CZ301334B6 - Zpusob modifikace kvasnicného biosorbentu vedoucí ke zvýšení biosorpcní kapacity pro Pb2+ navozením mikroprecipitace Pb2+ - Google Patents

Abstract

Zavedení peptidu NP3 obsahujícího fixacní motivy CPTEE pro kovy identifikované v primárních sekvencích bakteriálních P1-ATPas na bunecný povrch Saccharomyces cerevisiae, které vedlo ke zvýšení biosorpcní kapacity takto modifikovaných bunek a izolovaných bunecných sten pro Pb. Mechanismem zodpovedným za zvýšenou sorpcní kapacitu je mikroprecipitace Pb, která je prímým dusledkem modifikace povrchové expozice peptidu NP3 na bunecných stenách. Modifikace bunecných povrchu prostrednictvím povrchové expozice NP3 tak lze s výhodou použít pro prípravu biosorbentu pro težké kovy.

Description

Způsob modifikace kvasničného biosorbentu vedoucí ke zvýšení biosorpční kapacity pro Pb²⁺ navozením mikroprecipitace Pb²⁺

Oblast techniky:

Tento vynález se týká způsobu modifikace buněčné stěny Saccharomyces cerevisiae, který vede k mikroprecipitaci Pb²⁺ na buněčné stěně, jež několikanásobně zvyšuje přirozenou biosorpční kapacitu buněčných stěn pro Pb²⁺, a je cílen na průmyslové využití popsaného principu při příio pravě biosorbentů kovů. Modifikace buněčné stěny S. cerevisiae je dosaženo povrchovou expozicí vazebného peptidu označeného NP3.

Použití S. cerevisiae je založeno na skutečnosti, že kvasničná biomasa představuje potencionálně výhodný materiál pro přípravu biosorbentů, která vykazuje vysokou přirozenou vazebnou kapacit pro Pb²⁺ [1]. Využití technologie povrchové expozice s kotvícím proteinem bylo motivováno poznatkem, že zakotvení vazebných peptidů na buněčných stěnách bakterií a kvasinek zvyšuje jejich přirozenou sorpční kapacitu pro ionty těžkých kovů, přičemž toto zvýšení často roste se zvyšujícím se počtem tandemových opakování vazebných peptidů ve fůzi s kotvícím proteinem [2,3].

Dosavadní stav techniky:

Obecně je průběh interakce iontů kovů s buněčným povrchem komplexní proces zahrnující nejen elektrostatické interakce (iontovou výměnu) a chelataci kovu, ale i fyzikální adsorpci, mikroprecipitaci a krystalizaci a zachycení volného iontu v kapilárách matrice buněčné stěny. Tyto děje jsou vratné a v principu nezávislé na metabolismu buňky a souhrnně jsou označovány termínem biosorpce [1,4, 5]. Využití biosorpce, nejčastěji na buněčnou stěnu řas, chaluh, kvasinek, plísní a bakterií ale i rostlin, je považováno za slibný biotechnologický přístup pro odstraňování těžkých kovů z odpadních vod. Biosorbenty připravené zpracováním neživé biomasy dnes představují ekonomicky atraktivní alternativu běžněji používaných syntetických iontoměničů [4, 5, 6, 7]. Významnou výhodou obou přístupů je možnost rekuperace navázaných kovů desorpci do malého objemu, jež vede k vysoké koncentraci kovů v eluátu.

Mikrobiální povrchy, buněčné stěny chaluh a rostlin, z nichž mohou být biosorbenty připravovány, jsou souborem strukturních polysacharidů, proteinů a dalších organických a anorganických látek a za fyziologických podmínek mají většinou povahu polyaniontu. Tato nábojová vlastnost umožňuje interakci buněčného povrchu s kationty kovů prostřednictvím elektrostatických interakcí se záporně nabitými skupinami. Těmi jsou především karboxylové, fosfátové a sulfátové skupiny Vedle elektrostatických interakcí přispívají k vazbě kationtů kovů na buněčné stěny i kovalentně-koordinační vazby zprostředkované především hydroxylovými, acetamidovými, sulfhydrylovými, imidazolovými skupinami a aminoskupinami polysacharidů a proteinů buněčné stěny [4, 5, 8,9], V případě Pb byla jeho přirozená mikroprecipitace zjištěna např. na neupravené biomase plísně Rhizopus arrhizus [10], pro kterou bylo pomocí titrace roztokem Pb²⁺ ukázáno, že za nižší saturace biosorbentu Pb²⁺ je ion kovu vázán prostřednictvím karboxylových, fosfátových a sulfátových skupin a za vyšší saturace biosorbentu Pb odpovídající jeho rovnovážným koncentracím v roztoku >1 μΜ dochází na biosorbentu k mikroprecipitaci nerozpustných sloučenin Pb. Chemickou formou precipitátu Pb byly při externím pH v roztoku 5,0 patrně fosforečnany a nelze vyloučit ani tvorbu lokálně stabilního Pb(OH)₂ [10].

Komerčně byly nebo jsou nabízeny např. biosorbenty založené na granulované biomase Bacillus sp. v procesu AMT-Bioclaim™ (VistaTech Partnership Ltd., Salt Like City, z nabídky stažen v r. 1988) a AlgaSORB™ (Bio-Recovery Systems, lne, Las Cruces) založen na řase Chlorella sp. imobilizované v silikátech nebo polyakrylamidech. Dále jsou firmou BV Sorbex (Quebeck,

Kanada) komerčně nabízeny biosorbenty na bázi chaluh a ras Sargassum natans (pro rekuperaci

- 1 CZ 301334 B6 zlata patent US 4 769 223), Ascophyttum nodosum, Haíimeda opuntia, Palmyra pa mata. Chondrus crispus a Chloretta vulgaris. Potenciální využití by mohla nalézt i řada dalších biosorbentů založených na přirozené biomase, jako je např. biomasa Hyphomonas sp. (mezinárodní, patentová přihláška WO 98/30503), Bacittus sp. (národní patentová přihláška US 2008 009 954) bakte5 riální biofilm na nosiči ze syntetického zeolitu (mezinárodní patentová přihláška WO 2007/020 588), nebo polysacharidy buněčných stěn jsou např. extrahované polysacharidy rodů Aspergittus, Penicittium, Trichoderma a Micrococcus (národní patenty US 005 789 204 a KR 0150855) nebo algináty (národní patenty DE 4 117 234 a DE 4 138 544).

io Samozřejmou snahou je hledání cest, které by umožnily zvýšit vazebnou kapacitu, afinitu a případně i selektivitu biosorbentů. Atraktivní možností, jak cíleně ovlivnit počet a spektrum ligandů v buněčné stěně, je povrchová expozice (poly)peptidů schopných vázat těžké kovy. Možnou cestou, jak přivést nová vazebná místa na buněčné stěny organismů, je vytváření genetických fůzí peptidů s kotvícími proteiny (nebo jejich částmi), které na buněčných stěnách přirozeně lokalizu15 jí. V oblasti expozice heterologních proteinů na povrchu 5. cerevisiae je populárním kotvícím proteinem C-terminální doména a-aglutininu Sagl, jež umožňuje kovalentní zakotvení fúze na glukan buněčné stěny [11]. Další je kotvící doména a-aglutininu Aga2p (mezinárodní patentová přihláška WO 99/36569). V odborné literatuře byla popsána řada kotvících proteinů a vazebných peptidů, které po expozici na povrchu bakterií nebo kvasinek zvýšily přirozenou biosorpění kapacitu buněk pro ionty těžkých kovů (recentní přehled uvádí ref. 2). Až na výjimky [12, 13], byl příspěvek exponovaného peptidů kbiosorpční kapacitě modifikovaných buněčných stěn demonstrován na případech živých intaktních buněk, přičemž pro přípravu biosorbentů je vhodným materiálem neživá biomasa nebo její deriváty [4-6]. Dosavadní studie s izolovanými buněčnými stěnami obsahujícími uměle vnesené vazebné peptidy však ukázaly, že v daných případech došlo u modifikovaných kvasniěných [12] a bakteriálních [13] stěn ve srovnání s intaktními buňkami k výrazné redukci příspěvku vazebného peptídu k celkové biosorpění kapacitě.

Podstata vynálezu:

Podstatou vynálezu je modifikace buněčné stěny 5. cerevisiae 72 aminokyselinovým peptidem NP3 o sekvenci

GSLTISNMDCPTEEALIRDKLAGRGSLTISNMDCPTEEALIRDKLAGRGSLTISNMDC

PTEEAL1RDKLAGR.

Sekvence NP3 peptídu byla navržena tak, že obsahuje tri kopie potenciálního vazebného motivu pro ionty kovů (vazebné zbytky znázorněny tučně) identifikované v primární sekvenci bakteriálních Pl-ATPas odpovědných za transport Pb²⁺, např. proteinu PbrA z Cupravidus metallidurans CH34 [14]. Modifikace buněčné stěny bylo dosaženo expozicí NP3 ve formě genetické fuze s kotvícím proteinem. Jako kotvící protein zde byla použita C-terminální doména a-aglutininu. Kotvícím proteinem může být v podstatě jakýkoliv protein buněčné stěny nebo membránový protein.

Podstatou vynálezu je dále dosažení zvýšené akumulační kapacity modifikovaných buněk S. cerevisiae a izolovaných modifikovaných buněčných stěn pro Pb²⁺ při biosorpcí kovu z roztoku. Zvýšené biosorpění kapacity je dosaženo v důsledku mikroprecipitace Pb na buněč45 ných stěnách, jež je přímým důsledkem expozice sekvence peptídu NP3 na buněčných stěnách. Za sledovaných podmínek nebyla mikroprecipitace Pb zjištěna u stěn neobsahujících peptid NP3.

-2CZ 301334 B6

Popis obrázků na přiložených výkresech:

Obrázek 1:

Schematické znázornění uspořádání expresního vektoru plAG-NP3 pro povrchovou expozici NP3-V5-aAGlCp a detekce expozice NP3-V5-aAGlCp na povrchu S. cerevisiae. (A) Pro zavedení peptidu NP3 do buněčné stěny S. cerevisiae byla vytvořena jeho genetická fuze k amino-konci kotvící domény stěnového proteinu α-aglutininu extendovaného 14 aminokyselinovým epitopem V5 pro anti-V5 protilátky, umožňující imunochemickou detekci. Výsledný fuzio ní protein je NP3-V5-aAGlCp (sekvence identifikační číslo 2). Pro cílení fuzního proteinu na buněčnou stěnu byla genetická fuze konstruována tak, že NP3 peptid předchází signální exkreční sekvence a-faktoru 5. cerevisiae. Exprese fuzního genu jako součásti centromerového vektoru plAG-NP3 (založen na vektoru plV5-AG [12], který je odvozen od p416GPD [15]) je kontrolována konstitutivním promotorem GPD glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasy Š. cerevisiae. (B)

Detekce expozice NP3-V5-aAGlCp na povrchu živých buněk 5. cerevisiae W303 transformovaných plAG-NP3 pomocí imunoťluorescenční mikroskopie a protilátky anti-V5-FITC. Kontrolní buňky neprodukující NP3-V5-aAGlCp byly transformovány plasmidem p416GPD,

Obrázek 2.

Akumulace Pb²⁺ a depozice Pb v buněčných stěnách intaktních buněk S. cerevisiae W303 exponujících peptid NP3. (A) Sorpční izotermy Pb²⁺ na buňkách exponujících na povrchu NP3-V5aAGlCp (horní panel s , A, ·, ♦) a na kontrolní buňky exponující samotnou kotvící doménu V5-aAGlCp (dolní panel s □, Δ, o, 0) evaluované v roztocích 1 až 500 μΜ Pb²⁺ v 25 mM MES, pH 5,5, 25 °C a po indikované době kontaktu (45 min, 2 h, 4 h, 8 h). Koncentrace biomasy odpovídala 1,5 mg sušiny buněk ml'¹. C«, - rovnovážná koncentrace kovu v roztoku, Q_e rovnovážná koncentrace kovu v biomase (měřítko pro Q_c se u horního a dolního panelu liší). (B) Vizualizace mikroprecipitátů sloučenin(y) Pb na povrchu buněk exponujících NP3-V5-aAGlCp pomocí transmisní elektronové mikroskopie. Elektrondenzní částice mikroprecipitátů jsou indikovány šipkami a v detailu zobrazeny na homí mikrofotografii. Podobné částice nebyly viditelné ve stěnách buněk produkujících pouze V5-aAGlCp.

Obrázek 3.

Biosorpce Pb²⁺ na izolované buněčné stěny obsahující peptid NP3 a vliv iontů jiných těžkých kovů na biosorpci Pb²⁺. (A) Sorpční izotermy Pb²⁺ na izolovaných buněčných stěnách modifikovaných fuzním proteinem NP3-V5-aAGlCp (symboly A, Δ) a na kontrolní stěny obsahující samotnou kotvící doménu V5-aAGlCp (symboly ·, o), evaluované v roztocích 25 až 500 μΜ Pb²⁺ v 25 mM MES, pH 5,5, 25 °C a po indikované době kontaktu 2 h nebo 4 h. Koncentrace biomasy odpovídala 0,45 mg sušiny stěn raT¹. (B) Biosorpce Pb²⁺ v systémech s jedním a dvěma kovy. Počáteční koncentrace Pb²⁺ byly 100 μΜ a pro Cd²⁺ nebo Zn²⁺ byly 300 μΜ (doba kontaktu 4 h a další provedení shodné s tím popsaným v legendě k Obr. 3A). Označení uváděných dat: Pb, Cd nebo Zn-množství uvedeného biosorbovaného kovu v systému s jedním kovem; Pb(Cd) nebo Pb(Zn) - koncentrace Pb ve stěnách po biosorpci z roztoku obsahujícího Cd nebo

Zn; Pb(Cd) nebo Pb(Zn) - koncentrace Pb ve stěnách po biosorpci z roztoků obsahujících Cd nebo Zn; Cd(Pb) nebo Zn(Pb) - koncentrace Cd nebo Zn ve stěnách po biosorpci z roztoků obsahujících Pb²⁺.

-3CZ 301334 B6

Příklady provedení vynálezu:

Příkladě. I:

Na základě analýzy amino-koncových sekvencí dvou Pl-ATPas z C. metallidurans CH34, PbrA (přístupové číslo YP145622 v databázi GenBank) kódované na plasmidu pMOL30 a chromosomálně kódované CadA (přístupové číslo ABF11456 v databázi GenBank), schopných transportovat Pb²⁺, byla pro návrh peptidu NP3 vybrána konzervovaná sekvence MDCPTEEaLIR (méně io konzervovaný zbytek Ala je označen malým písmenem). Byla připravena dvojice oligonukleotidů (sekvence td. č.l), které vytvořily dvojřetězcový fragment DNA označený NP kódující fragment peptidu NP3 o sekvenci GSLTISNMDCPTEEALIRDKLAGR. Fragment DNA byl navržen tak, že 5' konec obsahoval přečnívající konec tvořený endonukleasou ZtawHI a 3' konec kompatibilní přečnívající konec tvořený endonukleasou flg/II. Toto uspořádání umožnilo postupné t5 vkládání fragmentů NP do expresního vektoru plV5-AG ve třech krocích do dosažení inzerce třech tandemových opakování NP (Obr. 1 A), neboť v každém kroku byl NP vkládán do vektoru štěpeného fla/nHI a po vložení došlo k rekonstrukci pouze jednoho cílového místa pro ftamHI.

Výsledný plasmid nazvaný plAG-NP3 obsahuje luzní gen MFalNP3-V5-aAGlC kódující protein MFal-NP3-V5-aAGlCp (sekvence id. č.2) pod kontrolou konstitutivního promotoru glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasy 5. cerevisiae (Obr. 1A). Sekvence MFal kóduje signální exkreční peptidovou sekvenci α-faktoru S. cerevisiae pro cílení fuzního proteinu na buněčnou stěnu, která je z proteinu in vivo odštěpena a exponován je protein NP3~V5-aAGlCp.

Plasmidem plAG-NP3 byly transfonnovány buňky 5. cerevisiae W303 kultivované v semisyntetickém mediu SD (v hmotnostních %: 0,7 % Difco Yeast Nitrogen Base, 2% glukosa, 0,005% adenin hemisulfát a L—histidin, L-tryptofan a L-leucin, každý o koncentraci 0,003 %). Konstitutivní exprese, povrchová expozice a lokalizace fuzního proteinu byly potvrzeny imunochemicky. Neťixované živé buňky, bylo možno díky povrchové expozici NP3-V5-aAGlCp fluorescenčně značit protilátkou proti V5 epitopu konjugovanou s fluorescein izothiokyanátem (anti-V5-FITC; Obr. 1B). Kontrolní buňky S. cerevisiae neprodukující V5-aAGlC s protilátkou neinteragovaly.

Příklad č. 2:

Pro biosorpce Pb²⁺ byly použity buňky z kultur vedených v semisyntetickém mediu SD do časné stacionární fáze. Biosorpce byly prováděny s intaktními neusmrcenými buňkami S. cerevisiae W3O3 ve vsádkovém uspořádání v 25 mM pufru 2-morfolino—ethansulfonová kyselina/NaOH (MES) o pH 5,5, při koncentraci biomasy odpovídající 1,5 mg suché váhy ml“’, koncentracích

Pb(NO₃)₂ v rozmezí 5 až 500 μΜ, teplotě 25 °C a stálého míchání třepáním při 130 otáčkách min ¹ a amplitudě 2,5 cm. Doba kontaktu byla 45 min, 2 h, 4 h a 8 h. Buňky byly vždy separovány odstředěním při 4 OOOg a 25 °C po dobu 2 min. Koncentrace kovu byla stanovena metodou atomové absorpční spektroskopie (AAS) před a po provedení biosorpčního experimentu v roztocích a buňkách, z nichž byl kov uvolněn působením 65% kyseliny dusičné. Zatímco po

45 min kontaktu s roztoky Pb nevykazovala biosorpce Pb buňkami exponujícími peptid NP3 ve formě fuzního proteinu NP3- V5-aAGlCp významný rozdíl od vlastností buněk produkujících samotnou kotvící doménu V5-aAGlCp, od 2. hodiny kontaktu dochází k prudkému nárůstu v množství Pb²⁺ akumulovaného buňkami exponujícími peptid NP3, a to především z roztoků o počáteční koncentraci Pb²⁺ v rozmezí 75 až 200 μΜ (Obr. 2A). Například při počáteční koncent50 raci Pb²⁺ v roztoku 150 μΜ bylo akumulováno buňkami sNP3 po 2 hodinách 43,7, po 4 hodinách 85,3 a po 8 hodinách 92,5 nmol Pb mg“¹ sušiny buněk, což je, v uvedeném pořadí 3,8-, 4,8- a 3,9-krát více než za shodných podmínek akumulovaly buňky produkující samotnou kotvící doménu V5-aAGlCp. Z buněk exponujících NP3 pak bylo po 4h akumulaci z roztoku obsahujícího na počátku 150μΜ Pb²⁺ možno uvolnit 98 % akumulovaného Pb působením lOmM

-4CZ 301334 B6

EDTA v objemu odpovídajícím 1/10 původního objemu roztoku kovu při 4 °C po dobu 10 min, což potvrzuje, že k akumulaci došlo biosorpcí na buněčném povrchu a nedocházelo k intracelulámí akumulaci kovu. Po 4 h pak bylo z roztoku biosorpcí odstraněno 93,8 % přítomného Pb²⁺.

Na rozdíl od sorpčních izoterem L-typu (lze je popsat např. na základě Langmuirovy rovnice pro adsorpcí), které byly zjištěny pro S. cerevisiae W303 produkující pouze kotvící doménu V5aAGlCp, jsou sorpční izotermy pro buňky exponující peptid NP3 S-typu (tvam písmene S). Tento typ sorpčních izoterem je charakteristický pro navození děje, který vede ke zvýšení kapalo city biosorbentu nad úroveň dostupných vazebných míst pro ionty kovu, a lze jej vysvětlit mikroprecipitací nerozpustných solí nebo hydroxidů kovů na povrchu sorbentu. Výskyt výrazně elektrondenzních částic mikroprecipitátu o průměrné velikosti průřezu 80 x 240 nm a lokalizujících v buněčné stěně byl zjištěn elektronmikroskopickou inspekci buněk exponujících peptid NP3 po

4h kontaktu v roztocích obsahujících počáteční koncentrace Pb²⁺ v rozmezí 100 až 300 μΜ 15 (Obr. 2B). Takové elektrondenzní částice nebyly za shodných podmínek experimentu detekovány v případě buněk produkujících samotnou kotvící doménu.

Příkladě, 3:

Pro biosorpce prováděné s buněčnými stěnami 5. cerevisiae, tj. neživým biosorbentem, byly pro izolaci použity buňky z kultur vedených v semisyntetickém mediu SD do časné stacionární fáze. Pro izolaci buněčných stěn byly buňky separovány od růstového media odstředěním při 4 OOOg a 25 °C po dobu 5 min a resuspendovány v izolačním pufru (10 mM Tris-HCI, pH 7,8, lmM PMSF) v koncentraci 0,25 g vlhké váhy buněk ml¹. Po přídavku skleněných balotinových kuliček o průměru 0,5 mM v objemu odpovídajícím 1/3 objemu suspenze byly buňky dezintegrovány 3 min v zařízení Mini-Beadbeater (BioSpec Products lne., USA) nastaveném na maximální výkon. Buněčné stěny byly ze suspenze nad vrstvou balotin usazených gravitací separovány 5min odstředěním při 1 OOOg a 4 °C. Před vlastním použitím pro biosorpcí iontů kovů byly izolované stěny ekvilibrovány ve 25mM MES (pH 5,5) po dobu dvakrát 10 min.

Biosorpce byly prováděny ve vsádkovém uspořádání v 25 mM pufru MES o pH 5,5, při koncentraci buněčných stěn odpovídající 0,45 mg suché váhy ml^-1, teplotě 25 °C a stálého míchání třepáním při 130 otáčkách min^-1 a amplitudě 2,5 cm. Doba kontaktu byla 2 nebo 4h. Koncentrace kovu byla stanovena metodou atomové absorpční spektroskopie (AAS) před a po provedení biosorpčního experimentu v roztocích a ve stěnách, z nichž byl kov uvolněn působením 65% kyseliny dusičné. Obr. 3A znázorňuje izotermy z biosorpcí při počátečních koncentracích Pb²⁺ jako Pb(NO₃)₂ v rozmezí 25 až 500 μΜ. Buněčné stěny obsahující peptid NP3 akumulují po 2 h kontaktu z roztoků o počáteční koncentraci >75 μΜ Pb²⁺ l ,6-krát (při 75 μΜ Pb²⁺) až 2,4™ krát při (300 μΜ Pb²) vyšší množství Pb než stěny obohacené o samotnou kotvící doménu V5aAGlCp. Po 4 hodinách pak dochází k asi jen 2 az 15% zvýšení v množství akumulovaného Pb, jež v konečném důsledku vede k odstranění 91 % Pb²⁺ z roztoku o počáteční koncentracích Pb²⁺ 100 μΜ.

Stejně jako v případě intaktních buněk jsou sorpční izotermy pro buňky exponující peptid NP3 S-typu, ukazující na mikroprecipitaci, zatímco pro 5. cerevisiae W303 produkující pouze kotvící doménu V5-aAGlCp jsou L-typu. Schopnost zvýšené biosorpční kapacity v důsledku expozice NP3 je specifická pro Pb²⁺ a buněčné stěny ji neztrácí ani v roztocích s trojnásobným molámím přebytkem potencionálně kompetujícího iontu Cd²⁺ nebo Zn²⁺ jak dokumentuje Obr. 3B pro buněčné stěny po 2 h kontaktu s roztoky obsahující 100 μΜ Pb²⁺ a 300 μΜ Cd²⁺ nebo Zn²⁺ přidané ve formě dusičnanů.

Je pravděpodobné, že za iniciaci mikroprecipitace nerozpustných sloučenin Pb v buněčné stěně

5. cerevisiae, způsobené povrchovou expozicí peptidu NP3, stojí schopnost tohoto peptidu pos-5CZ 301334 B6 tupně zvyšovat lokální koncentraci Pb²' v krocích 1. vazba Pb²⁺ z roztoku a 2. depozice na proximální přirozená vazebná místa, jež přispívá ke vzniku precipitačních center a mikroprecipitaci. Tomu odpovídá i dvoukrokový průběh biosorpce Pb²⁺, jež zahrnuje počáteční biosorpci iontovou výměnou a komplexací (např. po 45 min) se shodným průběhem pro buňky exponující i neexpo5 nující NP3 a až pozdější významný projev příspěvku NP3 k biosorpci (Obr. 2A). Podstata zvýšené biosorpce dosažené povrchovou expozicí peptidu NP3 zůstává zachována i v případě izolovaných buněčných stěn modifikované 5. cerevisiae. Tato skutečnost není triviální, neboť jsou známy případy izolovaných modifikovaných buněčných stěn bakterií i kvasinek, u nichž byl příspěvek vazebného peptidu k biosorpění kapacitě, ve srovnání s příspěvkem u intaktních buněk, ío výrazně redukován [12, 13]. S ohledem na skutečnost, že biosorbenty bývají připravovány z důvodů stálosti z neživé biomasy, je výhodou tohoto vynálezu možnost použít samotných buněčných stěn a eliminace přímého použití geneticky modifikovaného organismu. Další výhodou je možnost převedení akumulovaného kovu z biosorbentu do malého objemu, zde eluci Pb²⁺ pomocí 10 mM EDTA v objemu odpovídajícím 1/10 objemu původního roztoku z něhož byl kov biosorpci akumulován.

Průmyslová využitelnost:

Modifikované buňky 5. cerevisiae a izolované buněčné stěny dle přiloženého vynálezu jsou vhodné pro přípravu biosorbentů pro Pb²⁺.

Reference:

1. WangJ., Chen C.: Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae: A review,

Biotechnol Adv, 2006, vol. 24, p. 427^151.

2. Saleem M., Brim H., Hussain S., Arshad M., Leigh M.R, Zia-ul-hassan: Perspectives on microbial cell surface display in bioremediation, Biotechnol Adv, 2008, vol. 26, p, 151-161.

3. Ruml T., Kotrba P.: Microbial control of metal pollution: An overview. In: Recent Advances

3o in Marině Biotechnology (M, Fingerman, R. Nagabhushanam, Eds.), p. 81-153. Science

Publishers, lne.; Enfield, NH, USA, 2003.

4. Volesky R: Sorption and Biosorption, BV-Sorbex, lne., St. Lambert, Quebec, 2004

5. Kratochvil D., Volesky R: Advances in the biosorption of heavy metals, Trends Biotechnol, 1998, vol. 16, 291-300.

6. Wang J., Chen C.: Biosorbents for heavy metals removal and their future, Biotechnol Adv,

2009, vol. 27, p. 195-226.

7. Demirbas A.: Heavy metal adsorption onto agro-based materials. A review, J Hazard Mater, 2008, vol. 157, p. 220-229.

8. Volesky B., HolanZ.S.: Biosorption of heavy metals, Biotechnol Prog, 1995, vol. 11,

p. 235-250.

9. Avery S.V., Tobin J.M.: Mechanism of adsorption of hard and soft metal ions to Saccharomyces cerevisiae and influence of hard and soft anions, Appl Environ Microbiol, 1993, vol. 59, p. 2 851-2 856.

10. Naja G., Mustin C., Bertheíin J., Volesky B.: Lead biosorption study with Rkizopus arrkizus using a metal-based titration technique, J Coll Int Sci, 2005, vol. 292, p. 537-543.

11. Shibasaki S., MaedaH., UedaM.: Molecular display technology using yeast-arming technology, Anal Sci, 2009, vol. 25, p. 41-49.

12. Vinopal S., RumlT., Kotrba P.: Biosorption of Cd²⁺ and Zn²⁺ by cell surface-engineered Saccharomyces cerevisiae, Int Biodeter Biodegr, 2007, vol. 60, p. 96-102,

13. Kotrba P., DolečkováL., de Lorenzo V., RumlT.: Enhanced bioaccumulatíon of heavy metal ions by bacterial cells due to surface display of short metal binding peptides, Appl Environ Microbiol, 1999, vol. 65, p. 1 092-1 098.

-6CZ 301334 B6

14. MergeayM., Monchy S., VallaeysT., AuquierV., BenotmaneA., Bertin P., TaghaviS., Dunn J., van der Lelie D., Wattinez R.: Ralstonia metallidurans, a bacterium specifically adapted to toxic metals: towards a catalogue of metal-responsive genes, FEMS Microbiol Rev, 2003, vol. 27, p. 385^110.

15. MumbergD., MiiHerR., FunkM.: Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds, Gene, 1995, vol. 156, p. 119-122.

Přehled sekvencí:

io

Identifikační číslo: 1

Charakteristika: nukleotidová sekvence dvojřetězcového fragmentu NP s přečnívajícími konci odpovídajícími cílovým místům pro restrikční endonukleasy BamHI a BgllL

5' -GATCCCTAACTATCTCCAACATGGACTGTCCAACTGAAGAAGCTTTGATCAGAGACAAGTTGGCTGGTA

GGATTGATAGAGGTTGTACCTGACAGGTTGACTTCTTCGAAACTAGTCTCTGTTCAACCGACCATCTAG- 5'

Identifikační číslo 2:

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fuzního proteinu MFal-NP3-V5-aAGlCp s vyznačenou signální exkreční peptidovou sekvenci a-faktoru 5. cerevisiae (kurzívou) peptidem NP3 (tučně) a 14—ti aminokyselinovým epitopem V5 (podtržen).

mrfpsiftavlfaassalaagsltisnmdcpteealirdklagrgsltisnmdcpteealir

DKIAGRGBLTISRMPCPTBBALIRDKIAGRSGKPIPNPLLGLDSTEFASAKSSFISTTTTDL

TSINTSAYSTGSISTVETGNRTTSEVISHWTTSTKLSPTATTSLTIAQTSIYSTDSNITVG

TDIHTTSEVISDVETISRETASTWAAPTSTTGWTGAMNTYISQFTSSSFATINSTPIISSS

AVFETSDASIVNVHTENITNTAAVPSEEPTFVNATRNSLNSFCSSKQPSSPSSYTSSPLVSS

LSVSKTLLSTSFTPSVPTSNTYIKTKNTGYFEHTALTTSSVGLNSFSETAVSSQGTKIDTFL

VSSLIAYPSSASGSQLSGIQQNFTSTSLMISTYEGKASIFFSAELGSIIFLLLSYLLF

Claims (9)

1. Peptid NP3 o sekvenci,

GSLTISNMDCPTEEALIRDKLAGRGSLTISNMDCPTEEALIRDKLAGRGSLTIS

NMDCPTEEALIRDKLAGR,

35 která obsahuje tři opakování vazebného motivu CPTEE pro ionty kovů, jako součást konzervované sekvence MDCPTEEALIR bakteriálních Pl-ATPas.

2. Peptid podle nároku 1 ve fúzi s kotvícím proteinem.

40

3. Fúzní protein MFal-NP3-V5-aAGlCp o sekvenci id. č. 2 obsahující peptid podle nároku

1.

-7CZ 301334 B6

4. Molekula DNA kódující peptid podle nároku 1 nebo protein podle nároku 3.

5. Expresní vektor obsahující molekulu DNA podle nároku 3.

6. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku 5.

7. Hostitelská buňka podle nároku 6, kterou je kvasinková buňka.

io

8. Hostitelská buňka podle nároku 7, kterou je buňka Saccharomyces cerevisiae.

9. Použití peptidů NP3 nebo peptidů obsahujících jeho násobky dle kteréhokoliv z nároků 1, 2 nebo 3 pro přípravu biosorbentů pro těžké kovy.