CZ302204B6

CZ302204B6 - Zpusob výroby opticky cistých stereomeru silybinu A a silybinu B

Info

Publication number: CZ302204B6
Application number: CZ20090687A
Authority: CZ
Inventors: Kren@Vladimír; Gažák@Radek; Marhol@Petr; Monti@Daniela; Riva@Sergio
Original assignee: Mikrobiologický ústav AV CR, v.v.i.
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2009-10-21
Publication date: 2010-12-15
Also published as: CZ2009687A3

Abstract

Zpusob rozdelení stereomeru silybinu A a B využitím jejich acetylovaných forem. Smesný 23-O-acetylsilybin, který lze získat i chemickou acetylací prírodního silybinu, se výhodne pripraví enzymovou acetylací, pri níž se na silybin pusobí lipázou Novozym 435 v prítomnosti vinylacetátu rozpušteného v terc-butylmethyletheru. Na smesný silybin-O-acetát se pusobí Novozymem 435, lipázou z Candida antarctica imobilizovanou na polyakrylátové pryskyrici, výhodne ve smesi terc-butylmethylether/n-butanol. Pri reakci dochází ke kineticky rízené enzymové alkoholýze pouze jednoho stereomeru, silybin-O-acetátu B, takže vznikne smes volného silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A, které lze velmi snadno chromatograficky oddelit. Silybin A se poté uvolní enzymove katalyzovanou alkoholýzou za prídavku vyššího množství Novozymu 435 ve smesi terc-butylmethylether/n-butanol. Pro dosažení vysoké optické cistoty je možné nekteré enzymové separacní kroky opakovat, a to prípadne za upravených podmínek - napr. za použití toluenu jako rozpouštedla.

Description

Způsob výroby opticky čistých stereomerů silybinu A a silybinu B

Oblast techniky 5

Vynález se týká enzymové separace diastereomerů silybinu A a B z přírodního silybinu, izolovaného zplodů ostropestřce mariánského (Silybum marianum) pomocí mikrobiální lipázy. Silybin je účinný antioxidant a chemoprotektivní látka, jeho čisté stereomery A a B se podstatně liší v biologických aktivitách. Silybin B má na rozdíl od silybinu A estrogenní účinky a je mnohem účin10 nější proti nádorům prostaty.

Dosavadní stav techniky

Silybin (Obr. 1) je látka bohatě obsažená v semenech ostropestřce mariánského (Silybum marianum). Spolu se svými izomery sumárního vzorce C25H12O10 silydianinem, silychristinem a isosilybininem je součástí komplexu silymarinu, který se používá k léčbě jatemího poškození ajako hepatoprotektivum (např. v léčivech Legalon, Flavobion aj.). Silybin je v medicíně dlouhodobě využíván pro své významné antioxidační a celkově cytoprotektivní účinky i pro působení vůči volným radikálům. Chemické a farmakologické vlastnosti, jakož i terapeutické využití silymarinu a jeho složek, jsou důkladně popsány v literatuře (viz Morazzoni P., Bombardeli E.: Silybum marianum ICarduus marianusl; Fitoterapia, 1995, 3 - 42 a odkazy v této práci uvedené). V nedávné době se silybin začal používat také k léčbě některých nádorových onemocnění, například hyperplasie a nádorů prostaty. Tyto účinky jsou zprostředkovány interakcí silybinu s buněč25 nými a jadernými receptory.

Přírodní silybin je prakticky ekvimolámí směsí dvou diastereomerů, silybinu A a silybinu B (obr. 1) (D. Y.-W. Lee, Y. Liu, J. Nat. Prod. 2003, 66, 1171-1174.; N.-C. Kim, T. N. Graf a spol., Org. Biomol. Chem. 2003, /, 1684-1689). V literatuře je popsáno, že oba diastereomery silybinu mají odlišné farmakologické účinky, konkrétně silybin B má estrogenní účinky, zatímco silybin A tuto aktivitu nevykazuje (M. Plíšková a spol., Toxicology 2005, 215, 80-89), Další studie ukázala, že silybin B je značně účinnější při potlačení růstu buněk nádorů prostaty (P. R. Davis-Searles a spol., Cancer Res. 2005, 65, 4448-4457), což má značný význam pro jeho praktické využití v léčbě těchto nemocí. Pro terapeutické a jiné využití silybinu je tedy potřebné pou35 žívat tzv. opticky čistý silybin, tj. jeho čistý stereoizomer, který má požadovanou aktivitu. Problémem je však oddělení silybinu A a silybinu B.

Analytická separace těchto dvou látek je dobře popsaná (T.-M. Ding a spol., J. Pharm. Biomed. Anal,, 2001, 26, 155-161), ovšem preparativní separace je extrémně komplikovaná a výroba v preparativním měřítku je dosud prakticky nemožná. Jedním z hlavních problémů je velmi nízká rozpustnost silybinu v běžných rozpouštědlech (např. ve vodě přibližně 0,5 g/1, v acetonu přibližně 5 g/1) a dále značná blízkost retenčních časů obou diastereomerů při použití různých chromatografíckých technik. O separaci obou látek se pokusilo několik autorů, ovšem nepříliš úspěšně. T. N. Graf a spol. (Planta Med. 2007, 73, 1495-1501) popisuje pokus o preparativní separaci silybinu A a silybinu B pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie, HPLC, jde ovšem o pouhé opakování analytické separace ve větším měřítku. Sami autoři přiznávají, že takto je možné připravit gramová množství čistého silybinu A a silybinu B během několika měsíců. Nadto uvedená metoda používá drahé chromato grafické materiály (derivatizovaný silikagel ΟΙ 8) a hořlavá a toxická rozpouštědla (methanol, acetonitril), pro výrobu je tedy zcela nevhodná.

Další metoda pro separaci silybinu A a silybinu B byla vyvinuta autory tohoto vynálezu (V. Křen, R. Gažák, K. Purchartová, P. Marhol, D. Biedermann, P. Sedmera: Chemoenzymatic preparative separation of silybin A and B, J. Mol. Catal. B: Enzymat. v tisku (2009), doí:10.1016/j.molcatb.2009.07.013). Tato metoda využívá separace glykosidů silybinu v peracetylované formě. Popsaný způsob sice umožňuje přípravu gramových množství silybinu A a sily55 binu B, avšak využívá chromatografie na silikagelu za použití značných množství organických

-1 CZ 302204 B6 rozpouštědel i silikagelu. Je proto vhodný k přípravě nejvýše jednoho gramu sloučeniny. Nadto při této metodě vznikají vedlejší produkty, které lze z finálního preparátu odstranit jen velmi obtížně, anebo vůbec.

Podstata vynálezu

Uvedené nevýhody dosavadního stavu techniky odstraňuje způsob podle vynálezu, který spočívá v tom, že se nerozděluje směs A a B stereomerů silybinu, ale směs jejich 23-O-acetátů. Překvaio pivě dochází ke kineticky řízené enzymové alkoholýze pouze jednoho stereomerů, 23-O-acetylsilybinu B. Obě výsledné sloučeniny, silybin B a 23-ťT-acetylsilybin A, je možné velmi snadno chromatografícky oddělit. Čistý silybin A se poté získá řízenou enzymovou alkoholýzou odděleného 23-O-acetylsilybinu A.

Směsný 23-O-acetylsilybin lze připravit chemickou acetylací, například rozpuštěním přírodního silybinu (směsi silybinu A a silybinu B) v tetrahydrofuranu s přídavkem acetanhydridu a etherátu fluoridu boritého (BF₃.Et2O) při nízké teplotě. Reakční směs se následně neutralizuje směsí vodného nasyceného roztoku NaHCO₃ s ledem, extrahuje ethylacetátem a produkt se přečistí chromatografií na silikagelu. Výhodně lze uvedený acetát silybinu připravit také enzymovou acetyla20 cí, při níž se na silybin působí za zvýšené teploty lipázou Novozym 435 v přítomnosti vinylacetátu, rozpuštěného v terc-butyImethyletheru nebo acetonu a produkt se získá odfiltrováním enzymu a následným odpařením rozpouštědla. Na takto připravený směsný 23-O-acetylsilybin se působí Novozymem 435 (lipázou z Candida antarctica imobilizovanou na polyakrylátové pryskyřici; preparát firmy Novo, Dánsko) ve směsi terc-butylmethylether/n-butanol. Při reakci dochází ke kineticky řízené enzymové alkoholýze pouze 23-O-acetylsilybinu B (viz obr. 2), takže vznikne směs volného silybinu B a 23-O-acety lsily binu A, které lze velmi snadno oddělit chromatografícky. Silybin A se poté uvolní enzymově katalyzovanou alkoholýzou za přídavku vyššího množství Novozymu 435 ve směsi terc-buty 1 methylether/n-butanol. Pro dosažení vysoké optické čistoty je možno některé enzymové separační kroky opakovat případně za upravených podmínek - např. za použití toluenu jako rozpouštědla.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby opticky čistých stereomerů silybinu A a silybinu B, který zahrnuje následující kroky, v nichž:

a) se přírodní silybin jako směs silybinu A a silybinu B acetyluje na směsný 23-0-acetyl35 silybin,

b) na roztok vzniklého 23-0-acety lsily binu o koncentraci 1 g/l až 50 g/l ve směsi rozpouštědel s obsahem n-butanolu se působí Novozymem 435, což je lipáza z kvasinky Candida antarctica imobilizovaná na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 10 až 45 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 h za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, k získání směsi volného silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A,

c) směs silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A, získaná v kroku b), se rozdělí chromatografií na silikagelu, a

d) 23-D-acetylsilybin A z kroku c) se za přídavku Novozymu 435, lipázy z kvasinky Candida antarctica imobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množ45 ství 75 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, podrobí enzymově katalyzované alkoholýze ve směsi terc-butylmethylether/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, po dobu 20 až 100 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, k zisku silybinu A.

Význakem předkládaného vynálezu je také skutečnost, že acetylace z kroku a) se provádí enzy50 maticky ve směsi Zcrc-butylmethylether/vinylacetát v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, přídavkem Novozymu 435, tedy lipázy z kvasinky Candida antarctica imobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 30 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, přičemž použitý enzym se po skončení reakce odstraní filtrací a zbylý roztok se odpaří ve vakuu.

-2CZ 302204 B6

Dalším význakem tohoto vynálezu je rovněž to, že směs rozpouštědel s obsahem n-butanolu v kroku b) se zvolí se skupiny, sestávající ze soustavy terc-buty Imethy lether/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem a soustavy toluen/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem.

Význakem tohoto vynálezu je také to, že v kroku b) se použitý enzym aplikuje v množství 15 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi terc-butylmethylether/n-butanol nebo 30 % hmotnostních vůči substrátu ve směsí toluen/n-butanol a v kroku d) se použitý enzym aplikuje v množství 75 % hmotnostních vůči substrátu.

Význakem předkládaného vynálezu je, že chromatografie na silikagelu z kroku c) se provádí ve směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí v poměru 90:10:1, objem/objem.

Význakem předkládaného vynálezu je i skutečnost, že silybin B, získaný v kroku c), se případně acetyluje ve směsi Zcrc-butylmethylether/vinylacetát v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, působením Novozymu 435, tedy lipázy z kvasinky Candida antarctica mobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 30 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C; na získaný 23-O-acetylsilybin B se opět působí týmž enzymem o stejné aktivitě a v množství 10 až 45 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi toluen/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, za totožných reakčních podmínek ke vzniku 23-€>-acetylsilybinu A a silybinu B, přičemž posledně jmenovaný se po odfiltrování enzymu přečistí pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí v poměru 90:10:1, objem/objem, k získání opticky čistého silybinu B.

Význakem tohoto vynálezu je dále skutečnost, že se enzym, použitý pro acety láce, nebo pro alkoholýzu 23-O-acetylsilybinu B, aplikuje v množství 30 % hmotnostních vůči substrátu.

Význakem předkládaného vynálezu je skutečnost, že směsi Zcrc-butylmethylether/n-butanol a/nebo terc-butyl methy lether/v i nylacetát se výhodně použijí v poměru složek 9:1 (objem/objem) a směs toluen/n-butanol v poměru složek 10.Ί (objem/objem).

Dalším význakem předkládaného vynálezu je to, že enzymová reakce za použití Novozymu 435, tedy lipázy z kvasinky Candida antarctica zmobilizované na akrylátové pryskyřici, se s výhodou provádí při teplotě 45 °C.

Význakem předkládaného vynálezu je skutečnost, že meziprodukt 23-0-acetylsilybin A, vzniklý při výrobě opticky čistých silybinu A a B, se případně recykluje navrácením do výrobního kroku d).

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Struktury silybinu A, silybinu B a jejich 23-0-acetátů

Obr. 2: Preparativní metoda pro přípravu silybinu A (sloučeniny la)

MTBE = terc-butyl methy lether, n-BuOH = n-butanol, d. e. = diastereomemí nadbytek (excess)

Obr. 3: Preparativní metoda pro přípravu silybinu B (sloučeniny lb)

MTBE = terc-butylmethylether, n-BuOH - n-butanol, d.e. = diastereomemí nadbytek

Obr. 4: Optimalizovaná metoda pro přípravu silybinu A a silybinu B

MTBE = terc-butylmethylether; VA = vinyl acetát, BuOH = n-butanol, d.e. - diastereomemí nadbytek

- j CZ 302204 B6

Číselné údaje v prvním rámečku schématu udávají výchozí množství sloučeniny, v dalších rámečcích pak množství získané sloučeniny (výtěžek). Hmotnostní procenta enzymu vůči substrátu jsou uvedena u jednotlivých reakčních kroků.

Obr. 5: Údaje pro 23-O-acetylsilybin (2) z 'HNMR (399,89 MHz, DMSO-d₆, 30 °C), uvedeny jsou chemický posun [ppm] a multiplicita signálu a hodnota interakční konstanty [Hz] (kurzívou). Signály obou distereomerů se buď překrývají, nebojsou odlišeny (v tabulce uvedeno jako dva variantní signály projeden atom); v rámci chyby měření nelze jednoznačně přiřadit, který signál patří ke kterému diastereomerů.

Obr. 6; Údaje pro 23-O-acety Isilybin (2) z ⁱ³C NMR (100,55 MHz, DMSO-d₆, 30 °C), uveden je chemický posun [ppmj. Signály obou distereomerů se buď překrývají, nebojsou odlišeny (v tabulce uvedeno jako dva variantní signály projeden atom); v rámci chyby měření nelze jednoznačně přiřadit který signál patří ke kterému diastereomerů.

Obr. 7: Údaje pro silybin A (la) a silybin B (lb) z 'HNMR (399,95 MHz, CD₃OD, 25 °C), uvedeny jsou chemický posun [ppm] a multiplicita signálu a hodnota interakční konstanty [Hz] (kurzívou).

Obr. 8: Chromatogram stanovení přírodního silybinu A a silybinu B pomocí HPLC 1 = silybin A, 2 = silybin B; na ose x je vynesena odezva UV detektoru v mV, na ose y čas v minutách.

Podmínky: kolona Chromolith SpeedROD (Merck, DE), RP-18e, 50 x 4,6 mm, mobilní fáze CH₃CN/MeOH/H₂O/kys. trifluorooctová (2:37:61:0,1; objem/objem), průtok 0,9 ml/min pri 25 °C, detekce pri vlnové délce 285 nm. (MeOH = methanol)

Obr. 9: Chromatogram stanovení čistého silybinu A pomocí HPLC

Na ose x je vynesena odezva UV detektoru v mV, na ose y čas v minutách.

Podmínky: Chromolith SpeedROD (Merck, DE), RP-18e, 50 x 4,6 mm, mobilní fáze CH₃CN/MeOH/H₂O/kys. trifluorooctová (2:37:61:0,1; objem/objem), průtok 0,9 ml/min při 25 °C, detekce pri vlnové délce 285 nm. (MeOH - methanol)

Obr. 10: Chromatogram stanovení čistého silybinu B pomocí HPLC

Na ose x je vynesena odezva UV detektoru v mV, na ose y čas v minutách.

Podmínky: Chromolith SpeedROD (Merck, DE), RP-18e, 50 x 4,6 mm, mobilní fáze CH₃CN/MeOH/H₂O/kys. trifluorooctová (2:37:61:0,1; objem/objem), průtok 0,9 ml/min při 25 °C, detekce při vlnové délce 285 nm. (MeOH = methanol)

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Silybin (sloučenina 1, 40 g; 83 mmol) byl rozpuštěn ve směsi Zerc-butylmethylether/vinylacetát (1,6 I, 9:1, objem/objem), k roztoku byl přidán Novozym 435 (12 g, celková aktivita 2 pkat) a směs byla intenzívně třepána (frekvence třepáni 650 s ') po dobu 30 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací a roztok odpařen ve vakuu, což poskytlo 23O-acetylsilybin (2, 43,3 g; 99,5 %) jako bílý amorfní prášek, který byl použit v následných krocích bez nutnosti přečištění. Struktura byla potvrzena pomocí *H a ¹³C NMR, viz Obr. 5 a Obr. 6

23-O AcetyIsilybin (2, 43,3 g, 0,083 mol) byl rozpuštěn v 1,6 1 směsi /erc-butylmethylether/nbutanol (9:1, objem/objem). K roztoku byl přidán Novozym 435 v množství 6,5 g a o celkové aktivitě 1,1 pkat. Směs byla intenzivně třepána (frekvence 650 s^-') po dobu 48 hodin pri teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen ve vakuu a směs byla separována pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem). Objem použité kolony byl 3 I, minimální výška sloupce 30 cm; průběh chromatografie byl sledován přímo (pouhým okem) na základě pohybu barevných pásů dělených látek. Po odpaření frakcí, obsahujících podle TLC analýzy s

-4 CZ 302204 B6 mobilní fází chloroform/aceton/kyselina mravenčí v objemovém poměru 9:2:1 separovanou látku, byl získán silybin B (lb, výtěžek 28,4 g; 71 %, diastereomemí nadbytek /dále jen d.e./ = 72 %), který je možné použít pro další obohacení podle příkladu 3, a dále 23-O-acetylsilybin A (2a, 10,7 g; 25 %, d.e. = 98 %). Takto připravený 23-6>-acetylsilybin A (2a, 10,7 g; 20,4 mmol) byl rozpuštěn v 0,4 1 rozpouštědlové směsi terc-buty lmethy lether/n-butanol (9:1, objem/objem) a po přidání Novozymu 435 (8 g, celková aktivita 1,34 gkat) byla směs třepána (frekvence třepání 650 s¹) po dobu 60 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen ve vakuu a surový silybin A byl přečištěn pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem), io což poskytlo opticky čistý silybin A (la, 6,6 g; 61,7 %, d.e. = 98.5 %), [α]² d ⁼ + 16,33 (C = 0,3; aceton).

Reakce byla monitorována pomocí HPLC za následujících podmínek: kolona Chromolith SpeedROD (Merck, DE), RP-18e, 50 x 4,6 mm, mobilní fáze CH₃CN/MeOH/H₂O/kys. trifluor15 ooctová (2/37/61/0,1; objem/objem), průtok 0,9 ml/min při 25 °C, detekce při vlnové délce 285 nm. Struktura silybinu A a silybinu B byla potvrzena pomocí 'HNMR, viz Obr. 7.

Hodnoty optické otáčivosti [a]o získaných sloučenin byly stanoveny na polarimetru Jasco P2000 (při teplotě 27 °C, rozpouštědlem byl aceton).

Příklad 2

23-O_Acetylsilybin (2, 12 g; 25 mmol) byl rozpuštěn ve směsi toluen/n-butanol (440 ml, 10:1, objem/objem) a k roztoku byl přidán Novozym 435 v množství 4 g a o celkové aktivitě 0,7 pkat. Směs byla intenzivně třepána (frekvence třepání 650 s'¹) po dobu 48 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen do sucha ve vakuu a směs byla rozdělena pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem). Objem použité kolony byl 0,75 1, min. výška sloupce

30 cm; průběh chromatografie byl sledován přímo (pouhým okem) na základě pohybu barevných pásů dělených látek. Odpařením frakcí obsahujících čisté složky (na základě TLC analýzy s mobilní fází chloroform/aceton/kyselina mravenčí v objemovém poměru 9:2:1) byl získán silybin B (lb, 3,3 g; 27,5 %, d.e. = 92 %) a 23-O-acetylsilybin A (2a, 8,4 g; 70 %, d.e. = 68 %).

Takto připravený silybin B (lb, 3,3 g; 6,84 mmol, d.e. = 92 %) byl znovu acetylován v poloze C23 pomocí stejného enzymu Novozym 435 následovně: výše uvedený silybin B (lb, 3,3 g; 6,84 mmol, d.e. = 92 %) byl rozpuštěn ve směsi terc-butylmethylether/vinylacetát (132 ml, 9:1, objem/objem), k roztoku byl přidán Novozym 435 (1 g, celková aktivita 170 pkat) a směs byla intenzivně třepána (frekvence třepáni 650 s¹) po dobu 30 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací a roztok byl odpařen ve vakuu k získání 23-O-acetylsilybinu B (2b, 3,58 g; 99,5 %, d.e. = 92 %). Takto připravený obohacený 23-<2-acetylsilybin B (2b, 3,58 g; 6,82 mmol; d.e. = 92 %) byl rozpuštěn ve směsi toluen/n-butanol (150 ml, 10:1, objem/objem) a k roztoku byl přidán Novozym 435 v množství 1,07 g a o celkové aktivitě 180 pkat. Směs byla intenzivně třepána (frekvence třepáni 650 s ^l) po dobu 48 hodin při teplotě

45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen ve vakuu a surový silybin B byl přečištěn pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem), což poskytlo opticky čistý silybin B (lb, 1,71 g; 52 %, d.e. = 98,5 %) a jako vedlejší produkt 23-O-acetylsilybin B (2b, 1,65 g; 46 %, d.e. = 79 %). Reakce byla monitorována pomocí HPLC za použití následujících podmínek: kolona

Chromolith SpeedROD (Merck, DE), RP-18e, 50 x 4,6 mm, mobilní fáze CH₃CN/MeOH/H₂0/' kys. trifluorooctová (2:37:61:0,1; objem/objem), průtok 0,9 ml/min při 25 °C, detekce při vlnové délce 285 nm. Silybin B byl charakterizován pomocí *H NMR (viz Obr. 7) a pomocí optické rotace: [a]²³D = + 3,96 (C = 0,3; aceton).

- 5 CZ 302204 B6

Příklad 3

Silybin B (lb, 28,4 g; 59 mmol, d.e. = 72 %), získaný jako vedlejší produkt pri přípravě silybinu A podle příkladu 1 byl rozpuštěn v 1,141 směsi terc-butyl methy lether/v i nylacetát (9:1, objem/objem), k roztoku byl přidán Novozym 435 (8,52 g, celková aktivita 1,45 pkat) a směs byla intenzivně třepána (frekvence třepáni 650 s ') po dobu 48 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací a roztok byl odpařen ve vakuu, což poskytlo 23O-acetylsilybin B (2b, 30,87 g; 59 mmol; 99,5 %, d.e. - 72 %). Takto získaný 23-O-acetylsilybin B (2b, 30,87 g; 59 mmol; d.e. = 72 %) byl rozpuštěn ve směsi toluen/n-iutanol (1,32 I, to 10:1, objem/objem) a k roztoku byl přidán Novozym 435 v množství 9,26 g a o celkové aktivitě 1,57 pkat. Směs byla intenzivně třepána (frekvence třepání 650 s^_i) po dobu 48 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen ve vakuu a surový silybin B byl přečištěn pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem). Získán tak byl opticky čistý silybin B (lb, 15,85 g; 56 %, d.e. = 97.5 %) a dále 23-O-acetylsilybin A (2a, 11,02 g; 36 %, d.e. = 68 %), který lze výhodně recyklovat a využít k přípravě Čistého silybinu A podle příkladu 1. Silybin B byl charakterizován pomocí 'H NMR (viz Obr. 7 a pomocí optické rotace: [a]²³D ^{= +} 3,96 (C = 0,3; aceton).

Příklad 4

Postup byl stejný jako v příkladu 1 nebo 2 s tím rozdílem, že silybin byl acetylován v poloze C23 podle následujícího postupu: suchý silybin (1, lOg, 20,7 mmol) byl rozpuštěn v tetrahydro25 furanu (0,5 1) a roztok byl ochlazen na teplotu 0 °C. Poté byl přidán acetanhydrid (15 ml, 0,1596 mol) a BF₃.Et₂O (10 ml, 50% komerční roztok v diethyletheru, objem, procenta) a reakční směs byla míchána po dobu 1 hodiny při 0 °C. Následně byla reakční směs zředěna 0,5 I nasyceného vodného roztoku NaHCCh a extrahována ethylacetátem (2 x 1 I). Organická frakce byla sušena bezvodým Na₂SO₄ v množství 50 g a po filtrací odpařena ve vakuu. 23-č7-Acetylsilybin (2, Obr. 1) byl čištěn chromatografií na silikagelu za použití rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí v objemovém poměru 95:5:1 s výtěžkem 6,54 g, tj. 60 %. Struktura byla potvrzena pomocí 'H a ^l3C NMR, viz Obr. 5 a Obr. 6.

Příklad 5

Postup byl stejný jako u příkladů 1 až 4 s tím, že jednotlivé postupy byly kombinovány podle schématu na Obr. 4. Vedlejší produkt 23-O-acetylsilybin A, vzniklý při výrobě čistých silybinu A a B, byl recyklován a navracen do výroby, čímž se výtěžnost silybinu A zvýšila o 30 %.

Příklad 6

Postup byl stejný jako v příkladu 2, k roztoku byl ale přidán Novozym 435 v množství 2 g a o 45 celkové aktivitě 0,35 pkat. Důsledkem použití polovičního hmotnostního poměru enzymu vůči substrátu (15 hmotn. %) ve srovnání s příkladem 2 byla velmi nízká konverze 23-ť9-acetylsilybinu (33 %) a pouze nevýznamné zvýšení čistoty získaného silybinu B o jedno procento (d.e.

= 93 %) oproti příkladu 2, které bylo na úkor jeho výtěžku (16 % oproti 27,5 % získaných za podmínek uvedených v příkladu 2).

Příklad 7

Postup včetně množství použitého enzymu (4 g, 0,7 pkat) byl stejný jako v příkladu 2, 23-055 acetylsilybin byl ale rozpuštěn v alternativní rozpouštědlové směsi terc-buty lmethylether/n-6CZ 302204 B6 butanol (9:1, objem/objem). Alkoholýza proběhla poměrně neselektivně, tzn. čistota vzniklého silybinu B byla nedostačující (d.e. = 63 %) a 23-ť3-acetylsilybin A byl sice získán velmi Čistý, ale pouze v minimálním množství (10 %, d.e. > 99 % oproti 25 % a d.e. = 98 %, dosaženým za použití polovičního množství, tedy 15 % hm. enzymu vzhledem k substrátu, v téže směsi rozpouštědel, MTBE/n-BuOH - viz příklad 1).

Výsledky příkladů 6 a 7 potvrzují, že pouze podmínky použité v příkladech 1 až 5 jsou optimální, zaručující nej lepší výsledky separace, tedy jak vysoké konverze substrátů, tak výbornou čistotu obou diastereomerů.

Průmyslová využitelnost

Silybin je velmi účinný antioxidant a chemoprotektant, využitelný v nutraceutikách, funkčních potravinách. Opticky čisté stereomery silybinu A a B jsou využitelné ve farmaceutickém průmyslu, například pro prevenci a léčbu některých nádorových onemocnění, jako jsou nádory prostaty a rovněž v dermatologických prostředcích.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby opticky čistých stereomerů silybinu A a silybinu B, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky, v nichž:

a) se přírodní silybin jako směs silybinu A a silybinu B acetyluje na směsný 23-O-acetylsilybin,

b) na roztok vzniklého 23-0-acetylsilybinu o koncentraci 1 g/l až 50 g/l ve směsi rozpouštědel s obsahem n-butanolu se působí Novozymem 435, což je lipáza z kvasinky Candida antarctica imobilizovaná na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 10 až 45 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 h za protřepávání pri teplotě od 20 do 60 °C, k získání směsi silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A,

c) směs silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A, získaná v kroku b), se rozdělí chromatografií na silikagelu,

d) 23-O-acetylsilybin A z kroku c) se za přídavku Novozymu 435, lipázy z kvasinky Candida antarctica imobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 75 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, podrobí enzymově katalyzované alkoholýze ve směsi /ťrc-butylmethylether/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, po dobu 20 až 100 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, k zisku silybinu A.
2. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že acetylace z kroku a) se provádí enzymaticky ve směsi rerc-buty Imethy lether/v i ny lacetát v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, přídavkem Novozymu 435, tedy lipázy z kvasinky Candida antarctica imobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 30 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 hodin za protřepávání pri teplotě od 20 do 60 °C, přičemž použitý enzym se po skončení reakce odstraní filtrací a zbylý roztok se odpaří ve vakuu.
3. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že směs rozpouštědel s obsahem n-butanolu v kroku b) se zvolí ze skupiny, sestávající ze soustavy terc-butylmethylether/nbutanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem a soustavy toluen/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem.

-7CZ 302204 B6
4. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že v kroku b) se použitý enzym aplikuje v množství 15 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi /erc-buty 1 methy 1 ether/nbutanol nebo 30 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi toluen/n-butanol a v kroku d) se použitý enzym aplikuje v množství 75 % hmotnostních vůči substrátu.
5. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že chromatografie na silikagelu z kroku c) se provádí ve směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí v poměru 90:10:1, objem/objem.

i o
6. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že silybin B, získaný v kroku

c), se případně acetyluje ve směsi Zere-butylmethylether/vinylacetát v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, působením Novozymu 435, tedy lipázy z kvasinky Candida antarctica zmobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 30 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C; na

15 získaný 23-O-acety 1 silybin B se opět působí týmž enzymem o stejné aktivitě a v množství 10 až 45 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi toluen/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, za totožných reakčních podmínek ke vzniku 23-č?-acetylsilybinu A a silybinu B, přičemž posledně jmenovaný se po odfiltrování enzymu přečistí pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí v poměru 90:10:1, objem/objem, k

20 získání opticky čistého silybinu B.
7. Způsob výroby podle nároku 2 nebo6, vyznačující se tím, že se použitý enzym aplikuje v množství 30 % hmotnostních vůči substrátu.

25
8. Způsob výroby podle nároků 1, 3 nebo6, vyznačující se tím, že směsi tercbutylmethylether/n-butanol a/nebo /erc-butylmethylether/vinylacetát se výhodně použijí v poměru složek
9:1 objem/objem a směs toluen/n-butanol se výhodně použije v poměru složek 10:1 objem/objem.

30 9. Způsob výroby podle nároků 1, 2 nebo 6, vyznačující se tím, že enzymová reakce za použití Novozymu 435, tedy lipázy z kvasinky Candida antarctica imobilizované na akrylátové pryskyřici, se s výhodou provádí při teplotě 45 °C.
10. Způsob výroby podle nároku 1 nebo 6, vyznačující se tím, že meziprodukt 2335 0-acetylsilybin A, vzniklý při výrobě opticky čistých silybinu A a B, se případně recykluje navrácením do výrobního kroku d) podle nároku 1.