CZ300377B6 - Regulacní genový element obsahující promotor/zesilovac chránený pred methylací DNA a umlcením genové exprese - Google Patents

Abstract

Regulacní genový element obsahující promotor/zesilovac chránený pred methylací DNA a umlcením genové exprese, kterýžto element obsahuje modifikovaný retrovirový LTR, kde do libovolného místa LTR je vložena jedna nebo dve centrální sekvence IE v libovolné orientaci, pricemž IE má sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. C. 2. Výhodne je alespon jedna centrální sekvence IE vložena v poloze mezi promotorovou sekvencí a zesilovacem. Takto modifikovaný LTR zajištuje dostatecnou a dlouhodobou expresi integrovaného vektoru s cizorodým genem (transgenem) a jeho ochranu pred umlcením a postupnou methylací, a to i v lidských bunkách.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká v širším smyslu oblasti molekulární biologie, virologie a genové terapie, kde se využívají vektory, zejména virové a retrovirové vektory, pro přenos genů do buněk kultivovaných in vitro nebo do organizmů in vivo. Konkrétně se vynález týká řešení problému umlčení genové exprese a methylace DNA vektoru v eukaryotických buňkách, zejména buňkách savců. Uvedený problém je vyřešen použitím specifického regulačního genového elementu obsahujícího promotor/zesilovač, kteiý je založen na dlouhé koncové opakované sekvenci (LTR) retrovirů, obohacené o jednu nebo dvě centrální sekvence (IE) CpG ostrova. Takto modifikovaný LTR zajišťuje dostatečnou a dlouhodobou expresi integrovaného vektoru s cizorodým genem (trans15 genem) a jeho ochranu před umlčením a postupnou methylací, a to i v lidských buňkách. Element podle vynálezu má četné způsoby využití, například v experimentální biologii jako výzkumný nástroj, ale i v klinických oborech, zejména při kompensaci vrozených poruch genovou terapií. Může se uplatnit při konstrukci vektorů pro expresi terapeutických bílkovin, peptidů nebo malých molekul RNA.

Dosavadní stav technik

Pro přenos genů, např. při genové terapii a při přípravě transgenních živočichů se používají vek25 tory schopné zajistit jednak vlastní přenos (transdukci) cizorodých genů (transgenu), jednak jejich pozdější expresi. Virové vektory se jeví jako velmi účinné (přehled Osten et al., 2007; Zhang etal,, 2006). Často využívány jsou adenoviry, adeno-asociované viry, lentiviry nebo retrovíry.

Adenovirové vektory bývají často navrhovány a užívány pro účely genové terapie, neboť biologie adenovirů byla důkladně prozkoumána, virové částice jsou stabilní a lze relativně snadno produkovat preparáty adenovirů s vysokým titrem. Adenovirové vektory jsou schopny účinně transdukovat replikující se i nereplikující se buňky, a to jak in vitro tak in vivo. Cizorodá DNA je však přítomna v episomální podobě, takže se postupem času v proIiterujících buňkách vyředí a expre35 se transdukovaného genu vymizí.

Retroviry jsou v centru pozornosti při vývoji vektorů zejména z toho důvodu, že umožňují stabilní integraci transgenu do genomu hostitelské buňky. Moderní retrovirové vektory mají velkou kapacitu pro přenos cizorodých genů a vyrovnávají tak nižší dostupný titr ve srovnání s adeno40 viiy. Umožňují přenos genů jak do kultivovaných buněk, tkáňových kultur i intaktních živočichů.

K výhodám retrovirů patří to, že jejich životní cyklus sám o sobě vede k integraci virové DNA do genomu hostitele. Pokud se replikují, nemají cytopatogenní účinky a poskytují vysokou expresi v infikovaných buňkách. Nejčastěji užívané retrovirovové vektory jsou odvozeny z replikaČně defektního Moloneyho viru myší leukémie (MoMLV)

Pro některé výhodné vlastnosti jsou užívány i vektory odvozené z ptačích sarkomových a leukosových virů (ASLV). Hlavní výhodou je, že savčí buňky neobsahují endogenní retroviry schopné rekombinace s ASLV. ASLV mají navíc výhodný integrační profil, proto jsou stabilní a bezpečné z pohledu možného poškození genů v místě integrace a nebo indukce nádorového bujení. Významné jsou zejména vektory řady RCAS (Federspiel and Hughes, 1994), replikačně kompetentní vektory s donorem sestřihu odvozené z viru Rousova sarkomu (RSV). Významnou výhodou ASLV je to, že nejsou schopny replikovat se v savčích buňkách (Federspiel et al., 1994), protože replikace retrovirů vyžaduje buněčné kofaktory pro svůj životní cyklus. ASLV se nemohou repli55 kovat v savčích buňkách kvůli nedostatku specifických ptačích kofaktorů nutných pro správný

- 1 CZ 300377 B6 sestřih, štěpení polyproteinů, sestavování virových částic atd. (Svoboda etal., 2000). Proto vektory RCAS neprodukují žádné infekční potomstvo v savčích buňkách in vitro nebo in vivo (Federspiel et ak, 1994; Barsov and Hughes, 1996). Kromě toho, savčí buňky neobsahují žádné endogenní retroviry, které by byly schopné rekombinace s ASLV, ale virus s vysokým titrem může být připraven s pomocí kuřecí buněčné linie DF-1, která je rovněž prostá endogenních virů (Himly et ak, 1998). Vektory založené na ASLV jsou tak velmi stabilní a bezpečné pro genovou terapii. Další výhodou vektorů založených na ASLV je jejich integrační profil, který se liší od viru myší leukémie (MLV) nebo viru humánního imunodeficitu typu 1 (HIV-1). Celogenomové analýzy ukázaly, že ve srovnání s MLV a HIV-1, ASLV projevují nejslabší preferenci pro integio raci do genů a neprojevují sklon k integraci do promotorové oblasti (Narezkina et ak, 2004; Reinišová et ak, 2008). Proto se jeví jako bezpečnější než široce využívané lentivirové vektory nebo vektory založené na MLV.

Obecným problémem exprese přeneseného genu do savčích buněk (in vitro i in vivo) je to, že is přenesený gen (transgen) je zpravidla exprimován v dostatečné míře jen po relativně krátkou dobu, a pak dochází k poklesu exprese (na úrovni transkripce), někdy až k úplnému vyhasnutí transkripce (tzv. transkripční umlčení - sílencing). Mechanismy vedoucí k umlčení transkripce v eukaryotických buňkách jsou epigenetické, zahrnují zejména methylaci DNA, post-transkripční umlčení (PTGS) zprostředkované RNAi, methylaci/deacetylaci histonů a vlivy místa integrace (posiční efekty). Tyto mechanismy představují vážnou překážku při aplikaci genové terapie. Mechanismy methylace DNA byly podrobně zkoumány a je známo, že u obratlovců se methy láce DNA týká cytosinu methylovaného na pozici 5' (5mC) v dinukleotidové sekvenci CpG.

Dinukleotidy CpG nejsou v genomu obratlovců a zejména savců zastoupeny tak hojně, jak by odpovídalo volné kombinaci jednotlivých nukleotidů. Během evoluce byly dinukleotidy CPG eliminovány mutacemi a zachovaly se hlavně v tzv. ostrovech CPG na počátku některých, většinou konstitutivně exprimovaných, genů. Ostrovy CPG jsou alespoň 200 bp dlouhé, bohaté na G a C a se zastoupením dinukleotidů CpG odpovídajícím alespoň 60 % počtu, který bychom teore30 ticky očekávali při volné kombinovatelnosti nukleotidů. Většinou zde nacházíme vazebná místa pro transkripční faktor Spi. Takovéto ostrovy CPG zůstávají bez methylace, výjimkou jsou jen ostrovy CPG na inaktivovaném chromosomu X, imprintované lokusy a některé aberantně methylované ostrovy CPG v nádorových buňkách. Podstata anti-methylační resistence ostrovů CPG není definitivně objasněna a její znalost není nutná pro praktickou aplikaci (Suzuki and Bird,

2008).

Hlavní překážkou v použití ASLV vektorů v savčích buňkách je velmi účinné transkripční umlčování integrovaného proviru. Je známo, že exprese reportérového genu řízená retrovirem není dlouhodobě stabilní v in vitro kulturách a postupné umlčování transdukovaného genu koreluje s epigenetickými změnami retrovirových regulačních sekvencí, dlouhých koncových repetic (LTR). Sekvence LTR obsahují úseky U3, R a U5, jejichž struktura i funkce jsou známy. Tyto LTR sekvence obsahují signály zajišťující počátek ukončení transkripce, mj. promotor a zesilovač (enhancer).

U umlčených provirů in vitro byla zjištěna CpG methylace DNA a/nebo modifikace histonů v nukleosomech spojených s promotorovou oblastí. Zejména, MLV a HIV-1 byly charakterizovány podrobně (Hoeben et ak, 1991; Lorincz et ak, 2001; Mok et ak, 2007). Ke zvýšení stability MLV vektorů byly použity různé anti-methy lační a izolační strategie (Rivella etak, 2000; Yannaki et ak, 2002; Swindle et ak, 2004; Zhang et ak, 2007).

RSV a ASLV vektory nejsou progresivně umlčovány v kuřecích buňkách, nicméně v buňkách heterologního savčího hostitele jsou účinně methylovány a transkripčně umlčeny (Searle et al., 1984; Hejnar et ak, 1994). Ochrana před umlčením je proto vysoce potřebná, aby mohlo být využito výhodných vlastností ASLV vektorů při trangenezi nebo genové terapii.

-2CZ 300377 B6

Jak bylo již výše uvedeno, LTR sekvence retrovirů jsou známy, např. DNA sekvence LTR HIV1 byla popsána v patentu US 7 232 654. Využití retrovirů pro konstrukci vektorů vhodných pro přípravu transgenních organizmů je již dlouho známo, viz např. mezinárodní patentová přihláška WO 91/02805. Retrovirové vektory zvláště vhodné pro expresi v embryonálních buňkách a zej5 ména v embryonálních kmenových buňkách byly např. popsány v Evropském patentu EP 0 801 575. Retrovirovými vektory vhodnými pro genovou terapií se zabývá patentová přihláška US 2006/0153810. Modifikace LTR sekvencí s cílem ovlivnit expresi vektoru byly popsány v patentu US 5 814 493. Otázkou cíleného umlčování genové exprese u kvasinky Candida albicans se zabývá mezinárodní přihláška WO 01/48229. Specifický promotorový regulační eleio ment a strategie umlčení genové exprese jsou popsány v přihlášce WO 2007/111968. Avšak vynález popsaný ve WO 2007/111968 řeší opačný problém než předložené řešení, tj. cílené umlčení specifických genů. Žádný z uvedených patentových dokumentů se nezabývá přímo otázkou ochrany před methy lácí a/nebo umlčením genové exprese.

Podstata vynálezu

Původci již dříve pozorovali, že proviníš RSV je odolný vůči methylaci a umlčení, je-li v jeho sousedství CpG ostrov z genu myší adenosin fosforibosyltransferázy (aprt) (Hejnar et al., 2001).

Tento objev je základem předloženého vynálezu.

Cílem bylo zkonstruovat obecně využitelný regulační genový element, který by zabraňoval umlčení a methylaci retrovirového vektoru a umožnil by tak využití zejména ASLV, ale i jiných retrovirových vektorů. Cíle vynálezu bylo dosaženo tím, že retrovirový LTR byl obohacen o jednu nebo více centrálních sekvencí (IE) CpG ostrova genu aprt syrského křečka (Mesocricetus auratus), Takto vzniklý regulační genový element je schopen zajistit expresi retrovirem transdukovaného transgenu a účinně chránit integrovaný vektor před umlčením a postupnou methylaci.

Původci zjistili a popsali překvapivou schopnost centrální sekvence (IE) CpG ostrova aprt genu křečka (Siegfřied et al., 1999), stabilizovat dlouhodobě expresi retrovirového vektoru a chránit jej před transkripčním umlčením. Ve studii, kde tuto centrální sekvenci vložili do LTR RSV a připravili vektory vykazující stabilní a na pozici nezávislou expresi reportérové ho genu, prokázali, že provedená modifikace LTR může být proto využita ke konstrukci vektorů s prodlouženou transkripční aktivitou, zejména retrovirových vektorů, nej výhodněji ASLV vektorů, užitečných pro genovou terapii.

Závěry studie, která je podrobněji popsána dále v příkladech, dokazují, že vložení 120 bp IE do specifického místa LTR zajistí účinnou transkripci ASLV vektorů a překoná represivní epigenetické účinky v nepermisivních savčích buňkách. Nejlepší protektivní účinek byl zjištěn u LTR se dvěma IE v tandemu, který byl vložen mezi sekvence promotoru a enhanceru, a to v anti-sense orientaci. Žádný z 19 analyzovaných buněčných klonů transdukovaných touto modifikací reportérového vektoru neprojevil známky výrazného transkripčního umlčení vektoru ani po třinácti týdnech kultivace. Takto optimalizovaná konstrukce vektoru proto může být využita jako nová strategie ke zlepšení retrovirových vektorů pro účinný přenos genů a genovou terapii.

Předmětem vynálezu je tedy regulační genový element obsahující promotor/zesilovač chráněný před methylaci DNA a umlčením genové exprese, kterýžto element obsahuje modifikovaný retrovirový LTR, kde do libovolného místa LTR je vložena jedna nebo dvě centrální sekvence IE v libovolné orientaci, přičemž IE má sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 2. Odbor50 níkovi je přitom zřejmé, že DNA sekvence LTR přitom může být izolována z přirozeného zdroje (retrovirů) nebo může být připravena synteticky, a to postupy, které jsou v oboru všeobecně známy. Odborníkovi je také známo, jaké jsou vlastnosti sekvence funkčně ekvivalentní s centrální sekvencí IE. Funkčním ekvivalentem centrální sekvence IE může být sekvence pocházející z CpG ostrova a/nebo mající vlastnosti sekvence CpG ostrova, jak jsou obecně v oboru známy.

Odborník je schopen na základě svých znalostí takovou ekvivalentní sekvenci najít a izolovat

-3CZ 300377 B6 z přirozeného zdroje nebojí připravit synteticky, a na základě popisu předloženého vynálezu takovou sekvenci využít k přípravě regulačního genového elementu obsahujícího promotor/zesilovač chráněný před methy lácí DNA a umlčením genové exprese. Pokud se tedy v dalším popisu a nárocích užívá termín centrální sekvence (IE) CpG ostrova nebo jen centrální sekvence (IE), případně pouze zkráceně IE, tento termín zahrnuje i ekvivalentní sekvenci, tj. sekvenci pocházející z CpG ostrova a/nebo mající vlastnosti sekvence CpG ostrova, jak jsou odborníkovi známy, která plní v LTR promotoru stejnou funkci jako popsaná sekvence IE (SEKV. ID, Č. 2), ío Dále je předmětem vynálezu uvedený regulační genový element, kde alespoň jedna sekvence IE je vložena v poloze mezi promotorovou sekvencí a zesilovačem (enhancerem).

Dále je předmětem vynálezu výše popsaný regulační genový element obsahující modifikovanou sekvenci (LTR) viru Rousova sarkomu s vloženým tandemem sekvencí IE, výhodně v sense ori15 entaci, výhodněji vanti-sense orientaci, nej výhodněji v anti-sense orientaci v poloze -89 od počátku transkripce.

Předmětem vynálezu je také vektor obsahující alespoň jeden výše uvedený regulační genový element a alespoň jeden gen, který má být exprimován v cílové buňce, a dále terminátorové sek20 vence a případně další sekvence, přičemž všechny sekvence jsou operativně spojeny tak, že transkripce genu, který má být exprimován v cílové buňce, je řízena regulačním genovým elementem.

Dále je předmětem vynálezu výše popsaný vektor, kterým je retrovirový vektor, nevýhodněji

ASLV vektor.

Dalším předmětem vynálezu je způsob zabránění methylace promotoru/zesilovače a transkripěnímu umlčení genu, který zahrnuje krok, kdy se ve vektoru, který obsahuje retrovirový LTR obsahující promotor/zesilovač operativně spojený s genem, který má být exprimován v hosti30 telské buňce, modifikuje oblast promotor/zesilovač tak, že se do libovolného místa LTR vloží jedna nebo dvě centrální sekvence IE v libovolné orientaci, přičemž IE má sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 2.

Dále vynález zahrnuje také způsob podle předchozího bodu, kdy alespoň jedna sekvence IE je vložena v poloze mezi promotorovou a zesilovací sekvencí.

Vynález se týká i výše popsaného způsobu, kdy se sekvence LTR viru Rousova sarkomu modifikuje vložením tandemu sekvencí IE, výhodně v sense orientaci, výhodněji v anti-sense orientaci, nej výhodněji v anti-sense orientaci v poloze -89 od počátku transkripce.

Dalším předmětem vynálezu je buňka obratlovce, výhodně savce, obsahující vektor podle vynálezu.

A dále je předmětem vynálezu také transgenní organizmus, s výjimkou člověka, obsahující buňku podle předchozího bodu.

Předložený vynález je dále podrobněji vysvětlen pomocí následujících příkladů, s přihlédnutím k připojeným výkresům.

Popis obrázků na výkresech

Obr. 1: Schematické znázornění použitých retrovirových vektorů

-4CZ 300377 B6 (A) Základní vektory RNIG a MNIG obsahující neo^r a EGFP geny řízené 5'LTR z viru Rousova sarkomu (RSV) nebo z viru myší leukémie (MLV), v daném pořadí. PBS označuje vazebné místo primeru; ψ⁺ je enkapsidační signál MLV; IRES označuje vnitřní místo vstupu ribosomu; PPT je polypurinový úsek.

(B) Pořadí nukleotidů centrální sekvence (IE) CpG ostrova genu adenosin fosforibosyltransferázy (aprt) křečka. Spi vazebná místa jsou vyznačena rámečky, CpG dinukleotidy jsou vyznačeny tučně. Jsou ukázány substituce tří bází v každém Spi vazebném místě, které zrušily schopnost vázat Spi.

(C) Modifikace úseků LTR ve vektoru RNIG. Jednoduchá nebo zdvojená IE byla vložena do vyznačených restrikčních míst sense a/nebo anti-sense orientaci. Orientace IE je znázorněna šipkou. Bicistronické kódující úseky a 3 LTR nejsou znázorněny.

Obr. 2: FACS analýza exprese GFP z vektoru s modifikovanými a nemodifikovanými LTR

NIL-2, HEK 293 a QT6 buněčné linie transdukované vektory RNIG a RNIG2-2IE byly selektovány užitím G418 a pak 57 dnů po odstranění selekčního antibiotika analyzovány pomocí FACS. Je ukázán jeden klon z každé buněčné linie s každým ze dvou vektorů. V histogramech je vyne20 sena relativní GFP fluorescence proti počtu buněk a je ukázáno také zastoupení GFP-pozitivních buněk v procentech. Rozsah GFP positivity je znázorněn jako horizontální úsečka.

Obr. 3: Stabilita GFP exprese z retrovirových vektorů s modifikovanými a nemodifikovanými LTR v průběhu dlouhodobé kultivace transdukovaných buněk

NIL-2 buňky byly infikovány retrovirovými vektory modifikovanými vložením IE (A) do US oblasti LTR, (B) mezi LTR promotor a enhancer, a (C) na začátek U3 oblasti. Transdukované buňky byly selektovány G418 po dobu 15 dnů, procento GFP-pozitivních buněk bylo kvantifikováno pomocí FACS v pravidelných intervalech po té, co byla odstraněna selekce a buňky byly kultivovaný bez selekce. Každý bod představuje průměr ze tří kultivačních misek. (D, E) NIL-2 buňky byly infikovány modifikovanými a nemodifikovanými vektory, po 7 dnech selekce byly izolovány jednotlivé klony G418-rezistentních buněk a byly kultivovány odděleně bez selekce. Časový průběh umlčování vektorů byl sledován pomocí FACS v pravidelných intervalech a procento GFP-pozitivních buněk je uvedeno jako průměr ze všech buněčných klonů transdukova35 ných stejným vektorem. (E) Stabilita GFP exprese po odstranění selekce u 19 jednotlivých buněčných klonů transdukovaných vektorem RNIG2-2IE. Grafy 17 neumlčených klonů byly sloučeny do jednoho. (D) Stabilita GFP exprese u devíti jednotlivých buněčných klonů transdukovaných kontrolním vektorem RNIG. (F) Stabilita exprese vektorů modifikovaných vnesením IE s mutovanými Spi vazebnými místy. Populace NIL-2 buněk byla transdukované vektory, selektována užitím G418 a jednotlivé klony byly izolovány a kultivovány odděleně. Každá křivka představuje průměrné procento GFP-pozitivních buněk všech buněčných klonů transdukovaných stejným vektorovým konstruktem.

Obr. 4: Reaktivace umlčených vektorů

NIL-2 buňky byly infikovány vektory náchylnými k umlčení RNIG a RN1G3-MIE s mutovanými Spi vazebnými místy. Buňky byly selektovány antibiotikem G418 a po šesti dnech byla selekce odstraněna. Po 18denní kultivaci byly GFP-negativní buňky tříděny pomocí FACS. Každá GFP-negativní populace pak byl rozdělena na dvě subpopulace šest dnů po třídění: jedna pak byla ošetřena působením 5-azaC a TSA pro čtyři dny a byl vyhodnocen podíl GFPexprimujících buněk. Populace neošetřených GFP-negati vníeh buněk byla dále kultivována a ošetření bylo opakováno v pravidelných intervalech. Každý experiment byl proveden ve třech opakováních.

-5CZ 300377 B6

Obr. 5: DNA methy láce integrovaných vektorů

Methy lační stav CpG v LTR integrovaných vektorů byl testován bisulfitovou metodou.

(A) Stav methylace CpG v sekvenci 5 LTR vektorů RNIG a RNIG3-IE náchylných k umlčení.

NIL-2 buňky transdukované vektory byly použity pro isolaci DNA devět týdnů po odstranění selekce, DNA byla vyšetřena bisulfitovou metodou. Každá čára s kroužky představuje jednu nezávislou LTR sekvenci klonovanou z produktu PCR provedené s DNA ošetřenou bisulfitem. Jsou ukázána procenta GFP-pozitivních buněk a methylovaných CpGs.

to (B) Stav methylace CpG v sekvenci 5'LTR vektoru RNIG2-2IE ve dvou buněčných klonech. Analýza byla provedena bisulfitovou technikou, viz a.

(C) Stav methylce CpG párů v 5 LTR sekvenci vektorů RNIG a RNIG3-MIE náchylných k umlčení. NIL-2 buňky transdukované vektory a obohacené GFP-negativními buňkami pomocí

FACS tři týdny po odstranění selekce byly odebrány a podrobeny sekvencování bisulfitovou metodou. Každá čára s kroužky představuje jednu nezávislou LTR sekvenci PCR produktu získaného z DNA ošetřené bisulfitem. Jsou ukázána procenta GFP-pozitivních buněk a methylovaných CpGs. Methylované CpG jsou znázorněny jako plné kroužky, nemethylované CpG jsou znázorněny prázdnými kroužky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Studie účinku centrální sekvence IE na expresi retrovirových vektorů

Ve studii, která je podkladem předkládaného vynálezu, původci zkoumali účinek krátké centrální sekvence (IE) CpG ostrova genu aprt Syrského křečka (Mesocricetus auratus) na expresi reporté30 rových retrovirových vektorů na bázi RSV a MLV a na jejich resistenci vůči transkripčnímu umlčování.

Centrální sekvence CpG ostrova (IE) stabilizuje dlouhodobou expresi retro virového vektoru řízeného LTR z RSV

Původci zkonstruovali retrovirové vektory RNIG a MNIG s genem neomycinové rezistence (neo^r) a genem proteinu zesílené zelené fluorescence (GFP) pod kontrolou LTR z RSV (RNIG) a MLV (MNIG). Oba geny byly exprimovány z jedné bicistronové mRNA prostřednictvím interního místa pro vstup do ribosomů (IRES) z viru encefalomyokarditidy (Obr. 1 a). LTR z RSV obsa40 huje vysoce účinný promotor, ale je náchylný k CpG methy láci a transkripčnímu umlčení po infekci savčích buněk (Searle et al., 1984, Hejnar et al., 1994).

Struktura LTR RSV (pražský kmen RSV-Pr-C) je následující (SEKV. ID. Č. 1):

tgtagtcgtacgcaatactcctgltagtcttgclaacatgcttatgtaacgatgagttnagcaatatgccttacaaggaaagaaaaggc accgt|gcatgccga|ttggtggtagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggtatcagacgggtctaacatggattggacgaa ccactgaattccgcatcgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgccoftťtaccoftcoccQcgttggtgtec acctgggttgatggccggaccgtcgattccctaacgattgcgaacacctgaatgaagcagaaggcttca, přičemž rámečkem jsou vyznačeny dva enhancerové motivy, tučně a podtržením jsou vyznačeny promotorové sekvence attgg (inverted CCAAT) a tatttaa (TATAbox), kurzívou a podtržením je

-6CZ 300377 B6 vyznačen repetitivní segment R, který odděluje segment U3 (nalevo) a U5 (napravo) a jehož první nukleotid je počátkem transkripce.

Pro ochranu LTR RSV proti umlčení byla vybrána sekvence IE aprt CpG ostrova křečka charak5 terizovana již dříve jako účinný protektivní motiv (Siegfried etal., 1999). IE představuje sekvenci velikosti 120 bp, která zahrnuje sedm CpG dinukleotidů a dvě vysoce afinitní vazebná místa Spi (Obr. Ib) a je zodpovědná za většinu vlastností CpG ostrova. Sekvence uvedeného IE je následující (SEKV. ID. Č. 2):

cctctcct§gctggatjcg|ctccctaagga, přičemž CpG dinukleotidy jsou vyznačeny tučně a rámečkem, vazebná místa pro faktor Spi jsou podtržena.

is Sekvence LTR z RSV byla modifikována následujícím způsobem: Jeden IE byl vložen v obou orientacích ve třech různých polohách LTR RSV: I) v U5 oblasti downstream od promotoru a transkripčního počátku, II) ve středu U3 oblasti mezi enhancerem a promotorem a III) na začátku U3 oblasti upstream od enhanceru. V další variantě modifikace LTR byly vloženy dva IE v antisense orientaci mezi enhancer a promotor. U5 oblast byla užita v 5'LTR a U3 v 3'LTR, takže po reverzní transkripci odpovídající RNA se všechny modifikace objevily v obou LTR výsledného proviru. Celý soubor modifikovaných LTR RSV s příslušným označením odpovídajícího retrovirového vektoru je ukázán na obr. Ic.

Pro studii dlouhodobé stability exprese byly vektory divokého typu a modifikované vektory zabaleny („pakážovány“) v buňkách GP293 a transdukovány do dvou ptačích buněčných linií, kuřecí DF-1 a křepelčí QT6, a dvou savčích buněčných linií, křečci NIL-2 a lidské HEK 293. Buňky, které obsahovaly transkripčně účinné transdukované geny pro resistenci k neomycinu byly selektovány pomocí antibiotika G418 a exprese GFP byla sledována v pravidelných intervalech po odstranění G418 mikroskopickým a cytometrickým vyšetřením na aktivovanou fluo30 rescenci (FACS). Všechny vektory s LTR divokého typu nebo modifikovaným LTR vykazovaly velmi stabilní expresi v DFP během in vitro kultivace. Jen málo GFP-negativních buněk se objevilo po dvou měsících kultivace bez selekčního tlaku (data nejsou ukázána). Podobná stabilita exprese GFP byla také pozorována u buněk QT6 transdukovaných vektory RNIG, RNIG2-2IE a MNIG. Po transdukci každého z těchto tří vektorů bylo izolováno šest jednobuněčných klonů

G418-rezistentních buněk a tyto klony byly kultivovány odděleně pro víc než dva měsíce. Všechny klony projevovaly velmi stabilní expresi často bez jakéhokoliv náznaku umlčení (data nejsou ukázána). Pouze jeden klon QT6 transdukovaný vektorem s nemodifikovaným LTR RSV byl progresivně umlčen a po 70 dnech kultivace (bez selekce) bylo 22 % buněk GFP-negativních.

Významné je, že odlišné chování integrovaných vektorů bylo pozorováno po transdukci savčích buněk. Vektory RNIG a MNIG byly postupně umlčeny v buňkách NIL-2, zatímco vektory s vloženou centrální sekvencí IE vykazovaly odlišný stupeň ochrany před transkripčním umlčením (Obr. 2, 3A-C). Vložení jednoho nebo dvou IE mezi promotor a enhancer téměř úplně stabi45 lizovalo dlouhodobou expresi RNIG vektorů, a to bez ohledu na orientaci IE (Obr. 2, 3B). Kvůli významné variabilitě mezi buněčnými kulturami transdukovanými stejně modifikovaným vektorem bylo po infekci jednotlivými vektory izolováno několik G418-resistentních NIL-2 klonů a byla pozorována GFP exprese v průběhu času. Různé počty klonů byly kontrolovány, šest klonů s RNIG2+IE vektorem a až 19 klonů s RNIG2-2IE vektorem. Data jsou ukázána jednotlivě pro vektory divokého typu RNIG a vektory RNIG2-2IE a kumulativně pro zbývající vektory. Vektor RNIG byl postupně umlčen ve většině buněčných klonů. Z devíti izolovaných klonů pouze dva byly bez variegace a projevovaly stabilní expresi GFP (Obr. 3D), pravděpodobně v důsledku

-7CZ 300377 B6 integrace do konkrétního místa v genomu hostitelské buňky, které podporovalo účinnou transkripci integrovaného retroviru. Naproti tomu téměř žádné umlčení nebylo pozorováno u klonů nesoucích vektor RNIG2-2IE modifikovaný vnesením zdvojené IE v poloze -89. Bylo analyzováno 19 klonů NIL-2 buněk transdukovaných tímto vektorem a bylo pozorováno velmi slabé umlčování GFP exprese pouze u dvou z nich. Po 91 dnech kultivace se ukázalo 2 % a 8 % GFP negativních buněk. Ostatních 17 klonů neprojevilo ani náznak jakéhokoliv umlčení (Obr. 3E).

Všechny uvedené experimenty byly opakovány a potvrzeny na lidské buněčné linii HEK 293. Data týkající se umlčení ochrannému účinku IE proti umlčení plně odpovídají údajům získaným io na buňkách NIL-2. Jediným rozdílem byl zpravidla ještě pomalejší průběh umlčování v buněčné linii HEK 293. Intenzita fluorescence GFP byla v podstatě shodná u buněk NIL-2 a HEK 293, ale vyšší u buněk QT6. Toto souhlasí s očekávanou vyšší hladinou transkripce řízené LTR RSV v ptačích buňkách. Vložení IE, jak jednoho tak v tandemu, mezi enhancer a promotor, nezvýšilo

GFP fluorescenci (Obr. 2), což znamená, že transkripce a titry modifikovaných vektorů nebyly ovlivněny.

Vložení jedné IE, výhodně dvou IE v tandemu, mezi enhancer a promotor účinně zabránilo umlčení transkripce.

Odborníkovi je přitom zřejmé, že DNA sekvence LTR může být izolována z přirozeného zdroje (retroviru) nebo může být připravena synteticky, a to postupy, které jsou v oboru všeobecně známy. Odborníkovi je také známo, jaké jsou vlastnosti sekvence, která je funkčně ekvivalentní s centrální sekvencí IE. Funkčním ekvivalentem centrální sekvence IE může být sekvence pocházející z CpG ostrova a/nebo mající vlastnosti sekvence CpG ostrova, jak jsou obecně v oboru známy. Odborník je schopen na základě znalostí z oboru takovou ekvivalentní sekvenci najít a izolovat z přirozeného zdroje nebojí připravit synteticky, a na základě popisu předloženého vynálezu takovou sekvenci využít k přípravě regulačního genového elementu obsahujícího promotor/zesilovač chráněný před methylací DNA a umlčením genové exprese. Pokud se tedy v dalším popisu a nárocích užívá termín centrální sekvence (IE) CpG ostrova, tento termín zahr30 nuje i ekvivalentní sekvenci, tj. sekvenci pocházející z CpG ostrova a/nebo mající vlastnosti sekvence CpG ostrova, jak jsou odborníkovi známy, která plní v LTR promotoru stejnou funkci.

Spi vazebná místa jsou důležitá pro protektivní roli IE CpG ostrova

IE použitá v uvedených experimentech obsahuje dvě vazebná místa Spi. Do míst Spi byly zavedeny bodové mutace, která zrušily schopnost DNA sekvence vázat protein Spi. Vektory RNIG2IE, RNIG3+IE a RNIG3-IE mutované tímto způsobem byly nazvány RNIG2-MIE, RNIG3+MIE a RNIG3-MIE, v daném pořadí. Všechny Spi-mutované vektory vykazovaly významně snížený protektivní účinek na expres i GFP v buňkách NIL-2 ve srovnání s jejich nemutovanými pro40 tějšky. Mutované vektory RNIG3+M1E a RNIG3-MIE byly umlčeny dokonce rychleji než původní vektory bez jakéhokoliv vloženého IE (Obr. 3F). V buňkách DF-1 a QT6 byla exprese GFP z RNIG3-MIE vektoru stabilní a neprojevovala umlčení (data nejsou ukázána). Ukázalo se, že jedno intaktní Spi místo je v podstatě nutné pro účinnou funkci IE při zabránění umlčování (s výhradami uvedenými v podrobnější diskusi v části Diskuse).

Reaktivace umlčených vektorů 5-azacytidinem a trichostatinem A

Původci ověřili možnost zvrátit transkripční supresi DNA integrovaného proviru inhibitorem methyltransferázy, 5-azacytidinem (5azaC) a/nebo inhibitorem histondeacetylázy, trichostatinem

A (TSA). GFP-negativní buňky NIL-2 klonů náchylných k umlčení transdukované RNIG a RNIG3-MIE vektory byly cytometricky sortovány 11 dnů po odebrání G418 a buněčné kultury byly ošetřeny v pravidelných časových intervalech uvedenými inhibitory, buďto samotnými nebo v kombinaci. Zvýšení procenta GFP-pozitivních buněk bylo hodnoceno FACS analýzou. Jak 5azaC tak TSA použité odděleně reaktivovaly GFP expresi (data nejsou ukázána), ale kombinace obou inhibitorů poskytla nej silnější účinek (Obr. 4). Většina umlčených vektorů kultivovaných

-8CZ 300377 B6 dnů po odebrání G418 byla reaktivována 5-azaC a TSA, nicméně účinek inhibitorů postupně klesal a po 112 dnech kultivace bez selekce byla reaktivována pouze 2 % vektorů (Obr. 4).

Analýza methy láce DNA integrovaných vektorů

Protože transkripční umlčení genů nebo provirů je obvykle způsobeno methylací DNA v oblasti promotorů, byly analyzovány a srovnány CpG methylační profily LTR vektorů, které byly umlčeny nebo byly transkripčně aktivní. Pro tuto analýzu byly vybrány dvě klonální buněčné kultury NIL—2 transdukované vektorem RNIG, jedna s vysokým a druhá s velmi nízkým procentem io GFP-pozitivních buněk, a jedna klonální buněčná kultura transdukovaná RNIG3-IE vektorem s 30 % GFP-pozitivních buněk. Tyto klony byly testovány přibližně devět týdnů po G418 selekci transd ukovaných buněk. Bisulfitové sekvencování vektorů ukázalo téměř úplně methy lo váné

LTR sekvence v kultuře s umlčeným RNIG provirem. Na rozdíl od toho nebyla zjištěna téměř žádná CpG methy láce v kulturách bez umlčení RNIG vektoru (Obr. 5a). Klon s 30 % GFP-pozi15 tivních buněk byl mezi uvedenými hodnotami pokud jde o methylaci 5 LTR RNIG3-IE vektoru. Nebyl zde zřejmý methylační profil a methylované CpG dinukleotidy byly pozorovány v celé sekvenci (LTR). Klony transdukované vektorem RN1G2-2IE, které nevykazovaly žádné umlčování integrovaných vektorů, měly rovněž zanedbatelnou úroveň methylace 5 LTR. Bez methylace byly rovněž vložené sekvence IE (Obr. 5B).

Aby bylo možné sledovat časnou fázi umlčení vektorů, byla vyšetřena CpG methylace u vzácných GFP-negativních buněk, které se objevily brzy po selekci transdukovaných buněk. Z těchto buněk byly vybrány dvě buněčné kultury NIL-2 transdukované vektory RNIG a RNIG3-MIE pomocí FACS po 21 dnech kultivace bez selektivního tlaku. Jelikož je obtížné oddělit slabě exprimující buňky, získané buněčné kultury byly obohaceny GFP-negativními buňkami, obsahovaly ale také 15 a 28 % pozitivních buněk, v daném pořadí (Obr. 5C). Denzita CpG methylace v LTR sekvenci byla 28 a 19%, vdaném pořadí, tedy mnohem nižší než u devět týdnů staré buněčné kultury transdukované RNIG31E, která obsahovala srovnatelné procento umlčených buněk (Obr. 5C).

Na základě výše popsaných zjištění lze dojít k závěru, že umlčení integrovaného proviru je asociováno s CpG methylací promotorové sekvence, nicméně jsou zde i jiné mechanismy umlčení, které předcházejí silné methylaci provirových LTR.

V tomto experimentu původci prokázali, že vložení alespoň jedné IE chrání retrovirový LTR před oběma typy transkripční suprese.

Diskuse

V této části jsou z důvodů celistvosti studie a vědecké poctivosti diskutovány získané výsledky. Bez ohledu na různé teorie však výsledky plně podporují nárokované řešení a nikterak nezpochybňují možnosti jeho praktického využití, které byly popsány.

Existují dvě základní strategie „boje“ proti umlčování retrovirových vektorů odvozených z gam45 maretrovirů a lentivirů. První je eliminace tzv. silencerů definovaných např. V LTR a vazebném místu primem MLV. Mnohočetné bodové mutace všech CpG v LTR oblasti také stabilizují expresi MLV vektorů v embryonálních kmenových buňkách (Swindle et al., 2004). Alternativně byly použity úseky DNA pro navázání k jaderné matrix nebo „izolátory“ pro prevenci pozičních účinků přilehlých buněčných silencerů (Rivella et al., 2000; Yannaki et al., 2002; Zhang et al.,

2007).

Předchozí experimenty původců s CpG ostrovem myšího genu aprt (Hejnar et al,, 2001) sousedícího s RSV reportérovým provirem ukázaly, že ochrana před umlčením a před methylací by mohla být způsobena také některými izolačními účinky. Původci zjistili, že vnesení CpG ostrova

-9CZ 300377 B6 chrání downstream ležící enhancer/promoter způsobem závislým na orientaci, a to bez jakéhokoliv zvýšení síly promotoru.

V experimentech, které jsou popsány v předložené přihlášce, byla použita krátká sekvence (IE) z CpG ostrova aprt křečka (Siegfried et al., 1999), která byla vložena do retrovirových LTR. Tato sekvence IE projevuje plně ochranný účinek celého CpG ostrova, ale liší se v několika znacích. Pozorovaná stabilizace exprese reportérového genu byla významně závislá na poloze IE v LTR. IE vložený na začátku U3 úseku měla menší účinek, ale vložení mezi virové zesilovače a promotor vedlo k velmi účinné ochraně před umlčením.

io

Původci nemají k dispozici přesné údaje o síle promotorů LTR modifikovaných vložením IE, ale odhad expresní hladiny reportéru na základě FACS analýzy (Obr. 2) ukazuje, že mezi variantami LTR RSV jsou zanedbatelné rozdíly. Tato data jsou v rozporu s účinkem izolačních prvků definovaných jako sekvence schopné bránit vnějším zesilovačům v ovlivňování promotorů. Rozsah antimethylačního účinkuje omezen na přibližně 150 bp od IE (Hejnar et al., 2001). Tím by mohl být vysvětlen slabý nebo žádný ochranný účinek IE vložené upstream od enhanceru a nej lepší ochranný účinek IE vložené mezi enhancer a promotor. Oba transkripční regulátory jsou takto v dosahu účinku IE. Poloha 89 bp upstream od počátku transkripce se nejvíce blíží poloze IE v genu aprt křečka, 107 bp upstream od počátku transkripce. Tato vzdálenost je pravděpodobně příznivá pro zachování transkripčně účinného promotoru. Na rozdíl od úplného CpG ostrova myši je účinek IE orientace pouze slabý.

Úloha Spi vazebných míst vantimethylační schopnosti CpG ostrovů byla popsána (Macleod etal., 1994; Brandeis etal., 1994), přesný mechanismus jejich působení není ale znám. Původci testovali účinek Spi mutací ve třech modifikovaných LTR. Ve všech třech vektorech mutace Spi místa významně zvýšila umlčení proviru v průběhu dlouhodobé kultivace a zrušila tak ochranný účinek vložené IE. Zvláště vektor RNIG3-MIE byl umlčen ještě účinněji než vektor s nemodifikovaným LTR. To bylo pravděpodobně způsobeno nahromaděním CpG dinukleotidů, které jsou, bez závislosti (ohledu) na Spi místech, cílovými místy DNA methyltransferáz. Na druhé straně, nej stálejší vektor RNIG2-IE si zachoval část ochranné schopnosti proti umlčení i s mutovaným Spi místem. To ukazuje, že Spi vazebné místo se podílí na ochranné schopnosti IE proti umlčení, ale není jediným cís-pů sobicím prvkem.

Reaktivační experimenty vedly ke zjištění, že umlčení vektoru bylo spojeno s DNA methy laď a/nebo deacetylací histonů, jak bylo podrobně popsáno v experimentech s lentivirovými vektory (Heetal., 2005).

Účinné umlčení vektorů založených na ASLV bylo popsáno v buňkách hlodavců. Kvůli ověření relevance těchto výsledků i v lidských buňkách původci provedli experimenty paralelně s buněč40 nou linií HEK 293. Získané výsledky jsou v podstatě stejné jako výsledky získané pro NIL-2 buňky pro všechny vektory s modifikovaným 5 LTR, ale umlčení vektoru divokého typu RNIG bylo pomalejší a, tudíž, ochranné účinky vložené IE byly méně vyjádřené.

Transkripční umlčení je hlavní překážkou použití retrovirových a len ti virových vektorů při pře45 nosu genů a genové terapii (Ellis, 2005). Strategie antimethylační ochrany vektorů založených na ASLV pomocí centrální sekvence CpG ostrova ukazuje, že je možné připravit retrovirový vektor úplně odolný proti umlčení. Vektor nebo způsob podle vynálezu se proto jeví jako kdykoli ihned použitelné, např. když se užívají RCAS vektory v savčích buňkách, a mohou se stát základem optimalizované konstrukce vektorů.

- 10CZ 300377 B6

Příklad 2: Materiály a postupy použité ve studii Konstrukce retrovirových vektorů

Pro přípravu série konstruktů použitých v tomto experimentu byly použity plazmidy pLPCX, pLXRN, pIRES2-EGFP (všechny Clontech, Mountain View, CA) a pH19KE, Gen rezistence kneomycinu (neo^r) jako 1,419 bp £g/II - £c<?RV fragment z plazmídu pLXRN byl vložen do mnohonásobného klonovacího místa pIRES2-EGFP štěpeného s BglXX a 5/nal, čímž byl získán pN-IRES-G. Konstrukt pRMR byl vytvořen ligací 3,445 bp BstEll-BalX fragmentu pH19KE io nesoucího LTR RSV a 2,548 bp PsňAI-PvwII vnitřního fragmentu pLPCX. Kazeta obsahující neo^r, IRES a EGFP, 2,864 bp £co47IIl - HpaX fragment pN-IRES-G, pak byla ligována do 4,579 bp hlavního fragmentu pRMR štěpeného SmaX &Xho\. Výsledný retrovirový vektor pRNIG (Obr. 1 A) byl použit pro konstrukci všech inzerčních variant LTR RSV. Vektor pMNIG byl připraven ligací 3,509 bp BstE II - Cla I kazety neo^r, IRES a EGFP z pRNIG a 4,458 bp Zřs/EII 15 ClaX LTR fragmentu z pLPCX. 5' a 3' LTR sekvence v pLPCX pocházejí zMoIoneyho viru myší leukemie a jeho replikačně-defektního derivátu Moloneyho viru myšího sarkomu virus, v uvedeném pořadí. Menší rozdíly v sekvencích těchto LTR umožnily rozlišit klonovanou plazmidovou retrovirovou DNA od provirové DNA, která prošla reverzní transkripcí.

Tři jedinečná restrikční místa byla vnesena do LTR sekvencí pRNIG pomocí in vitro mutageneze (viz níže). Do 3 LTR bylo vneseno BsiWI místo v poloze -226 upstream od transkripčního počátku a £s?Z17l místo v poloze -89 a do 5'LTR bylo vneseno HpaX místo v poloze +27. Jedinečná restrikční místa byla použita pro vložení centrální sekvence IE. PRNIG 1+1E a pRNIG 1 —IE byly připraveny vložením IE do HpaX místa v sen se a anti-sense orientaci, v daném pořadí.

PRNIG2 nebo pRNIG3 varianty byly připraveny analogicky vložením IE do £s/Zl71 nebo BsíWX místa, v daném pořadí. PRNIG2-2IE varianta byla připravena analogicky vložením dvou kopií IE do £tfZ17I místa v anti-sense orientaci (Obr. IC). Vektory s vloženou IE obsahující mutovaná Spi vazebná místa (viz níže) byly nazvány RNIG3+MIE, RNIG3-MIE a RNIG2-MIE. Místa inzerce a orientace IE byla potvrzena pomocí DNA sekvencování.

Příprava IE

Centrální sekvence (IE) CpG ostrova aprt genu (45) byla připravena pomocí „genotvomé“ PCR („gene assembly PCR“) s použitím osmi oligonukleotidů:

1F: 5'-agtcgtatactccagcaaatgcgttacttcctgcc-3',

2F: 5'-aaaagccagcctccccgcaacccac-3',

3F: 5'-tctcccagaggccccgccccgtccc-3',

4F: 5'-gccccctcccggcctctcctcgtgctgg-3\

IR: 5'-tgcggggaggctggcttttggcagg-3',

2R: 5'-gggcggggcctctgggagagtgggt-3',

3R: 5'-cgaggagaggccgggagggggcgggacg-3' a

4R: 5'-atgcgtatactccttagggagcgatccagca-3'.

- 11 CZ 300377 B6

Tyto oligonukleotidy byly kombinovány do dvojic, 1F+1R, 2F+2R, 3F+3R a 4F+4R ve čtyřech reakcích, 1 -4, vdaném pořadí. Podmínky cyklování byly následující: 96 °C po dobu 2 minut, 4 cykly 95 °C po dobu 40 s, 70 °C po dobu 10 s, 0,3 °C/s pokles na 25 °C a noc po dobu 1 minuty, a 35 cyklů; 95 °C po dobu 30 s, 54 °C po dobu 30 s a 72 °C po dobu 30 s, závěrečná extenze v 72 °C po dobu 3 minut. Produkty reakce 1 a 2 byly smíchány a byla připravena PCR s primery 1F a 2R. Reakce 3 a 4 byly provedeny analogicky s primery 3F a 4R. Podmínky PCR byly následující: 96 °C po dobu 2 minut a 35 cyklů: 95 °C po dobu 30 s, 50 °C po dobu 30 s a noc po dobu 40 s, závěrečná extenze v noc po dobu 5 minut. Produkty těchto dvou reakcí byly smíchány do jedné reakce a byla provedena PCR v podmínkách použitých v předchozí PCR io s primery 1F a 4R, kterážto reakce poskytla 142 bp produkt s£s/Z171 restrikčním místem na každém konci. Pro přípravu IE s BsiWI restrikčními místy byla provedena PCR konečného produktu s primery lFb: 5'-agtccgtacgtccagcaaatgcgttacttcctgc-3' a

4Rb: 5'-agtccgtacgtccttagggagcgatccagc-3'.

Místně-cílená mutageneze

Všechny experimenty s místně cílenou mutagenezí byly provedeny pomocí soupravy „Transformer site-directed mutagenesis“ (Clontech, Mountain View, CA) podle protokolu výrobce. Syn20 tetizovaný fragment IE byl klonován do vektoru pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI).

Pro mutaci Spi vazebných míst byl použit mutagenní primer:

5'- ctcccagaggcccattcccgtcctttcccctcccggc-3', který také sloužil jako selekční primer. Selekce byla provedena pomocí restriktázy Drali. Pro vnesení jedinečného klonovacího místa do pRNIG konstruktu byl použit mutagenní primer:

5'-ggaaatgtagtcgtacgcaatactcctg-3' pro vnesení Ks/WI místa, mutagenní primer:

5'-cttattaggaaggtatacagacgggtc~3' pro vnesení BstZA 71 místa a mutagenní primer:

5'- acattggtgttaacctgggttg-3' pro vnesení Hpal místa.

Selekce vektorů s novými místy byl prováděna střídavým použitím dvou selekčních primerů, selekčního primeru ScoI/Bg/II;

5'-gtgactggtgagatctcaaccaag-3' a reselekčního primeru Bg/II/Scal:

5'-gtgactggtgagtactcaaccaag~3'.

- 12 CZ 300377 B6

Buněčné kultury

Balicí linie GP293 (Clontech, Mountain View, CA) byla udržována v médiu D-MEM/F12 (Sigma, St Louis, MO) s přídavkem 5% telecího séra novorozených telat, 5% fetálního telecího séra (obojí Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) a penicilinu/streptomycinu (100 mg/ml každý). Linie lidských zárodečných ledvinových buněk HEK293, linie křečcích fibroblastoidů NIL-2, linie methy lcholanthrenem transformovaných křepelčích buněk QT6 a buněčná linie kuřecích fibroblastů DF1 byly udržovány v médiu D-MEM/F12 s přídavkem 5% telecího séra novorozených telat, 2% fetálního telecího séra (obojí Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) a pěnicilinu/io streptomycinu (100 mg/ml každý). Tkáňové kultury byly kultivovány ve 37 °C v atmosféře s 3% CO₂. V reaktivačních experimentech byly užity 5-AzaC a TSA pro ošetření buněk pomocí 4 μΜ

5-azaC (Sigma) a 0,5 μΜ nebo 1 μΜ TSA (Sigma) po dobu 4 dnů.

Množení vektorů

Vektory MNIG a RNIG a jejich modifikace byly množeny transfekcí plazmidové DNA obsahující provirové formy reportérových vektorů společně s plazmidem pVSV-G (Clontech, Mountain View, CA) do GP293 buněk. GP293 buňky v množství 1,5 χ 10⁷ byly nasazeny na 140 mm Petriho misky. Po 24 hodinách byly buňky kotransfekovány 10 pg pVSV-G a 50 pg vektorového plazmidu. Kotransfekce byla provedena pomocí precipitace s fosforečnanem vápenatým. Kultivační médium obsahující vektorové částice bylo sebráno 1, 2 a 3 dny po transfekci. Sebrané virové roztoky byly centrifugovány při 200 x g po dobu 10 minut ve 4 °C. Supernatant byl sebrán a stočen při 24 000 rpm po dobu 2 hodin a 30 minut ve 4 °C v rotoru SW28, Beckman Optima 100 (Beckman, Fullerton, CA). Pelet byl resuspendován v kultivačním médiu s 10% telecím sérem novorozených telat, zmražen a skladován v -80 °C. Titrace infekčních virových částic se prováděla sériovým ředěním virového roztoku a následnou infekcí DF1 buněk. V opakovaných pokusech vektory s modifikovanými a nemodifikovanými LTR dosahovaly podobných titrů v rozsahu 2x 10⁴ - 10⁵ IU/ml. Dvacet čtyři hodin po infekci bylo přidáno 400 pg/ml G418 (Sigma, St Louis, MO) a buňky byly selektovány po dobu 15 dnů. Po selekci byl vyhodnocen počet G41830 resistentních kolonií.

Transdukce buněk a FACS analýza

Buňky byly vysety na Petriho misky v množství 5 χ 10⁵ buněk na 60 mm misku a po 5 hodinách bylo přidáno 200 pl virové suspenze s 15 pg/ml polybrenem a bylo ponecháno adsorbovat po dobu 40 minut při teplotě místnosti. Po adsorpci bylo přidáno Čerstvé médium do 4 ml a buňky byly umístěny ve 37 °C a 3% CO₂. Dvacet čtyři hodin po infekci byla zahájena selekce s 400 pg/ml G418 (Sigma) a selekční médium bylo měněno každé dva nebo tři dny. Po 15 dnech selekce byl G418 odebrán. V týdenních intervalech byly buněčné kultury analyzovány pomocí cytometru LSR II (Becton-Dickinson, San Jose, CA) a byly vyhodnocena frekvence GFP⁺ buněk. Ve specifických intervalech byly kultury tříděny použitím zařízení FACS Van tage SE (BectonDickinson) podle přítomnosti nebo nepřítomnosti GFP exprese. V případě klonální FACS analýzy byly buněčné klony získány limitním ředěním transdukovaných buněčných kultur.

Analýza methylace

Genomová DNA izolovaná z infikovaných buněk byla ošetřena disiřičitanem sodným pomocí soupravy EpiTect (Qiagen, Hilden, Německo) podle protokolu výrobce. „Semi-nested“ PCR horního vlákna byla provedena s primery komplementárními k U3 úseku LTR RSV a vedoucímu („leader“) úseku (Obr. 5b) obsahující až najeden všechny CpG v LTR. Sekvence primerú byly následující:

- 13CZ 300377 B6

5'-gttttataaggaaagaaaag-3‘ (horní),

5'-aacccccaaataaaaaacccc-3' (spodní-vnitřní) a

5'-aaacaaaaatctccaaatcc-3' (spodní-vnější).

PCR reakce byly provedeny s 200 ng DNA v 25 cyklech: 95 °C po dobu 1 minuty, 58 °C po dobu 2 minut a 72 °C po dobu 90 s. PCR produkty byly klonovány do vektoru pGEM-T Easy (Prome5 ga) a sekvencovány pomocí univerzálních primerů pUC/M 13.

Seznam citované literatury

Patentové dokumenty

US 7 232 654 WO 91/02805 EP0 801 575 2006/0153810

US 5 814 493 WO 01/48229 WO 2007/111968

Ostatní literatura

Barsov, LV., and S.H. Hughes. 1996. Gene transfer into mammalian celíš by a Rous sarcoma virus-based retroviral vector with the host range of the amphotropic murine leukemia virus. J. Virol. 70:3 922-3 929.

Brandejs M., D. Frank, I. Keshet, Z. Siegfried, M. Mendelsohn, A. Nemes, V. Temper, A. Razin,

H. Cedar. 1994. Spi elements protéct a CpG island from de novo methylation. Nátuře 371:435-8.

Ellis, J. 2005. Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors. Human Gene Ther. 16: 1 241-1246.

Federspiel, M.J., and S.H. Hughes. 1994. Effects of the gag region on genome stability: avian retroviral vectors that contain sequences from the Bryan stťain of Rous sarcoma virus. Virology

203:211-220.

Federspiel, M.J., D.A. Swing, B. Eagleson, S.W. Reid, and S.H. Hughes. 1996. Expression of transduced genes in mice generated by infecting blastocysts with avian leukosis virus-based retroviral vectors. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 4 931-4 936.

He J., Q. Yang, and L.J. Chang. 2005. Dynamic DNA methylation and histone modifications contribute to lentiviral transgene silencing in murine embryonic carcinoma cells. J. Virol. 79:13 497-508.

Hejnar, J., J. Svoboda, J. Geryk, V.J, Fincham, and R. Hák. 1994. High rate of morphological reversion in tu mor cell line H-19 associated with permanent transcriptional suppression of the LTR, v-src, LTR provirus. Cell Growth Differ. 5: 277-285.

Hejnar, J., P. Hájková, J. Plachý, D. Elleder, V. Stepanets, and J. Svoboda. 2001. CpG island protects Rous sarcoma virus-derived vectors integrated into nonpermissive cells from DNA methylation and transcriptional suppression. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 98: 565-569.

Himly, M., D.N. Foster, I. Bottoli, J.S. Iacovoni, and P.K. Vogt. 1998. The DF-1 chicken fibroblast cell line: transformation induced by diverse oncogenes and cell death resulting from infec45 tion by avian leukosis viruses. Virology 248:295-304.

Hoeben, R.C., A.A. Migchielsen, R.C. van der Jagt, H. van Ormondt, and A.J. van der Eb. 1991. Inactivation of the Moloney murine leukemia virus long terminál repeat in murine fibroblast cell

- 14CZ 300377 B6 lineš is associated with methylation and dependent on its chromosomal position. J. Virol. 65: 904-912.

Lorincz, M.C., D. Schuebeler, S.C. Goeke, M. Walters, M. Groudine, and D.I.K. Martin. 2000. Dynamic analysis of proviral induction and De Novo methylation: implications for a histone deacetylase-independent, methylation density-dependent mechanism of transcriptional repression. Mol. Cell. Biol. 20: 842-850.

Macleod, D, J. Charlton, J. Mullins, A.P. Bird. 1994. Spi sites in the mouše aprt gene promotér are required to prevent methylation of the CpG island. Genes Dev. 8: 2 282-92.

Mok, H.P., S. Javed, and A. Lever. 2007. Stable gene expression occurs from a minority of integrated HIV-1—based vectors: transcriptional silencing is present in the majority. Gene Ther.l4:741-751.

Narezkina, A., K.D. Taganov, S. Litwin, R. Stoyanova, J. Hayashi, C. Seeger, A.M. Skalka, and R.A. Katz. 2004. Genome-wide analyses of avian sarcoma virus integration sites. J. Virol. 78:11 656-11 663.

Osten P, Grinevich V, Cetin A. 2007. Viral vectors: a wide range of choices and high levels of Service. Handb. Exp. Pharmacol. 178: 177-202.

Reinišová, M., A. Pavlíček, P. Divina, J. Geryk, J. Plachý, and J. Hejnar, 2008. Target site preferences of subgroup C Rous sarcoma virus integration into the chicken DNA. The Open Genomics J. 1:6-12.

Rivella, S., J.A. Callegari, C. May, C.W. Tan, and M. Sadelain. 2000. The cHS4 insulator increases the probability of retroviral expression at random chromosomal integration sites. J. Virol. 74: 4 679-4 687.

Searle, S., D.A. Gillespie, D.J. Chiswell, and J.A. Wyke. 1984. Analysis of the variations in proviral cytosine methylation that accompany transformation and morphological reversion in a line of Rous sarcoma virus-infected Rat-1 cells. Nucleic Acids Res. 12:5 193-5 210.

Siegfried, Z., S. Eden, M. Mendelsohn, X. Feng, B.Z. Tsuberi, and H. Cedar. 1999. DNA methylation represses transcription in vivo. Nat. Genet, 22: 203-206.

Suzuki MM and Bird A. 2008. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nat. Rev. Genet. 9: 465-476.

Svoboda, J, J. Hejnar, J. Geryk, D. Elleder, and Z. Vemerová. 2000. Retroviruses in foreign species and theproblem of provirus silencing. Gene 261:181-188.

Swindle, C.S., H.G. Kim, and C.A. Klug. 2004. Mutation of CpGs in the murine stem cell virus retroviral vector long terminál repeat represses silencing in embiyonic stem cells. J. Biol. Chem. 279: 34-41.

Yannaki, E., J. Tubb, M. Aker, G, Stamatoyannopoulos, and D.W. Emery. 2002. Topological constraints goveming the use of the chicken HS4 chromát i n insulator in oncoretrovirus vectors. Mol. Ther. 5: 589-598.

Zhang X and Godbey WT. 2006. Viral vectors for gene delivery in tissue enginering. Adv. Drug Deliv. Rev. 58:515-534.

Zhang, F., S.l. Thomhill, S.J. Howe, M. Ulaganathan, A. Schambach, J. Sinclair, C. Kinnon, H.B. Gaspar, M. Antoniou, and A.J. Thrasher. 2007. Lenttviral vectors contaíning an enhancerless ubiquitously-acting chromatín opening element (UCOE) provide highly reproducible and stable transgene expression in haematopoietic cells. Blood 110: 1 448-1 457.

-15CZ 300377 B6

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Regulační genový element obsahující promotor/zesilovač chráněný před methylací DNA a umlčením genové exprese, kterýžto element obsahuje modifikovanou retrovirovou sekvenci (LTR), kde do libovolného místa LTR je vložena jedna nebo dvě centrální sekvence IE v libovolné orientaci, přičemž IE má sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 2.

   io
2. 2. Regulační genový element podle nároku 1, kde alespoň jedna centrální sekvence IE je vložena v poloze mezi promotorovou sekvencí a zesilovačem.
3. 3. Regulační genový element podle nároku 1 nebo 2, obsahující modifikovanou sekvenci 15 (LTR) viru Rousova sarkomu s vloženým tandemem sekvencí IE, výhodně v sen se orientaci, výhodněji v anti-sense orientaci, nej výhodněji v anti-sense orientaci v poloze -89 od počátku transkripce.
4. 4. Vektor obsahující alespoň jeden regulační genový element podle kteréhokoliv z nároků 1 až

   20 3 a alespoň jeden gen, který má být exprimován v cílové buňce, a dále terminátorové sekvence a případně další sekvence, přičemž všechny sekvence jsou operativně spojeny tak, že transkripce genu, který má být exprimován v cílové buňce, je řízena regulačním genovým elementem.
5. 5. Vektor podle nároku 4, kterým je retrovirový vektor, výhodně vektor na bázi ASLV.
6. 6. Způsob zabránění methylace promotoru/zesilovače a transkripčnímu umlčení genu, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se ve vektoru, který obsahuje retrovirový LTR obsahující promotor/zesilovač operativně spojený s genem, který má být exprimován v hostitelské buňce, modifikuje oblast promotor/zesilovač tak, že se do libovolného místa LTR

   30 vloží jedna nebo dvě centrální sekvence IE v libovolné orientaci, přičemž IE má sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 2.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že alespoň jedna sekvence IE je vložena v poloze mezi promotorovou a zesilovací sekvencí.
8. 8. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že sekvence LTR viru Rousova sarkomu se modifikuje vložením tandemu sekvencí IE, výhodně v sen se orientaci, výhodněji v anti-sense orientaci, nej výhodněji v anti-sense orientaci v poloze -89 od počátku transkripce.
9. 9. Buňka obratlovce, výhodně savce, obsahující vektor podle nároku 4 nebo 5.
10. 10. Transgenní organizmus, s výjimkou člověka, obsahující buňku podle nároku 9,

    5 výkresů

    - 16CZ 300377 B6

    Obr. 1

    A RNIG | h

    LIR PBS ψ !Mď IRtS tOP PPI VIR

    MNÍC

    i lK PH$ ψ

    IR KS KGKP PPI I.TR

    RSV I.TR rn MMLV LI R atgtagctgacctc-agc.aaatgflttt.T.acttcct-.gccaaaagízcaaectcci-.flacaac^cac-c-cccaqag | gÍ.’cc£gm.c^tcÍ;atccm|ctccflgg^ctctuctaazqL’tgqdtfigt:tccctaavgii(;gtgaccutt^t

    Spi Spi substituce mutSpl)

    V3 R

    V5

    RNIGH1E

    ΓΈ

    DniWI 0MZ17I

    PBS Ψ

    RN1G1-IE

    1-1BtiWl

    PBS Ψ

    RNIG2UE

    BtiWI vp

    Hpat

    PBS ψ

    RNIG2-IF

    IE

    B»,Wl q=

    HpoJ

    PBS ψ

    RNIG2-21F.

    RNIG3UE

    RNIG3-IF.

    I

    IKUZ17I Hpol

    PBS ψ

    - 17CZ 300377 B6

    Obr. 2

    RNIG RNIG2-2IE

    NIL-2

    HEK 293

    QT6

    - 18CZ 300377 B6

    Obr. 3

    GFP+ (%) GFP+ (%) GFP+ (%)

    0 7 14 21 28 36 42 49 57 64 70 78 84

    0 7 14 21 28 36 42 49 57 64 70 78 84

    80 - 60 - -S-RNIG ♦ RMG2-IE 40 -«-RNIG2-MIE ^RNtG3+IE 20 A . -*-RRG3-ie -«-RNIG3+MIE -ή-RNIG3-MIE

    0 7 14 21 28 36 42 49 57 64

    Dny po odstranění G418

    - 19CZ 300377 B6

    Obr. 4

    -20CZ 300377 B6

    Obr. 5

    U3 |r| us I »ο-«κ>ο<» oo ooooo

    RNIG3-IE (30% GFP+) 62 dnů po selekci 49% mCpG

    RNIG(4%GFP+) 64 dnů po selekci 88% mCpG

    RNIG Í99% GFP+) 64 dnů po selekci 2% mCpG

    I IE | IE | U3 |r| U5 |

    RNIG2-2IE (99.8% GFP+) 62 dnů po selekci 1,6% mCpG um mmu u um

    OMXXXW-OOOWOOOOCO-O l^Rl « I

    RNIG2-2IE (99.7% GFP+) 38 dnů po selekci 4% mCpG

    RNIG3-MIE (28% GFP+)

    21 dnů po selekci 19% mCpG

    RNIG (15% GFP+) 21 dnů po selekci 28% mCpG

    Konec dokumentu