CZ298177B6

CZ298177B6 - Zpusob tvorby klonu Crataegus sp. s overenými biologickými vlastnostmi a rezistentním chováním k Erwinia amylovora

Info

Publication number: CZ298177B6
Application number: CZ20070119A
Authority: CZ
Inventors: Mertelík@Josef; Kloudová@Katerina
Original assignee: Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v. v. i.
Priority date: 2007-02-14
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2007-07-11
Also published as: CZ2007119A3

Abstract

Podstatou resení je originální zpusob pouzití metodických postupu, který umoznuje tvorbu klonu Crataegus sp. s overenými biologickými vlastnostmi a rezistentním chováním k Erwinia amylovora (EA). Zpusob zahrnuje postupy pro výber donorových rostlin,odvození primokultury in vitro, mikropropagaci invitro, prevedení regenerantu do ex vitro, pestování mladých rostlin in vivo, laboratorní testy rezistence k EA, výsadbu mladých klonových rostlin in situ, overení biologických vlastností a hodnocení polní rezistence, uchovávání matecných klonu v podmínkách in vitro.

Description

Podstatou řešení je originální způsob použití metodických postupů, který umožňuje tvorbu klonů Crataegus sp. s ověřenými biologickými vlastnostmi a rezistentním chováním k Erwinia amylovora (EA). Způsob zahrnuje postupy pro výběr donorových rostlin, odvození primokultury in vitro, mikropropagaci in vitro, převedení regenerantů do ex vitro, pěstování mladých rostlin in vivo, laboratorní testy rezistence ' k EA, výsadbu mladých klonových rostlin in sítu, ověření biologických vlastností a hodnocení polní rezistence, uchovávání matečných klonů v podmínkách ín vitro.

Způsob tvorby klonů Crataegus sp. s ověřenými biologickými vlastnostmi a rezistentním chováním k Erwinia amylovora

Oblast techniky

Vynález se týká unikátního systému ochrany rostlin z čeledi růžovitých proti infekci karanténní bakterií Erwinia amylovora (Burrill) jako původci významné choroby „spála růžovitých rostlin.

Dosavadní stav techniky

V roce 1986 (Kůdela, 1988) byl v ČR zaznamenán první výskyt významné choroby nazvané podle projevů a hostitelů „spála růžovitých rostlin“ - původce Erwinia amylovora (Burrill) - (EA). Tato nebezpečná karanténní infekce se do současnosti rozšířila na většinu území ČR. Způsoby 15 šíření bakteriálních buněk EA, tzv. propagulí (forma slizovítého exsudátu, vzdušné provazce) mohou být velice různorodé - vítr, déšť, hmyz, ptactvo, dopravní koridory a pod. (Kůdela, 1990). Nejvýznamnější způsob pasivního šíření EA je přemisťování infikovaných rostlin nebo jejich částí v rámci vegetativní reprodukce a obchodu s rostlinným materiálem.

Výskyt EA byl ve světě prokázán zhruba na 200 druzích rostlin z čeledi růžovitých (Kůdela, 1990\ v ČR je naprostá většina výskytů vázána na rod Crataegus.

Hloh (Crataegus sp.) je ekologicky významná dřevina, která pomáhá vytvářet vhodné prostředí pro řadu bylinných druhů rostlin, slouží jako úkryt i potrava pro drobné živočichy, je včelařsky 25 významná a léčivá rostlina. Jedná se o jeden z nejrozšířenějších rodů dřevin v květeně ČR, je významný zejména na vysychavých stanovištích a vyskytuje se velmi často i v krajině člověkem značně pozměněné - tedy v lemových porostech lesů, na mezích, navážkách a na ruderálních plochách.

V podmínkách ČR je rod Crataegus nej významnější z hlediska dlouhodobé perzistence EA a tudíž zdrojem infekce pro ostatní hostitele z čeledi růžovitých, zejména pro produkční ovocné dřeviny. Z těchto důvodů bylo v rámci eradikačních opatření uplatňovaných Státní rostlinolékařskou správou jen do roku 1997 vyklučeno více než 25 tis. keřů hlohů (Korba et al., 1998), tato opatření se negativně promítla do biologické rozmanitosti společenstev se zastoupením hlohů.

V rámci nového zákona bylo od roku 2004 od eradikace infikovaných rostlin v přirozených společenstvech ustoupeno s výjimkou okolí produkčních ploch hostitelských ovocných dřevin. Omezením eradikace byla sice zastavena přímá devastace biotopů hlohů, ale na druhou stranu však dochází ke zvyšování infekčního tlaku patogena (EA) a tím ke zvyšování rizika lokálního šíření infekce a intenzity poškození těchto porostů. Vývoj tohoto stavu mohou výrazně negativně ovliv40 nit také nové výsadby hlohů náchylných k EA.

U Crataegus sp. se choroba projevuje rychlou spálou letorostů a brachyblastů, někdy až celých větví, přičemž intenzita poškození v jednotlivých letech může kolísat. Počáteční přímá škodlivost pro vitální rostliny hlohů nebyla velká a význam vazby EA na tento taxon spočíval převážně 45 v tvorbě rezervoárů infekce v krajině. Zvrat patosy stému nastal v roce 2004 kdy bylo poprvé zaznamenáno komplexní poškození hlohů nevratného charakteru a tudíž vlastní ohrožení stavu taxonu. Tento vývoj způsobily interakce silného projevu infekce EA s dalšími bionózami a abionózami, přičemž velmi výraznou predispozici vytváří vývoj průběhu počasí. V současné době je poškození u některých keřů zejména na vysychavých pro hloh typických stanovištích dost 50 výrazné v podobě spálových příznaků infekcí EA, proschnutí koruny od její periferie, vysoké fruktifíkace, minimalizace tvorby letorostů. Tento cyklus poškození se opakuje a v řadě sledovaných případů už dospěl až k celkovému odumření keře. Pokračování tohoto vývoje může vést k poklesu biologické rozmanitosti rostlinných společenstev v ekosystémech, kde má hloh nezastupitelnou úlohu.

- 1 CZ 298177 B6

Přímá účinná ekologicky příznivá ochrana hostitelských rostlin proti EA není doposud známa. Velmi účinnou možností je využití zdrojů přirozené rezistence k EA (Patáková, Korba, 2000), která již byla v ČR u hlohu Crataegus sp. prokázána.

Systémové vyhledávání zdrojů rezistence k EA v přirozených společenstvech, využití metod množení in vitro pro vytvoření klenového potomstva a laboratorní testy pro ověření rezistence získaných klonů k EA nebylo u hlohů ve světě prováděno. Repatriace a reintrodukce klonových rostlin hlohů rezistentních k EA v laboratorních testech do přirozených společenstev hlohů pro ověření polní rezistence k EA a vyhodnocení jejich biologických vlastností ve světě rovněž nebylo prováděno.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je originální způsob použití metodických postupů, který umožňuje tvorbu klonů Crataegus sp. s ověřenými biologickými vlastnostmi a rezistentním chováním k Erwinia amylovora (EA).

Způsob zahrnuje postupy pro výběr donorových rostlin, odvození primokultury in vitro, mikropropagaci in vitro, převedení regenerantů do ex vitro, pěstování mladých rostlin in vivo, laboratorní testy rezistence k EA, výsadbu mladých klonových rostlin in sítu, ověření biologických vlastností a hodnocení polní rezistence, uchovávání matečných klonů v podmínkách in vitro v genobance VÚKOZ, v.v.i.

Příklady provedení vynálezu

Na lokalitě s přirozenými společenstvy hlohů (Crataegus sp.) byl na základě sledování vývoje infekce Erwinia amylovora (EA) prováděného v období 1994—2006 vybrán keř hlohu jako donorová rostlina pro založení primární kultury in vitro. Tento keř v průběhu celého sledování nebyl ’ napaden EA a vykazoval dobrý růst a vývoj. Výskyt infekce EA na sledované lokalitě byl v jednotlivých letech u napadených keřů prokazován laboratorně.

Z donorového keře byly odebrány jednoleté výhony jejichž apikální i axilámí pupeny byly použity pro založení primární kultury in vitro. Primární kultura in vitro byla založena na modifikovaném WPM médiu zpevněném agarem o koncentraci 7,5 g. 1-1 s přídavkem 0,5 mg. 1-1 benzyladeninu, 20 g. 1-1 sacharózy a vitaminů. Pěstování probíhalo v 16-hod fotoperiodě, při teplotě 22 °C. Odvozená kultura byla postupně multiplikována in vitro, byly z ní odebrány vrcholové řízky, které byly zakořeněny v propařeném množářenském substrátu v podmínkách in vivo v kultivačním boxu. Po dosažení velikosti cca 10 cm byly mladé klonové rostliny umístěny do kójového skleníku, postupně nahrnkovány do rašelinového substrátu typu A a dopěstovány v pařeništích do velikosti cca 20 - 40 cm. Klonové rostliny s velikostí výhonů cca 20 cm byly v počtu 10-20 kusů předány do specializované bakteriologické laboratoře na provedení testů rezistence k EA. Laboratorní testy byly provedeny metodou inokulace dekapitováných výhonů kapkou suspenze směsi kmenů EA, rezistence byla stanovena podle stupnice USDA (Korba et al„ 1998; Mohan et al., 2002).

Mladé rostliny klonu s rezistencí prokázanou v laboratorních testech byly repatriovány na lokalitu jejich původu do okolí jejich donorové rostliny. Současně byly také reintrodukovány na další čtyři lokality v různých oblastech ČR s přirozenými společenstvy hlohů (Crataegus sp.) dlouhodobé zamořenými EA. Na všech pět lokalit byly současně s klonovými rostlinami vysazeny také semenáčky hlohů ve velikosti odpovídající klonovým rostlinám. Hodnocení probíhalo v období 2002 - 2006. U mladých klonových rostlin, kontrolních semenáčků i přirozeně rostoucích keřů byl sledován výskyt příznaků EA, vzorky s podezřelými příznaky byly vždy laboratorně analyzovány standardními metodami na přítomnost EA.

-2CL 47011l HO

Výskyt infekce EA na přirozeně rostoucích keřích hlohu s příznaky spály na pěti sledovaných lokalitách byl v jednotlivých letech vždy prokazován laboratorními testy. Šíření EA do nových výsadeb na lokalitě bylo prokázáno detekcí EA v některých rostlinách kontrolních semenáčků. U klonových rostlin byl současně hodnocen celkový růst a vývoj a porovnáván s růstem a vývojem kontrolních semenáčků, donorové rostliny a ostatních přirozeně rostoucích keřů hlohu na lokalitě.

U klonových rostlin nebylo v pěti vegetačních obdobích v přirozených podmínkách infekčního tlaku EA na lokalitě prokázáno napadení EA a současně byl ověřen jejich dobrý růst a vývoj. U klonových rostlin byla tímto prokázána i polní rezistence k EA při současném zachování biologických vlastností.

Klon vykazující stabilitu požadovaných znaků se stává matečným klonem a je uchováván v podmínkách in vitro v genobance VÚKOZ, v.v.i; Průhonice.

Průmyslová využitelnost

Použití klonových rostlin hlohů (Craiaegus sp.) s ověřenými biologickými vlastnostmi a rezistentním chováním k Erwinia amylovora (EA) do nových výsadeb je nej efektivnější způsob preventivní ochrany před touto karanténní bakteriální infekcí.

Z hlediska samotného rodu Crataegus umožní tyto klonové rostliny realizaci nových výsadeb s minimalizací rizika jejich devastace, ztráty biologické funkčnosti a užitné hodnoty. Z epidemiologického hlediska umožní tyto výsadby snížení rezervoárů infekce EA v krajině a snížení zdrojů inokula EA pro ostatní hostitelské rostliny z čeledi růžovitých na lokalitě.

Uvedeným způsobem vytvořené klonové rostliny proto řeší problém výsadeb hlohů zejména v ochranných zónách produkčních celků Pyrus a Malus, v městské zeleni a v opláštění plantáží rychle rostoucích dřevin.

Seznam citované literatury.

KŮDELA V. (1988): Erwinia amylovora, původce spály růžovitých rostlin v Československu. Sbor, ÚVTIZ-Ochr. Rostlin., 24:173 - 182.

KŮDELA V. (1990): Spála růžovitých rostlin. Ministerstvo zemědělství a výživy ČSR. Agrodat, ISBN 80-7084-018-8, 163 s.

KORBA J., PATÁKOVÁ S-, KŮDELA V. (1998): Rezistence hlohů ke spále růžovitých rostlin. Plant Protection Science, 34:53-58.

MOHAN, S.K., FALLAHI, E. AND BIJMAN, V.P. (2002): Evaluation of Apple Varieties for Susceptibility to Erwinia amylovora by Artificial Inoculation under Field Conditions. Acta Hort. (1SHS) 590:373-375

PATÁKOVÁ S., KORBA J. (2000): Stanovení stupně rezistence odrůd jabloní a hrušní ke spále růžovitých rostlin. Sborník referátů z XV. České a Slovenské konference o ochraně rostlin, Brno, 2000, p. 36-37

-3CZ Z9B177 Βΰ

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

5 1. Způsob tvorby klonů Crataegus sp. s ověřenými biologickými vlastnostmi a rezistentním chováním kErwiniaamylovora(Burrill) (EA), vyznačující se t í m ,že

a) na lokalitě s přirozenými společenstvy hlohů (Crataegus sp.) dlouhodobě zamořené EA se vybere keř hlohu nenapadený EA a s dobrým růstem a vývojem jako donorová rostlina pro
10 založení primární kultury in vitro,

b) z apikálních i axilámích pupenů jednoletých výhonů se založí primární kultura in vitro,

c) odvozená kultura se postupně multiplikuje in vitro,

15' ...

d) odebrané vrcholové řízky se zakořeňují v podmínkách in vivo v kultivačním boxu,

e) zakořeněné klonové rostliny se dopěstují do velikosti cca 20 - 40 cm,

20 f) u mladých klonových rostlin se stanoví stupeň rezistence v laboratorních testech,

g) klonové rostliny s rezistencí prokázanou v laboratorních testech se vysadí na původní lokalitu (repatriace) a na další EA zamořené lokality (reintrodukce),

25 h) na stejné lokality se vysadí kontrolní semenáčky hlohu (Crataegus sp.),

i) na každé výsadbové lokalitě v každé vegetaci se u přirozeně rostoucích keřů hlohu, donorové rostliny, vysazených kontrolních semenáčků hlohu a klonových rostlin hodnotí výskyt příznaků spály, laboratorně prokazuje přítomnost EA, sleduje výskyt všech abnormalit růstu

30 a vývoje a určuje jejich příčina,

j) u klonových rostlin se porovnává jejich růst a vývoj najednotlivých výsadbových lokalitách a identifikují se klony, které vykazují stabilitu požadovaných znaků,

35 k) vybrané matečné klony jsou uchovávány v podmínkách in vitro.