CZ290347B6 - Cyclopeptides stimulating growth hormone release and process of their preparation - Google Patents
Cyclopeptides stimulating growth hormone release and process of their preparation Download PDFInfo
- Publication number
- CZ290347B6 CZ290347B6 CZ1997369A CZ36997A CZ290347B6 CZ 290347 B6 CZ290347 B6 CZ 290347B6 CZ 1997369 A CZ1997369 A CZ 1997369A CZ 36997 A CZ36997 A CZ 36997A CZ 290347 B6 CZ290347 B6 CZ 290347B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- configuration
- fmoc
- cysteine
- amino acid
- mercaptopropionic acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Vynález se týká cyklopeptidů stimulujících uvolňování růstového hormonu a způsobu jejich přípravyThe present invention relates to cyclopeptides that stimulate growth hormone release and a process for their preparation
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Cyklické peptidy jsou silné a specifické stimulátory sekrece růstového hormonu (dále jen GH) u rozmanitých živočišných druhů, které mají určité aminokyselinové pořadí.Cyclic peptides are potent and specific stimulators of growth hormone secretion (GH) in a variety of animal species having a certain amino acid sequence.
Mechanismus biologické úlohy GH spočívá v regulaci funkce různých růstových faktorů (GFs, Rothe M., Falanda V.,: Arch. Dermatol. 125, 1390 (1989); Cohen S., Carpenter G.: Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 72, 1317 (1975): Lynch S. E., Nixon J. C., Colvin R. B., Anthonianes Η. N.: Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7696 (1987); Baxter R. C.: Adv. Clin. Chem. 25, 49 (1986); Gospodarowicz D., Neufeld G., Schweigerer L.: Mol. Cell. Endocrinol. 16, 187 (1986)), které mají komplexní význam pro růst a syntézu buněk. Jsou považovány za důležité mediátory při hojení ran, při fibróze a obměně tkání. Nedostatečná sekrece GH má za následek poruchu funkce GFs a následně omezuje růst a regulaci tkáňového systému v různých organismech. Na druhé straně, zvýšený přísun GH vede ke stimulaci funkce GFs v metabolismu a zlepšuje růst, stav či hojení tkání a orgánů člověka a živočichů (Rothe M., Falanga V.,: Arch. Dermatol. 125, 1390 (1989).The mechanism of biological role of GH is to regulate the function of various growth factors (GFs, Rothe M., Falanda V., Arch. Dermatol. 125, 1390 (1989); Cohen, S., Carpenter, G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1317 (1975): Lynch SE, Nixon JC, Colvin RB, Anthonianes N., Proc., Natl. Acad. Sci. USA 84, 7696 (1987); Baxter RC: Adv. 49 (1986), Gospodarowicz D., Neufeld G., Schweigerer L .: Mol. Cell Endocrinol., 16, 187 (1986), which are of complex importance for cell growth and synthesis. They are considered to be important mediators in wound healing, fibrosis and tissue replacement. Insufficient GH secretion results in impaired function of GFs and consequently limits growth and regulation of the tissue system in various organisms. On the other hand, increased GH intake stimulates GFs function in metabolism and improves growth, condition or healing of tissues and organs of humans and animals (Rothe M., Falanga V., Arch. Dermatol. 125, 1390 (1989)).
Neuroendokrinní systém, kde GH a GFs hrají tak důležitou funkci se uplatňuje rovněž v procesu stárnutí organismu (Meites J., Goya R., Takahasni S.: Exp. Gerontol. 22, 1 (1987); Fabris N.: Intem. J. Neuroscience, 51, 373 (1990), Ďoubal S.: Mech. Ageing Dev. in press). Teprve nedávno byly popsány účinky nízkých dávek GH na imunitní systém a stárnutí myší (Khansari D. N., Gustad T.: Mech. Ageing Dev. 56, 87 (1991)).The neuroendocrine system, where GH and GFs play such an important function, has also been implicated in the aging process of the organism (Meites, J., Goya, R., Takahasni, S .: Exp. Gerontol. 22, 1 (1987); Fabris, N .: Intem. J. Neuroscience, 51, 373 (1990), Doubal S .: Mech. Ageing Dev. In press). Recently, effects of low doses of GH on the immune system and aging of mice have been described (Khansari D. N., Gustad T .: Mech. Ageing Dev. 56, 87 (1991)).
Endogenní sekrece GH může být kromě tzv. releasing faktoru (GRF) z hypothalamu, obsahujícího 44 aminokyselinových zbytků, stimulována i tzv. releasing peptidem : His-D-TrpAla-Trp-D-Phe-Lys-HN2 (GHRP), složeným pouze ze 6 aminokyselinových zbytků a působícím sekreci GH in vitro i in vivo (Momany F. A., Bowers C. Y., Reynolds G. A., Chang D., Hong A., Newlander K.: Endocrinology 108, 31 (1981); Bowers C. Y., Momany F. A., Reynolds G. A., Hong A.: Endocrinology, 114, 1537 (1984)).In addition to the so-called releasing factor (GRF) from the hypothalamus containing 44 amino acid residues, endogenous GH secretion can also be stimulated by the so-called releasing peptide: His-D-TrpAla-Trp-D-Phe-Lys-HN2 (GHRP). 6 amino acid residues and exerting GH secretion both in vitro and in vivo (Momany FA, Bowers CY, Reynolds GA, Chang D., Hong A., Newlander K .: Endocrinology 108, 31 (1981); Bowers CY, Momany FA, Reynolds GA , Hong A., Endocrinology, 114, 1537 (1984).
Tento hexapeptid amid neinteraguje se stejným receptorovým místem v hypofyze jako GRF a je patrně zapojen do jiného mechanismu sekrece GH (Sartor O., Bowers C. Y., Chang D.: Endocrinology, 116, 952 (1985); Cheng K., Chán W. W. S., Barrets, Jr. A., Convey D. M., Smith R. G.: Endocrinology 124, 2791 (1989)). U člověka je jeho potence dokonce vyšší než účinek zmíněného GRF (Yellin T. O., Huffman W. F. in „Peptides“; Chemistry, Structure and Biology. Proč. llth A.P.S. (Rivier. J. E., Marshall G. R., Eds.), p. 214. ESCOM, Leiden, 1990). Pro svou krátkou aminokyselinovou sekvenci je z praktického hlediska GHRP, případně jeho analogy, zajímavější než GRF obsahující desítky aminokyselinových zbytků a mohl by být proto využíván v humánní i veterinární medicíně.This hexapeptide amide does not interact with the same receptor site in the pituitary gland as GRF and appears to be involved in another mechanism of GH secretion (Sartor, O., Bowers CY, Chang D .: Endocrinology, 116, 952 (1985); Cheng K., WWS Khan, Barrets , Jr.A., Convey DM, Smith RG: Endocrinology 124, 2791 (1989)). In humans, its potency is even higher than that of the GRF (Yellin TO, Huffman WF in "Peptides"; Chemistry, Structure and Biology. Proc. 11 th APS (Rivier JE, Marshall GR, Eds.), P. 214. ESCOM (Leiden, 1990). Because of its short amino acid sequence, GHRP or its analogues are, in practical terms, more interesting than GRF containing tens of amino acid residues and could therefore be used in human and veterinary medicine.
Před časem jsme objevily, že GHRP také výrazně zpomaloval proces stárnutí myší v experimentu trvajícím 10 měsíců (Hlaváček J., Smékal O., Barth T., Ďoubal S., Robinson I.: Peptides 1992 (Schneider C. H. and Eberle A. N., Eds.), p. 741, ESCOM, 1993).Recently, we discovered that GHRP also significantly slowed the aging process of mice in an experiment lasting 10 months (Hlavacek J., Smekal O., Barth T., Doubal S., Robinson I .: Peptides 1992 (Schneider CH and Eberle AN, Eds. , p. 741, ESCOM, 1993).
Na základě výpočtů (Momany F. A., Bowers C. Y., Reynolds G. A., Hong A., Newlander K.: Endocrinology, 114, 1531 (1984)) byla pro GHRP navržena pseudocyklická konformaceBased on calculations (Momany F.A., Bowers C.Y., Reynolds G.A., Hong A., Newlander K .: Endocrinology, 114, 1531 (1984)), a pseudocyclic conformation was proposed for GHRP.
-1 CZ 290347 B6 umožněná flexibilním zbytkem alaninu v centrální části molekuly a stabilizovaná interakcí mezi aromatickými zbytky aminokyselin opačné chirality v amino- (His, D-Trp) a karboxy- (Trp,Enabled by flexible alanine residues in the central part of the molecule and stabilized by the interaction between aromatic amino acid residues of opposite chirality in amino- (His, D-Trp) and carboxy- (Trp,
D-Phe) terminální části. Navržená konformace je spojována s účinkem GHRP na stimulaci uvolňování GH.D-Phe) terminal portions. The proposed conformation is associated with the effect of GHRP on stimulating GH release.
Výše uvedené poznatky nás vedly k myšlence kovalentně fixovat výše uvedenou pseudocyklickou konformaci. Proto jsme syntetizovali řadu cyklopeptidů (I) podle schématu hlava k ocasu a sledovali jejich účinek na uvolňování GH do plazmy. Některé z analogů vykazují agonistický účinek lineárního hexapeptid amidu, což potvrzuje naši představu, že cyklické uspořádání je relevantní pro interakci cyklopeptidů s odpovídajícím receptorem a nebrání následujícím procesům, které vedou k sekreci GH. Navíc, při dlouhodobém experimentu na myších (10 měsíců), byl jeden z cyklických analogů dokonce účinnější než GHRP při zpomalení procesu stárnutí u experimentálních zvířat.The above findings led us to the idea of covalently fixing the aforementioned pseudocyclic conformation. Therefore, we synthesized a series of cyclopeptides (I) according to the head-to-tail scheme and observed their effect on the release of GH into the plasma. Some of the analogs exhibit the agonist effect of the linear hexapeptide amide, confirming our notion that the cyclic alignment is relevant to the interaction of cyclopeptides with the corresponding receptor and does not prevent the following processes that lead to GH secretion. In addition, in a long-term experiment in mice (10 months), one of the cyclic analogs was even more effective than GHRP in slowing the aging process in experimental animals.
Tyto peptidy a jejich kombinace působí přímo na přední lalok hypofýzy za specifického spouštění GH a jsou potenciálními analogy GHRP s protrahovaným účinkem. Některé z nich rovněž v dlouhodobém testu zpomalují pochody vedoucí ke stárnutí experimentálních zvířat.These peptides and combinations thereof act directly on the pituitary anterior lobe under specific GH triggering and are potential GHRP analogues with protracted action. Some of them also slow down the processes leading to the aging of experimental animals in the long-term test.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Cyklické peptidy stimulující uvolňování růstového hormonu obecného vzorce ICyclic peptides stimulating growth hormone release of formula I
A - B - C (I),A - B - C (I),
F - E - D kde A znamená zbytky aminokyselin histidinu nebo cysteinu v jejich L nebo D konfiguraci nebo zbytek 3-merkaptopropionové kyseliny,F - E - D where A represents the amino acid residues of histidine or cysteine in their L or D configuration or the residue of 3-mercaptopropionic acid,
B a D znamenají zbytky aminokyselin tryptofanu, terc.leucinu nebo neopentylglycinu v jejich L nebo D konfiguraci,B and D are the amino acid residues of tryptophan, tert.leucine or neopentylglycine in their L or D configuration,
C znamená zbytek aminokyseliny alaninu v jeho L nebo D konfiguraci,C is the amino acid residue of alanine in its L or D configuration,
E znamená zbytky aminokyselin lysinu, fenylalaninu nebo tetrahydroizochinolinkarboxylové kyseliny v jejich L nebo D konfiguraci,E represents the amino acid residues of lysine, phenylalanine or tetrahydroisoquinolinecarboxylic acid in their L or D configuration,
F znamená zbytky aminokyselin lysinu nebo cysteinu v jejich L nebo D konfiguraci nebo zbytek 3-merkaptopropionové kyseliny;F represents the amino acid residues of lysine or cysteine in their L or D configuration or the residue of 3-mercaptopropionic acid;
nebo je cyklus tvořen disulfídovou případně thiomethylenovou vazbou mezi postranními řetězci zbytků aminokyseliny cysteinu v jeho L nebo D konfiguraci, případně v kombinaci se zbytkem 3-merkaptopropionové kyseliny.or the cycle consists of a disulfide or thiomethylene bond between the side chains of the amino acid residues of the cysteine in its L or D configuration, optionally in combination with a 3-mercaptopropionic acid residue.
Způsob přípravy cyklopeptidů podle vynálezu spočívá vtom, že se N“-Fmoc-Ne-Boc-lysin nebo N“-Fmoc-S-Trt-cystein, případně S-Trt-3-merkaptopropionová kyselina připojené na polymemí nosič postupně kondenzují s aktivními hydroxybenztriazolovými estery N“-Fmocaminokyselin v přítomnosti diizopropylethylaminu, přičemž kondenzační reakce se nechá proběhnout v syntetickém cyklu za přídavku dimethylsulfoxidu, N“-Fmoc chránící skupina se v každém kroku syntézy odštěpí působením piperidinu v dimethylformamidu a v závěrečném stupni se hexapeptid po odštěpení z pryskyřice působením slabě alkalického činidla s následným okyselením nebo 1% TFA kyselinou cyklizuje působením difenylfosforylazidu, zatímcoProcess for preparing cyclopeptides according to the invention consists in a N "-Fmoc-N e -Boc-lysine or N" -Fmoc-S-Trt-cysteine or S-Trt-mercaptopropionic acid, 3-linked to a polymeric carrier is gradually condensed with an activated with hydroxybenztriazole esters of N ' -Fmocamino acids in the presence of diisopropylethylamine, where the condensation reaction is allowed to proceed in a synthetic cycle with the addition of dimethylsulfoxide, the N ' -Fmoc protecting group is cleaved at each stage of the a weakly alkaline reagent followed by acidification or 1% TFA acid cyclizes with diphenylphosphoryl azide, while
-2CZ 290347 B6 hexapeptidy se zbytky aminokyseliny cysteinu v její L nebo D konfiguraci, případněHexapeptides with the amino acid residues of the cysteine in its L or D configuration, respectively
3-merkaptopropionové kyseliny, jsou odštěpeny z pryskyřice za současného uzavření disulfidové vazby působením jodu ve směsi rozpouštědel AcOH, TFE a DCM.The 3-mercaptopropionic acids are cleaved from the resin while the disulfide bond is closed by iodine in a mixture of AcOH, TFE and DCM solvents.
Peptidy jsou syntetizovány podle obecného postupu modifikacemi standardních metodik na polymemím nosiči nebo v roztoku. V prvním případě se ke karboxyterminální aminokyselině připojené na polymemí nosič s výhodou chlormethylovou Merrifieldovu pryskyřici nebo její kysele labilnější hydroxymethylové, případně chlortritylové modifikace postupně připojují Na-Fmoc-aminokyseliny v trojnásobném přebytku. Jejich karboxylová skupina je aktivovaná pomocí diizopropylkarbodiimidu (dále jen DIC) a N-hydroxybenztriazolu (dále jen HOBt) jako HOBt ester a kondenzace prováděna v přítomnosti dimethylformamidu (dále jen DMF) resp. N-methylpyrrolidonu (dále jen NMP). Syntetický cyklus pro požadované připojení aminokyseliny zahrnuje odštěpení N“-Fmoc chránicí skupiny působením 20% piperidinu v DMF (5+20 min), pětinásobné promytí peptidyl-pryskyřice DMF, 2-propanolem, DMF resp. NMP. Acylační reakce zpravidla vyžaduje cyklus 2 hod, přičemž po 40 min se přidá dimethylsulfoxid (15% v reakční směsi). Dokončení reakce je kontrolováno ninhydrinovým testem (KaiserE., Colescott R. L., Bossinger C. D., Cook P. I.: Anal. Biochem. 34, 595 (1970)) a změnou zbarvení bromfenolové modři (Krchňák V., Vágner J., Šafář P., Lebl M.: Collect. Czech. Chem. Commun. 53, 2542 (1988)). V případě nekompletní kondenzace (pod 99%) je přidáno BOP činidlo ve třímolámím přebytku s DIEA a reakce prodloužena o 1 h. Nekompletní kondenzace i po této operaci je eliminována acylační reakcí s 25% acetanhydridem v DMF po dobu 5 až 10 min.The peptides are synthesized according to the general procedure by modifying standard methodologies on a polymeric carrier or in solution. In the first case, the carboxyterminal amino acid attached to the polymeric carrier, preferably the chloromethyl Merrifield resin or its acid labile hydroxymethyl or chlorotrityl modifications, are sequentially attached in triple excess with N and -Fmoc-amino acids. Their carboxyl group is activated with diisopropylcarbodiimide (DIC) and N-hydroxybenztriazole (HOBt) as the HOBt ester and condensation is carried out in the presence of dimethylformamide (DMF), respectively. N-methylpyrrolidone (NMP). The synthetic cycle for the desired amino acid attachment includes cleavage of the N ' -Fmoc protecting group by treatment with 20% piperidine in DMF (5 + 20 min), 5 times washing of the peptidyl resin with DMF, 2-propanol, DMF, respectively. NMP. The acylation reaction generally requires a cycle of 2 hours, after which dimethyl sulfoxide (15% in the reaction mixture) is added after 40 min. Completion of the reaction is controlled by a ninhydrin test (KaiserE., Colescott RL, Bossinger CD, Cook PI: Anal. Biochem. 34, 595 (1970)) and a change in bromophenol blue color (Krchňák V., Vagner J., Safar P., Lebl M Chem. Commun., 53, 2542 (1988). In the case of incomplete condensation (below 99%), the BOP reagent is added in a 3 molar excess with DIEA and the reaction is prolonged by 1 hour. Incomplete condensation after this operation is eliminated by acylation reaction with 25% acetic anhydride in DMF for 5-10 min.
Peptid se odštěpí z pryskyřice mírně alkalickým vodným roztokem 0,1 M NaOH ve směsi rozpouštědel MeOH a dioxan, během 3 min, přičemž štěpení se provede celkem třikrát. Poté se roztok okyselí octovou kyselinou k regeneraci karboxylové funkce. V případě kysele labilní pryskyřice se peptid odštěpí působením 1% TFA. Surový produkt analogu GHRP se odsolí na koloně s náplní biogelu Sephadex G-10 za použití 0,2M octové kyseliny. Po Iyofilizaci se peptid dále čistí gelovou filtrací na Sephadexu G-25 v 0,2M octové kyselině, preparativní kontinuální průtokovou elektroforézou (Prusík Z., Kašička V., Mudra P., Štěpánek J., Smékal O., Hlaváček J.: Electrophoresis 11, 932 (1990)) v 0,5M octové kyselině a nakonec preparativní vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (dále jen HPLC). Preparativní HPLC byla prováděna na zařízení fy Spectra Physics s kolonou Vydac C18 při gradientu: 0 až 30% MeOH, 10 min a 30 až 80 % MeOH, 40 min v 0,05% trifluoroctové kyselině, průtoková rychlost 3 ml/min s detekcí při 222 resp. 254 nm. Analytická kontrola čistoty produktů byla prováděna pomocí TLC v systémech Sl(2-butanol-98% HCOOH-voda, 75:13,5:11,5), S2(2-butanol-25% vodný amoniak-voda, 85:7,5:7,5), S3(l-butanol-octová kyselina-voda, 4:1:1) a S4(l-butanol-pyridinoctová kyselina-voda, 15:10:3:6) dále elektroforézou na papíře Whatman 3MM při potenciálovém spádu 20V/cm, 1 h v 1M octové kyselině (pH 2,4) a v pufru pyridin-acetát (pH 5,7) a pomocí analytické HPLC (kolona Vydac Cl8, 20 až 80 % MeCN/0,5% trifluoroctová kyselina, 60 min, průtok 1 ml/min, detekce 222 a 280 nm), aminokyselinové analýzy na přístroji Durrum Instrum. Corp. USA, po hydrolýze peptidu v 6M-HC1, 20 h při 110 °C a hmotové spektrometrie na přístroji VG Analytical, England.The peptide is cleaved from the resin by a slightly alkaline aqueous solution of 0.1 M NaOH in a mixture of solvents MeOH and dioxane, over 3 min, cleaving a total of three times. Then the solution is acidified with acetic acid to regenerate the carboxylic function. In the case of an acid labile resin, the peptide is cleaved with 1% TFA. The crude GHRP analog product was desalted on a Sephadex G-10 biogel column using 0.2M acetic acid. After lyophilization, the peptide is further purified by gel filtration on Sephadex G-25 in 0.2M acetic acid, preparative continuous flow electrophoresis (Prusik Z., Kasicka V., Mudra P., Stepanek J., Smekal O., Hlavacek J .: Electrophoresis 11, 932 (1990)) in 0.5 M acetic acid and finally preparative high performance liquid chromatography (HPLC). Preparative HPLC was performed on a Spectra Physics apparatus with a Vydac C18 column at a gradient of 0 to 30% MeOH, 10 min and 30 to 80% MeOH, 40 min in 0.05% trifluoroacetic acid, flow rate 3 mL / min with detection at 222 resp. 254 nm. Analytical purity of the products was performed by TLC in S1 (2-butanol-98% HCOOH-water, 75: 13.5: 11.5), S2 (2-butanol-25% aqueous ammonia-water, 85: 7, 5: 7.5), S3 (1-butanol-acetic acid-water, 4: 1: 1) and S4 (1-butanol-pyridineacetic acid-water, 15: 10: 3: 6) followed by electrophoresis on Whatman 3MM paper at a potential gradient of 20V / cm, 1 h in 1M acetic acid (pH 2.4) and in pyridine acetate buffer (pH 5.7) and by analytical HPLC (Vydac Cl8 column, 20 to 80% MeCN / 0.5% trifluoroacetic acid) acid, 60 min, flow rate 1 ml / min, detection 222 and 280 nm), amino acid analysis on Durrum Instrum. Corp. USA, after hydrolysis of the peptide in 6M-HCl, 20 h at 110 ° C and mass spectrometry on a VG Analytical, England.
V dalším je vynález a obecný experimentální postup blíže objasněn v příkladech provedení aniž se tím jakkoli omezuje.In the following, the invention and the general experimental procedure are explained in more detail in the examples without being limited thereto.
- j CZ 290347 B6- j CZ 290347 B6
Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Příklad 1Example 1
Na-Fmoc-NE-Boc-lysyM-oxomethylenfenyl-pryskyřiceN and -Fmoc-N E -Boc-lysyl-4-oxomethylenophenyl resin
Merrifieldova pryskyřice (substituce 0,7 mmol/g, 2% kopolymer s divinylbenzenem, Fluka, 2,8 g) byla promyta DMF, vodou, vysušena ve vakuu a promyta benzenem. K pryskyřici byl přidán roztok cezné soli připravené z N“-Fmco-Ne-Boc-Lys-OH (3,42 g) a Cs2CO3 (3,1 g) mícháním obou komponent ve směsi DMF-voda, 3 hod a celá směs byla míchána 48 hod při 40 °C. Po odstranění rozpouštědla byl polymemí materiál s navázanou aminokyselinou promyt na fritě EtOH a DCM a po vysušení bylo 1,67 g použito pro postupnou výstavbu peptidového řetězce.The Merrifield resin (0.7 mmol / g substitution, 2% divinylbenzene copolymer, Fluka, 2.8 g) was washed with DMF, water, dried in vacuo and washed with benzene. To the resin was added a solution of the precision salt prepared from N '-Fmco-N e -Boc-Lys-OH (3.42 g) and Cs 2 CO 3 (3.1 g) by mixing both components in DMF-water for 3 hours. and the whole mixture was stirred at 40 ° C for 48 hours. After removal of the solvent, the polymeric amino acid-bound material was washed on a frit of EtOH and DCM, and after drying, 1.67 g was used to gradually build the peptide chain.
Příklad 2 cyklo(D-His-T rp-Ala-D-T rp-Pre-Lys)Example 2 cyclo (D-His-T rp-Ala-D-T rp-Pre-Lys)
Na-Fmoc chránící skupina z navázaného Lys(Boc) podle příkladu 1 byla odštěpena 20% piperidinem v DMF (5 + 20 min) a po promytí polymemího materiálu DMF, 2-propanolem a opět DMF byl produkt acylován postupně N“-Fmoc deriváty Phe (0,75 g, 2 h), D-Trp (0,46 g, 3 h), Ala (0,57 g, 2 h), Trp (0,38 g, 3 h) a D-His(Boc) (0,42 g, 2 h). Fmoc skupina byla odštěpena 20% piperidinem v DMF a všechny kondenzace probíhaly působením DIC v přítomnosti HOBt v DMF. Částečně chráněný hexapeptid byl posléze odštěpen z pryskyřice v prostředí vodného 0,lM NaOH vMeOH-dioxan (3x50 ml) při teplotě místnosti a od polymemího materiálu oddělen filtrací a promytím 50 ml DMF, DCM a MeOH. Získáno 0,52 g surového produktu, který byl cyklizován působením difenylfosforylazidu v přítomnosti 1M roztoku K2HPO4. Po cyklizaci byl produkt čištěn gelovou filtrací na Sephadexu G-10 a G-25 v 0,2M octové kyselině a pomocí HPLC. Aminokyselinová analýza: His 0,93, Ala 0,98, Trp 1,72, Phe 1,05, Lys 1,0. Pro C56H69N11O10 (1056,2) byl zjištěn /Μ+ΗΛ 1057,1. V posledním stupni byl cyklopeptid rozpuštěn ve směsi TFA(90)-anisol(5)-ethandithiol(5) s přídavkem 100 mg indolu a roztok po 1 h odpařen do sucha za vakua, zbytek extrahován etherem, rozpuštěn ve 3M octové kyselině a roztok promyt 3x etherem a po zředění vodou lyofilizován. Surový produkt byl čištěn semipreparativní HPLC v gradientu mobilní fáze 50-90% MeOH v 0,05% TFA, 30 min (retenční čas 5,21 min).The N and -Fmoc protecting group of the bound Lys (Boc) of Example 1 was cleaved with 20% piperidine in DMF (5 + 20 min) and after washing the polymeric material with DMF, 2-propanol and again DMF the product was acylated sequentially with N'-Fmoc derivatives. Phe (0.75 g, 2 h), D-Trp (0.46 g, 3 h), Ala (0.57 g, 2 h), Trp (0.38 g, 3 h) and D-His ( Boc) (0.42 g, 2 h). The Fmoc group was cleaved with 20% piperidine in DMF and all condensations were treated with DIC in the presence of HOBt in DMF. The partially protected hexapeptide was then cleaved from the resin in aqueous 0.1 M NaOH in MeOH-dioxane (3 x 50 mL) at room temperature and separated from the polymer material by filtration and washing with 50 mL DMF, DCM and MeOH. 0.52 g of crude product was obtained, which was cyclized by treatment with diphenylphosphoryl azide in the presence of a 1M solution of K 2 HPO 4 . After cyclization, the product was purified by gel filtration on Sephadex G-10 and G-25 in 0.2M acetic acid and by HPLC. Amino Acid Analysis: His 0.93, Ala 0.98, Trp 1.72, Phe 1.05, Lys 1.0. For C56H69N11O10 (1056.2) found Μ + ΗΛ 1057.1. In the final step, the cyclopeptide was dissolved in TFA (90) -anisole (5) -ethanedithiol (5) with the addition of 100 mg indole and the solution was evaporated to dryness in vacuo after 1 h, extracted with ether, dissolved in 3M acetic acid and washed. 3x ether and lyophilized after dilution with water. The crude product was purified by semi-preparative HPLC in a mobile phase gradient of 50-90% MeOH in 0.05% TFA, 30 min (retention time 5.21 min).
Pro C46H53NiiOé (856,02) byl stanoven /Μ+ΗΛ = 857. Aminokyselinová analýza: Lys 1, Phe 1,03, Trp 1,84, Ala 1,04, His 0,96; EGiy 2’41,18, EHis 5’7 0,82.For C 46 H 45 N 11 O 6 (856.02) the assay was found to be Μ + ΗΛ = 857. Amino acid analysis: Lys 1, Phe 1.03, Trp 1.84, Ala 1.04, His 0.96; E and G y 2 '4 1.18 E His 5' 7 0.82.
Příklad 3 cyklo(His-D-Trp-Ala-Trp-D-Tic-Lys)Example 3 Cycle (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Tic-Lys)
Fmoc-Lys(Boc)-oxymethylenfenyl-resin (0,62 g) byla po odštěpení Fmoc-chránicí skupiny 20% piperidinem v DMF postupně acylována HOBt estery Fmoc derivátů D-Tic (0,6 g, 3 h), Trp (0,7 g, 4 h), Ala (0,3 g, 2 h), D-Trp (0,7 g, 3 h) a His(Boc) (0,73 g, 2 h). Částečně chráněný hexapeptid byl odštěpen z pryskyřice jako v příkladu 2 a cyklizován rovněž pomocí difenylfosforylazidu v přítomnosti K2HPO4. Po odštěpení Boc chránících skupin jako v příkladu 2 byl cyklohexapeptid čištěn preparativní HPLC za použití gradientu mobilní fáze 50 až 90% MeOH v 0,05% TFA, 30 min, s retenčním časem 5,64. Aminokyselinová analýza: His 0,94, Trp 1,56, Ala 1,08, Tic0,93, Lys 1,0 . EGly 2,4 1,16, EHís5,7 0,82. Pro Ο47Η53Ν]ΐθ6 (868,0) stanoven /M+HT = 868,4.Fmoc-Lys (Boc) -oxymethylenophenyl-resin (0.62 g) was acylated successively after cleavage of the Fmoc-protecting group with 20% piperidine in DMF with HOBt esters of Fmoc derivatives of D-Tic (0.6 g, 3 h), Trp (0 7 g, 4 h) Ala (0.3 g, 2 h), D-Trp (0.7 g, 3 h) and His (Boc) (0.73 g, 2 h). The partially protected hexapeptide was cleaved from the resin as in Example 2 and also cyclized with diphenylphosphoryl azide in the presence of K 2 HPO 4 . After cleavage of the Boc protecting groups as in Example 2, the cyclohexapeptide was purified by preparative HPLC using a mobile phase gradient of 50 to 90% MeOH in 0.05% TFA, 30 min, with a retention time of 5.64. Amino Acid Analysis: His 0.94, Trp 1.56, Ala 1.08, Tic0.93, Lys 1.0. E Gly 2.4 1.16, EHis 5.7 0.82. For Ο47Η 53 Ν] ΐθ6 (868.0) is determined / M + H + = 868.4.
-4CZ 290347 B6-4GB 290347 B6
Příklad 4 cyklo(His-D-Neo-Ala-Trp-D-Phe-Lys)Example 4 cyclo (His-D-Neo-Ala-Trp-D-Phe-Lys)
N“-Fmoc chránící skupina z navázaného Lys(Boc) byla odštěpena 20% piperidinem v DMF (5 + 20 min) a po promytí polymemího materiálu DMF, 2-propanolem a opět DMF byl produkt acylován postupně N“-Fmoc deriváty D-Phe (0,75 g, 2 h), Trp (0,46 g, 3 h), Ala (0,57 g, 2 h), D-Neo (0,31 g, 2 h) a His(Boc) (0,42 g, 3 h). Fmoc skupina byla odštěpena jako v předchozích případech. Všechny kondenzace probíhaly působením DIC v přítomnosti HOBt v DMF. Částečně chráněný hexapeptid byl uvolněn z pryskyřice jako v příkladu 2 a cyklizován rovněž pomocí difenylfosforylazidu v přítomnosti K2HPO4. Po odštěpení Boc chránících skupin jako v příkladu 2 měl cyklohexapeptid aminokyselinové složení: His 0,94, Neo 0,97, Trp 0,82, Ala 1,08, Phe 0,93, Lys 1,0 . EGly 2·4 1,12, EHís 5’7 0,79.The N '-Fmoc protecting group from bound Lys (Boc) was cleaved with 20% piperidine in DMF (5 + 20 min) and after washing the polymeric material with DMF, 2-propanol and again DMF, the product was acylated sequentially with N -Fmoc derivatives D-Phe (0.75 g, 2 h), Trp (0.46 g, 3 h), Ala (0.57 g, 2 h), D-Neo (0.31 g, 2 h) and His (Boc) ( 0.42 g, 3 h). The Fmoc group was cleaved as before. All condensations were treated with DIC in the presence of HOBt in DMF. The partially protected hexapeptide was released from the resin as in Example 2 and cyclized also with diphenylphosphoryl azide in the presence of K 2 HPO 4. After cleavage of the Boc protecting groups as in Example 2, the cyclohexapeptide had the amino acid composition: His 0.94, Neo 0.97, Trp 0.82, Ala 1.08, Phe 0.93, Lys 1.0. E 2 Gly 4 · 1.12 H i E 5 '7 0.79.
Pro C42H56N10O6 (796,97) byl zjištěn /M+H/4 = 797. Preparativní HPLC poskytla při použití gradientu mobilní fáze 50 až 90% MeOH v 0,05% TFA, 30 min čistý produkt III s retenčním časem 6,68.For C 42 H 56 N 10 O 6 (796.97) found (M + H) + = 797. Preparative HPLC gave a mobile phase gradient of 50-90% MeOH in 0.05% TFA, 30 min pure product III, retention time 6.68.
Příklad 5Example 5
N“-Fmoc-NE-Boc-Lys-2-methoxy—4-alkoxybenzylalkohol-pryskyřiceN '-Fmoc-N E -Boc-Lys-2-methoxy-4-alkoxybenzyl alcohol-resin
K Sasrin pryskyřici (substituce 0,9 mmol/g, Bachem, 1 g) v DMF byl za míchání přidán aktivní ester vytvořený reakcí Fmoc-Lys(Boc)-OH (1,15 g) s HOBt (0,76 g) a „komplexu“ pentafluorfenol/DCC (3,74 g) při 0 °C, 30 min a dimethylaminopyridin (30 mg). pH směsi bylo upraveno na 7 přídavkem DIEA (1,2 ml) a po 4 dnech míchání při teplotě místnosti byla pryskyřice s navázanou aminokyselinou odsáta na fritě a promyta 5x 10 ml DMF, EtOH, iPrOH a MeOH a sušena v exsikátoru do konstantní váhy. Vážením (1,24 g) a stanovením Fmoc skupiny byla zjištěna substituce 0,57 mmol aminokyseliny na 1 g pryskyřice. Nezreagované OH-CH2 skupiny linkeru byly acetylovány směsí acetanhydrid (1,3 ml)-DIEA(2 ml)-DCM(8 ml) a po 1 hod pryskyřice odsáta na fritě a promyta 3x 10 ml DCM, iPrOH a DMF. Po odštěpení Fmoc skupiny 20% piperidinem v DMF a promytí 5x10 ml DMF byl materiál připraven pro postupnou výstavbu peptidového řetězce jako v příkladu 1.To the Sasrin resin (substitution 0.9 mmol / g, Bachem, 1 g) in DMF was added the active ester formed by reaction of Fmoc-Lys (Boc) -OH (1.15 g) with HOBt (0.76 g) with stirring, and Pentafluorophenol / DCC "complex" (3.74 g) at 0 ° C, 30 min and dimethylaminopyridine (30 mg). The pH of the mixture was adjusted to 7 by addition of DIEA (1.2 mL) and after 4 days of stirring at room temperature, the amino acid-bound resin was aspirated on a frit and washed with 5x 10 mL DMF, EtOH, iPrOH and MeOH and dried in a desiccator to constant weight. Weighing (1.24 g) and determining the Fmoc group resulted in a substitution of 0.57 mmol amino acid per g resin. Unreacted OH-CH 2 linker groups were acetylated with acetic anhydride (1.3 mL) -DIEA (2 mL) -DCM (8 mL) and after 1 h the resin was aspirated on a frit and washed 3 x 10 mL with DCM, iPrOH and DMF. After cleavage of the Fmoc group with 20% piperidine in DMF and washing with 5x10 ml DMF, the material was prepared for the sequential construction of the peptide chain as in Example 1.
Příklad 6Example 6
H-Cys-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Cys-OHH-Cys-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Cys-OH
Do roztoku Fmoc-Cys(Trt)-OH (0,96 g) v DCM (20 ml) a DMF (I ml) byla za míchání při teplotě místnosti přidána chlortritylová pryskyřice (2 g, subst. 1,3 mmol Cl/g, NovaBiochem, Švýcarsko) a po 5 min 0,26 ml a po dalších 5 min 0,52 ml DIEA. Po 60 min míchání byla reakce stopnuta přídavkem MeOH (2 ml) a po 10 min rozpouštědlo odfiltrováno a na fritě pryskyřice s navázanou aminokyselinou promyta 3x20 ml DCM, DMF, iPrOH, DMF, iPrOH, MeOH, etheru a sušena nad KOH v exsikátoru. Vážením a stanovením Fmoc skupiny byla zjištěna substituce 0,54 mmol/g pryskyřice. Poté byla odštěpena Fmoc chránící skupina 5%, resp. 20% piperidinem ve směsi DCM/DMF 1:1 (10+15 min) a po 4x promytí DMF byl produkt acylován postupně N-Fmoc deriváty D-Phe (0,75 g, 2 h), Trp (0,46 g, 3 h), Ala (0,57 g, 2 h), D-Trp (0,38 g, 3 h) a Cys(Trt) (0,72 g, 2 h). Fmoc skupina byla odštěpena 20% piperidinem v DMF a všechny kondenzace probíhaly působením DIC v přítomnosti HOBt v DMF. Částečně chráněný hexapeptid byl posléze uvolněn z pryskyřice a současně uzavřena disulfidová vazba mezi oběma Cys zbytky působením jodu (0,76 g) ve směsi rozpouštědel: AcOH (1,2 ml), TFE (2,4 ml),To a solution of Fmoc-Cys (Trt) -OH (0.96 g) in DCM (20 mL) and DMF (1 mL) was added chlorotrityl resin (2 g, substrate 1.3 mmol Cl / g) with stirring at room temperature. , NovaBiochem, Switzerland) and after 5 min 0.26 ml and after another 5 min 0.52 ml DIEA. After stirring for 60 min, the reaction was quenched by the addition of MeOH (2 mL) and after 10 min the solvent was filtered off and washed with 3x20 mL DCM, DMF, iPrOH, DMF, iPrOH, MeOH, ether and dried over KOH in a desiccator. The substitution of 0.54 mmol / g resin was found by weighing and determining the Fmoc group. The Fmoc protecting group was then cleaved off with 5% and 5% respectively. 20% piperidine in DCM / DMF 1: 1 (10 + 15 min) and after washing with DMF 4 times, the product was acylated sequentially with N-Fmoc derivatives of D-Phe (0.75 g, 2 h), Trp (0.46 g, 3 h), Ala (0.57 g, 2 h), D-Trp (0.38 g, 3 h) and Cys (Trt) (0.72 g, 2 h). The Fmoc group was cleaved with 20% piperidine in DMF and all condensations were treated with DIC in the presence of HOBt in DMF. The partially protected hexapeptide was then released from the resin and at the same time the disulfide bond between the two Cys residues was closed by treatment with iodine (0.76 g) in a mixture of solvents: AcOH (1.2 mL), TFE (2.4 mL),
-5 CZ 290347 B6-5 CZ 290347 B6
DCM(8,4 ml), 10 min při teplotě místnosti. Roztok byl extrahován 10 ml 0,1% Na2S2O3 do odbarvení roztoku, který byl posléze odpařen a zbytek rozpuštěn ve 3M AcOH a lyofílizován.DCM (8.4 mL), 10 min at room temperature. The solution was extracted with 10 mL of 0.1% Na 2 S 2 O 3 until the solution was decolorized, which was then evaporated and the residue dissolved in 3M AcOH and lyophilized.
Surový produkt byl čištěn semipreparativní HPLC v gradientu mobilní fáze 5% až 90% ACN v 0,05% TFA, 30 min (retenční čas 24,3 min) a pro C4oH44N807S2 (813,0) zjištěn /M+Hf =813,3. Aminokyselinová analýza: Ala 1, Trp 1,64, Phe 1,03, Cys 2,02.The crude product was purified by semi-preparative HPLC in a mobile phase gradient of 5% to 90% ACN in 0.05% TFA, 30 min (retention time 24.3 min) and found / M + for C 4 H 4 N 8 O 7 S 2 (813.0) Hf = 813.3. Amino Acid Analysis: Ala 1, Trp 1.64, Phe 1.03, Cys 2.02.
ZkratkyAbbreviations
Zkratky aminokyselin odpovídají nomenklatuře navržené IUPAC-IUB (Nomenclature and ío Symbolism for Amino Acids and Peptides, Recommendations 1983: Eur. J. Biochem. 138, 9 (1984)). Dále jsou pro chránící skupiny aminokyselin použity tyto zkratky: AcOH, octová kyselina; Boc; terc.butyloxykarbonyl; DCC; Ν,Ν-dicyklohexylkarbodiimid; DCM, dichlormethan; DIC, Ν,Ν-diizopropylkarbodiimid; DIEA, diizopropylethylamin; DMF, dimethylformamid; EtOH, ethanol; Fmoc, fluorenylmethyloxykarbonyl; HOBt, 1-hydroxybenztriazol, 15 MeOH, methanol; iPrOH, 2-propanol; TFA, trifluoroctová kyselina; Trt, trifenylmethyl.Amino acid abbreviations correspond to the nomenclature proposed by IUPAC-IUB (Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides, Recommendations 1983: Eur. J. Biochem. 138, 9 (1984)). In addition, the following abbreviations are used for amino acid protecting groups: AcOH, acetic acid; Boc; tert-butyloxycarbonyl; DCC; Ν, Ν-dicyclohexylcarbodiimide; DCM, dichloromethane; DIC, Ν, Ν-diisopropylcarbodiimide; DIEA, diisopropylethylamine; DMF, dimethylformamide; EtOH, ethanol; Fmoc, fluorenylmethyloxycarbonyl; HOBt, 1-hydroxybenztriazole, 15 MeOH, methanol; iPrOH, 2-propanol; TFA, trifluoroacetic acid; Trt, triphenylmethyl.
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Látky podle vynálezu mohou být využity v humánní a veterinární medicíně při ovlivnění imunitního systému v souvislosti s regulací funkce některých růstových faktorů za účelem zpomalování pochodů uplatňovaných v procesu stárnutí.The compounds of the invention can be used in human and veterinary medicine to affect the immune system in connection with the regulation of the function of certain growth factors in order to slow down the processes involved in the aging process.
Claims (2)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ1997369A CZ290347B6 (en) | 1997-02-07 | 1997-02-07 | Cyclopeptides stimulating growth hormone release and process of their preparation |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ1997369A CZ290347B6 (en) | 1997-02-07 | 1997-02-07 | Cyclopeptides stimulating growth hormone release and process of their preparation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ36997A3 CZ36997A3 (en) | 1998-09-16 |
CZ290347B6 true CZ290347B6 (en) | 2002-07-17 |
Family
ID=5461617
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ1997369A CZ290347B6 (en) | 1997-02-07 | 1997-02-07 | Cyclopeptides stimulating growth hormone release and process of their preparation |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ290347B6 (en) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2118123T3 (en) | 2007-01-31 | 2016-01-25 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Stabilized p53 peptides and uses thereof |
ES2711526T3 (en) | 2010-08-13 | 2019-05-06 | Aileron Therapeutics Inc | Peptidomimetic macrocycles |
MX362492B (en) | 2012-02-15 | 2019-01-21 | Aileron Therapeutics Inc | Peptidomimetic macrocycles. |
AU2013337388B2 (en) | 2012-11-01 | 2018-08-02 | Aileron Therapeutics, Inc. | Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof |
KR20170058424A (en) | 2014-09-24 | 2017-05-26 | 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 | Peptidomimetic macrocycles and uses thereof |
SG11201702175YA (en) | 2014-09-24 | 2017-04-27 | Aileron Therapeutics Inc | Peptidomimetic macrocycles and formulations thereof |
-
1997
- 1997-02-07 CZ CZ1997369A patent/CZ290347B6/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ36997A3 (en) | 1998-09-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US3929758A (en) | Cyclization of cysteine-containing peptides | |
KR100216386B1 (en) | Biologically active peptides containing d-2-alkyltryptophan | |
FI83660C (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING BUKSPOTTSKOERTELNS GRF HOS MAENNISKAN. | |
Maerki et al. | Total solid-phase synthesis of porcine gut gastrin releasing peptide (GRP), a mammalian bombesin | |
CN113330024A (en) | Method for preparing GIP/GLP1 dual agonist | |
AU2020334993B2 (en) | Methods of making incretin analogs | |
BECK‐SICKINGER et al. | Structure/activity relationships of C‐terminal neuropeptide Y peptide segments and analogues composed of sequence 1–4 linked to 25–36 | |
EP0597997B1 (en) | Lanthionine bridged peptides | |
US8383581B2 (en) | Short-chain peptides as parathyroid hormone (PTH) receptor agonist | |
JPH10510814A (en) | Amino acid for producing betide and screening method and production method of betide library | |
HU218288B (en) | Bombesin-antagonistic polypeptide derivatives and pharmaceutical compositions containing them | |
KR20070108953A (en) | Peptide vectores | |
CZ290347B6 (en) | Cyclopeptides stimulating growth hormone release and process of their preparation | |
US6673769B2 (en) | Lanthionine bridged peptides | |
Ponsati et al. | Solid-phase approaches to regiospecific double disulfide formation. Application to a fragment of bovine pituitary peptide | |
CN108047323B (en) | GpTx-1 synthesized by solid phase fragment method and analogue and synthesis method thereof | |
Miranda et al. | Synthesis of human CCK26-33 and CCK-33 related analogs on 2, 4-DMBHA and TMBHA | |
Leondiadis et al. | Solid-phase synthesis of thymosin β10 using a p-cyanotrityl resin. Chemical characterization and immunochemical control of the synthetic peptide | |
EP0495013B1 (en) | Hexapeptides with sulphate ester groups | |
JP2010150253A (en) | Pharmaceutical for treating hepatoma | |
Žertová et al. | The analogs of 8-D-homoarginine-vasopressin with p-substituted phenylalanine in position 2; Synthesis and some biological properties | |
Žertová et al. | Strong uterotonic inhibitors–analogs of 1-deamino-8-D-homoarginine-vasopressin with p-substituted phenylalanine in position 2 | |
CA2245379C (en) | Superpotent calcitonin analogs having greatly increased hypocalcemic action in vivo | |
Žertová et al. | Amino and deamino analogs of 8-D-homoarginin-vasopressin with modified tyrosine in position 2: synthesis and some biological properties | |
US5502164A (en) | Peptide compounds having therapeutic activity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |