuje, že uvolňování chloridů bylo způsobeno vazbou částečně rozbalených molekul TNF k lipidové dvojvrstvě, spíše než vložením membrány molekulou TNF.

Dále jsme testovali, zdali jsou TNF koncové peptidy schopné indukovat odtok chloridů z vezikul obsahujících SPQ a zdali může být pozorováno vymizení fluorescence tryptofanu po interakce s hromovanými lipidy. Byly použity lipozómy obsahující buďto 100 % neutrálních lipidů, 100 % kyselých lipidů, nebo směs obou látek v poměru 1:1. Pro žádný z lipidových preparátů a pro koncentrace peptidu do 300 pg/ml jsme nepozorovali žádnou změnu v SPQ fluorescenci, ani žádné potlačení fluorescence hromovanými lipidy. Toto platilo pro všechny 4 peptidy. Tyto experimenty naznačují, že Ltip, stejně tak jako modifikované koncové peptidy nebyly schopné interagovat s membránami.

Příklad 2

Experimenty s períuzí izolovaných plic

Plíce samic potkanů kmene Wistar vážících okolo 300 g byly izolovány, jak je popsáno v práci DeCampos et al., (1993). Do plic bylo intratracheálně podáno buďto 500 μΙ sterilního 9% NaCI, divoký typ myšího TNF (1 pg/plíce), nebo mTNF koncový peptid (Ltip, viz výše, 1 mg/plíce). Následně byly plíce perfundovány krví izolovanou ze stejného potkana. O třicet minut později bylo do plic podáno intratracheálně 2 mí sterilního 9% roztoku NaCI, což vedlo váhovému nárůstu o zhruba 2 g (Obr. 5). Vývoj váhy byl poté sledován průběžně po dobu 150 minut (Obr. 5).

Váha kontrolních plic (preinkubovaných s NaCI) se časem nesnížila, naopak u plic, které byly preinkubovány buďto s wtTNF, nebo s koncovým peptidem, došlo k významnému snížení váhy na 25 až 50 % po 150 minutách (Obr. 5 6), což odpovídá menší přítomnosti hydrostatického edému. V případě TNF koncového peptidu došlo k úbytku váhy okamžitě po injekci 2 ml roztoku NaCI (Obr. 5).

Tyto experimenty demonstrují, že koncový peptid mTNF, podobně jako divoký typ molekuly, mohou vést k resorpci edému. Koncový peptid se však na rozdíl wt mTNF neváže na TNF receptory a nevede ke zvýšené expresi adhezních molekul v plicních endoteliálních a epiteliálních buňkách. Z tohoto důvodu koncový peptid indukuje v plicích méně toxických účinků ve srovnání s wt mTNF.

-9CZ 302862 B6

Seznam citací

Alexander, H. R. et al. (1991): Single-dose tumor necrosis factor protection against endotoxininduced shock and tissue injury in rats. Infect. Immun. 59, 3889 až 3894.

Atherton, Shepard (1989). Solid phase peptide synthesis. 1RL Press, Oxford.

Baldwin, R. L. et al. (1996): Structural changes of tumor necrosis factor alpha associated with membrane insertion and channel formation. PNAS USA 93.1021 až 1026.

Baldwin, R. L. et al. (1996): Structural changes of tumor necrosis factor alpha associated with membrane insertion and channel formation. Proč Nati Acad Sci USA 93, 1021 až 1026.

Beutler, B. et al. (1985): Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science 229, 869 až 871.

Bolen, E. J. a Holloway, P. W. (1990): Quenching of tryptophan fluorescence by brominated phospholipid. Biochemistry 29, 9638 až 9643.

Bruče, A. J., et al. (1996): Altered neuronal and microglial responses to excitotoxic and ischemic brain injury in mice lacking TNF receptors. Nat. Med. 7, 788 až 794.

Deckert-Schluter, M. et al. (1998): Crucial role of TNF receptor type I (p55), but not of TNF type 2 (p75), in murine toxoplasmosis. 160, 3427 až 3436.

DeCampos et al. (1993): Assessment of postpreservation rat lung function using a new model for extended venous reperfusion. J. Appl. Physiol. 75, 1890 až 1896.

Echtenacher, B. et al. (1990): Requirement of endogenous tumor necrosis factor for recovery from experimental peritonitis. J. Immunol. 145, 3762 až 3766.

Fields, G. B. aNoble, (1990) Int J Pept Protein Res 35, 161-214.

Flynn, J. L. et al. (1995): TNF is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity 2, 561 az 572.

Gearing, A. J. et al. (1994): Processing of TNF precursor by metalloproteinases. Nátuře 370, 555 až 557.

Gonzales-Manas, J. M. et al. (1992) Biochemistry 31, 7294 až 7300. Hlodán, R, a Pain, R. H. (1994) FEBS Lett 343, 256 až 260.

Houbenweyl (1974): Methode der organischen chemie, vol. 15, I a II (ed. Wusch E). Thieme, Stuttgart. IRL Press, Oxford.

Jackson, C. J. et al. (1990): Binding of human endothelium to Ulex europaeus l-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci 96, 257 až 262.

Kagan, F. et al. (1992): Formation of ion-permeable channels by tumor necrosis factor-alpha. Science 255, 1427 až 1430.

Lucas, R. et al. (1993): A role for TNF during Afričan Tiypanosomiasis; involvement in parasite control, immunosupression and pathology. Res. Immunol 144, 370 až 376.

- 10CZ 302862 B6

Lucas, R. et al. (1994); Mapping the lectin-like affinity of tumor necrois factor. Science 263, 814 až 817.

Lucas, R, et al. (1997): Generation of a mouše tumor necrosis factor mutant with anti-peritonitis and desensitation activitíes comparable to those of the wild type but with reduced systemic toxicity. Infect. Immun, 65(6), 2006 až 2010.

Magez, S. et al. (1997): Specifíc update of tumor necrosis factor a is involved in growth control of Trypanosoma Brucei, J. Cel. Biol. 137(3): 715 až 727.

i o

ManiatisT, Fritsch E, Sambrook J (1982). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Markello, T. et al. (1985): Determination of the topography of cytochrome b5 in lipid vesicles by fluorescence quenching. Biochemistry 24,2895 až 2901.

Pfeffer, K. et al. (1993): Mice deficient for the 55 kD TNF receptor are resistant to endotoxic shock, yet succumb to L. monocytogenes infection. Cell 73, 457 až 467.

Rezaiguia, S. et al. (1997): Acute bacterial pneumonia in rats increases alveolar epithelial fluid clearance by tumor necrosis factor-alpha-dependent mechanism. J. Clin. Invest. 99(22), 325 až 335.

Rothe, J. et al. (1993): Mice lacking the TNF receptor 1 are resistant to TNF-mediated toxicity but highly susceptible to infection by Listeria monocytogenes. Nátuře 364, 798 až 802.

Steinshamn, S. et al. (1996): TNF receptors in murine Candida albicans infection: evidence for an important role of TNF receptor in antifugal defense. J. Immunol. 157, 2155 až 2159.

Van der Goot, G. F. et al. (1991): A 'molten-globule' membrane insertion intermediate of the pore-forming domain of colicin A, Nátuře 354, 408 až 410.

Van der Poli, T. et al. (1997): Passive immunization against tumor necrosis factor-alpha impairs host defense during pneumococcal pneumonia in mice. Am. J. Resp. Crit. Care Med, 155, 603 až

608.

Vecsey-Semjen, B. et al. (1996) J Biol Chem 271, 8655 až 8660.

Vecsey-Semjen, B. et al. (1997) J Biol Chem 272, 5709 až 5717.

Webb, D. R. a Goeddel D. V., eds (1987: Lymphokines Vol 13, Molecular Cloning and analysis of lymphokines in Lymphokines, A fórum for immunoregulatory cell products (Piek E., ed.), Academie Press, lne., London.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití peptidu odvozeného od TNF-α a obsahujícího řetězec 7 až 17 sousedících aminokyselin, přičemž tento peptid

- má aminokyselinovou sekvenci obsahující hexamer TX|EX₂X₃E, kde X_t, X₂ a X₃ může být jakákoliv přirozená nebo nepřirozená aminokyselina, a

- nevykazuje žádnou vazebnou aktivitu k TNF receptoru, pro přípravu léčiva na léčení otoků.
2. Použití podle nároku 1, kde hexamer má sekvenci TPEGAE.
3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde peptid obsahuje řetězec 7 až 17 sousedících aminokyselin pocházející z oblasti lidského TNF-α od Ser™ do Glu¹¹⁶, nebo z oblasti myšího TNF-α od Ser do Glu⁵.
4. Použití podle nároku 3, kde peptid obsahuje řetězec 11 až 16 sousedících aminokyselin,
5. Použití podle nároku 3, kde peptid obsahuje řetězec 13 až 15 sousedících aminokyselin.
6. Použití podle nároku 3, kde peptid obsahuje řetězec 14 sousedících aminokyselin.
7. Použití podle nároku 6, kde řetězec 14 sousedících aminokyselin je zvolen ze souboru sestávajícího ze sekvencí sousedících aminokyselin QRETPEGAEAKPWY a PKDTPEGAELKPWY.
8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde peptidem je syntetický peptid.
9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde peptid je cirkularizován.
10. Použití podle nároku 9, kde peptid je cirkularizován nahrazením NH₂- a COOH-terminálních aminokyselin zbytky cysteinu, přičemž mezi těmito cysteinovými zbytky je vytvořen disulfidový můstek.
11. Použití podle nároku 10, kde cirkularizované peptidy jsou zvoleny ze souboru sestávajícího z cirkularízovaných peptidů CGQRETPEGAEAKPWYC a CGPKDTPEGAELKPWYC.
12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde otokem je plicní edém.