CZ292879B6 - DNA vakcína proti houbovým infekcím, zejména trichofytóze - Google Patents

Abstract

DNA vakcína proti houbovým infekcím, zejména trichofytóze, která obsahuje fragment deoxyribonukleové kyseliny dermatofyta Trichophyton mentagrophytes imunodominantní části heat shockového proteinu heat shockové rodiny charakterizované molekulovou hmotností 60 000 až 65 000 inkorporovaný do plazmidu vybaveného eukaryontním promotorem.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká DNA vakcíny proti houbovým onemocněním, zejména trichofytóze, využitelné pro humánní i veterinární použití při aplikaci injekční formou.

Dosavadní stav techniky

Dosud známé vakcíny proti trichofytickým onemocněním byly připravovány z různých živých plně virulentních nebo atenuovaných dermatofytů. Jejich široké použití je úspěšné ve veterinární medicíně, když aplikace těchto vakcín je limitována rizikem nákazy trichofytózou pro personál i očkovaná zvířata u plně virulentních kmenů nebo nebezpečím genetické reverze, a tím i návratu virulence u kmenů, jejichž atenuace je podmíněna indukcí bodových mutací indukovaných ultrafialovým světlem nebo jiným mutagenem. V někteiých případech pak bylo k očkování použito usmrcených jednojademých mikrokonidií.

Je známa vakcinace proti houbovým patogenům dle CZ PAT 160 324, jejímž základem jsou živé kmeny Trichophyton faviforme. Nevýhodou tohoto způsobu je, že experimenty potvrdily vysokou virulenci kmenů obsažených ve vakcíně, když se tedy jedná o živou vakcínu, která ohrožuje zdraví lidí při výrobě i aplikaci a zároveň je při nesprávném použití riziková i pro vakcinovaná zvířata. Další vakcíny a způsoby jejich výroby jsou známy dle vynálezů CS autorské osvědčení č. 201 481, kde byly použity kmeny izolované z klinických případů v terénu, nebo PL 188 414, kde byla vakcína připravena v tekuté formě a jejíž nevýhodou je mimo jiné velmi krátká expirační doba přibližně 14 dnů.

Podstatou další známé atenuované živé vakcíny proti trichofytóze skotu dle CS PAT 245 914 byl kmen M-9A Trichophyton verrucosum, u níž byl virulentní potenciál houby snížen genetickou cestou indukcí bodových mutací, které ovlivňovaly schopnost růstu a přežití kmene v teplotních podmínkách savčího organismu, tedy při teplotě přibližně 37 °C. Nově získané vlastnosti vakcíny se ukázaly jako stabilní, i když ultrafialové záření indukuje převážně bodové mutace, které podléhají reverzím cestou spontánních mutací, objevujících se přibližnou frekvencí 10~⁸. Při počtu spor použitých v jedné vakcinační dávce je možnost návratu do virulentní formy natolik riziková, že vakcína nikdy nebyla navržena pro humánní použití. Geneticky pozměněná vakcína si však zachovává imunogenitu srovnatelnou s imunogenní aktivitou stávajících vakcinačních kmenů.

Obecnou základní charakteristikou všech výše uvedených vakcinačních přípravků je využití živých plně virulentních nebo genetickou cestou atenuovaných, případně usmrcených, vždy však celých, buněčných elementů patogenních mykromycet. Výjimky z tohoto přístupu nebo pokusy o přípravu podrobněji definovaných subjednotkových vakcín zůstaly na úrovni experimentu. Příkladem je využití surové ribozomální frakce z některých hub pro indukci protektivní imunity, publikované například autory Elad D., Segal E. „Immunogenicity in guinea-pigs of a crude ribosomal fraction from Microsponum canis. Vaccine. 1994 Feb;12 (2) : 134-8“, nebo Levý R., Segal E., Eylan E., Barr-Nea L.: „Cell-medicated immunity following experimental vaccinations with Candida albicans ribosomes. Mycopathologia. 1983 Nov 25; 83 (3) : 161-8“.

Nedostatkem těchto řešení je, že nevyužívají znalosti později objevených protektivních antigenů u patogenních hub, tedy o proteinech, glykoproteinech, případně polysacharidech antigenní povahy, které jsou asociovány s virulenci významných patogenních hub a představují tzv. kandidátní antigeny pro přípravu protektivních vakcín. Je pak známa role glukuronoxylomananu ve virulenci kvasinkové basidiomycety Cryptococcus neoformans, laboratorní pokusy pro přípravu účinné vakcíny nebo úloha adhesivních molekul v patogenezi Candida albicans a možná role heat shockových proteinů v patogenezi některých hub, což je možno dokladovat například publikacemi

-1 CZ 292879 B6 autorů Sundstrom J.B., Chemiak R.: „The glucuronoxylomannan of Cryptococcus neoformans serotype A is a type 2 T-cell-independent antigen. Infect Immun. 1992 Oct.; 60 (10) : 4080-7“, Devi S.J.N., Schneerson R., Egan W., Ulrich TJ., Bryla D., Robbins J.B., Bennet J.E.: „Cryptococcus neofrormans serotyp A glukoronoxylomaman - protein conjugate vaccine: synthesis, characterisation and immunogenicity. Infection and Immunity 1991, 59 (10), 3700-3707“, Ponton J., Hemando F.L., Moragues M.D., Barea P.L., Gerloni M., Conti S., Fisicaro P., Cantelli C., Plonelli L.: „Candida albicans stress mannoproteins expression in superfical and systemic candidiasis. Stress mannoproteins in Candida albicans. Mycopethologia 1996, 133 (2): 89-94, Pallonelli L., Casadevall A., Han Y., Bemardis F., Kirkland T.N., Matthews R.C., Adriáni D., Boccanera M., Bumie J.P., Cassone A., Conti S., Cutler J.E., Frazzi R., Gregory C., Hodgetts S., Illidge C., Magliani W., Riggs G., Santoni G.: „The efficacy of acquired humoral and cellular immunity in the prevention and therapy of experimental fungal infections. Med Mycol. 2000; 38 Suppl. 1 : 281-92. Review“, Polloneli L., Gerloni M., Conti S., Ficicaro P., Cantelli C., Portincasa P., Almondo F., Barea P.L., Hemando F.L., Ponton J.: „Heat-shock manoproteins as targets of secretory IgA in Candida albicans. J.Infect Dis. 1994 Jun; 169 (6): 1401-5“, Polonelli L., Poulain D., Cole G.T., Conti S., Elad D., Gerloni M., Kirkland T., Matthews R., Segal E., Wyckoff E.: „New strategies in vaccination against fungal infections. J Med Vet Mycol. 1994; 32 Suppl 1 : 105-12“, Dixon D.M., Casadevall A., Klein B., Mendoza L., Deepe G.S. Jr.: „Development of vaccines and their use in the prevention of fungal infections. Med Mycol. 1998; 36 Suppl. 1 : 57-67 Review.“, Matthews R.C., Maresca B., Bumie G.P., Cardona A., Carratu L., Conti S., Deepe G.S., Florez A.M., Franceschelli S., Garcia E., Gargano L.S., Kabayashi G.S., McEwen J.G., Ortiz B.L., Oviedo A.M., Pollonelli L., Ponton J., Restrepos A., Storlazzi A.: „Stress proteins in fungal diseases. Med Mycol. 1998; 36 Suppl 1 : 45-51 Review“ , Deepe G.S. Jr.: Prospects for the development of fungal vaccines. Clin Microbiol Rev. 1997 Oct.; 10(4) : 585-96“, Deepe G.S.Jr., Gibbons R., Brunner G.D., Gomez F.J.: „A protective domain of heat-shock protein 60 from Histoplasma capsulatum. J Infect Dis. 1996 Oct.; 174(4) : 828-34“ nebo Gomez F.J., Allendorfer R., Deepe G.S.Jr: „Vaccination with recombinant heat shock protein 60 from Histoplasma capsulatum protects mice against pulmonary histoplasmosis. Infect Immun. 1995 Jul; 63(7) : 2587-95“.

Je rovněž znám vakcinační přistup dle objevu Wolfa a kolektivu z roku 1990 pomocí tzv. DNA vakcín, podle něhož je prokázáno, že pro indukci systémové imunitní odpovědi není nezbytná aplikace proteinu, ale že odpovídající imunitní odpověď je možno navodit přenesením pouhé informace pro syntézu daného proteinu formou vybrané sekvence DNA inzertované do eukaryontně expresního plazmidu. Touto cestou byla připravena řada vakcinačních preparátů proti virovým, bakteriálním i některým parazitárním infekcím. U houbových patogenů, které se vyznačují strukturální složitostí a biochemickou, a tím i antigenní, plasticitou byl uveřejněn pouze jediný pokus o přípravu DNA vakcíny proti houbové infekci, a to autory Abuodeh R.O., Shubitz L.F., Siegel E., Snyder S., Peng T., Orsbom K.I., Brummer E., Stevens D.A., Galgiani J.N.: „Resistance to Coccidioides immitis in mice after immunization with recombinant protein or a DNA vaccine of a proloine-rich antigen. Infect Immun. 1999 Jun; 67(6) : 2 935-40“. Proti dermatofytům a kvasinkovým infekcím nebyla zatím DNA vakcína připravena ani v pokusných studiích.

Podstata vynálezu

Vynálezem je nové složení DNA vakcíny proti houbovým onemocněním, zejména trichofytóze, a jeho podstat spočívá vtom, že obsahuje fragment deoxyribonukleové kyseliny dermatofyta trichophyton mentagrophytes imunodominantní části heat shockového proteinu heat shockové rodiny charakterizované molekulovou hmotností 60 000 až 65 000 inkorporovaný do plazmidu vybaveného eukaryontním promotorem.

Hlavním přínosem nového složení DNA vakcíny je přesná definice materiálu použitého k vakcinaci, a to jak na úrovni deoxyribnukleové kyseliny, tak i na úrovni aminokyselinové sekvence

-2CZ 292879 B6 proteinu, když na rozdíl od živých vakcín nelze tento materiál pomnožit pouhým přenesením na nová kultivační média. Protein je v tomto případě syntetizován uvnitř buňky, a je proto prezentován imunokompetentním buňkám jako endogenní antigen cestou MHC II molekul, což zajišťuje buněčnou imunitní odpověď.

Popis obrázků na připojených výkresech

Výsledky experimentů v následně uvedených příkladech jsou schematicky znázorněny na připojených výkresech kde na obr. 1 je graf zobrazující závažnost lézí po čelenži vakcinovaných telat, obr. 2 graf zobrazující srovnání hladin specifických sérových protilátek u telat po vakcinaci a čelenži a obr. 3 graf zobrazující závažnost lézí po čelenži vakcinovaných pokusných morčat.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vakcinace telat

V této sérii experimentů byla hodnocena účinnost DNA vakcíny a současně bylo provedeno srovnání vakcíny se stávajícími vakcinačními přípravky vyráběnými firmou Bioveta a.s. a srovnání s experimentálně připraveným rekombinantním proteinem Hsp 60.

V době zahájení pokusu byla telata 3 až 5 týdnů stará, průměrné hmotnosti 50 kg, klinicky bez zjevných známek onemocnění. Telata byla rozdělena do pěti skupin po třech kusech. Po ostříhání srsti v místě vpichu a lokální dezinfekci (Cutasept F, Bode Chemie Hamburg, Germany) byla podle níže uvedeného schématu imunizována injekcí vakcíny do m. gluteus tak, že indukční dávka byla shodně u všech telat aplikována na levé a čelenž na pravé straně.

Časové schéma imunizačního pokusu

Vakcinace den 0

Booster den 14 čelenž den 40

1. kontrola den 62

2. kontrola den 69

Ukončení observace den 120

DNA vakcína

	tele	DNA vakcína pVAXl-hsp60-TM814K v TE	TEpufr	Tris-Cl pufr
	106 089	500 pl (500 pg)	-	-
indukce	106 087	300 pl (300 pg)	-	-
	106 085	500 μΐ (500 pg)	1 ml	-
	106 089	500 pl (500 pg)	-	4 ml
booster	106 087	300 pl (300 pg)	-	4 ml
	106 085	500 pl (500 pg)	-	4 ml

-3CZ 292879 B6

Rekombinantní proteinová vakcína

	tele	Rekombinantní protein hsp60-TM664 v lx PBS	lxPBS	CFA	ICFA
	106 088	1 ml (1 mg)	—	1 ml	—
indukce	106 086	2,5 ml (2.5 mg)	—	2,5 ml	—
	106 084	2,5 ml (2.5 mg)	—	2,5 ml	—
	106 088	1 ml (1 mg)	3 ml	—	1 ml
booster	106 086	2 ml (2 mg)	1 ml	—	2 ml
	106 084	2 ml (2 mg)	1 ml	-	2 ml

Celobuněčné vakcíny a kontrola

	Skupina	tele	CFA	ICFA	lxPBS	Trichoben	Trichobin
	Trichoben	106 081	—	—	—		—
	Trichoben	106 079	—	—	—		—
	Trichoben	106 083	—	—	—		—
	Trichobin	106 082	-	—	—	-
indukce	Trichobin	106 080	—	—	—	—
	Trichobin	106 078	-	—	—	-
	kontrola	106 091	1 ml	—	—	—	—
	kontrola	106 092	2,5 ml	—	—	-	-
	kontrola	106 093	2,5 ml	—	—	—	-
	Trichoben	106 091	—	—	—		—
	Trichoben	106 079	-	-	-		-
	Trichoben	106 083	-	—	—		—
	Trichobin	106 082	-	-	—	-
booster	Trichobin	106 080	—	—	—	—
	Trichobin	106 078	—	—	-	—
	kontrola	106 091	-	1 ml	-	—	—
	kontrola	106 092	-	2 ml	—	—	—
	kontrola	106 093	-	2 ml	-	-	-

Vysvětlení zkratek. Použité pufry a adjuvans

pufr/adjuvans	Složení	Původ
TE pufr	10 mM Tris-Cl, pH8; lmM EDTA	Sigma, St. Louis, MO, USA
Tris-Cl pufr	10 mM Tris-Cl, pH8	Sigma, St. Louis, MO, USA
lxPBS	137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 4.3 mM Na2HPO4; 1,4 mM KH2 PO4	Sigma, St. Louis, MO, USA
CFA	kompletní Freundovo adjuvans	Sigma, St. Louis, MO, USA
ICFA	inkompletní Freundovo adjuvans	Sigma, St. Louis, MO, USA

Po aplikaci indukční dávky vakcín byla pokusná telata každý týden prohlédnuta. Byl hodnocen celkový stav a podrobně byla sledována oblast vpichu s důrazem na tvorbu granulomů, bolestivost a další známky zánětu.

Čelenž - inokulace konidií (pokusná infekce)

Všechna telata byla v „den 40“ čelenžována dávkou 3.10⁵ CFU (conidia forming unites) virulentního kmene Trichophyton mentagrophytes (tm) 10 najedno tele. Telatům byla na pravém boku

-4CZ 292879 B6 ostříhána nůžkami srst na čtverci 20x20 cm a kůže byla v 10 řadách křížově skarifíkována jehlami ve vrstvě stratům comeum epidermis. Poté byla pomocí gumové ucpávky o průměru 4 cm vetřena suspenze obsahující čelenžní dávku T. mentagrophytes aplikována přikapáváním z injekční stříkačky.

Klinické hodnocení telat po čelenži a stanovení sérových protilátek

Sledované klinické parametry

Po čelenži byl jednou týdně po dobu 120 dnů hodnocen celkový stav jednotlivých telat a pozornost byla soustředěna na místo inokulace patogena. Byl sledován celkový stav kůže, zejména tvorba granulací, vřídků a později iychlost hojení a stav srsti.

V době čelenže a v 1. kontrolní den (den 62) bylo telatům po ostříhání srsti a lokální sterilizaci (Cutasept F, Bode Chemie Hamburg, Germany) odebráno z v. jugularis 45 ml krve. Z krve bylo izolováno sérum: koagulací 2 h, 22 °C. po retrakci koagula 12 h, 4 °C byly vzorky centrifugovány 10 000 g, 10 min, 4 °C. Supematant byl přenesen do nových zkumavek. Materiál byl uložen před dalším použitím při 20 °C. Ve vzorcích sér byla stanovena hladina protilátky specificky reagující s rekombinantním hsp60. Detekce byla provedena pomocí Western blotu preparativně rozděleného rekombinantního hsp60-TM664 v uspořádání MultiScreen. Jako kontrola byly použity protilátky anti-T7 Tag (Cat.No.: 69 048 Novagen, lne., Germany) a anti-hsp60 (StressGen, Cat.No.: SPA-807; StressGen Biotechnologies, Victoria, BC Canada). SDS-PAGE, Western blot i imunodetekce byly provedeny za standardních podmínek. Telecí sérum bylo ředěno 1 : 300 a v blokačním pufru bylo FCSI nahrazeno HSI (Human Sérum Heat Inactivated, Immunology MF PU Olomouc).

Výsledky

Experimentální infekce indukovaná u DNA vakcinovaných telat potvrdila účinnost DNA vakcíny. Závažnost klinických příznaků je v grafech vyjádřena stupnicí + - +++. Výsledky vakcinace jsou závislé na aplikované dávce vakcinačního plazmidu. Při dávkování 500 ug plazmidu/tele je ochranný efekt DNA vakcíny zcela zřejmý a je srovnatelný s ochranným efektem celobuněčných vakcín. Při dávkování 300 ug plazmidu/tele se efekt vakcíny ztrácí. Indukce protilátkové odpovědi je po aplikaci DNA plazmidu minimální ve srovnání s vakcinací rekombinantním proteinem a je opět srovnatelná s tvorbou protilátek po vakcinaci celobuněčnými vakcínami. To ukazuje, že efekt vakcíny je realizován cestou buněčné imunitní odpovědi, což je znázorněno na grafech dle obr. 1 a obr. 2.

Příklad 2

Vakcinace morčat

Patnáct albinotických morčat samičího pohlaví o hmotnosti kolem 500 g bylo rozděleno do tří skupin po pěti kusech zvířat. Jedna skupina byla vakcinována plazmidovou DNA vakcínou v dávce 200 ug/morče, druhá skupina rekombinantním Hsp proteinem v dávce 0,5 mg/morče. Třetí skupina sloužila jako kontrola. Vakcíny byly aplikovány do m. gluteus. Booster dávka (opakovaná injekce) byla podána 14 dnů po první vakcinaci. Dvacet jedna dnů po první vakcinaci byla zvířata pokusně infikována čelenžní dávkou 10 virulentních mikrokonidií dermatofyta Trichophyton mentagrophytes. Experimentální infekce byla provedena vetřením suspenze mikrokonidií do ostříhané a skarifikované kůže na boku každého zvířete. Infikováno bylo všech 15 morčat. Výsledky byly hodnoceny 14 a 21 dnů po čelenžní inokulaci. Závažnost klinického obrazu byla hodnocena + - +++. U kontrolních zvířat se po infekci rozvíjela dermatofytóza pod obrazem okrouhlých vředovitých lézí s trustami a bělavým lemem na periferii zánětlivého ložiska. U zvířat očkovaných DNA vakcínou nebyly známky mykotické léze patrné. Na boku zvířat byla

-5CZ 292879 B6 pouze zřejmá okrouhlá ložiska hojení po skarifikaci, která postupně zarůstala nepoškozenou srstí, což je znázorněno na grafu dle obr. 3.

Postup při přípravě vakcíny

Vakcína byla připravena klonováním cDNA Hsp 60 Trichophyton mentagrophytes do eukaryontně expresního plazmidu. Použitá cDNA Hsp 60 byla připravena standardními molekulárně biologickými postupy z cDNA knihovny Trichophyton mentagrophytes (tm) 10 pomocí PCR amplifikace s dvojicí originálně připravených primerů. Identita cDNA byla ověřena srovnáním sekvence nukleových kyselin s dosud popsanými příslušníky Hsp 60 rodiny pomocí softwarové nabídky NCBI (USA). Identita genového fragmentu byla potvrzena rovněž hmotnostní spektrometrií exprimovaného rekombinantního proteinu v prokaryontním expresním systému. Fragment DNA izolovaný PCR amplifikací byl klonován nejprve do klonovacího vektoru a po sekvenování přenesen do expresního vakcinačního plazmidu. K množení a selekce plazmidů byl použit prokaryontní produkční mikroorganismus - derivát bakterie E. coli. Pomnožené plazmidy byly izolovány alkalickou hydrolýzou bakterií a purifikovány pomocí anexových chromatografických kolon. Identita byla ověřena restrikční analýzou DNA. Koncentrace a čistota plazmidů byla stanovena UV spektrometrií. Pro vakcinační účely byla plazmidová DNA rozpuštěna v Tris-Cl pufru pH8. Vakcinační přípravek byl skladován při -80 °C.

Průmyslová využitelnost

DNA vakcína podle vynálezu je využitelná k prevenci a terapii mykotických infekcí vyvolaných houbami, zejména rodu Trichophyton, a patogenními houbami, jejichž imunodominantní epitopy jsou identické nebo velmi blízké epitopům determinovaným izolovaným fragmentem DNA.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (1)

1. DNA vakcína proti houbovým infekcím, zejména trichofytóze, vyznačující se t í m, že obsahuje fragment deoxyribonukleové kyseliny dermatofyta Trichophyton mentagrophytes imunodominantní části heat shockového proteinu heat shockové rodiny charakterizované molekulovou hmotností 60 000 až 65 000 inkorporovaný do plazmidu vybaveného eukaryontním promotorem.