CZ28367U1 - Zařízení pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulárním prostoru - Google Patents

Description

Zařízení pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulárním prostoru

Oblast techniky

Technické řešení se týká problematiky kultivace adherentních buněk in vitro (primárních buněk i imortalizovaných buněčných linií). Technické řešení představuje zařízení a systém, díky kterým je možné realizovat zejména dva druhy aplikací: 1) pěstovat buňky při libovolné, výzkumníkem definované a v průběhu času konstantní pericelulámí koncentraci plynů, např. koncentraci kyslíku, a 2) exponovat kultivované adherující buňky rychlým změnám v koncentraci plynů, např. intermitentní hypoxii, tj. rychlým a reprodukovatelným změnám v pericelulámí koncentraci kyslíku prováděným v horizontu přibližně 3 až 5 minut (v závislosti na požadovaném rozsahu změny v koncentraci O2).

Dosavadní stav techniky

Standardní kultivace buněk in vitro probíhá v plastových kultivačních destičkách, typicky vyrobených z polystyrenu s následně chemicky či fyzikálně upraveným povrchem pro lepší adhezi a proliferaci buněk. Buňky rostou a žijí přisedlé na dně jednotlivých jamek v kultivační destičce a jsou převrstveny kultivačním médiem, které poskytuje živiny a další látky nezbytné pro růst a metabolické procesy pěstovaných buněk. Tyto kultivační destičky jsou typicky umístěny v zařízení, tzv. CO2 inkubátoru, které zajišťuje stálou teplotu (37 °C), vlhkost (100 %) a koncentraci CO₂ (5 %).

Tento způsob pěstování buněk je zatížen základní nevýhodou - vrstva kultivačního média přítomná nad buňkami přisedlými na dno kultivační jamky, která typicky dosahuje síly několika milimetrů (objem kultivačního média však není nijak závazně kodifikován ani standardizován), představuje významnou bariéru pro dostupnost kyslíku (O2) přítomného v okolní atmosféře uvnitř inkubátoru k samotným buňkám, kde dochází k jeho spotřebě. Fyzikální proces difúze plynů v kapalinách determinuje množství O2, které za jednotku času difunduje na dno kultivační jamky a tím k rostoucím buňkám. Toto množství je funkcí rozpustnosti daného plynu ve vodném kultivačním médiu a síly vrstvy kultivačního média, kterou jsou rostoucí buňky převrstveny. Nezávislými autory i laboratoří původce bylo zjištěno, že koncentrace O₂ v pericelulárním prostoru, tedy kultivačním médiu bezprostředně obklopujícím kultivované buňky, se dramaticky liší od koncentrace O₂ uvnitř inkubátoru, kde koncentrace O₂ činí ~20 %. Tento fakt je způsoben spotřebou O2 v průběhu energetického metabolismu v buňkách. Bylo zjištěno, že spotřeba O2 metabolicky aktivními buňkami velmi často přesahuje limit fyzikální difúze O₂ skrze vrstvu kultivačního média danou fyzikálními zákony. Bylo tak zjištěno, že ačkoli jsou kultivační destičky umístěny v atmosféře inkubátoru s 20 % O₂, samotné buňky jsou vystaveny různě závažné hypoxii až kompletní anoxii a tak de facto anaerobním podmínkám. Aktuální spotřeba O2 buňkami se liší nejen v závislosti na množství, typu a původu dané buňky nebo buněčné linie (například vysoká metabolická aktivita u hepatocytů v porovnání s nižší metabolickou aktivitou buněk nervových), ale také v průběhu času ve stejné kultivační jamce - s rostoucí denzitou buněk v průběhu jejich proliferace, kdy roste počet buněk na ¢1¾ povrchu kultivační destičky a stoupají tak nároky na difúzi O₂ skrze kultivační médium. Důsledkem těchto fyziologických a fyzikálních pochodů je stav, kdy koncentrace O2 v pericelulárním prostoru je značně proměnlivá v čase, různá mezi různými laboratořemi a buněčnými typy a celkově tedy zcela nedefinovaná a v běžných laboratorních podmínkách neznámá. Přitom je evidentní, že koncentrace O₂ je základním faktorem determinujícím metabolické buněčné procesy i funkční charakteristiky rostoucích buněk in vitro.

V některých experimentech je navíc potřeba vystavit buňky rychlým změnám v pericelulámí koncentraci O₂ (například při výzkumu faktorů vlivů hypoxie, modelech ischemie-reperfuze či při modelaci podmínek intermitentní hypoxie nalézaných např. u pacientů trpících syndromem spánkové apnoe). Na základě publikovaných prací, matematických modelů a experimentů původce je zjevné, že trvá několik desítek minut až několik hodin (v závislosti na síle vrstvy kultivačního média, konvenčních silách a mechanického promývání), než se změna v koncentraci O₂

-1 CZ 28367 U1 v atmosféře uvnitř inkubátoru projeví na úrovni buněk převrstvených kultivačním médiem (rozpuštění plynu v kapalině a difúze na dno kultivační destičky). Je tedy zřejmé, že vystavení buněk intermitentní hypoxii se změnami v pericelulámí koncentraci O₂ v řádu minut není z fyzikálního hlediska za těchto podmínek možné.

V současné době je v běžné laboratorní praxi faktor pericelulámí koncentrace O₂ obvykle zcela ignorován (standardní kultivační protokoly). Byly však vyvinuty i systémy, které některé z nevýhod uvedených výše řeší. Mezi tyto lze počítat systémy založené na konstantní perfuzi kultivačního média skrze kultivační jamku (kultivační médium je předem probubláváno a ekvilibrováno na požadovanou koncentrací O₂) nebo systémy založené na konstantním pohybu a promíchávání kultivačního média k urychlení difúze. Mezi zásadní nevýhody těchto přístupů patří zejména smykový („shear“) stres buněk indukovaný proudem kapaliny a dále také technická a finanční náročnost takových řešení. K dalším nevýhodám patří omezená možnost multiplikace a omezené množství kultivačních jamek, které lze využít. Podobné nevýhody se týkají i systémů založených na principu mikro fluidity, kdy jsou buňky kultivovány pouze ve vrstvě média o síle pouze několika mikrometrů. Ačkoli difúze plynů skrze takto tenkou vrstvu média je značně urychlena, je tento přístup zatížen velmi omezeným množstvím média, které je následně dostupné např. pro analýzu buňkami produkovaných nebo spotřebovaných metabolitů.

V komerčně dostupném zařízení (InVitro Cabinet System, Coy Laboratory, Grass Lake, MI, USA) je difúze plynů k rostoucím buňkám zajištěna přestupem skrze fluorokarbonovou membránu, podobně, jako v předloženém technickém řešení. Avšak uvedené zařízení je koncipováno tak, že kultivační destičky jsou vkládány do inkubátoru a expozice buněk dané koncentraci plynů je realizována výměnou celé vnitřní atmosféry v inkubátoru. Tento postup je při realizaci expozici intermitentní hypoxii zatížen vysokou spotřebou směsí plynů, které musí být do inkubátoru vháněny při vysokém průtoku, aby bylo dosaženo efektivní výměny plynů v inkubátoru. Dlouhodobá expozice trvající několik týdnů je tak prakticky nerealizovatelná. Dalším omezením jsou pak celkové rozměry zařízení (nejmenší model 241 x 406 x 381 mm) ztěžující manipulaci i umístění do provozu laboratoře a samozřejmě ekonomická nákladnost samotného zařízení a zejména jeho provozu (spotřeba 16000 litrů směsi plynů /24 hod expozice intermitentní hypoxii).

Předložené technické řešení, na rozdíl od existujících metod a zařízení, umožňuje přesně definovanou, reprodukovatelnou a dlouhodobou (několik dnů-týdnů) expozici buněk intermitentní hypoxii s časovým rozlišením několika minut, bez zavedení nežádoucích faktorů, jako je např. smykový stres, a přitom poskytuje dostatečný objem kultivačního média pro následné analýzy, a to s výrazně nižšími náklady na pořízení i provoz zařízení v porovnání s existujícími přístupy. Kromě toho se může použít pro krátkodobou i dlouhodobou expozici buněk i jiným plynů s biologickým účinkem, např. NO nebo CO.

Podstata technického řešení

Podstatou předloženého technického řešení je zařízení, které umožňuje kultivaci adherentních buněk při definované (tedy přesně známé) a v čase konstantní koncentraci plynů, zejména pak O₂, na úrovni buněk, a to nezávisle na počtu buněk, stupni jejich diferenciace nebo metabolické aktivitě. Dalším aspektem předloženého technického řešení je systém, který obsahuje výše uvedené zařízení a který umožňuje rychlou změnu pericelulámí koncentrace plynů, zejména O₂, na buněčné úrovni, a to v horizontu např. 1 až 2 minut, čímž je umožněna např. expozice buněk tzv. „intermitentní hypoxii“. Uvedený systém tak umožňuje vytvořit jedinečný in-vitro model užitečný v mnoha biomedicínských oblastech, např. při výzkumu mechanismů ischemie-reperfuze, poruch plicních funkcí nebo syndromu spánkové apnoe.

Předkládané řešení využívá difúze plynů skrze fluorokarbonovou membránu, která je vysoce propustná pro plyny (při síle membrány 25 pm je O₂ permeabilita > 6300 cm³/(m².den.bar), CO2 permeabilita > 7000 cm³/(m².den.bar)). Tato membrána tvoří dno kultivační jamky adherující buňky tedy rostou přisedlé na tuto membránu (dno jamky). Difúze plynů (zejména O2 a CO₂) tak probíhá pouze skrze tuto propustnou membránu namísto obtížné a řádově pomalejší difúze skrze

-2CZ 28367 Ul vrstvu kultivačního média. Tímto mechanismem je jednak zaručena konstantní pericelulámí koncentrace O₂, která odpovídá koncentraci O₂ v atmosféře obklopující spodní stranu kultivační membrány (rozdíl < 1 % O₂). Touto klíčovou změnou v paradigmatu kultivace buněk in vitro je podmíněna druhá unikátní vlastnost předloženého řešení - možnost rychlé změny v pericelulámí koncentraci O₂ v průběhu několika minut (v závislosti na amplitudě požadované změny v koncentracích O₂: při změně z 16 % O₂ na 1 % O₂ dojde k plné změně za 3 až 5 minut).

Systém pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulámím prostoru (dále stručně také jen „expoziční systém“), obsahuje následující hlavní komponenty:

1. Zařízení pro umístění alespoň jedné kultivační destičky pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulámím prostoru (dále stručně držák kultivačních destiček“) a zajištění požadovaného průtoku a výměny plynů pod kultivační destičkou;

2. Soustavu rozvodu plynu obsahující propojovací hadice a alespoň jeden elektromagnetický ventil; a

3. Řídicí jednotku obsahující programovatelný mikroprocesor a řídicí software po řízení expozičního systému.

Držák kultivačních destiček pro zajištění požadovaného průtoku a výměny plynů pod kultivačními destičkami má podobu boxu, který má víko, do kterého se umístí kultivační destička se dnem z fluorokarbonové membrány (například o velikosti 24 jamek) nebo několik kruhovitých kultivačních destiček (například 6 destiček s průměrem 50 mm). Kultivační destička spočívá svým okrajem na obrubě vytvořené ve víku a je po celé obvodové kontaktní ploše vzduchotěsně utěsněna, výhodně pomocí silikonového tmelu. Jiným způsobem utěsnění může být užití těsnicí pásky nebo těsnicích kroužků z technické pryže nebo silikonové pryže. Dvě protilehlé boční strany (výhodně kratší strany) jsou opatřeny otvory a push-to-connect fitinky pro připojení hadic přiváděj ících/odváděj ící ch plyn o požadované koncentraci O₂, CO₂, případně dalších plynů dle konkrétního experimentálního protokolu.

Soustava rozvodu plynu obsahuje hadice propojující tlakové lahve se zásobou směsi plynů o požadovaných koncentracích O₂ (případně jiný zdroj plynů) s elektromagnetickým ventilem, případně ventily, a následně s držákem kultivačních destiček. Držák kultivačních destiček je obvykle v průběhu experimentu umístěn v termostatu. Pro zajištění požadované teploty plynů přiváděných do vnitřku držáku kultivačních destiček je použit tepelný výměník tepla. Jako tepelný výměník může být například použit v termostatu uložený 15 m smotek propojovací hadice nebo může být užit jakýkoliv jiný vhodný tepelný výměník. Hadice na výstupu z držáku kultivačních destiček vyvádějí daný plyn do místnosti, kde je zařízení umístěno, případně ho mohou odvádět mimo budovu (např. při použití nebezpečných nebo dráždivých plynů).

Řídicí jednotka je zodpovědná za časování jednotlivých fází výměny plynů. Jednotka obsahuje programovatelný mikroprocesor, který ovládá (otevírá či zavírá) elektromagnetické ventily. Elektromagnetické ventily jsou zařazeny v soustavě rozvodu plynu a zajišťují v požadovaných intervalech dodávku - přerušení dodávky - a opětovné obnovení dodávky směsi plynů o požadovaném složení do držáku kultivačních destiček. Řídicí jednotka je koncipována modulárně a lze jí ovládat několik (až 15) elektromagnetických ventilů. Pro expozici buněk setrvalé koncentraci kyslíku postačuje v expozičním systému jeden elektromagnetický ventil, pro expozici intermitentní hypoxii (2 směsi plynů o rozdílné koncentraci O₂) jsou nutné 2 ventily. Řídicí jednotka je programovatelná (časování a trvání průtoku plynů do vnitřku držáku) skrze jednoduché sharewarové softwarové rozhraní (Basic Stamp Editor Software, Parallax, USA).

Při provozu expozičního systému se držák kultivačních destiček naplní plynem o dané koncentraci O₂, a tento plyn prochází s velmi malým průtokem (např. 0,1 1/min až 10 1/min) vnitřkem držáku kultivačních destiček. Koncentrace plynů se skrze dno kultivačních destiček (fluorokarbonovou membránu) vyrovnává s koncentrací plynů rozpuštěnou v mediu v pericelulámím prostoru adherujících buněk. Po uplynutí požadovaného času expozice buněk dané koncentraci O₂ (či jiných plynů), který může být rozdílný dle požadavků experimentu (od několika sekund po dobu několika dnů), je plyn uvnitř držáku nahrazen cestou propojovacích hadic pod kontrolou

-3 CZ 28367 U1 řídicí jednotky jinou požadovanou směsí plynů a dochází opět k vyrovnání koncentrace plynů rozpuštěných v pericelulámím prostoru. V průběhu experimentu je držák kultivačních destiček umístěn v prostředí zajišťující konstantní teplotu, typicky 37 °C. Optimálním řešením je samostatný termostat, případně standardní laboratorní CO₂ inkubátor (byť navržené řešení nevyžaduje přítomnost CO₂ v okolní atmosféře, jelikož CO₂ difunduje jako ostatní plyny skrze dno kultivační destičky a musí tedy být obsažen ve směsi plynů aplikované do nitra držáku).

Zařízení a systém podle předloženého technického řešení přinášejí oproti dosavadnímu stavu techniky mnohé jedinečné výhody, ke kterým patří:

- reprodukovatelná a dlouhodobá expozice kultivovaných buněk definované koncentraci plynů, např. kyslíku;

- možnost provádět expozici intermitentní hypoxii;

- neomezená flexibilita doby a časování expozice díky programovatelnému mikroprocesoru;

- ekonomicky nenáročný provoz, minimální spotřeba směsi plynů;

- malé rozměry zařízení a tudíž možnost využití stávajících CO₂ inkubátorů;

- modulární uspořádání a variabilita řešení.

Objasnění výkresů

Obrázek 1. Schéma znázorňující výměnu plynů v jamce kultivační destičky. Difúze plynů probíhá skrze dno (flourokarbonovou membránu) přímo k adherujícím buňkám.

Obrázek 2. Schéma systému pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulámím prostoru. Řídicí jednotka obsahující programovatelný mikroprocesor řídicí časování a dávkovaní směsi plynů do vnitřku držáku kultivačních destiček. Variabilní zapojení elektromagnetických ventilů pod kontrolou mikroprocesoru umožňuje provádět variabilní profily expozice, včetně intermitentní hypoxie, při použití směsí plynů uložených v tlakových lahvích.

Obrázek 3. Zařízení pro umístění kultivační destičky pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulámím prostoru (držák kultivačních destiček) určené pro kultivační destičku s 24 jamkami. Ve výřezu ve víku boxuje umístěna a vzduchotěsně utěsněna kultivační destička s24jamkami s membránovým dnem. Při provozuje směs plynů o definované koncentraci O₂ a CO₂ vháněna do vnitřku držáku a následně opouští držák výstupními otvory na protilehlé straně. A. celkový pohled na držák kultivační destičky. B. Výkres víka držáku s otvorem pro umístění kultivační destičky. C. Výkres boční strany držáku opatřené otvory pro přívod/odvod plynů.

Obrázek 4. Zařízení pro umístění kultivačních destiček pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulámím prostoru (držák kultivačních destiček) pro šest kultivačních destiček (misek) s průměrem 50 mm. Ve výřezech ve víku boxu jsou umístěny a vzduchotěsně utěsněny kultivační destičky s membránovým dnem. Při provozu je směs plynů o definované koncentraci O₂ a CO₂ vháněna do vnitřku držáku vstupními otvory a následně opouští držák výstupními otvory na protilehlé straně. A. celkový pohled na držák kultivačních destiček. B. Výkres víka držáku s otvory pro umístění kultivačních destiček. C. Schematický boční řez držákem s vloženými kultivačními destičkami.

Obrázek 5. Změny v pericelulámí koncentraci kyslíku v průběhu expozice intermitentní hypoxii při využití standardní kultivační destičky (A) v porovnání s destičkou, kde je dno konstruováno z materiálu propustného pro plyny (B). Doba trvání jednoho cyklu - 10 minut.

Obrázek 6. Změna pericelulámí koncentrace O₂ rozpuštěného v médiu na dně kultivační jamky při změně koncentrace plynů uvnitř držáku kultivačních destiček z 16 % na 1 % O₂ po otevření elektromagnetického ventilu (v čase vyznačeném šipkou) umožňujícího proud směsi plynů obsahující 1 % O₂.

-4CZ 28367 Ul

Obrázek?; Expozice intermitentní hypoxii po dobu 14-dnů zvýšila lipolytickou aktivitu 3T3 preadipocytů o 463 % (po 240 minutové inkubaci), respektive 246 % (po 60 minutové inkubaci) (p < 0,05).

Příklady provedení technického řešení

Příklad 1

Konstrukce systému pro expozici a kultivaci buněk

Systém S pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulámím prostoru (schematicky znázorněný na obr. 2) obsahuje následující hlavní komponenty:

1) Zařízení D pro umístění kultivačních destiček pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulámím prostoru (držák kultivačních destiček) pro zajištění požadovaného průtoku a výměny plynů pod kultivačními destičkami;

2) Soustavu rozvodu plynu obsahující propojovací hadice H a jeden nebo dva elektromagnetické ventily V; a

3) Řídicí jednotku R obsahující programovatelný mikroprocesor a řídicí software.

Zařízení D pro umístění kultivačních destiček (držák kultivačních destiček) bylo vyrobeno ve dvou alternativních provedeních: Jedná se o box 1, H (viz obr. 3 a 4) s víkem 2,12, opatřeným otvorem 3 či otvory 13, kam lze umístit jednu kultivační destičku se dnem vyrobeným z fluorokarbonové membrány o velikosti 24 jamek (obr. 3, víko 2), respektive šest kruhovitých kultivačních destiček (misek) s průměrem 50 mm (obr. 4, víko 12). V těchto příkladných provedeních byly použity destičky Lumox 24-well a Lumox D50 se dnem z flourokarbonové membrány od společnosti Sarstedt (Sarstedt AG & Co, Nůmbrecht, Německo). Kultivační destičky spočívají svým okrajem na vybrání 4, resp. 14 po obvodu otvoru 3, respektive 13 ve víku 2, respektive 12, a jsou dále po celém kontaktním obvodu vzduchotěsně utěsněny pomocí silikonového tmelu.

V obou kratších stranách boxu I, H jsou otvory 5, 15, do kterých jsou pomocí push-to-connect fitinků připojeny hadičky přivádějící (a na protilehlé straně odvádějící) plyn o požadovaném složení.

V systému S je držák i, ii umístěn v laboratorním CO₂ inkubátoru I zajišťujícím konstantní teplotu, typicky 37 °C.

Soustava rozvodu plynu obsahuje hadice H a jeden (případně dva) elektromagnetický ventil V (viz obr. 2): Hadice H (průměr 8 mm) propojují tlakové lahve L se zásobou směsi plynů o požadovaných koncentracích O₂ s elektromagnetickým ventilem V (případně dvěma ventily) a následně vedou do držáku D kultivačních destiček umístěného v inkubátoru I. Pro zajištění požadované teploty plynů přiváděných do vnitřku držáku D je v inkubátoru I uloženo 15 m hadice H, sloužících jako výměník T tepla. Při tomto řešení změna teploty vzduchu uvnitř držáku D pri výměně plynů s rychlostí 10 1/min nepřesahuje 0,2 °C. Odvod plynů z vnitřku držáku D je zajištěn obdobným způsobem pomocí hadic H.

Řídicí jednotka R (viz obr. 2) je v systému S zodpovědná za časování jednotlivých fází výměny plynů. Jednotka R obsahuje programovatelný mikroprocesor (Parallax BS2, Parallax, USA), který skrze MOSFET tranzistory ovládá (otevírá či zavírá) jeden (případně dva) elektromagnetický ventil V (VT307, SMC Pneumatics, USA). Soustava rozvodu plynu ovládaná řídicí jednotkou R zajišťuje v požadovaných intervalech dodávku - přerušení dodávky - a opětovné obnovení dodávky směsi plynů o požadovaném složení. Řídicí jednotka R je koncipována modulárně a v případě potřeby lze její pomocí ovládat až 15 elektromagnetických ventilů V, v závislosti na konkrétním využití systému S. Pro expozici buněk setrvalé koncentraci kyslíku je v systému S zařazen jeden elektromagnetický ventil V, pro expozici intermitentní hypoxii (2 směsi plynů o rozdílné koncentraci O₂) jsou v systému S nutné 2 ventily V. Řídicí jednotka R je programovatelná (časování a trvání průtoku plynů do nitra držáku) prostřednictvím jednoduchého sharewarového softwarového rozhraní (Basic Stamp Editor Software, Parallax, USA)

-5CZ 28367 Ul

Příklad 2

Standardní kultivace buněk v systému pro expozici a kultivaci buněk

Jelikož dostupnost O₂ představuje základní faktor života buněk v živých organismech, je i pro in vitro podmínky klíčové zajistit danou koncentraci kyslíku i buňkám pěstovaným v kultivačních destičkách. Expoziční systém S podle předloženého technického řešení popsaný podrobně v příkladu 1 umožňuje změnit stávající nevyhovující praxi kultivace buněk in vitro, která tento základní faktor života nedostatečně kontroluje, což má za následek v mnoha případech kultivaci buněk za hypoxických až anaerobních podmínek a přesmyk do anaerobního buněčného metabolismu s odpovídajícími změnami ve fenotypu daných buněk. Rozšíření běžné laboratoře o předložené technické řešení umožní zajistit pěstovaným buňkám predikovatelné životní podmínky, konstantní v čase (tedy neměnné s nárůstem počtu buněk a změnou jejich metabolické aktivity). Příklad 3

Základní test systému pro expozici a kultivaci buněk

Expoziční systém S podle předloženého technického řešení popsaný v příkladu 1 umožňuje v uživatelem definovaných časových úsecích výměnu směsi plynů uvnitř držáku D kultivačních destiček a dovoluje tak exponovat buňky intermitentní hypoxii. Typickou oblastí pro takové uspořádání experimentů jsou kardiovaskulární výzkum ischemie-reperfuze, nádorová biologie, sportovní biologie (hypoxický trénink) nebo výzkum reaktivních forem kyslíku. Výhodné využití systém S najde zejména při výzkumu mechanismů buněčného poškození při syndromu obstrukční spánkové apnoe, kde změny v koncentracích kyslíku probíhají v průběhu několika desítek sekund až minut.

Pro otestování funkčnosti expozičního systému S popsaného v příkladu 1 byly měřeny změny v pericelulámí koncentraci kyslíku v průběhu expozice intermitentní hypoxii při využití standardní kultivační destičky porovnání s destičkou, kde je dno konstruováno z materiálu propustného pro plyny, umístěnou v držáku D kultivačních destiček. Řídicí jednotka R byla naprogramována tak, že v cyklech (doba trvání jednoho cyklu =10 minut) byla do držáku D střídavě aplikována směs plynů s 1 % O₂ a s 16 % O₂. Výsledky znázorněné na obr. 5 ukazují, že při standardní kultivaci dle dosavadního stavu techniky se pericelulámí koncentrace O₂ prakticky neměnila (dlouhodobě pomalu klesla z koncentrace přibližně 11 % na přibližně 8 %), zatímco při využití destiček osazených v držáku D pericelulámí koncentrace O₂ skutečně oscilovala mezi 1 % a 16 % koncentrací O₂.

Časový průběh změny pericelulámí koncentrace O₂ rozpuštěného v médiu na dně kultivační jamky při změně koncentrace plynů uvnitř držáku D z 16 % na 1 % O₂ je podrobně ukázán na obr. 6. Nová hladina se ustaví do přibližně 5 minut.

Funkčnost expozičního systému S byla dále ověřena v biologickém experimentu popsaném v následujícím příkladu.

Příklad 4

Test expozičního systému pro expozici buněk intermitentní hypoxii

V tomto příkladu je popsán experiment, kde byl zkoumán vliv intermitentní hypoxie na lipolytickou aktivitu diferencovaných 3T3-L1 preadipocytů.

Metody. 3T3L1 preadipocyty (Zen-Bio lne., NC, USA) byly pěstovány na kultivačních destičkách, jejichž dno je tvořeno fluorokarbonovou membránou (Prod. #94.6077.410, Sarstedt AG & Co. Numbrecht, Germany). Buňky byly expandovány a pěstovány podle doporučení dodavatele ve standardním CO₂ inkubátoru při 37 °C a 5 % CO₂. Buňky byly expandovány v preadipocytárním médiu (PMI-L1. Zen-Bio lne., NC, USA) do pasáže číslo li (4 - 5 dnů) v T75 kultivačních lahvích (Prod. #156499 Nunc, Roskilde, Denmark) a následně vysazeny v množství 5000 viabilních buněk/cm² do 24jamkové kultivační destičky s fluorokarbonovým dnem. Po dosažení konfluence bylo médium zaměněno za diferenciační médium (DM2-L1, Zen-Bio lne., NC, USA) po dobu 3 dnů. Po 3 dnech bylo diferenciační médium zaměněno za adipocytámí médium (AM2-L1,

-6CZ 28367 U1

Zen-Bio lne., NC, USA), které bylo částečně obměňováno každý druhý den po dobu 11 dnů, kdy byly buňky použity k experimentům.

Expozice intermitentní hypoxii byla realizována pomocí expozičního systému S popsaného v příkladu 1. Kultivační destička s rostoucími buňkami byla po celou dobu diferenciace (14 dnů) umístěna do držáku D kultivačních destiček v expozičním systému S a exponována buď: a) intermitentní hypoxii nebo b) kontrolnímu experimentu (setrvalá koncentrace O₂ =20 %). Intermitentní hypoxie byla realizována pomocí dvou elektromagnetických ventilů V řízených řídicí jednotkou R, které zajišťovaly průtok plynů o definované koncentraci O₂ do vnitřku držáku D a tím ke kultivovaným buňkám. Pro experiment bylo využito těchto směsí plynů: 16% O_2j 5 % CO₂, 79 % N₂ a 1 % O₂ 5 % CO₂,94 % N₂. Řídicí jednotka R byla naprogramována tak, že po dobu 2 minut byla do vnitřku držáku D aplikována směs plynů s 1 % O₂ při průtoku 2000 ml/min (indukce hypoxie), následována 3 minutovým obdobím s průtokem 100 ml/min (udržení hypoxie po 3 minuty). Následně byla do vnitřku držáku D aplikována směs plynů s 16 % O₂ při průtoku 2000 ml/min (navození normoxie), následována 3 minutovým obdobím s průtokem 100 ml/min (udržení normoxie). Celý cyklus normoxiehypoxie-normoxie tak měl trvání 10 minut. Minutový průtok plynů do nitra držáku D v průběhu indukce hypoxie či návratu do normoxie byl stanoven na 4násobek mrtvého objemu držáku D.

Stanovení bazální lipolýzy. Po expozici buněk intermitentní hypoxii či kontrolnímu experimentu bylo kultivační médium odsáto a buňky následně inkubovány po 60 a 240 minut v roztoku KRBHA (Krebs-Ringerův bikarbonátový pufr s 10 mmol/1 HEPES a 2% bovinním sérovým albuminem, pH 7,4). Po inkubaci byl KRBHA odebrán a zmražen v -80 °C do doby analýzy. Koncentrace glycerolu uvolněného z 3T3-L1 buněk v průběhu 60 a 240 minut do KRBHA byla měřena kolorimetricky (Reagens bez glycerolu, Sigma, F6428). Data byla následně normalizována na celkové množství lipidů změřené pomocí barvení na lipidy pomocí Oil Red O s jeho následnou extrakcí isopropanolem a kolorimetrickou kvantifikací. Celkem byla provedena 3 nezávislá opakování (n = 3)

Výsledky: Expozice intermitentní hypoxii po dobu 14 dnů zvýšila lipolytickou aktivitu 3T3 preadipocytů o 463 % (po 240 minutové inkubaci), respektive 246 % (po 60 minutové inkubaci), jak je ukázáno na obr. 7. Výsledky byly statisticky průkazné (p < 0,05).

Příklad 5

Expozice buněk jiným plynům či signálním molekulám

Systém S podle předloženého technického řešení popsaný v příkladu 1 umožňuje krátkodobou i dlouhodobou expozici buněk i jiným plynů s biologickým účinkem. Zejména expozice plynu NO nebo CO s rozsáhlými biologickými efekty může být velmi výhodně realizována pomocí předloženého systému S, zejména vzhledem k jeho krátkému biologickému poločasu.

Výhodné využití tak bude např. při toxikologických testech.

Claims (7)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Zařízení pro umístění alespoň jedné kultivační destičky pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulámím prostoru, vyznačující se tím, že obsahuje box (1, 11) s víkem (2, 12) opatřeným alespoň jedním otvorem (3, 13) pro vložení alespoň jedné kultivační destičky se dnem vyrobeným z fluorokarbonové membrány tak, že je ve vybrání (4, 14) po obvodu otvoru (3, 13) vzduchotěsně utěsněna, přičemž ve dvou protilehlých stranách boxu (1, 11) jsou otvory (5, 15) pro přívod/odvod plynu požadovaného složení.
2. 2. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že kultivační destička jev otvoru (3, 13) utěsněna silikonovým tmelem nebo těsněním z technické nebo silikonové pryže.

   -7CZ 28367 Ul
3. 3. Zařízení podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že otvor (3, 13) je uzpůsoben pro umístění jedné kultivační destičky s 24 jamkami.
4. 4. Zařízení podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že otvor (3, 13) je uzpůsoben pro umístění šesti kruhovitých kultivačních destiček.
5. 5. Systém pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů v pericelulámím prostoru, vyznačující se tím, že obsahuje zařízení pro umístění alespoň jedné kultivační destičky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, soustavu rozvodu plynu obsahující hadice (H) a alespoň jeden elektromagnetický ventil (V) pro připojení alespoň jedné tlakové lahve (L) se zásobou směsi plynů o požadovaném složení a řídicí jednotku (R) obsahující programovatelný mikroprocesor pro časování jednotlivých fází výměny plynů.
6. 6. Systém podle nároku 4, vyznačující se tím, že dále obsahuje tepelný výměník (T) pro temperování přiváděného plynu.
7. 7. Systém podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že dále obsahuje termostat nebo inkubátor (I) pro umístění zařízení podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.

   4 výkresy

   Seznam vztahových značek:

   S systém pro expozici a kultivaci buněk při definované koncentraci plynů

   D zařízení pro umístění kultivačních destiček H hadice

   V elektromagnetický ventil

   L tlaková nádoba s plynem

   R řídicí jednotka

   I inkubátor

   T tepelný výměník

   1, 11 box

   2, 12 víko

   3, 13 otvor pro umístění kultivační destičky

   4, 14 vybrání

   5,15 otvor pro přívod/odvod plynu.