CZ297834B6 - Asistovaná elicitace pro produkci metabolitu rostlin - Google Patents

Abstract

Resení se týká zpusobu prípravy metabolitu metodou asistované elicitace pomocí tkánových kultur rostlin, pri kterém se k tkánové kulture soucasne pridá elicitor, s výhodou kyselina jasmonová a její deriváty, a prekurzor zádaného metabolitu. Produkují se tak metabolity rostlin, které jsou pouzitelnézejména ve farmaceutickém prumyslu.

Description

Asistovaná elicitace pro produkci metabolitů rostlin

Oblast techniky

Vynález se týká metody asistované elicitace pro zvýšení produkce metabolitů v tkáňových kulturách rostlin.

Dosavadní stav techniky

Produkce sekundárních metabolitů; v tkáňových kulturách může být v principu zvýšena optimalizací kultivačních podmínek, nebo přímým zásahem do metabolismu, například pomocí elicitorů či prekurzorů.

Tkáňové kultury

Buněčné kultury rostlin jsou považovány za potenciální, velmi bohatý zdroj biologicky aktivních látek. Rostliny jsou schopné tvořit látky obtížně syntetizovatelné v chemické laboratoři. Dokladem toho je řada léků, kde je známá struktura aktivní složky, která se ale jednodušeji získává klasickou extrakcí z rostlinného materiálu, než řízenou syntézou (Famsworth N. R., et al. 1985). Problémem kultivace je, že jen relativně málo kultur je skutečně schopno tyto látky syntetizovat v dostatečné koncentraci (Jedna z nejvyšších produkcí je popsána u kyseliny rozmarýnové Coleus blumei buňkami nad 20% suché váhy na buňku) (Petersen M., 1989). Exprese genetické informace sekundárních metabolitů je totiž v takovýchto proliferujících buňkách obecně potlačována (Nishi A., 1993).

Problém optimalizace podmínek kultivace a složení média ovlivňuje skutečnost, že metoda vhodná pro jeden druh rostliny, někdy dokonce pro buněčnou linii, nemusí být vhodnou pro ostatní. (Buněčná linie odvozená z jedné rostliny a z jednoho kalusu kultury Thalictrum species se lišily produkcí alkaloidu, jedna linie alkaloid produkovala, u druhé byla biosyntetícká dráha vedoucí k alkaloidu zablokována (Zenk Μ. H., 1991).

Pro některé kultury byly vysledovány společné parametry, které měly vliv na výtěžek např. použití vysoké nebo optimální koncentrace sacharózy v médiu zvýšilo výtěžek shikoninu suspenzní kulturou Lithospermum erythrorhizon, kyseliny rozmarýnové Coleus blumei a indolových alkaloidů Catharanthus roseus (Fowler M. W., et al., 1990). Efekt různých sacharidů na produkci taxolu byl sledován u Taxus brevifolia (Kim J. H., et al., 1995). Nahrazení 2,4-D, který může mít tendenci inhibovat vznik sekundárních metabolitů, jiným auxinem jako NAA nebo IAA pozitivně změnilo množství nikotinu u Nicotiana tabacum, kyseliny rozmarýnové u Anchusa offlcinalis. Akumulace některých metabolitů může být zvýšena přidáním prekurzoru, u některých látek se běžně uplatňuje cesta biotransformace např. hydroxylace gitoxigeninu buňkami Daucus carota (Jones J., 1981) nebo biotransformace verbenolů tkáňovými kulturami Solanum aviculare (Vaněk T., 1994). I aplikace speciálních doplňků jako je použití kolchicinu může zvýšit hladiny valepotriatů u Valeriana wallichii suspenzních buněk (Fowler M. W., et al., 1990).

Elicitace

Pojem elicitor je používán pro sloučeniny biologického a nebiologického původu, které mají schopnost indukovat tvorbu phytoalexinů (Buitelaar R. M., et al., 1992). Elicitory mohou být rozděleny do dvou skupin na základě specifity elicitace phytoalexinů - na specifické a nespecifické elicitory. Elicitory specifické mají rozdílnou elicitovou aktivitu u různých rostlin v závislosti na nemocech rezistentním genotypu.

-1 CZ 297834 B6

U nespecifických elicitorů tato rozdílnost pozorována není. Jsou to obvykle komponenty, které jsou běžně přítomny u různých druhů patogenů a mohou být důležité při vývoji tzv. obecné rezistentní odpovědi rostlin. (Yoshikawa M., et al, 1993).

Abiotické elicitory tj. elicitory nebiologického původu jsou často nazývány „abiotické stresové faktory“, protože pojem elicitor je dosti často používán pro sloučeniny biologického původu (Eilert U., 1987). Tato skupina je velmi široká, obsahuje např. UV záření, ionty těžkých kovů, detergenty, glutathion a další xenobiotika, zmrazení nebo zahřátí rostlinných buněk.

Kyselina jasmonová, její prekurzory a deriváty (jasmonáty) se zdají být klíčovými komponenty v procesu elicitace, který může vést k de novo transkripci a translaci a k tvorbě sekundárních produktů u rostlin. (Gundlach, H., et al., 1992). Kyselina jasmonová je integrální součástí obecného systému přenosu signálu. Je součástí mechanismu, kterým se regulují induktivní geny ochrany u rostlin.

Působení kyseliny jasmonové se opírá o následující předpokládaný mechanismus: elicito-receptorový komplex je aktivátorem lipasy, která spustí dráhu gama-linolenové kyseliny, ta je poté přes řadu meziproduktů jako je 12-oxo-fytodienová kyselina, transformována konstitutivním enzymem na kyselinu jasmonovou a methyl jasmonát (viz oktadekanoidová cesta). (Dittrich H., etal, 1992).

Bylo zjištěno, že v řetězci přenosu signálu mezi elicito-receptorovým komplexem a geny spouštějícími syntézu se v suspenzních kulturách různých rostlinných druhů vyskytuje kyselina jasmonová a její prekurzory např. α-kyselina linolenová (Gundlach H., et al, 1992). Jasmonáty jsou rychle syntetizovány jako odpověď na fungální elicitor např. v suspenzních kulturách Rauvolfia a Eschscholtzia. Přítomnost kyseliny jasmonové a/nebo jejích methyl esterů byla analyzována a oba komponenty byly nalezeny v průměrné koncentraci 25 ng/g (suché váhy) v kulturách Eschscholtzia californica, Glycine max, Rauvolfia canescens, Lycopersicum esculentum, Corydalis claviculata a Sarcocapnos crassifolia. (Gundlach H., et al, 1992).

Kyselina jasmonová byla srovnávána s prostaglandiny, chemicky podobnými savčím hormonům (Zimmerman D.C., et al, 1984).

Bylo ukázáno, že jasmonáty dodané k suspenzním kulturám různých druhů rostlin napodobují působení elicitorů a vyvolávají kvalitativně a kvantitativně srovnatelný způsob indukce takových ochranných komponentů jakými jsou flavonoidy, alkaloidy, terpenoidy atd. (Gundlach H., et al, 1992).

Obecně je nevýhodou tohoto přístupu skutečnost, že zvýšená metabolická aktivita vede, vzhledem k omezenému disponibilnímu „poolu“ strukturních elementů nezbytných k syntéze sekundárních metabolitů k:

1) k omezení metabolické aktivity v jiných oblastech („přesměrování metabolismu“) a k celkové nižší efektivitě procesu

2) vzhledem k nedostatku stavebních „kamenů“ k nízké nebo žádné produkci.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky dosavadního stavu techniky prakticky zcela odstraňuje a vpředu popsané problémy řeší způsob přípravy metabolitů rostlin metodou asistované elicitace pomocí tkáňových kultur rostlin, který je založený na současném použití jak elicitorů tak prekurzorů, kdy se ke tkáňové kultuře přidá současně elicitor a prekurzor žádaného metabolitů, podle vynálezu,

-2CZ 297834 B6 jehož podstata spočívá v tom, že se jako prekurzor metabolit použije analog prekurzoru paclitaxolu, což dosud nebylo jako cesta vedoucí k zvýšení produkce popsáno.

Podle tohoto způsobu se produkce metabolitů zvyšuje více, než jak bylo možné očekávat pouhým sečtením těchto postupů. Navržený postup využívá známého principu elicitace a odstraňuje jeho popsané nevýhody současnou aplikací blízkých prekurzorů žádaného metabolitů, což odstraňuje limitace dané nízkými disponibilními zdroji metabolismu.

Podle vynálezu je výhodné, když se jako elicitor využijí sloučeniny biologického a nebiologického původu, které mají schopnost elicitace a to jak specifické tak i nespecifické. Jako prekurzor může být s výhodou, v závislosti na požadovaném metabolitů, využita každá látka z jeho biosyntetické dráhy, která je co nejblíže požadovanému produktu.

Příklady provedení

Produkce paclitaxelu a jeho analog v tkáňové kultuře Taxus baccata

Produkce paclitaxelu a jeho analoga v tkáňové kultuře Taxus baccata, která je za běžných podmínek relativně nízká a nedosahuje úrovně využitelné pro případné praktické využití (0,43 pg/ml).

Ke tkáňové kultuře Taxus baccata byly současně aplikovány blízké prekurzory paclitaxelu (10deacetylbaccatinu a fenylizoserinu) a elicitor (kyseliny jasmonové). Dosažená produkce se zvýšila na úroveň 45 pg/ml. V případě, že byly za stejných podmínek použity pouze prekurzory dosahovala produkce pouze 12,8 pg/ml, při samostatném využití pouze elicitace 0,52 pg/ml.

Průmyslová využitelnost

Postup podle vynálezu je využitelný při produkci metabolitů rostlin, zejména ve farmaceutickém průmyslu.

Literatura

1) Buitelaar R. M., Cesário Μ. T., Tramper J., 1992, Enzyme Microb. Technol., 14, 2-7.

2) Eilert U., 1987, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, 4, 153-196.

3) Famsworth N. R., Akerele O., Bingel A. S., Soejarto D. D. Guo Z. G., 1985, Medical Plants in Therapy, Bull WHO, 63, 965-981.

4) Fowler M. W., Cresswell R. C., Stafford A. M., 1990, Bioactive compounds from plants. Wiley, Chichester, Ciba Foundation Symposium, 154, 157-174.

5) GundlachH., MůllerM. J., Kutchan Τ. M., Zenk Μ. H., 1992 Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 2389-2393.

6) Jones J., Veliký I. A., 1981, European J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 13.

7) Kim J. H., Yun J. H., Hwang Y. S., Byun S. Y., Kim D. I., 1995, Biotechnology letters, 17, 101-106.

8) Nishi A., 1993, Yakugaku Zasshi- Joumal of the Pharmaceutical Society of Japan, 113, 847-860.

-3 CZ 297834 B6

9) Petersen M., 1989, Secondaiy Plant Products from in vitro Cultures, Abstracts of the DutchGerman IAPTC Workshop, 1989.

10) Vaněk T., Valterová I., Pospíšilová R., Vaisar T., 1994, Biotechnology technique, 8.

11) Yoshikawa M., Yamaoka N., Takeuchi Y., 1993, Plant Cell Physiology, 34, 1163-1173.

12) Zimmerman D. C., Vick B. A., 1984, Plant Physiol., 75, 458-461; Zenk Μ. H., 1991, Phytochemistry, 30, 3861-3863.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy metabolitů metodou asistované elicitace pomocí tkáňových kultur rostlin, při kterém se k tkáňové kultuře současně přidá elicitor a prekurzor žádaného metabolitů, vyznačující se t í m , že jako prekurzor metabolitů použije analog prekurzoru paclitaxolu.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako elicitor používá kyselina jasmonová a její deriváty a blízký prekurzor žádaného metabolitů.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako elicitor využijí sloučeniny biologického a nebiologického původu s požadovaným elicitačním účinkem, a to jak specifické tak i nespecifické.
4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že se jako prekurzor použije v závislosti na požadovaném metabolitů každá látka z jeho biosyntetické dráhy.