CZ301002B6 - Biomaterial based on nanofiber layer and process for preparing thereof - Google Patents
Biomaterial based on nanofiber layer and process for preparing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CZ301002B6 CZ301002B6 CZ20090252A CZ2009252A CZ301002B6 CZ 301002 B6 CZ301002 B6 CZ 301002B6 CZ 20090252 A CZ20090252 A CZ 20090252A CZ 2009252 A CZ2009252 A CZ 2009252A CZ 301002 B6 CZ301002 B6 CZ 301002B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- layer
- group
- monomers
- biomaterial
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Oblast technikyTechnical field
Vynález se týká biomateriálu na bázi nanovlákenné vrstvy a způsobu jeho přípravy.The present invention relates to a biomaterial based on a nanofiber layer and a process for its preparation.
Dosavadní stav techniky ioBACKGROUND ART
Příprava různých forem pevných látek vyznačujících se přítomností pórů, respektive měrného povrchu odpovídajícího rozměrům strukturních jednotek systému v řádu několika nanometrů až stovek nanometrů, je v současné době v popředí zájmu materiálového inženýrství. Prakticky všechny důležité vlastnosti takových systémů se odvozují právě od mimořádně velkého měrného povrchu. Zatímco porézní materiály na bázi polymerů a nanomateriály připravované cestou organizovaných nadmolekulámích struktur jsou dlouhodobě zevrubně studovány, vláknům o průměru řádově v desítkách až stovkách nanometrů se věnuje zvýšená pozornost teprve v posledních pěti letech. Z těchto vláken lze přitom vytvářet vlákenné vrstvy dobrých mechanických vlastností přímo v průběhu procesu zvláknění. Mechanické vlastnosti i morfologie jsou příznivě ovlivněny anizotropickým charakterem vlákenné vrstvy. Póry v takových vrstvách mají specifickou geometrii, díky níž jsou povrchy vláken dobře přístupné.The preparation of various forms of solids characterized by the presence of pores or specific surface areas corresponding to the structural units of the system in the order of several nanometers to hundreds of nanometers is currently in the forefront of material engineering. Virtually all important features of such systems derive from the extremely large specific surface area. While porous polymer-based materials and nanomaterials prepared through organized supermolecular structures have been extensively studied for a long time, fibers of the order of tens to hundreds of nanometers have received special attention only in the last five years. These fibers can be used to form fibrous layers of good mechanical properties directly during the spinning process. The mechanical properties and morphology are favorably influenced by the anisotropic nature of the fiber layer. The pores in such layers have a specific geometry which makes the fiber surfaces easily accessible.
Nanovlákna jsou obecně popisována jako vlákna, jejichž průměr se pohybuje v submikronové oblasti, tedy v rozsahu do 1000 nm. Mají řadu výjimečných vlastností, jako je například velký měrný povrch vláken, velká pórovitost vlákenné vrstvy a malý průměr pórů. Z hlediska buněčných kultur se struktura nanovlákenných vrstev přibližuje struktuře extracelulámí matrix. Tomu odpovídají opakovaná pozorování vyšší adheze buněk k nanovláknům než k mikrovláknům nebo vrstvám identických polymerů [Schindler M, Ahmed I, Kamal J, Nur EKA, Grafe TH, Young Chung H, et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morpho30 genesis for cells in culture. Biomaterials. 2005 Oct; 26(28):5624-31.; Rho KS, Jeong L, Lee G, Seo BM, Park YJ, Hong SD, et al. Electrospinning of collagen nanofibers: effects on the behavior of normál human keratinocytes and early-stage wound healing. Biomaterials. 2006 Mař; 27(8): 1452-61.; Min BM, Lee G, Kim SH, Nam YS, Lee TS, Park WH. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normál human keratinocytes and fibroblasts in vitro. Biomaterials. 2004 Mar-Apr; 25(7-8): 1289-97].Nanofibers are generally described as fibers whose diameter ranges in the submicron region, that is in the range up to 1000 nm. They have a number of exceptional properties, such as large fiber specific surface area, large fiber layer porosity and small pore diameter. From the point of view of cell cultures, the structure of nanofibrous layers approximates the structure of extracellular matrix. This is consistent with repeated observations of higher cell adhesion to nanofibres than to microfibers or layers of identical polymers [Schindler M, Ahmed I, Kamal J, Nur EKA, Grafe TH, Young Chung H, et al. Synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morpho30 genesis for cells in culture. Biomaterials. 2005 Oct; 26 (28): 5624-31.; Rho KS, Jeong L, Lee G, Seo BM, Park YJ, Hong SD, et al. Electrospinning of collagen nanofibers: effects on the behavior of normal human keratinocytes and early-stage wound healing. Biomaterials. 2006 Mař; 27 (8): 1452-61. Min BM, Kim Lee, Lee G, Nam YS, Lee TS, Park WH. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes and fibroblasts in vitro. Biomaterials. 2004 Mar-Apr; 25 (7-8): 1289-97].
Standardním postupem pro udržování kultur tkáňových i kmenových buněk je kultivace v monolayeru (růst v ploše); pro tuto kultivaci se využívá speciálně povrchově upravených materiálů, ke kterým buňky adherují (tkáňový plastik, sklo povrchově upravené lamininem, polylysinem, tkáňový plastik porostlý inaktivovanými fibroblasty apod.). Alternativní metody kultivace zahrnují kultivaci v suspenzi nebo v materiálech na bázi řídkých gelů, např. MatriGel®. Všechny popsané metody kultivace mají své nevýhody. Růst buněk v kultuře v monolayeru je podmíněn jejich adhezí k materiálu, na němž jsou kultivovány; médium má přístup pouze k apikální (od kultivačního povrchu odvrácené) vrstvy; vlastnosti buněk se mění po dosažení souvislé (kon45 fluentní) vrstvy; látky produkované buňkami se uvolňují do média a nezůstávají v okolí buněk. Výhodou kultivace v monolayeru je - kromě toho, že jde o velmi dobře standardizovaný postup také možnost sledovat v mikroskopu jednotlivé buňky (obr. I),The standard procedure for maintaining both tissue and stem cell cultures is monolayer cultivation; for this cultivation, specially coated materials adhere to the cells (tissue plastic, laminin-coated glass, polylysine, tissue plastic covered with inactivated fibroblasts, etc.) are used. Alternative cultivation methods include cultivation in suspension or in thin gel-based materials such as MatriGel®. All the cultivation methods described have disadvantages. The growth of cells in a monolayer culture is conditioned by their adhesion to the material on which they are cultured; the medium only has access to the apical layer facing away from the culture surface; the properties of the cells change upon reaching a continuous (con45 fluent) layer; the substances produced by the cells are released into the medium and do not remain around the cells. The advantage of monolayer cultivation is - besides being a very well standardized procedure - the ability to monitor individual cells in a microscope (Fig. I),
Při kultivaci buněk na vláknech, nebo v makroporézních materiálech, jejichž velikost pórů se pohybuje v rádu desítek mikrometrů, se buňky chovají podobně jako v monolayeru - porůstají rovné plochy materiálu (obr. 2).When cultivating cells on fibers or in macroporous materials whose pore size is in the order of tens of micrometers, the cells behave similarly as in monolayer - the flat surfaces of the material grow (Fig. 2).
Vrstvy z netkané nanovlákenné textilie připravené metodou elektrospínningu je možné využít ke kultivaci buněk v monolayeru podobně jako například tkáňový plastik; první experimenty s buněčnými kulturami na nanovlákenných textiliích byly publikovány v roce 2002 [Li WJ, LauCZ 301002 Bó rencin CT, Caterson EJ, Tuan RS, Ko FK. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res. 2002 Jun 15;60(4):613-21.]. Systém pro kultivaci buněk na nanoviákenných vrstvách je chráněn patentem [US 6 790 455]. Očekávané prospěšné využití nanoviákenných vrstev v biomedícíně vedlo k podání souhrnné patentové přihlášky [WO 2005/025630], ve které však použití nanovláken pro konstrukci tkáňových náhrad není zmiňováno.Electrospinning nonwoven nanofiber layers can be used to cultivate cells in a monolayer similar to a tissue plastic; the first experiments with cell cultures on nanofibrous textiles were published in 2002 [Li WJ, LauCZ 301002 Boronin CT, Caterson EJ, Tuan RS, Ko FK. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res. 2002 Jun 15; 60 (4): 613-21.]. A system for culturing cells on nanosilver layers is protected by a patent [US 6,790,455]. The expected beneficial use of nanofibrous layers in biomedicine has led to the filing of a co-pending patent application [WO 2005/025630], in which the use of nanofibres for the construction of tissue replacements is not mentioned.
Biomateríály na základě kopolymeru 2-hydroxyethylmethakrylátu (HEMA) již byly opakovaně připraveny. Tyto kopolymery jsou vysoce biokompatibilní a adheze buněk k jejich povrchům ío závisí na jejich elektrickém náboji [Lesný P, Pradny M, Jendelova P, Michalek J, Vacik J,Biomaterials based on 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) copolymer have been prepared repeatedly. These copolymers are highly biocompatible and cell adhesion to their surfaces depends on their electrical charge [Lesny P, Pradny M, Jendelova P, Michalek J, Vacik J,
Sykova E. Macroporous hydrogels based on 2-hydroxyethyl methacrylate. Part 4: Growth of rat bone marrow stromal cells in three-dimensional hydrogels with positive and negative surface charges and in polyelectrolyte complexes. Journal of materials science, 2006 Sep; 17(9):829-33.].Sykova E. Macroporous hydrogels based on 2-hydroxyethyl methacrylate. Part 4: Growth of rat bone marrow cells in three-dimensional hydrogels with positive and negative surface charges and in polyelectrolyte complexes. Journal of Materials Science, 2006 Sep; 17 (9): 829-33.].
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Předmětem předloženého vynálezu je biomateriál na bázi nanoviákenných vrstev, jehož podstata spočívá vtom, že sestává z nanovlákenné vrstvy porostlé na jedné straně živými buňkami, kteréThe object of the present invention is a biomaterial based on nanofibrous layers, which consists in that it consists of nanofibrous layer covered on one side by living cells, which
2o jsou funkčně polarizované, přičemž nanovlákenná vrstva je tvořena syntetickými polymery nebo kopolymery monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, urethany, vinylalkohol a monomery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů.2o are functionally polarized, wherein the nanofibrous layer consists of synthetic polymers or copolymers of monomers selected from the group comprising esters of methacrylic acid, methacrylic acid amides, urethanes, vinyl alcohol and monomers derived from lactic acid and its derivatives.
Význakem biomateriálu podle předloženého vynálezu je, že nanovlákenná vrstva je netkaná.It is a feature of the biomaterial according to the present invention that the nanofiber layer is non-woven.
S výhodou jsou monomery vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethyl methakry lát, 2-ethoxyethylmethakrylát a 2-hydroxypropylmethakrylamid.Preferably, the monomers are selected from the group consisting of 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-ethoxyethyl methacrylate and 2-hydroxypropyl methacrylamide.
Význakem vynálezu je, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně. S výhodou jsou buňky vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty, fibroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.It is a feature of the invention that the cells are selected from the group consisting of connective tissue cells, epithelial cells, parenchymatous organ cells, and mesenchymal stem cells derived from bone marrow or adipose tissue. Preferably, the cells are selected from the group consisting of chondrocytes, fibroblasts, hepatocytes and mesenchymal stem cells derived from bone marrow or adipose tissue.
Schopnost polymeru formovat se do vláken, tedy zvlákňovat se, je ovlivněna řadou procesních a materiálových parametrů, jako je například intenzita elektrického pole, elektrická vodivost, viskozita, molámí hmotnost, povrchové napětí, koncentrace polymeru, rozpouštědlo, dielektrické vlastnosti polymemího roztoku, hydrofilnost/hydrofobnost, polymerizační stupeň a stupeň větve40 ní polymeru nebo uspořádání experimentu. Vlastnosti zvlákněného materiálu ovlivňuje nejen chemické složení polymeru, ale i parametry zvlákňování. Změnou uvedených parametrů lze ovlivnit nejen proces zvlákňování, ale v určitých mezích i strukturu výsledné vrstvy a jemnost vláken. Pro každý polymemí roztok zvlákňovaný metodou elektrostatického zvlákňování je však třeba zvlášť hledat optimální procesní a systémové parametry, protože nalezené parametry jsou přenositelné jen ve velmi omezené míře.The ability of a polymer to form into fibers, i.e., fiberize, is influenced by a number of process and material parameters such as electric field strength, electrical conductivity, viscosity, molar mass, surface tension, polymer concentration, solvent, dielectric properties of polymer solution, hydrophilicity / hydrophobicity , the polymerization stage and the polymer branching stage or the experimental setup. The properties of the spinning material are influenced not only by the chemical composition of the polymer, but also by the spinning parameters. By changing these parameters it is possible to influence not only the spinning process, but also within certain limits also the structure of the resulting layer and the fineness of the fibers. However, for each polymeric solution spun by the electrospinning method, optimum process and system parameters need to be sought separately, since the parameters found are transferable to a very limited extent.
Způsobem přípravy nanovláken syntetického polymeru nebo kopolymeru podle předloženého vynálezu může být metoda elektrostatického zvlákňování „Nanospider“, při které jsou vlákna formována účinkem elektrostatického pole z tenké vrstvy polymemího roztoku, vynášené brodícím válečkem, kteiý je zároveň kladnou elektrodou, a jsou ukládána na kolektor, který je zároveň protilelektrodou [CZ 294274 (B6), WO 2005/024101].The method of preparation of nanofibres of synthetic polymer or copolymer according to the present invention can be the electrospinning method "Nanospider", in which the fibers are formed by the electrostatic field from a thin layer of polymer solution carried by a wading roller which is at the same time positive electrode. is also an antibody electrode [CZ 294274 (B6), WO 2005/024101].
Kontakt s molekulami extracelulámí matrix a adheze k nim jsou pro většinu buněk velmi důležité faktory, které podmiňují jejich adhezi a růst v organismu. Kultivace buněk ve dvojrozměrných kultivačních systémech neodráží přirozené prostředí v organismu. Struktura nanovlákenné vrstvy je přirovnávána ke struktuře bazální membrány.Contact with and adhesion to extracellular matrix molecules are a very important factor for most cells that condition their adhesion and growth in the body. Cell culture in two-dimensional culture systems does not reflect the natural environment in the body. The structure of the nanofiber layer is compared to the structure of the basement membrane.
Buňky výrazně adherují na nanovlákenné vrstvy biomateriálů podle předloženého vynálezu tvo5 řené polymery s nanovlákennou strukturou, a to i tehdy, když nejeví afinitu k vlastním polymerů bez nanovlákenné struktury. Po naočkování buněk na vrstvu nanovláken dojde v době dnů až týdnů (v závislosti na koncentraci buněk) k tomu, že buňky vrstvu nanovláken hustě porostou ajejich výběžky vrostou i mezi vlákna. Je-li vrstva nanovláken dostatečně tenká (jednotky až desítky mikrometrů), přesahuje růst buněk až na opačnou stranu vrstvy; od tloušťky vrstvy cca io 100 mikrometrů již buňky na druhou stranu vrstvy nepřesahují.The cells adhere strongly to the nanofibrous layers of biomaterials of the present invention formed nanofibrous polymers, even when they do not show affinity for the non-nanofibrous polymers themselves. After the cells are inoculated on the nanofiber layer, the nanofiber layer grows densely in the days to weeks (depending on the cell concentration) and their protuberances also grow between the fibers. If the layer of nanofibres is sufficiently thin (units up to tens of micrometers), it exceeds the cell growth to the opposite side of the layer; from a layer thickness of about 100 micrometers, the cells on the other side of the layer no longer exceed.
Kultivace buněk na vrstvách nanovláken má řadu předností před jejich kultivací v monolayeru, v suspenzi nebo v gelu. Při kultivaci na nanovláknech má - na rozdíl od kultivace v monolayeru - médium přístup k apikální (od vrstvy nanovláken odvrácené) i bazální (k nanovláknům přivrá15 cené) straně buněk. Pokud se při kultivaci nanovlákenné textilie umístí na rozhraní dvou prostředí odlišujících se buď fyzikálními (teplota) nebo chemickými (koncentrace růstových faktorů, složení média) vlastnostmi tak, že jedno prostředí je v kontaktu s apikální stranou buněk, a druhé prostředí je v kontaktu s bazální stranou buněk, může rozdíl těchto vlastností na apikální a bazální straně buňky vyvolat její funkční polarizaci (zejména odlišnou koncentraci receptorů na membrá20 ně apikální a bazální části buňky). Funkční polarizace buněk může být dále využívána, například při konstrukci detoxikačních bioreaktorů obsahujících hepatocyty, ve kterých je simulováno fyziologické umístění hepatocytu mezi kapilární a biliámí řečiště [Ostrovidov S, Jiang J, Sakai Y, Fujii T. Membrane-based PDMS microbioreactor for perfused 3D primary rat hepatocyte cultures. Biomed Microdevices. 2004 Dec; 6(4):279-87.].Cultivation of cells on nanofiber layers has many advantages over their cultivation in monolayer, suspension or gel. When cultivating on nanofibres, unlike monolayer cultivation, the medium has access to both the apical (nanofibers facing away) and the basal (nanofibers) side of the cells. When the nanofibrous textile is cultivated, it is placed at the interface of two media differing in either physical (temperature) or chemical (growth factor concentration, media composition) properties so that one media is in contact with the apical side of the cells and the other media is in contact with As opposed to cells, the difference in these properties on the apical and basal side of the cell can induce its functional polarization (in particular, a different concentration of receptors on the membrane-apical and basal parts of the cell). Functional polarization of cells may further be utilized, for example, in the construction of detoxifying bioreactors containing hepatocytes in which the physiological placement of hepatocytes between the capillary and biliary bed is simulated [Ostrovidov S, Jiang J, Sakai Y, Fujii T. Membrane-based PDMS microbioreactor for perfused Rat hepatocyte cultures. Biomed Microdevices. 2004 Dec; 6 (4): 279-87.].
Předmětem předloženého vynálezu je také způsob přípravy biomateriálů podle předloženého vynálezu, obsahujícího funkčně polarizované buňky, jehož podstata spočívá v tom, že se připraví syntetický polymer nebo kopolymer monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, urethany, vinylalkohol a monomery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů, připravený syntetický polymer nebo kopolymer se zvlákní metodou elektrostatického zvlákňování, následně se na metodou elektrostatického zvlákňování připravenou zvlákněnou vrstvu syntetického polymeru nebo kopolymeru vysejí buňky a kultivují se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur, přičemž se vrstva zvlákněného syntetického polymeru nebo kopolymeru v průběhu kultivace buněk umístí na rozhraní dvou prostředí odlišujících se fyzikálními nebo chemickými vlastnostmi. S výhodou jsou monomery vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethylmethakrylát, 2-ethoxyethylmethakrylát a 2hydroxypropylmethakrylamid.The present invention also provides a process for the preparation of biomaterials according to the present invention comprising functionally polarized cells comprising preparing a synthetic polymer or copolymer of monomers selected from the group consisting of methacrylic acid esters, methacrylic acid amides, urethanes, vinyl alcohol and monomers derived from methacrylic acid. lactic acid and its derivatives, prepared synthetic polymer or copolymer with a special electrostatic spinning method, followed by the electrostatic spinning prepared spinning layer of synthetic polymer or copolymer cells are sown and cultured under standard tissue culture conditions, wherein the layer of spinning synthetic polymer or The copolymer is placed at the interface of two media differing in physical or chemical properties during cell culture. Preferably, the monomers are selected from the group consisting of 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-ethoxyethyl methacrylate and 2-hydroxypropyl methacrylamide.
Standardní podmínky pro pěstování tkáňových kultur zahrnují použití kombinace média vhodné40 ho pro daný typ buněk, fetální telecího séra nebo jeho náhrady, antibiotik, případně růstových faktorů, a kultivace probíhá v inkubátorech, při 37 °C a 5 % CO2, kultivační médium je měněno každé 2 až 3 dny.Standard conditions for culturing tissue cultures include the use of a combination of medium40 suitable for a given cell type, fetal calf serum or its replacement, antibiotics or growth factors, and cultivation in incubators, at 37 ° C and 5% CO 2 , culture medium changed every 2 to 3 days.
S výhodou jsou monomery vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethylmethakrylát, 2-ethoxy45 ethylmethakrylát a 2-hydroxypropylmethakrylamid.Preferably, the monomers are selected from the group consisting of 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-ethoxy45 ethyl methacrylate and 2-hydroxypropyl methacrylamide.
Znakem způsobu podle vynálezu je, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně. S výhodou jsou buňky vybrány ze skupiny zahmu50 jící chondrocyty, fibroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.It is a feature of the method of the invention that the cells are selected from the group consisting of connective tissue cells, epithelial cells, parenchymatous organ cells and mesenchymal stem cells derived from bone marrow or adipose tissue. Preferably, the cells are selected from the group consisting of chondrocytes, fibroblasts, hepatocytes and mesenchymal stem cells derived from bone marrow or adipose tissue.
Celý postup podle vynálezu tedy spočívá v neoddělitelných procesech zahrnujících přípravu a charakterizaci polymeru, proces zvláknění, osídlení nanovláken vhodnou buněčnou kulturou, Thus, the whole process according to the invention consists in inseparable processes including the preparation and characterization of the polymer, the spinning process, the settlement of nanofibres by a suitable cell culture,
CZ 301002 Bó kultivaci buněk na vrstvě nanovláken a zformování výsledného materiálu do podoby vhodné k vybrané aplikaci v tkáňovém inženýrství nebo konvenčním léčebném procesu.The cultivation of cells on a layer of nanofibres and forming the resulting material into a form suitable for selected application in tissue engineering or conventional treatment process.
Biomedicinální aplikaceBiomedical applications
V oblasti biomedicinálních aplikací je nutné brát zřetel na kvalitu použitého materiálu z několika úhlů pohledu. První hledisko jsou výsledně užitné fyzikálně-chemické vlastnosti, jako jsou mechanické (pevnost, tvrdost, houževnatost, elasticita), botnací (rovnovážný obsah vody), transportní (permeabilita), optické (index lomu) a povrchové (drsnost, smáčívost, kontaktní úhel) ío vlastnosti. Dalšími podstatnými hledisky jsou pak fyzikální a chemická struktura materiálu, které významně ovlivňují biotoleranci materiálu v aplikacích v daném prostředí. Jedná se o požadovanou interakci materiálu s živou tkání, tedy buněčnou kulturou, dále o jeho chemickou stabilitu, respektive řízenou biodegradaci. Požadavky kladené na vlastnosti biomateriálů jsou často protichůdné a je nutno hledat kompromis mezi nimi. Proto také pro řadu aplikací existuje pouze úzký výběr vhodných chemických struktur.In the field of biomedical applications, it is necessary to take into account the quality of the material used from several points of view. The first aspects are the resulting useful physico-chemical properties such as mechanical (strength, hardness, toughness, elasticity), swelling (equilibrium water content), transport (permeability), optical (refractive index) and surface (roughness, wettability, contact angle) properties. Other important aspects are the physical and chemical structure of the material, which significantly affect the biotolerance of the material in applications in the environment. It is the required interaction of the material with living tissue, ie cell culture, as well as its chemical stability or controlled biodegradation. The demands placed on the properties of biomaterials are often contradictory and a compromise must be sought. Therefore, for many applications, there is only a narrow selection of suitable chemical structures.
Dalším problémem bioaplikací jsou nutné dlouhodobé testy vlastních účinků a zejména možných nežádoucích účinků použitých látek. Ze všech uvedených důvodů rezultuje přirozená snaha testovat v nových aplikacích již zavedené a tedy dlouhodobě užívané vyzkoušené materiály, které mají dobrý předpoklad vyhovět v testech toxicity respektive snášenlivosti. V oblasti hydrogelů je takovým materiálem síťovaný poly(2-hydroxyethylmethakrylát) a některé jeho kopoiymery nebo poly(2-hydroxypropylmethakrylamid).Another problem of bio-applications is the need for long-term tests of the effects themselves and in particular the possible adverse effects of the substances used. For all these reasons, there is a natural effort to test in new applications already established and therefore long-term used tested materials, which are well-suited to comply with toxicity or tolerance tests. In the field of hydrogels, such a material is cross-linked poly (2-hydroxyethyl methacrylate) and some of its copolymers or poly (2-hydroxypropyl methacrylamide).
Biomateriál podle předloženého vynálezu je ve tkáňovém inženýrství možné využít například jako plošný nosič buněk, produkujících růstové faktory: je-li vrstva nanovláken připravena z nedegradovatelného materiálu a porostlá z jedné strany buňkami, uvolňují tyto buňky růstové faktory, které mohou prostupovat vrstvou nanovláken. Při loží-li se takto připravený materiál na cílové místo, dosáhne se působení růstových faktorů, aniž by bylo cílové místo v přímém kontaktu s buňkami. Příklad použití: kožní kryty porostlé alogenními fibroblasty, které po přiložení na ránu uvolňují faktory napomáhající hojení.Biomaterial according to the present invention can be used in tissue engineering for example as a surface carrier of cells producing growth factors: if the nanofiber layer is made of non-degradable material and overgrown with cells on one side, these cells release growth factors that can penetrate the nanofiber layer. When the material thus prepared is deposited at the target site, growth factors are obtained without directing the target site to the cells. Example of use: skin covers covered with allogeneic fibroblasts, which, when applied to the wound, release healing factors.
Nanovlákennou vrstvu podle předloženého vynálezu lze využít i jako nosič polarizovaných buněčných kultur: necháme-li vrstvu nanovláken porůst z jedné strany buňkami a umístíme-Ii ji na rozhraní dvou prostředí s odlišným složením média, vznikne polarizovaná buněčná kultura, ve které mají buňky na straně odvrácené od nanovláken i na straně přivrácené k nanovláknům odlišné povrchové vlastnosti. Příklad použití: hepatální bioreaktor.The nanofibrous layer according to the present invention can also be used as a carrier of polarized cell cultures: if we leave the nanofiber layer on one side by the cells and place it on the interface of two media with different media composition, a polarized cell culture is formed. different surface properties from nanofibres and on the side facing nanofibres. Example of use: hepatic bioreactor.
Přehled obrázkůOverview of pictures
Obr. 1 znázorňuje lidské stromální buňky kostní dřeně rostoucí v monolayeru na plastiku pro tkáňové kultuiy. Černá úsečka znázorňuje měřítko = 100 pm.Giant. 1 depicts human bone marrow stromal cells growing in a monolayer for tissue culture plastic. The black line represents the scale = 100 µm.
Obr. 2 znázorňuje lidské chondrocyty (šipka) rostoucí na povrchu polylaktidového vlákna o tloušťce 50 mikrometrů. Černá úsečka znázorňuje měřítko = 50 pm.Giant. 2 shows human chondrocytes (arrow) growing on the surface of a 50 micrometer thick polylactide fiber. The black line represents the scale = 50 µm.
Obr. 3 ukazuje schéma přístroje pro elektrospinning. Použité vztahové značky: 1 - kovový válec, kladná elektroda, 2 - zvlákňovaná vrstva polymemího roztoku, 3 - rezervoár polymemího roztoku, 4 - textilní substrát (podpůrný materiál), 5 - směr vzniku nanovláken, 6 - záporná uzemněná elektroda, 7 - odsávání vzduchu a par.Giant. 3 shows a diagram of an electrospinning apparatus. Reference numerals used: 1 - metal cylinder, positive electrode, 2 - spinning layer of polymer solution, 3 - reservoir of polymer solution, 4 - textile substrate (support material), 5 - direction of nanofibers formation, 6 - negative grounded electrode, 7 - air suction and par.
Obr. 4 ukazuje strukturu nanovlákenné vrstvy zobrazenou elektronovým mikroskopem AQUASEM.Giant. 4 shows the structure of the nanofibrous layer displayed by an AQUASEM electron microscope.
Obr. 5 znázorňuje růst lidských chondrocytů obarvených pomocí imunofluorescence CFDA-SE (karboxyíluorescein diacetát, sukcinimidyl ester) na vrstvě nanovláken; (A) z horní strany jsou viditelné celé buňky (šipka), (B) ze spodní strany jsou viditelné pouze jejich výběžky. Bílá úsečka znázorňuje měřítko = 100 μπι.Giant. 5 shows the growth of human chondrocytes stained by immunofluorescence CFDA-SE (carboxyluorescein diacetate, succinimidyl ester) on the nanofiber layer; (A) whole cells are visible from the top (arrow), (B) only their projections are visible from the bottom. The white line represents the scale = 100 μπι.
Obr. 6 znázorňuje vznik tkáně v nanovlákenném implantátu připraveného stočením nanovláken do ruličky v míše laboratorního potkana, a jejím vložením v podélné ose míchy (A, C, E, G, 1) nebo kolmo na podélnou osu míchy (B, D, F, H, J, K, L).Giant. 6 shows the formation of tissue in a nanofibrous implant prepared by twisting nanofibers into a ball in the rat spinal cord and inserting it in the longitudinal axis of the spinal cord (A, C, E, G, 1) or perpendicular to the longitudinal axis of the spinal cord (B, D, F, H, J, K, L).
ío A, B - přehledné barvení hematoxylinem-eosinern, obdélníky označují výřezy s vysokou a s nízkou denzitou buněk, kteréjsou dále zobrazeny ve větším měřítku. Měřítko = 500 pm,A, B - transparent staining with hematoxylin-eosinern, rectangles indicate cutouts with high and low cell density, which are further shown on a larger scale. Scale = 500 pm,
C, D - detaily vrůstání tkáně s vysokou denzitou buněk, barvení hematoxylinem-eosinern. Měřítko = 100 pm.C, D - details of tissue ingrowth with high cell density, hematoxylin-eosinern staining. Scale = 100 pm.
E, F - detaily vrůstání tkáně s nízkou denzitou buněk, barvení hematoxylinem-eosinern; Měřítko = 100 pm.E, F - tissue ingrowth details with low cell density, hematoxylin-eosinern staining; Scale = 100 pm.
G, H - přehledné imunohistochemické barvení protilátkou proti NF160; obdélníky označují výre20 zy, kteréjsou dále zobrazeny ve větším měřítku. Měřítko = 500 pm.G, H - clear immunohistochemical staining with anti-NF160 antibody; Rectangles indicate cutouts that are further shown on a larger scale. Scale = 500 pm.
I - NF160 u implantátu vloženého kolmo na podélnou osu míchy rostou pozitivní výběžky nervových buněk podél okraje implantátu. Měřítko = 100 pm.I - NF160, when the implant is placed perpendicular to the longitudinal axis of the spinal cord, the positive processes of the nerve cells grow along the edge of the implant. Scale = 100 pm.
J, K - NF160 pozitivní výběžky nervových buněk vrůstající do implantátu vloženého v podélné ose míchy. Měřítko = 100 pm.J, K - NF160 positive nerve cell protrusions growing into the implant inserted in the longitudinal axis of the spinal cord. Scale = 100 pm.
L -NF160 pozitivní výběžky nervových buněk vrůstající do implantátu vloženého v podélné ose míchy. Měřítko = 50 pm.L -NF160 positive nerve cell protuberances growing into the implant inserted in the longitudinal axis of the spinal cord. Scale = 50 pm.
Obr. 7 znázorňuje růst potkaních stromálních buněk kostní dřeně barvených imunofluorescenčně phalloidinem (cytoskelet buněk) a DAPI (jádra buněk) na vrstvě nanovláken v různém zvětšení.Giant. 7 shows growth of rat bone marrow stromal cells stained immunofluorescently with phalloidin (cell cytoskeleton) and DAPI (cell nuclei) on the nanofiber layer at different magnifications.
Obr. 8 ukazuje růst potkaních stromálních buněk kostní dřeně na vrstvě nanovláken - rekon35 strukce zobrazení vkonfokálním mikroskopu, pořízená pomocí software Amira®, Cytoskelet buněk byl barven phalloidinem A - střed nanovlákenné vrstvy s konfluentně rostoucími buňkami,Giant. 8 shows the growth of rat bone marrow stromal cells on the nanofiber layer - the reconfunctional structure of the confocal microscope image taken with Amira® software. The cell cytoskeleton was stained with phalloidin A - the center of the nanofibrous layer with confluent growing cells.
B - pohled z boku s vyznačením pozice nanovlákenné vrstvy (světle) a prorůstajících výběžků buněk (tmavě), C - místo, kde byla nanovlákenná vrstva zvlněná: buňky kopírují tvar vrstvy, D okraj nanovlákenné vrstvy, kde buňky rostly izolovaně.B - side view showing the position of the nanofibrous layer (light) and ingrown cell protuberances (dark), C - the place where the nanofibrous layer was wavy: the cells follow the shape of the layer, D the edge of the nanofibrous layer where the cells grew isolated.
Obr. 9 Růst potkaních mezenchymálních buněk derivovaných z tukové tkáně na vrstvě nanovláken, barveno phalloidinem, A - přehledné zobrazení, měřítko = 500 pm. B - detail, měřítko = 100 pm.Giant. 9 Growth of adipose-derived rat mesenchymal cells on the nanofiber layer, stained with phalloidin, A - clear view, scale = 500 pm. B - detail, scale = 100 pm.
Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Příklad 1Example 1
Kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu (25,5 g) s 2-ethoxyethylmethakrylátem (60 g) byl připraven oxidačně redukční radikálovou polymerací monomerů účinkem persíranu amonného (0,5 g) a pyrosiřičitanu sodného (0,5 g) ve vodně ethanolickém roztoku (380 g ethanolu, 170 g vody) při 23 °C po dobu 7 dnů. Poté byl vzniklý kopolymer vysrážen do vody (3 1), vysušen a rozpuštěn v ethanolu na koncentraci 16,6%. Molámí hmotnost kopolymeru byla 6,78 .A copolymer of 2-hydroxyethyl methacrylate (25.5 g) with 2-ethoxyethyl methacrylate (60 g) was prepared by oxidative reduction radical polymerization of monomers by the action of ammonium persulfate (0.5 g) and sodium pyrosulfite (0.5 g) in aqueous ethanol (380 g). ethanol, 170 g water) at 23 ° C for 7 days. Then, the resulting copolymer was precipitated into water (3 L), dried and dissolved in ethanol to a concentration of 16.6%. The molar mass of the copolymer was 6.78.
105 g/mol, vnitřní viskozita 27,1.10 5 g / mol, intrinsic viscosity 27.1.
Příklad 2Example 2
Polymer 2-ethoxyethylmethakrylátu (85,5 g) byl připraven oxidačně redukční radikálovou polymeraci monomerů účinkem persíranu amonného (0,5 g) a pyrosiřičitanu sodného (0,5 g) ve vodné - ethanolickém roztoku (380 g ethanolu, 170 g vody) při 23 °C po dobu 7 dnů. Poté byl io vzniklý polymer vysrážen do vody (3 I), vysušen a rozpuštěn v absolutním ethanolu na koncentraci 16,1 %. Molámí hmotnost kopolymeru byla 6,78 . Í05 g/mol, vnitřní viskozita 26,9.Polymer 2-ethoxyethyl methacrylate (85.5 g) was prepared by redox-free radical polymerization of monomers by the action of ammonium persulfate (0.5 g) and sodium pyrosulfite (0.5 g) in aqueous ethanolic solution (380 g ethanol, 170 g water) at 23 ° C for 7 days. The resulting polymer was then precipitated into water (3 L), dried and dissolved in absolute ethanol to a concentration of 16.1%. The molar mass of the copolymer was 6.78. 15 g / mol, intrinsic viscosity 26.9.
Příklad 3Example 3
Poly(2-hydroxypropylmethakrylamid) byl připraven srážecí polymeraci 10 g monomeru účinkem 0,1 g azobis(isobutyronitrilu) při 60 °C po dobu 8 hod. v40g acetonu, následným promytím polymeru acetonem a vysušením. Molámí hmotnost polymeru byla 8,2 . 105.Poly (2-hydroxypropyl methacrylamide) was prepared by precipitation polymerization of 10 g of monomer with 0.1 g of azobis (isobutyronitrile) at 60 ° C for 8 hours in 40 g of acetone, followed by washing the polymer with acetone and drying. The molar weight of the polymer was 8.2. 10 5 .
Příklad 4Example 4
Roztok kopolymeru podle příkladu 1 byl zvlákněn metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Schéma přístroje je znázorněno na obr. 3 a podrobně bylo popsáno již dříve [CZ 294274 (B6), WO 2005024101]. Zvláknění probíhalo při napětí 25 kV.The copolymer solution of Example 1 was spun by electrospinning on a laboratory model of Nanospider technology. The schematic of the apparatus is shown in Fig. 3 and has been described in detail previously [CZ 294274 (B6), WO 2005024101]. The spinning was performed at a voltage of 25 kV.
Příklad 5Example 5
Polyuretan o molámí hmotnosti 2000 (lineární polykarbonátový diol a alifatický isophorondiizokyanát) (Larithane LSI 086 od firmy Novotex, Itálie) byl zvlákněn z hmotn. 15% roztoku dimethylformamidu s hmotn. 1% tetraethylamoniumbromidu (vztaženo na polyuretan) metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro techno35 logii Nanospider. Zvláknění probíhalo při 25 kV.Polyurethane having a molar mass of 2000 (linear polycarbonate diol and aliphatic isophorone diisocyanate) (Larithane LSI 086 from Novotex, Italy) was spun from wt. 15% dimethylformamide solution with wt. 1% tetraethylammonium bromide (based on polyurethane) by electrospinning on a Nanospider techno35 logic lab model. The spinning was performed at 25 kV.
Příklad 6Example 6
Polyvinylalkohol se stupněm hydrolýzy 80±8 % (Sloviol R - Chemické závody Nováky, Slovensko) byl zvlákněn z hmotn. 12 % vodného roztoku spolu s glyoxalem (hmotn. 3%) a kyselinou trihydrogenfosforečnou (hmotn. 4,5 %) metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Zvláknění probíhalo při 25 kV.Polyvinyl alcohol with a degree of hydrolysis of 80 ± 8% (Sloviol R - Chemical Plant Novaky, Slovakia) was spun from mass. 12% aqueous solution together with glyoxal (3% w / w) and phosphoric acid (4.5% w / w) by electrostatic spinning on a laboratory model of Nanospider technology. The spinning was performed at 25 kV.
Následně byla vlákenná vrstva zahřáta na 140 °C po dobu 3 minut, při čemž došlo kzesítění, a tím stabilizaci vláken proti rozpouštění ve vodě.Subsequently, the fiber layer was heated to 140 ° C for 3 minutes, during which crosslinking occurred, thereby stabilizing the fibers against dissolution in water.
Příklad 7Example 7
Kopolymer kyseliny mléčné a glykolové - (typ 7525DL HIGH IV od firmy Lakeshore Biomaterials Birmingham, AL) byl zvlákněn z hmotn. 15% roztoku v dichlormethanu a acetonu (4:1) metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Zvláknění probíhalo při 25 kV.The lactic acid-glycolic acid copolymer (type 7525DL HIGH IV from Lakeshore Biomaterials Birmingham, AL) was spun from wt. 15% solution in dichloromethane and acetone (4: 1) by electrospinning method on a laboratory model of Nanospider technology. The spinning was performed at 25 kV.
Cl 301002 B6Cl 301002 B6
Příklad 8Example 8
16,6% ethanolický roztok polymeru podle příkladu 1, jehož vodivost byla upravena přídavkem 5 nasyceného roztoku chloridu sodného na 260 gS/cm, byl zvlákněn metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospínníngu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider.The 16.6% ethanolic polymer solution of Example 1, whose conductivity was adjusted to 260 gS / cm by adding 5 saturated sodium chloride solution, was spun by electrostatic spinning (electrospinning) on a laboratory model of Nanospider technology.
Povrchové napětí polymemího roztoku bylo 27,07 mN/m, napětí při zvláknění 30 kV. Vzniklá nanovlákenné struktura je dokumentována na obr. 4 (fotografie z mikroskopu AQUASEM ve velkém zvětšení).The surface tension of the polymer solution was 27.07 mN / m, the spinning voltage was 30 kV. The resulting nanofibrous structure is documented in Fig. 4 (AQUASEM high magnification photograph).
ioio
Příklad 9Example 9
16,1% vodně - ethanolický roztok (66,3 % ethanolu) polymeru podle příkladu 2, jehož vodivost 15 byla upravena přídavkem nasyceného roztoku chloridu sodného na 260 gS/cm, byl zvlákněn metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospínníngu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Povrchové napětí polymemího roztoku bylo 26,9 mN/m, napětí při zvláknění 34 kV.A 16.1% aqueous ethanolic solution (66.3% ethanol) of the polymer of Example 2, whose conductivity 15 was adjusted to 260 gS / cm by the addition of saturated sodium chloride solution, was spun by electrostatic spinning (electrospinning) on a laboratory model of the technology equipment. Nanospider. The surface tension of the polymer solution was 26.9 mN / m, the spinning voltage was 34 kV.
Příklad 10Example 10
16,8% vodný roztok polymeru podle příkladu 3, jehož vodivost byla upravena přídavkem nasyceného roztoku chloridu sodného na 270 gS/cm, byl zvlákněn metodou elektrostatického zvlák25 ňování (elektrospínníngu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Povrchové napětí polymemího roztoku bylo 26,2 mN/m, napětí při zvláknění 31 kV.The 16.8% aqueous polymer solution of Example 3, whose conductivity was adjusted to 270 gS / cm by the addition of saturated sodium chloride solution, was spun by electrostatic spinning (electrospinning) on a laboratory model of Nanospider technology. The surface tension of the polymer solution was 26.2 mN / m, the spinning voltage was 31 kV.
PřikladliThey did
Vrstva nanovláken podle příkladů 1 a 4 o ploše 5 mm2 a tloušťce 50 gm byla na jednu hodinu ponořena do suspenze chondrocytů, označených plazmatickým barvivém CFDA, o koncentraci lxlO6 buněk/ml a kultivována po dobu 2 dní ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur (médium DMEM/F12 1:1, 10% FCS, penicilin+streptomycin, inkubátor s 5 % CO2,The nanofiber layer according to examples 1 and 4 with an area of 5 mm 2 and a thickness of 50 gm was immersed for one hour in a suspension of chondrocytes labeled with plasma dye CFDA at a concentration of 1x10 6 cells / ml and cultured for 2 days under standard tissue culture conditions. (DMEM / F12 medium 1: 1, 10% FCS, penicillin + streptomycin, 5% CO 2 incubator,
37 °C). Po uplynutí této doby byla vrstva nanovláken hustě porostlá z obou stran chondrocyty.37 ° C). After this time, the layer of nanofibres was densely covered with chondrocytes from both sides.
Na obr. 5 je ukázán růst buněk z horní (A) a ze spodní (B) strany nanovlákenné vrstvy.Fig. 5 shows cell growth from the upper (A) and lower (B) sides of the nanofibrous layer.
Příklad 12Example 12
Na vrstvu nanovláken o ploše 5 mm2 a tloušťce 50 gm připravenou podle příkladů 1 a 4 byly vysety potkaní buňky olfaktorické glie (OEG); vrstva byla stočena do roličky o tloušťce 1,5 mm a délce 1 mm a vložena do míchy laboratorního potkana. Po uplynutí 2 týdnů buňky pojivové tkáně a cévy masivně prorostly do implantované nanovlákenné roličky. V okolní tkáni nedošlo k zánětlivé infiltraci. Z proximálního i distálního okolí implantátu (roličky) prorůstala u implantátů, jejichž osa byla totožná s osou míchy, i vlákna nervových buněk; u implantátů, které byly kolmé na osu míchy vlákna nervových buněk prorůstala jen minimálně (obr. 6).Rat olfactory glia (OEG) cells were sown on a 5 mm 2 nanofiber layer prepared according to Examples 1 and 4; the layer was rolled into a 1.5 mm thick and 1 mm long roll and placed in the spinal cord of the rat. After 2 weeks, the connective tissue and blood vessels have grown massively into the implanted nanofiber roll. There was no inflammatory infiltration in the surrounding tissue. From the proximal and distal surroundings of the implant (the roll), nerve cell fibers also grew in implants whose axis was identical to the spinal cord axis; in the case of implants that were perpendicular to the spinal cord axis, the nerve cell fibers only grew minimally (Fig. 6).
Příklad 13Example 13
Na vrstvu nanovláken připravenou podle příkladů 1 a 4 o ploše 5 mm2 a tloušťce 50 gm byly vysety potkaní stromální buňky kostní dřeně v koncentraci 1 x 104 / cm3. Buňky byly obarveny phalloidinem (červeně) a jádra dobarvena DAPI (modře). Za sedm dní porostly obě buněčné Rat bone marrow stromal cells were seeded at a concentration of 1 x 10 4 / cm 3 on a nanofiber layer prepared according to Examples 1 and 4 with an area of 5 mm 2 and a thickness of 50 gm. Cells were stained with phalloidin (red) and nuclei stained with DAPI (blue). Both cells grew in seven days
kultury (srovnatelně navzájem) nanovlákennou vrstvou srovnatelné jako při růstu na standardním polystyrenu upraveném pro růst tkáňových kultur (obr. 7).cultures (comparable to each other) with a nanofibrous layer comparable to growth on standard polystyrene adapted for the growth of tissue cultures (Fig. 7).
Příklad 14Example 14
Na vrstvu nanovláken připravenou podle příkladů 1 a 4 o ploše 1 cm2 a tloušťce 50 pm byly vysety stromální buňky kostní dřeně a mezenchymální buňky derivované z tukové tkáně v koncentraci 1 x 105 / cm3. Po 3 dnech kultivace ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových io kultur buňky porostly celou vrstvu nanovláken; zobrazení v konfokálním mikroskopu po obarvení phalloidinem ukázalo, že buňky porůstají souvisle (konfluentně) vrstvu nanovláken (obr. 8A) a vysílají výběžky do vrstvy nanovláken (obr. 8B). V místech, kde byla nanovlákenná vrstva zvlněná, porůstaly buňky její povrch (obr. 8C); buňky rostly i na okraji nanovlákenné vrstvy, kde byla koncentrace buněk nej nižší (obr. 8D).Bone marrow stromal cells and adipose-derived mesenchymal cells at a concentration of 1 x 10 5 / cm 3 were seeded on the nanofiber layer prepared according to Examples 1 and 4 with an area of 1 cm 2 and a thickness of 50 µm. After 3 days of cultivation under standard conditions for both tissue and culture cultivation, the cells grew the whole layer of nanofibres; imaging in a confocal microscope after phalloidin staining showed that the cells grow continuously (confluent) of the nanofiber layer (Fig. 8A) and emit projections into the nanofiber layer (Fig. 8B). In places where the nanofibrous layer was corrugated, the cells grew its surface (Fig. 8C); cells also grew at the edge of the nanofibrous layer, where the cell concentration was the lowest (Fig. 8D).
Příklad 15Example 15
Stejný experiment jako v příkladu 16 byl zopakován s vrstvou nanovláken připravenou podle příkladů 3 a 10 o ploše 1 cm2 a tloušťce 50 pm. 3D zobrazení v konfokálním mikroskopu po obarvení buněk phalloidinem prokázalo obdobný růst, jako v předchozím případě, v místech na okrajích rostly na povrchu vrstvy izolované buňky.The same experiment as in Example 16 was repeated with a layer of nanofibres prepared according to Examples 3 and 10 having an area of 1 cm 2 and a thickness of 50 µm. 3D imaging in a confocal microscope after phalloidin staining of the cells showed a similar growth as in the previous case, isolated cells were growing on the surface of the layer at the edges.
Příklad 16Example 16
Na vrstvách nanovláken připravených podle příkladů 2 a 9 (obr. 9A) a 3 a 10 (obr. 9B) byly kultivovány za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur mezenchymální buňky derivované z tukové tkáně laboratorního potkana po dobu 4 dnů. Poté byly buňky obarvené phal30 toidinem. Buňky porostly konfluentně vrstvu nanovláken.On the nanofiber layers prepared according to Examples 2 and 9 (Fig. 9A) and 3 and 10 (Fig. 9B), mesenchymal cells derived from adipose tissue of a rat were cultured under standard conditions for 4 days. The cells were then stained with phal30 toidine. The cells grew confluent with a layer of nanofibres.
Příklad 17Example 17
Na vrstvu nanovláken podle příkladů 1 a 4 o ploše 1 cm2 byly vysety buňky primokultury olfaktorické glie laboratorního potkana. Tato vrstva byla umístěna do poloviny výšky zkumavky zcela naplněné kultivačním roztokem (médium DMEM/F12 1:1, 10% FCS, penicilin+streptomycin). Zkumavka byla umístěna do inkubátoru (37 °C, 5% CO2). Po dvou hodinách byl na hladinu přidán útržek filtračního papíru, který obsahoval 2 pg faktoru NT3 a 2 pg barviva (fenolová červeň).The cells of the nanofibres according to examples 1 and 4 with the area of 1 cm 2 were seeded with cells of the primoculture of the olfactory glial lab rat. This layer was placed at half the height of the tube completely filled with culture solution (DMEM / F12 medium 1: 1, 10% FCS, penicillin + streptomycin). The tube was placed in an incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). After two hours, a piece of filter paper containing 2 µg of NT3 factor and 2 µg of dye (phenol red) was added to the surface.
Po dobu 4 hodin byla zkumavka ponechána na místě a nebylo s ní manipulováno. Po této době byl ve zkumavce viditelný gradient barviva s maximem při hladině a minimem pří dně zkumavky. Vrstva nanovláken obsahující buňky byla fixována, obarvena fluorescenčními protilátkami proti receptorů p75 a byla vyhodnocena intenzita obarvení buněčných membrán na straně přivrácené ke zdroji faktoru NT3 a na opačné straně. Pomocí obrazové analýzy byl poměr intenzity fluorescence buněčných membrán roven 2,3 : I, což ukazuje funkční polarizaci - odlišnou distribuci p75 receptorů na buněčné membráně přivrácené a odvrácené ke zdroji růstového faktoru NT3.The tube was left in place for 4 hours and was not handled. After this time, a dye gradient was visible in the tube with a maximum at the level and a minimum of the bottom of the tube. The layer of nanofibres containing cells was fixed, stained with fluorescent antibodies against p75 receptors and the intensity of staining of cell membranes was evaluated on the side facing the source of factor NT3 and on the opposite side. By image analysis, the ratio of fluorescence intensity of cell membranes was 2.3: 1, indicating functional polarization - a different distribution of p75 receptors on the cell membrane facing and facing the source of growth factor NT3.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090252A CZ301002B6 (en) | 2007-01-23 | 2007-01-23 | Biomaterial based on nanofiber layer and process for preparing thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090252A CZ301002B6 (en) | 2007-01-23 | 2007-01-23 | Biomaterial based on nanofiber layer and process for preparing thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ301002B6 true CZ301002B6 (en) | 2009-10-07 |
Family
ID=41136312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20090252A CZ301002B6 (en) | 2007-01-23 | 2007-01-23 | Biomaterial based on nanofiber layer and process for preparing thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ301002B6 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770417A (en) * | 1986-11-20 | 1998-06-23 | Massachusetts Institute Of Technology Children's Medical Center Corporation | Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo |
| US6428802B1 (en) * | 1999-12-29 | 2002-08-06 | Children's Medical Center Corp. | Preparing artificial organs by forming polylayers of different cell populations on a substrate |
| US20030054035A1 (en) * | 2001-09-14 | 2003-03-20 | Benjamin Chu | Cell storage and delivery system |
| WO2005047493A2 (en) * | 2003-11-05 | 2005-05-26 | Michigan State University | Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture |
-
2007
- 2007-01-23 CZ CZ20090252A patent/CZ301002B6/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770417A (en) * | 1986-11-20 | 1998-06-23 | Massachusetts Institute Of Technology Children's Medical Center Corporation | Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo |
| US6428802B1 (en) * | 1999-12-29 | 2002-08-06 | Children's Medical Center Corp. | Preparing artificial organs by forming polylayers of different cell populations on a substrate |
| US20030054035A1 (en) * | 2001-09-14 | 2003-03-20 | Benjamin Chu | Cell storage and delivery system |
| WO2005047493A2 (en) * | 2003-11-05 | 2005-05-26 | Michigan State University | Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Fabrication and in vitro evaluation of PCL/gelatin hierarchical scaffolds based on melt electrospinning writing and solution electrospinning for bone regeneration | |
| Chen et al. | A three-dimensional dual-layer nano/microfibrous structure of electrospun chitosan/poly (d, l-lactide) membrane for the improvement of cytocompatibility | |
| Bhattarai et al. | Hydrophilic nanofibrous structure of polylactide; fabrication and cell affinity | |
| Khanam et al. | Electrospun linear polyethyleneimine scaffolds for cell growth | |
| Wu et al. | Cell infiltration and vascularization in porous nanoyarn scaffolds prepared by dynamic liquid electrospinning | |
| Pezeshki‐Modaress et al. | Gelatin/chondroitin sulfate nanofibrous scaffolds for stimulation of wound healing: In‐vitro and in‐vivo study | |
| Rajasekaran et al. | Role of nanofibers on MSCs fate: Influence of fiber morphologies, compositions and external stimuli | |
| Yow et al. | Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells | |
| Kim et al. | 3D tissue formation by stacking detachable cell sheets formed on nanofiber mesh | |
| Shahmoradi et al. | Controlled surface morphology and hydrophilicity of polycaprolactone toward human retinal pigment epithelium cells | |
| CN101253259A (en) | Polymer coated nanofibrillar structures and methods for cell maintenance and differentiation | |
| Zou et al. | Electrospun regenerated Antheraea pernyi silk fibroin scaffolds with improved pore size, mechanical properties and cytocompatibility using mesh collectors | |
| Garcia et al. | Chitosan based biomaterials for cartilage tissue engineering: Chondrocyte adhesion and proliferation | |
| WO2013103423A2 (en) | A graft for directed vascular and lymphatic regeneration and methods to guide endothelial cell assembly | |
| Sridhar et al. | Improved regeneration potential of fibroblasts using ascorbic acid‐blended nanofibrous scaffolds | |
| JP2002536011A (en) | Textile | |
| CN108368468A (en) | Cell culture apparatus | |
| Unnithan et al. | Strategic design and fabrication of biomimetic 3d scaffolds: unique architectures of extracellular matrices for enhanced adipogenesis and soft tissue reconstruction | |
| Yang et al. | Coaxial bioelectrospinning of P34HB/PVA microfibers biomimetic scaffolds with simultaneity cell-laden for improving bone regeneration | |
| Wu et al. | Development of dynamic liquid and conjugated electrospun poly (L-lactide-co-caprolactone)/collagen nanoyarns for regulating vascular smooth muscle cells growth | |
| Sekar et al. | Development of a novel porous polyvinyl formal (PVF) microfibrous scaffold for nerve tissue engineering | |
| Kwon et al. | Electrospinning of microbial polyester for cell culture | |
| Qiao et al. | An ordered electrospun polycaprolactone–collagen–silk fibroin scaffold for hepatocyte culture | |
| Wang et al. | A simple method for controlling the bacterial cellulose nanofiber density in 3D scaffolds and its effect on the cell behavior | |
| Wu et al. | Bacterial cellulose nanofiber distribution on gelatin and silk fibroin scaffolds and the cell behavior |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20180123 |